Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль интерлейкина-5 при бронхиальной астме и регуляция его продукции

На правах рукописи

САЗОНОВ

Алексей Эдуардович

Роль интерлейкина-5 при бронхиальной астме и регуляция его продукции

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск - 2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН г. Москва

Огородова

Людмила Михайловна

Дыгай

Александр Михайлович

Лишманов Юрий Борисович

Назаренко Сергей Андреевич

Защита состоится «28» октября 2004 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, Россия, Томск, Московский тр., 2)

С диссертацией можно ознакомится в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, Россия, Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан «27»сентября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета (З^р**^ СУхан°та Г.А

2005-4 12371

Общая характеристика работы

Введение

Бронхиальная астма (БА) является хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, которое характеризуется обратимой бронхиальной обструкцией и гиперреактивностью бронхов [Busse W.W., Lemanske R.FJ., 2001; GINA, 2002]. По данным эпидемиологических исследований этим заболеванием страдает от 3 до 10% населения [Spoiik R. et al, 1990; Черняк Б.А., 2002; Нота D.M., 2000], причем наблюдается неуклонный рост заболеваемости и смертности по причине БА [Spoiik R. et al, 1990; GINA, 2002; Чучалин А.Г., 2003].

В большинстве случаев астма является атопическим заболеванием и сопровождается синтезом реагинов — иммуноглобулинов Е и/или G к распространенным аллергенам окружающей среды [GINA, 2002]. В развитии БА принимают участие многие клетки (тучные клетки, базофилы, эозинофилы и др.) и медиаторы (гистамин, лейкотриены, цитокины и т.д.) [Nicod L.P., 2003].

Патогенез БА представляет собой сложный комплекс нарушений регуляции иммунного ответа в сторону ТЬ2-лимфоцитов, сопровождающийся развитием персистирующего эозинофильного воспаления [Laiche М., Kay A.B., 2003]. В настоящее время все компоненты воспаления при астме претерпевают непрерывные и существенные изменения, как за счет увеличения нагрузки внешнесредовых факторов, так и за счет накопления генетических нарушений.

Патогенетические механизмы при БА обладают целым рядом особенностей, осложняющих проведение терапевтических мероприятий. Одной из важных задач патофизиологии при изучении воспаления, ассоциированного с БА, является выяснение механизмов, лежащих в основе диф-ференцировки, пролиферации и изменения продолжительности жизни основных клеток-эффекторов—эозинофилов.

За последние два десятилетия понимание патогенеза астмы в значительной степени изменилось благодаря развитию инвазивных и неинва-зивных методов диагностики, а также в связи с прогрессом в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. Стало понятным, что дисрегуляция клеточного и гуморального иммунного ответа при действии аллергенов является основой атопии. Такой иммунный ответ проявляется уже в раннем возрасте под влиянием генетических факторов и факторов окружающей среды. Хотя атопия и является фактором риска развития БА, не у всех атопиков регистрируется бронхиальная гиперрерактивность и другие симптомы астмы. Дополнительные факторы, такие как производные эпителиальных клеток дыхательных путей и резидентных тканевых клеток, могут быть критически важными для регуляции иммунного ответа в легких и развития хронического персистирующего воспаления, кото-

■ '■..'.u-.rt.lbl

tii сл ПОТЕКА

рое приводит к функциональным изменениям и, в конечном итоге, к морфологическим структурным изменениям в бронхиальном дереве (ремо-делирование дыхательных путей).

Важнейшую роль в патогенезе БА играют эозинофилы [Huber H.L., Koessler K.K., 1922; Lambrecht B.N. et al, 2003]. Инициируя позднюю фазу воспаления, эозинофилы обеспечивают развитие бронхиальной гиперреактивности (БГР) и ремоделирование [Kita H. et al, 1998; Kay A.B. et al, 2004]. Воспаление при астме сопровождается эозинофильной инфильтрацией дыхательных путей, причем существует положительная корреляция между содержанием эозинофилов в стенке бронхов и степенью тяжести БА [Bochner В. S., et al, 1991]. Эозинофилы могут модулировать воспалительный процесс, продуцируя большое количество факторов, таких как токсические основные (щелочные) белки, липидные медиаторы, цитокины и супероксид-анионы. Несмотря на то, что эозинофилию давно связывают с воспалением, молекулярные механизмы, быстро и специфически регулирующие уровень эозинофилии, остаются малоизученными.

В созревании, дифференцировке и активации эозинофилов ключевым фактором является интерлейкин-5 (ИЛ-5), поскольку рецепторы для этого цитокина экспрессируются преимущественно на эозинофилах [Sehmi R., et al, 1997; Yamada Т., et al, 1998]. ИЛ-5 является основным и, возможно, единственным цитокином, специфически вовлеченным в процесс продукции эозинофилов. Показано, что ИЛ-5 имеет важное значение в формировании воспалительного процесса при астме [Walker С, et al, 1991; Bradley В. L., et al, 1991; Robinson D., et al, 1992; Huston D. P., 1997; Сазонов А.Э. и др., 2002]. У больных БА выявлено увеличение концентрации этого цитокина в воздухоносных путях после стимуляции специфическим антигеном, а в биоптатах бронхов обнаружено возрастание экспрессии мРНК ИЛ-5, которое коррелирует с тяжестью заболевания, снижением функции легких [Huang J. С., et al, 2003].

Клеточные эффекты ИЛ-5 опосредуются через его рецептор (ИЛ-5Р), который относится к семейству цитокиновых рецепторов первого типа (наряду с рецепторами к ИЛ-3 и ГМ-КСФ). Рецептор состоит из двух субъединиц: а-субъединицы (ИЛ-5Ра), специфически связывающей ИЛ-5 и р-субъединицы (ИЛ-5Рр), реализующей проведение сигнала с комплекса ИЛ-5Ра/ИЛ-5. Альтернативный сплайсинг м Р ШК-м© ж е т приводить к образованию различных изоформ рецептора, которые обладают антагонистическими свойствами: мИЛ-5Ра (мембраносвязанная изофор-ма) образует комплекс с RJI-5Pß в мембране клетки, тогда как рИЛ-5Ра (растворимая изоформа) может связывать свободный ИЛ-5, блокируя его физиологическую активность [Tavernier J., et al, 1992; Johanson K., et al, 1995]. Альтернативный сплайсинг не является строго детерминированным, соотношение экспрессии мИЛ-5Раи рИЛ-5Ра может варьировать. В зависимости от преобладания продукции той или иной изоформы может

изменяться конечное содержание ИЛ-5 в тканях и периферической крови, модулироваться сигнал в ИЛ-5Ра+-клетках. Патологический дисбаланс изоформ рецептора может реализоваться в прогрессировании эозино-фильного воспаления.

Несомненно, в последнее время достигнут значительный прогресс в понимании патогенеза БА, взаимосвязи иммунных механизмов воспаления и манифестации клинических проявлений астмы. Используемое лечение эффективно для контроля большинства симптомов астмы. Однако традиционная терапия, основанная на применении кортикостероидов, направлена на общее снижение воспаления и не позволяет проводить целенаправленную коррекцию функции клеток-эффекторов. В связи с этим большое значение приобретает поиск новых фармакологических стратегий направленных на регуляцию сложного взаимодействия между различными клетками-эффекторами и медиаторами воспаления. В отношении эозинофилии таким медиатором выступает ИЛ-5, вследствие чего теоретическое обоснование подходов к регуляции его эффектов является актуальной задачей.

Цель: Установить общие закономерности и механизмы участия ИЛ-5 в развитии аллергического воспаления и особенности регуляции его продукции при бронхиальной астме различной степени тяжести.

Задачи:

1. Оценить характер и степень изменения продукции ИЛ-5 в периферической крови и индуцированной мокроте у больных с бронхиальной астмой разной тяжести в периодах обострения и ремиссии, выявить закономерности и особенности регуляции продукции ИЛ-5 путем оценки экспрессии мРНК гена ИЛ-5.

2. Установить взаимосвязь экспрессии мРНК ИЛ-5, продукции ИЛ-5, ИЛ-4 и клинических проявлений у больных бронхиальной астмой в периодах обострения и ремиссии.

3. Изучить роль рецептора ИЛ-5 (а-цепь) в механизмах воспаления при астме, установить общие закономерности и особенности экспрессии сплайс-вариантов мРНК гена рецептора ИЛ-5 при бронхиальной астме.

4. Оценить механизмы участия ИЛ-4, нуклеарных факторов р53 и NF-кВ в регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и его рецептора.

5. С использованием адекватной экспериментальной модели бронхиальной астмы на морских свинках изучить особенности формирования ИЛ-5 опосредованной бронхиальной гиперреактивности.

6. Оценить влияние ИЛ-5 и растворимой изоформы рецептора ИЛ-5 (а-цепь) на апоптоз эозинофилов периферической крови больных с бронхиальной астмой разной тяжести.

7. Выявить механизмы участия рекомбинантного растворимого рецептора ИЛ-5 в регуляции аллергического воспаления на экспериментальной модели бронхиальной астмы.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное, с использованием современных молекулярно-биологических методов, исследование продукции ИЛ-5 и общих закономерностей его участия в развитии аллергического воспаления при БА с учетом тяжести заболевания и проводимой противовоспалительной терапии в клинике и эксперименте.

Получены новые доказательства взаимосвязи активности воспаления и тяжести БА с однонаправленным и стабильным нарушением продукции ИЛ-5. Показано, что повышение продукции ИЛ-5 наблюдается у больных с различной степенью тяжести БА, а степень этого повышения ассоциирована с выраженностью клинических симптомов, уровнем БГР и глубиной нарушения функции легких. Снижение уровня ИЛ-5 на фоне проводимой противовоспалительной терапии с применением ингаляционных глюкокортикостероидов и/или системных кортикостероидов сопровождается уменьшением клинических и функциональных проявлений БА. Особенностью цитокиновой регуляции у больных среднетяжелой и тяжелой астмой является сохранение повышенного уровня ИЛ-5 в периоде ремиссии после проведенной терапии.

Новыми являются данные о взаимосвязи и особенностях конечной продукции ИЛ-5 с экспрессией мРНК гена ИЛ-5, активность которой достоверно выше при тяжелой БА, чем при легкой и среднетяжелой. Не наблюдается нормализации экспрессии мРНК гена ИЛ-5 после противовоспалительной терапии у больных тяжелой БА и это ассоциировано с достоверно более высоким уровнем ИЛ-5 в данной группе больных.

Расширены представления об участии ИЛ-4 в регуляции продукции ИЛ-5 при БА. Получены новые данные о взаимосвязи уровня ИЛ-4, экспрессии мРНК гена ИЛ-5 и продукции ИЛ-5 в сыворотке крови и индуцированной мокроте больных в периоде обострения заболевания.

Приоритетными являются результаты, демонстрирующие роль нуклеарных факторов в регуляции продукции ИЛ-5 и изоформ его рецепторов. Показано, что повышение экспрессии мРНК гена в эозино-филах связано с экспрессией мРНК генов ИЛ-5, его мембраносвязанного рецептора (прямая зависимость) и с экспрессией мРНК растворимой изо-формы рецептора (обратная зависимость).

Получены новые данные об экспрессии двух сплайс-вариантов мРНК гена рецептора ИЛ-5 — мембраносвязанной (мРНК мИЛ-5Ра) и растворимой (мРНК рИЛ-5Ра) изоформ при БА. Экспрессия мРНК мИЛ-5 Ра повышена в крови и в мокроте при любой тяжести заболевания в периодах обострения и ремиссии, причем при тяжелой форме БА экспрес-

сия повышена и после лечения. Особенностью экспрессии мРНК рИЛ-5Ра является отсутствие ее достоверного увеличения в индуцированной мокроте больных тяжелой БА после применения глюкокортикостероидов, в отличие от больных легкой и среднетяжелой формами заболевания.

В целом установлено, что реализация патологических эффектов ИЛ-5 при тяжелой бронхиальной астме связана как с повышенной экспрессией мРНК мИЛ-5Ра при обострении и ремиссии, так и с относительно низкой экспрессией мРНК рИЛ-5Ра во всех периодах заболевания. Данные результаты являются приоритетными и обосновывают взаимосвязь нарушения продукции и эффектов ИЛ-5 при астме с экспрессией сплайс-вариантов изоформ рецептора ИЛ-5.

Впервые на экспериментальной модели БА получены прямые доказательства участия ИЛ-5 в формировании БГР через взаимодействие с его рецептором на гладких мышцах по эозинофил-независимому пути. Показано, что ИЛ-5 не вызывая сокращения гладких мышц самостоятельно, повышает их чувствительность к медиаторам воспаления, таким как гистамин. На эозинофилах периферической крови больных с разной тяжестью БА доказаны антиапоптотические эффекты ИЛ-5, продемонстрированы особенности антиапоптотического эффекта ИЛ-5 у пациентов с легкой/среднетяжелой и тяжелой БА.

Доказано, что рИЛ-5Ра является важным звеном регуляции конечного уровня ИЛ-5, блокирует ИЛ-5-опосредованные эффекты, такие как повышение БГР и снижение апоптоза эозинофилов. Показано, что ре-комбинантный рИЛ-5Ра может связывать как эндогенный, так и экзогенный ИЛ-5.

На основание собственных результатов, в которых установлено снижение экспрессии мРНК ИЛ-5Ра в эозинофилах пациентов с лег-кой/среднетяжелой БА, культивированных с ИЛ-5, отсутствие антиапоп-тотического эффекта ИЛ-5 на эти эозинофилы, ИЛ-5-опосредованное снижение апоптоза и отсутствие снижения экспрессии мРНК в

эозинофилах пациентов с тяжелой БА; а также опираясь на ранее проведенные исследования [Wang P. et al, 1998], демонстрирующие ИЛ-5 зависимую деградацию рецепторного комплекса ИЛ-5~мИЛ-5Ра—0с на эозинофилах и замену высокоспецифичного мИЛ-5Ра на низкоспецифичный мембраносвязанный рецептор к ИЛ-3 (мИЛ-ЗРа), нами выдвинута концепция, в которой обоснованы особенности влияния ИЛ-5 на экспрессию его рецептора по механизму отрицательной обратной связи у пациентов с различной тяжестью БА. У пациентов с легкой и среднетяжелой БА взаимодействие ИЛ-5 с его рецептором на эозинофилах результируется в активации эозинофилов, последующей деградации рецепторного комплекса и замене

высокоспецифичного мИЛ-5Ра на низкоспецифичный мем-браносвязанный рецептор к ИЛ-3 что делает приме нение

анти-ИЛ-5 терапии малоэффективным. У пациентов с тяжелой БА,

тов с тяжелой БА, вследствие повышенной экспрессии мИЛ-5Ра и (возможно) особенностей функционирования внутриклеточных сигнальных путей, взаимодействие ИЛ-5 с его рецептором не приводит к значительной замене мИЛ-5Ра на мИЛ-ЗРа на эозинофилах, причем относительно низкий уровень эндогенного рИЛ-5Ра не обеспечивает достаточную регуляцию эффектов ИЛ-5 через его элиминацию. В рамках предложенной концепции обосновано применение анти-ИЛ-5 терапии для пациентов с тяжелой Б А.

Теоретическое и практическое значение работы

В результате исследований получены новые данные о фундаментальных механизмах нарушения регуляции продукции ИЛ-5 при БА, вскрыты общие закономерности и особенности нарушений экспрессии гена ИЛ-5 и гена рецептора ИЛ-5 при различной тяжести БА, что позволяет рассматривать эти белки как специфические маркеры астмы. Установлена взаимосвязь повышения экспрессии гена ИЛ-5 и гена рецептора ИЛ-5 с клиническими проявлениями БА. Продемонстрировано участие ИЛ-4 и нуклеарных факторов в регуляции продукции ИЛ-5 и его рецептора. Получены новые данные об участии ИЛ-5 в формировании БГР по эозинофил-независимому пути и эффектах ИЛ-5 в отношении эозинофи-лов in vitro. На экспериментальной модели БА обоснована возможность использования растворимой изоформы рецептора ИЛ-5 в качестве препарата анти-ИЛ-5 терапии. Важное теоретическое значение имеет разработанная концепция применения целенаправленной патогенетической анти-ИЛ-5 терапии, основанной на использовании растворимой изоформы рецептора ИЛ-5 у пациентов с тяжелой БА. Положения, выносимые на защиту

1. Бронхиальная астма сопровождается значительным повышением уровня ИЛ-5 в крови и мокроте, которое является стабильным и сохраняется после противовоспалительного лечения с применением глюкокортикостероидов. Степень выраженности этих нарушений определяется тяжестью бронхиальной астмы и периодом заболевания.

2. Содержание ИЛ-5 в крови и мокроте при бронхиальной астме связано с экспрессией мРНК гена ИЛ-5, уровень которой выше в мокроте и при тяжелых формах бронхиальной астмы. Повышенная экспрессия мРНК гена ИЛ-5 регистрируется в периодах обострения, ремиссии и снижается под влиянием противовоспалительного лечения. Стабильно повышенная экспрессия мРНК гена ИЛ-5 является механизмом нарушения продукции ИЛ-5 при тяжелой бронхиальной астме.

3. Нарушение продукции ИЛ-5 связано с формированием основных патологических эффектов (патогенетических проявлений) бронхиальной астмы: бронхообструкции, бронхиальной гиперреактивно-

сти, нарушения апоптоза эозинофилов за счет развития воспаления. Степень патологических проявлений ассоциирована с уровнем гиперпродукции ИЛ-5.

4. Бронхиальная астма сопровождается нарушением продукции рецепторов ИЛ-5 в сторону относительного снижения образования растворимой изоформы рецептора (сплайс-вариант) и увеличения образования мембраносвязанной изоформы при обострении. Сплайс-варианты рецептора обеспечивают регуляцию эффектов ИЛ-5 по механизму обратной связи и путем связывания свободного ИЛ-5.

5. Продукция ИЛ-5 и сплайс-вариантов его рецептора находится под прямым транскрипционным контролем ядерного фактора NF-kB и ИЛ-4 (опосредованно).

6. Рекомбинантный растворимый рецептор ИЛ-5 связывает ИЛ-5 и блокирует его действие и может быть использован для разработки технологии анти-ИЛ-5-терапии тяжелой бронхиальной астмы. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, г. Курск, 2002 г.; на конференции «Functional Genomics» г. Boston, Massachusetts, США, 2002 г.; на конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск, 2003, 2004 г.; на Европейском респираторном конгрессе, г. Вена, 2003 г., г. Глазго, 2004 г.; на конференции «Актуальные проблемы морфологии», г. Красноярск, 2003 г.; на XIII национальном конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2003 г.; на Всероссийской конференции «Мембранные и молекулярные механизмы регуляции функций гладких мышц», г. Томск, 2004 г., на конгрессе «3-rd Congress of Europian Region International Union against Tuberkulosis and Lung Diseases (IUATLD)» и 13 конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2004 г.; на IV межрегиональной научно - практической конференции "Здоровье детей - наше будущее!", г. Томск, 2004 г.

Внедрение результатов исследований

Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета и кафедре биохимии и молекулярной биологии Сибирского государственного медицинского университета, а также на кафедре биофизики Сибирского государственного медицинского университета и кафедре клинической аллергологии Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Методы РТ-ПЦР ИЛ-5 и изоформ его рецептора адаптированы и внедрены в практику научных исследований Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 работ, в том числе 10 журнальных статей, из которых 8 - в журналах рекомендованных... ВАК.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 243 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, главы собственных наблюдений и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 52 рисунками и 26 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 333 работы, из которых 19 отечественных и 314 - зарубежных авторов.

Работа выполнена на базе отдела биохимии (зав. отд.- к.м.н. А.Э. Сазонов) и отдела молекулярной биологии (зав. отд. - к.м.н. И.И. Иван-чук) Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Байков), кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф.- профессор, д.м.н. Л.М. Огородова), кабинета функциональной диагностики областного детского центра клинической иммунологии-аллергологии Областной детской больницы, г. Томск (зав. каб. - И.А. Деев), Астма-центра Областной клинической больницы, г. Томск (гл. врач - к.м.н. Б.Т Серых), кафедры морфологии и общей патологии Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф.- д.м.н. И.В. Суходоло), кафедры биофизики Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф. - д.м.н. М.Б. Баскаков).

Материалы и методы исследования

Клинические исследования

В период 2000 - 2004 гг. в Областном детском центре клинической иммунологии-аллергологии Областной детской больницы и в Астма-центре Областной клинической больницы было обследовано 166 человек в возрасте от 7 до 64 лет: 30 здоровых и 136 больных БА с легкой, средне-тяжелой и тяжелой формой заболевания.

Критерии включения пациентов с бронхиальной астмой

• Амбулаторные и стационарные пациенты; о Возраст пациентов от 7 до 65 лет;

□ Положительные аллергопробы с 1 и более аэроаллергенами;

□ Пациенты, имеющие ранее подтверждённый диагноз бронхиальной астмы:

• 1 группа: лёгкая персистирующая астма (на момент включения в исследование необходимо наличие одного и более следующих признаков: симптомы чаще, чем 1 раз в неделю, но реже чем 1 раз в день; ночные симптомы чаще 2 раз в месяц, но не чаще 1 раза в неделю; вариабельность ПСВ (ОФВО 20 - 30%, при этом ОФВ^ 80% от должного и

Предварительно все обследуемые были разделены на три возрастные группы: 7-15 лет, 16 - 25 лет, и старше 25 лет. Однако при оценке основных исследуемых параметров (ИЛ-4, ИЛ-5, мРНК ИЛ-5, мРНК мИЛ-5Р и рИЛ-5Р) не было установлено межгрупповых различий по возрасту. Кроме того, по данным показателям не было выявлено различий между мужчинами и женщинами. Это позволило проводить сравнительный анализ данных только с учетом тяжести заболевания.

Таким образом все больные были распределены на 3 групп - пациенты с легкой, среднетяжелой и тяжелой БА. Практически здоровые люди составили контрольную группу. Кроме того, было выделено две подгруппы в группе пациентов с тяжелой астмой - больные с контролируемым и неконтролируемым течением заболевания.

Больные атопической БА были обследованы в период обострения (до лечения) и ремиссии (спустя 12 недель после лечения). Исследование функции легких

Оценка функциональных тестов была проведена всех группах пациентов. Для оценки выраженности обструктивной и рестриктивной дыхательной недостаточности были определены ОФВ1 и ПСВ с помощью пикфлуометрии. Исследование проводилось утром, использовались 3 попытки, регистрировалась наилучшая. Для оценки уровня неспецифической бронхиальной гиперреактивности проводилась метахолиновая проба (РС2о). Функцию легких оценивали с использованием спирографа MasterScope (Erich Jaeger GMBH, Германия)

Получение индуцированной мокроты и периферической крови Индуцированную мокроту получали после ингаляции 3-5% гипертонического солевого раствора в течение 5-30 мин по методике в модификации Попова Образцы мокроты объемом до 2 мл собирали в пластиковые контейнеры, помещали в лед и в течении двух часов замораживали при температуре - 70 С° для предотвращения разрушения белка ИЛ-5, с последующей обработкой «Муколизином» (раствор дитиотритиола, Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва) согласно приложенной инструкции и в дальнейшем отбирали по 200 мкл суспензии клеток для проведения иммуноферментного анализа.

Периферическую (венозную) кровь забирали из локтевой вены утром, натощак в стерильную пробирку, содержащую 2,5 мл 3% раствора ЭДТА, в объеме 10 мл.

Определение абсолютного и относительного содержания эозинофилов в мокроте и периферической крови Относительное и абсолютное содержание эозинофилов определяли общепринятыми методами [Новицкий В., 1999].

Определение неспецифического IgE в сыворотке крови Определение неспецифического в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью стандартного

одной пробирке «в один шаг»). Такая реакция основана на принципе совместного использования AMV ревертазы и Taq ДНК полимеразы. Метод позволяет выполнить амплификацию фрагментов размером до 2 т.п.о. с минимумом ошибок. Система Titan One Tube RT-PCR предназначена для чувствительного, быстрого и воспроизводимого анализа РНК с высокой точностью.

Праймеры для мРНК рИЛ-5Ра (S1) являются универсальными как для S1, так и для S2 сплайс-вариантов мРНК ИЛ-5Ра, что позволяет оценить общий пун мРНК растворимой изоформы рецептора. Праймеры для мРНК рИЛ-5Ра (S2) специфичны только для этого сплайс-варианта мРНК рецептора. Для оценки экспрессии мРНК S1 и S2 изоформ по отдельности из результатов экспрессии рИЛ-5Ра (S1) вычитали результаты экспрессии рИЛ-5Рсс (S2).

Для каждой пары праймеров подбиралась соответствующая концентрация Mg и программа амплификации. Экспрессию мРНК оценивали полуколичественно в сравнении с экспрессией мРНК глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФД). Ген этого фермента относится к постоянно экспрессирующим (house keeping) генам, экспрессия этого гена является стабильной и постоянной во всех клетках организма. Степень экспрессии мРНК выражали в процентах.

Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 2% агарозном геле. Изображения электрофореграмм получали с использованием стационарной видеосистемы и обрабатывали при помощи адаптированной компьютерной программы «Biotest D» с целью получения количественной информации по каждой пробе. Предварительно сфотографированный гель корректировали с помощью встроенных опций для получения максимально четкого изображения. Основной характеристикой был параметр «интегральной светимости», который выражался количественно. При этом определение области светимости пробы происходило полуавтоматически, то есть достаточно было пометить курсором приблизительно середину светлого пятна на изображении. В каждой серии экспериментов результат оценки экспрессии мРНК ГАФД принимали в качестве эталонной пробы, а количественное значение - за 100%. Количественные значения остальных пробы в серии экспериментов оценивали относительно эталонной пробы и выражали в процентах.

Все праймеры были синтезированы к.м.н. Иванчуком И.И. (Центральная научно-исследовательская лаборатория Сибирского государственного медицинского университета) на автоматическом ДНК-синтезаторе («Биосет», Новосибирск).

Выделение эозинофилов из периферической крови

Выделение эозинофилов проводили на трех градиентах плотности фиколла (молекулярная масса 400000) и 35% раствора урографина: 1,082, 1,092 и 1,115 г/см3. Клетки над выбранными градиентами плотности

(1,115 - эозинофилы нормальной плотности; 1,092 - эозинофилы высокой плотности) собирали пипеткой в центрифужную пробирку и дважды отмывали раствором Хенкса.

Оценка жизнеспособности клеток (с трипановым синим)

Для определения числа эозинофилов в суспензии и их жизнеспособности использовали 1% раствор трипанового синего на изотоническом растворе хлорида натрия. Подсчет клеток производили в камере Горяева по формуле Х=К*А*104, где К-разведение, А-количество клеток в 25 больших квадратах камеры Горяева. В присутствии трипанового синего окрашивались только погибшие клетки. Окрашивание клеток трипановым синим является признаком необратимого повреждения плазматической мембраны.

Оценка содержания фрагментированной ДНК клеток

периферической крови

Данный метод использовался для качественной оценки апоптоти-ческой гибели клеток.

Клетки ресуспендировали в 20 мл изотонического лизируюгцего буфера, содержащего 100 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 1.5 мМ MgCl2, с добавлением 0,15 % NP-40. После инкубации на льду в течении 30 мин лизат центрифугировали при 200g до осаждения ядер. Ядра смешивали с 150 мМ NaCI, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5 и ресуспендировали в конечном объеме 1 мл того же буфера.

Изолированные ядра центрифугировали при 200g 10 мин. Супер-натант сохраняли. Осадок дополнительно лизировали в 0,5 мл ТТЕ (10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 1 мМ EDTA, рН 8,0, 0,2 % Triton Х-100) и интенсивно встряхивали на вортексе в течение 30 сек. Фрагментированная ДНК отделялась от интактного хроматина центрифугированием при 12000g в течение 20 мин и 4 °С. Супернатант собирался и сохранялся, осадок ресуспендировали в 0,5 мл того же раствора. Преципитацию ДНК проводили в изопропаноле при -20 °С в течение ночи. Содержание ДНК в осадке и супернатанте было оценено на спекрофотометре СЭФ-56 при длине волны 260,280, 320 нм. Процент фрагментированной ДНК определяли отношением количества ДНК в супернатанте к общему количеству ДНК (осадок и супернатант).

Цитоморфологический анализ апоптотической гибели клеток

Морфологический анализ апоптотической гибели клеток проводили на препаратах, приготовленных из культуральной клеточной суспензии и мокроты больных БА по общепринятой методике. Мазки окрашивали по Нохта-Максимову (азур П-эозин). Анализ препаратов проводился на микроскопе «БИОЛАМ» (Россия) при увеличении об. 90 х ок. 10. При анализе использовали критерии, характеризующие кариопатологические

и цитопатологические изменения в клетках. Подсчитывали не менее 200 клеток.

Метод индукции апоптотической гибели

Данный метод использовали для индукции аоптотической гибели эозинофилов при 24-х часовой инкубации.

Состав культуральной среды: среда №199, 10% эмбриональная бычья сыворотка, 100 ЕД/мл пенициллина. Клетки (суспензия эозиофи-лов) ресуспендировали культуральной средой в количестве 150 микролитров, определяли клеточность и жизнеспособность и помещали в лунки 96-ячеистой микропланшеты. Инкубировали при 37°С в течение 6-24 часов. Мазки готовили через 6 часов и 24 часа культивирования клеток. Перед каждым приготовлением мазка среду с клетками ресуспендировали путем пипетирования. Для индукции апоптотической гибели использовали синтетический аналог глюкокортикоидных гормонов - дексаметазон. Дексаметазон добавляли в культуры клеток в концентрациях 0,1 и 1 ммоль. Учет апоптотической гибели проводили всеми вышеперечисленными методами.

Получение модели бронхиальной астмы на морских свинках

В данной работе использован принцип моделирования астматического приступа у экспериментальных животных, основанный на их сенсибилизации овальбумином.

В работе были использованы экспериментальные животные - половозрелые морские свинки-самцы весом 200-400 г. 12 морских свинок составили экспериментальную группу и 8 животных - контрольную. Животные экспериментальной группы были сенсибилизированы трехкратно подкожными инъекциями 0,1 мл на 100 г. массы тела животного 0,25% взвеси овальбумина в физиологическом растворе (промежуток между инъекциями 3-4 дня). На 21 день животных подвергали ингаляционному воздействию аэрозоля той же взвеси. Ингаляции выполняли с помощью ультразвукового небулайзера «Муссон-1М» с размером дисперсных частиц до 5 мкм. Контролем служили интактные животные.

По окончании ингаляции животных умерщвляли без применения наркоза методом цервикальной дислокации, вскрывали грудную клетку и выделяли легкие. Легкие помещали в резервуар с раствором Кребса при комнатной температуре (20-25 °С), после чего трахею и главные бронхи отделяли от окружающей ткани.

Для гистоморфологического исследования был получен гистологический материал - фрагменты главных бронхов, среднедолевых бронхов и мелких бронхиол с участками легочной паренхимы (по три образца от каждого животного).

Для изучения сократительной активности были приготовлены кольцевые сегменты бронхов длиной 2-3 мм. В эксперименте были использованы эпителизированные и деэпителизированные сегменты брон-

хов. Эпителий удалялся механически, вращением деревянного шпателя в просвете сегмента в течение 1 мин.

Гистологическое исследование слизистой оболочки бронхиальной стенки

Для подтверждения адекватности полученной модели БА было проведено гистологическое исследование слизистой оболочки бронхиальной стенки. Материал слизистой оболочки бронхов был фиксирован в 10-12% нейтральном растворе формалина при 18-20° в течение 24-48 часов, промыт в проточной воде в течение 24 часов, после чего был обезвожен в спиртах возрастающей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 96%, абс I, абс II). Далее материал был залит в парафин.

Из парафиновых блоков были сделаны срезы толщиной 5-7 мкм. Для проведения обзорной микроскопии слизистой оболочки бронхов микропрепараты были окрашены гематоксилином и эозином.

Окраска гистологических препаратов гематоксилином-эозином

Принцип метода заключался в том, что ядра клеток обладают сродством к основному красителю гематоксилину, а цитоплазма - к кислому красителю эозину.

Окраска гистологических препаратов пикрофуксином по Ван-Гизону

Для исследования коллагеновых волокон соединительной ткани срезы окрашивались. Принцип метода заключается в том, что коллагено-вые волокна воспринимают пикрофуксин и окрашиваются в ярко розовый цвет, а ядра клеток в черный цвет.

Окраска гистологических препаратов основным коричневым и прочным зеленым

Исследование морфологии тканевых базофилов и эозинофилов проводили с помощью сочетанной окраски гистологических препаратов основным коричневым и прочным зеленым. Принцип метода заключается в том, что в основной среде (рН=8,7) катионные белки эозинофилов способны образовывать стойкие соединения с прочным зеленым окрашиваясь в темно-зеленый цвет, а гранулы тучных клеток с основным коричневым с формированием темно-желтых гранул.

Окраска гистологических препаратов по Браше Для выявления интенсивности пролиферативных процессов в слизистой оболочке бронхов использовали дифференциальный метод окраски ДНК и РНК по Браше.

Морфометрическое исследование слизистой оболочки бронхов При обзорной световой микроскопии при увеличении в 200 раз оценивали патологические изменения в слизистой оболочке бронхов (воспалительные и склеротические процессы). Количественный подсчет

морфометрических параметров производился с использованием графического редактора Adobe PhotoShop 5.5.

Подсчет объемной плотности исследуемых параметров осуществляли при увеличении в 400 раз методом точечного счета с использованием сетки Автандилова. С помощью сетки на 100 точек подсчитывали объемную плотность (Vve, мм 2/мм2) всех оболочек бронха, слизистой (Уусл. мм2/мм2), волокнисто-хрящевой оболочки (Vv,x. мм2/мм2), соединительной ткани (Wc. мм2/мм2). На гистолошческом препарате подсчитывали высоту эпителиального пласта , толщину железистого слоя

мм). Кроме того, при увеличении в 1500 раз учитывали плотность клеточного инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки путем количественного подсчета нейтрофилов, лимфоцитов, плазмоцитов, в 1 мм2. Эозинофилы и тучные клетки оценивали по данным сочетанной окраски. В популяциях тканевых базофилов и эозинофилов определяли количество недегранулированных (1гип) и дегранулированных (II тип) клеток.

Исследование сократительной активности (механического

напряжения) гладкомышечных сегментов

Исследование сократительной активности (механического напряжения) гладкомышечных сегментов проводили с помощью метода меха-нографии в условиях, близких к изометрическим. Установка, с помощью которой исследовали сократительную активность, изготовлена на опытно - экспериментальном производстве Сибирского физико-технического института по специальному заказу.

Эффекты биологически активных веществ оценивали в процентах от амплитуды контрольного сокращения сегментов, принимаемую за 100%, на стандартную концентрацию КС1, которая составляла 40 мМ. По результатам тестирования строили кривые "доза-эффект". Вклад эпителия определялся путем сопоставления сократительных реакции интактных и деэпителизированных сегментов легочной артерии.

В деэпителизированных сегментах оценивали экспрессию мРНК рецептора к ИЛ-5.

Статистическая обработка результатов

Математические расчеты проводили с помощью пакета программ "Statistica for Windows 5.0". Вычисляли среднее арифметическое значение (М), стандартное отклонение медиану (Me) и квартели (25%-75%). Выявление межгрупповых различий проводили по критерию Крускала-Уоллеса с применением поправки Бонферони. В связи с тем, что распределение полученных цифровых данных не соответствовало нормальному, использовали непараметрический U-критерий Манн-Уитни для независимых совокупностей. Для оценки различий зависимых совокупностей использовали парный критерий Вилкоксона. Для выявления наиболее зна-

чимых показателей, по которым наблюдались межгрупповые различия был проведен пошаговый дискриминантный анализ. Для выявления зависимости между группами факторов был проведен регрессионный анализ. Для выявления корреляционных связей в полученных данных использовался коэффициент корреляции рангов Спирмена. Изменения считались значимыми при достоверности р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Клинико-функциональная характеристика больных

бронхиальной астмой

Клинические и параклинические исследования были выполнены во всех группах пациентов (больные с легкой, среднетяжелой и тяжелой БА). Оценка функциональных тестов (ОФВь ПСВ, РС20,) была проведена для верификации диагноза БА и оценки эффективности лечения. Было установлено, что терапия ингаляционными кортикостероидами оказалась эффективной во всех группах и привела к значительной динамике оценивавшихся показателей терапии.

Помимо проведения функциональных тестов у пациентов было определено абсолютное и относительное содержание эозинофилов в мокроте и в периферической крови. Динамика изменения абсолютного и относительного содержания эозинофилов в целом совпадала, поэтому при анализе результатов был использован показатель относительного содержания эозинофилов. Как и в случае оценки функции внешнего дыхания, лечение привело к снижению уровня эозинофилов в индуцированной мокроте и периферической крови. Интересно, что в периферической крови больных тяжелой БА уровень эозинофилов был достоверно выше, чем при легкой и среднетяжелой БА (до лечения при сравнении тяжелой и легкой астмы р=0,028; при сравнении тяжелой и среднетяжелой астмы р=0,014; после лечения при сравнении тяжелой и легкой р=0,005; при сравнении тяжелой и среднетяжелой астмы р=0,002), тогда как в мокроте этого не наблюдалось. Различий по этим показателям между легкой и среднетяжелой астмой не установлено.

При оценке уровня общего 1§Е у больных БА установлено, что данный признак, в первую очередь, отражает патогенетическую структуру заболевания в представленной выборке пациентов. Статистически значимые отличия между больными экзогенным и эндогенным вариантами болезни отмечены по уровню общего 1§Е (272,2+13,6 МЕ/мл и 134,3+13,5 МЕ/мл соответственно).

Значения общего ^Е у больных БА (легкая форма - 233,0+17,9 МЕ/мл; среднетяжелая - 198,5+12,7 МЕ/мл; тяжелая - 252,6+10,3 МЕ/мл) достоверно превышали уровень указанного показателя у представителей группы контроля (47,2+4,7 МЕ/мл). Не было выявлено достоверных различий в группах с различной степенью тяжести заболевания.

Оценка содержания ИЛ-5 в мокроте и сыворотке крови

больных бронхиальной астмой

Многие отличительные черты воспаления при БА связаны с эф-фекторными функциями ТЬ2-цитокинов (таких как ИЛ-4, -5, -9, -10 и -13). ИЛ-5 способен регулировать функцию Тп2-клеток самостоятельно и опосредованно, через эозинофилы, таким образом, влияя на продукцию других цитокинов [Mattes J., Foster P. S., 2003]. Основная функция ИЛ-5 -обеспечение пролиферации, дифференцировки, активации и увеличение жизнеспособности эозинофилов.

Была проведена оценка этого цитокина в периодах обострения и ремиссии в трех группах пациентов с различной тяжестью БА и в контрольной группе (как было показано выше, оценка функциональных показателей с достаточной степенью достоверности позволяет верифицировать состояния обострения и ремиссии у больных). Для определения конечной продукции ИЛ-5 был использован ИФА. Дополнительно оценивалась экспрессия мРНК ИЛ-5 методом РТ-ПЦР. Результаты этого фрагмента исследования представлены в табл. 1.

В периферической крови и в мокроте было выявлено достоверное повышение уровня ИЛ-5 у всех пациентов по сравнению с контрольной группой, как при обострении, так и в ремиссии, что позволяет рассматривать определение этого цитокина, как специфический показатель, характеризующий БА. Единственным исключением оказались результаты, полученные в сыворотке крови больных легкой БА в стадии ремиссии. В этом случае достоверных различий с контролем не обнаружено (р=0,277). При этом уровень ИЛ-5 в сыворотке крови этих больных был достоверно ниже, чем в сыворотке крови пациентов с тяжелой Б А.

Конечный уровень ИЛ-5 во многом определяется экспрессией гена этого цитокина, которая верифицируется количеством вновь образованной мРНК ИЛ-5. Образование пептида на мРНК зависит от ряда факторов, но уровень зрелой мРНК в значительной степени формирует пул белка, который через систему эндоплазматического ретикулума экстрагируется во внеклеточное пространство. В ряде работ зарубежных авторов [Humbert M., et al, 1997; Minsall E. M., et al, 1998; Frieri, M., et al, 2003] оценка степени экспрессии мРНК этого цитокина используется в качестве дополнительной характеристики продукции ИЛ-5.

В периферической крови этот показатель был повышен только у пациентов тяжелой БА (в обострении и ремиссии). Повышенная экспрессия мРНК этого цитокина в мокроте (по сравнению с контролем) обнаруживалась у всех пациентов в обострении, в ремиссии - только у больных с тяжелой БА. При этом достоверное снижение экспрессии мРНК на фоне лечения зафиксировано во всех трех группах пациентов.

Таблица 1

Уровень ИЛ-5 и экспрессия мРНК ИЛ-5 в сыворотке крови и мокроте у пациентов с бронхиальной астмой различ-ной степени тяжести в периодах обострения и ремиссии, Ме (25% - 75%)_

Показатели Период Пациенты с бронхиальной астмой различной степени тяжести Контроль (п=30)

Легкая (п=22) Р Р* Среднетя-желая (п=17) Р Р* Тяжелая (п=85) Р Р*

ИЛ-5, пг/мл (периферическая кровь) О 92,5 (55-109) 0,093 р'<0,001 62 (30-123) 0,173 p^O.OOl 110,5 (90,5-145) 0,014 р1<0,001 28,0 (0-40)

Р 20 (6-62) р3=0,041 30 (20-70) р'=0,014 72 (69-132) р'<0,001

ИЛ-5, пг/мл (мокрота) О 220 (98-315) 0,028 р'<0,001 190 (48-480) 0,047 р1 =0,004 420 (130-690) 0,001 р1 =0,006 35,0 (10-53)

Р 79 (32-20) р1 =0,007 174,5 (30-240) р1 =0,033 123,5 (0-430) р1 =0,053

мРНК ИЛ-5, % (периферическая кровь) О 22 (18-25) 0,370 р3<0,001 21 (15-28) 0,276 р3<0,001 120 (110-128) <0,001 р'<0,001 18,0 (10-25)

Р 19 (16-21) р3<0,001 19 (17-25) р3 <0,001 54 (48-56) р'<0,001

мРНК ИЛ-5, % (мокрота) О 67 (40-73) 0,005 р'<0,001 р3<0,001 69 (69-75) 0,011 р'<0,001 р3<0,001 145 (100-157) <0,001 р'<0,001 22,0 (18-27)

Р 27 (22-32) р3<0,001 25 (24-32) р3=0,006 56 (48-62) р'<0,001

Примечание: О - обострение, Р - ремиссия, п - количество обследованных пациентов, р - достоверность различий при сравнении показателей, полученных в обострении и ремиссии; р*- достоверность различий при сравнении показателей между исследуемыми группами (р1 - с контролем, р3 - с тяжелой бронхиальной астмой, р* указан только для статистически значимых различий).

Сравнивая уровень экспрессии мРНК ИЛ-5 в периферической крови и мокроте можно сделать заключение о тканеспецифичной экспрессии мРНК в воздухоносных путях у больных БА. Это подтверждается отсутствием значимых изменений экспрессии мРНК ИЛ-5 в периферической крови больных легкой/среднетяжелой БА с одной стороны, и достоверно более высокой экспрессией мРНК ИЛ-5 в мокроте в сравнении с кровью с другой стороны. Особенностью экспрессии мРНК ИЛ-5 при БА является значительно более высокая ее степень у пациентов с тяжелой астмой, которая достоверно превышает контрольные значения и значения при легкой и среднетяжелой БА при определении в периферической крови и мокроте.

Оценка содержания ИЛ-4 в мокроте и сыворотке крови

больных бронхиальной астмой и его участие в регуляции

продукции ИЛ-5

ИЛ-4 может быть критическим звеном в патофизиологии астмы в связи с уникальной функцией регуляции баланса в сторону ТЬ2 клеток [Wierenga, Е., й а1, 1990; Ма^ Е., й а1, 1992]. Кроме того, данный цито-кин активирует продукцию ^Е, участвует в других патологических процессах при БА [ВгсМе Б. Н. 2001]. В частности ИЛ-4 модулирует продукцию ИЛ-5 ТЬ2 лимфоцитами. С этой точки зрения оценка общих закономерностей изменчивости уровня ИЛ-4 представляет интерес для понимания механизмов регуляции продукции ИЛ-5. Уровень ИЛ-4 был изучен у пациентов с различной тяжестью БА в периодах обострения и ремиссии, а также в контрольной группе (табл. 2).

Прежде всего, необходимо отметить значительные колебания уровня ИЛ-4 в периферической крови всех пациентов с БА. Однако уровень ИЛ-4 периферической крови при обострении и ремиссии был выше контрольных значений у всех больных БА, что позволяет использовать указанный показатель (как и ИЛ-5) в качестве дополнительного маркера астмы. В периоде обострения БА различий между группами пациентов с тяжелой/ среднетяжелой/ легкой астмой не наблюдалось стадии ремиссии фиксируемый в периферической крови уровень ИЛ-4 у пациентов с легкой астмой оказался ниже, чем у пациентов с тяжелой и среднетяжелой астмой, но при этом оставался выше контрольных значений. При обострении БА, уровень ИЛ-4 в мокроте был выше, чем в контроле у всех больных, тогда как в периоде ремиссии - только у тяжелых пациентов. В зависимости от проведенного лечения в группе пациентов с легкой БА этот показатель достоверно снижался как в периферической крови, так и в мокроте. У среднетяжелых пациентов количество ИЛ-4 было достоверно меньшим в ремиссии, чем в обострении, но только при исследовании мокроты. В группе пациентов с тяжелой БА достоверных различий по уровню ИЛ-4 между обострением и ремиссией не установлено.

23

Таблица 2

Уровень ИЛ-4 в сыворотке крови и мокроте у пациентов с бронхиальной астмой различной степени тяжести в пе-

риодах обострения и ремиссии, Ме (25% - 75%)

Показатели Период Пациенты с бронхиальной астмой различной степени тяжести Контроль (п=30)

Легкая (п=22) Р Р* Среднетя-желая (п=17) Р Р* Тяжелая (п=85) Р Р*

ИЛ-4, пг/мл (периферическая кровь) О 214 (120-518) 0,018 р^О.004 440 (379-460) 0,011 р]<0,001 346 (260-670) 0,962 р'<0,001 19,0 (5-35)

Р 70 (20-140) р'=0,004 р2=0,023 р3=0,001 210 (128-290) р1 <0,001 345 (232-710) р1 <0,001

ИЛ-4, пг/мл (мокрота) О 192 (125-415) 0,017 р'^ООб 415 (214-760) 0,008 р'=0,001 215 (150-863) 0,653 р'=0,003 65,0 (20-100)

Р 125 (25-197) р3=0,003 170 (70-312) р*=0,008 695 (444-735) р'<0,001

Примечание: О — обострение, Р — ремиссия, п — количество обследованных пациентов, р - достоверность различий при сравнении по-

казателей, полученных в обострении и ремиссии; р*- достоверность различий при сравнении показателей между исследуемыми группами (р1 - с контролем, рг - со среднетяжелой бронхиальной астмой, р3 - с тяжелой бронхиальной астмой, р* указан только для статистически значимых различий).

Проведенный регрессионный анализ показал, что в обострении уровень ИЛ-5 периферической крови взаимосвязан с содержанием ИЛ-4 (Р=0,51, р=0,006, р'=0,003, где Р - коэффициент регрессии, р - достоверность для коэффициента регрессии р, р - достоверность для уравнения регрессии). В мокроте конечный уровень ИЛ-5 также ассоциирован с влиянием ИЛ-4, но преимущественно в стадию ремиссии ¡$=0,68, р=0,050, р'=0,015).

Анализ взаимосвязи продукции ИЛ-5 и ИЛ-4 с изменением функции легких при бронхиальной астме

Для выявления наиболее значимых факторов, формирующих межгрупповые различия больных БА был выполнен дискриминантный анализ, который позволил установить отсутствие различий между легкой и среднетяжелой астмой по показателям, характеризующим продукцию ИЛ-4 и ИЛ-5 (оценка конечного уровня цитокинов методом ИФА и определение степени экспрессии мРНК методом РТ-ПЦР): показатели уравнения ЛДФ - Лямбда Уилкса=0,56; F=3,9; р=0,10З. В то же время между тяжелой БА и среднетяжелой/легкой БА основные дискриминирующие переменные были найдены. На рис. 1 видно, что значения дискриминирующей функции для БА тяжелой степени составляют одну группу, а для легкой и среднетяжелой БА — другую. Основной и практически единственной дискриминирующей переменной в периоде обострения оказался уровень экспрессии мРНК ИЛ-5, определяемый в периферической крови методом ПЦР.

Корень 1 - : Корень 1

Рис. 1. Распределение значений дискриминантной функции при сравнении показателей продукции ИЛ-5, ИЛ-4 и экспрессии мРНК ИЛ-5 у пациентов с бронхиальной астмой различной степени тяжести в обострении (А) и ремиссии (В); ЛА - легкая астма, СА - среднетяжелая астма, ТА -тяжелая астма

Обращает внимание высокий уровень классификации, достигающий 100%. Это свидетельствует о высоком качестве дискриминантной

модели и достаточно большом различии между группой пациентов с тяжелой БА и другими группами, а также демонстрирует определяющий вклад показателя экспрессии мРНК ИЛ-5 в формирование тяжести заболевания. Интересно, что в периоде ремиссии основным дискриминирующим фактором становится уровень экспрессии мРНК ИЛ-5, определяемый в мокроте. То есть если на системном уровне лечение приводит к тому, что этот показатель становится менее важным, на местном уровне (в дыхательных путях) экспрессия мРНК ИЛ-5 продолжает участвовать в формировании межгрупповых различий.

В дальнейшем для всех пациентов (без разделения на группы) был проведен анализ зависимости между наиболее важными параметрами, ха-растеризующими функцию внешнего дыхания, по которым отличались больные БА с различной степенью тяжести (ОФВь ПСВ) и показателями продукции интерлейкинов. Получена обратная зависимость параметров внешнего дыхания от продукции изучаемых цитокинов, причем наиболее значимая корреляция установлена с показателем степени экспрессии мРНК ИЛ-5.

Таким образом, все исследуемые цитокины связаны с изменением функциональных показателей легких и участвуют в формировании межгрупповых различий. Причем с увеличением продукции цитокинов данные функциональных тестов ухудшаются, что свидетельствует об их участии в воспалительном процессе дыхательных путей, который характеризуется бронхиальной обструкцией и гиперреактивностью бронхов.

Оценка уровня мРНК нуклеарных факторов р53 и NF-кВ В

эозинофилах при бронхиальной астме

Одним из наиболее важных белков, обеспечивающих регуляцию работы генома любой клетки, является продукт гена р53, который относится к транскрипционным факторам и участвует в реализации программы клеточной гибели. Этот фактор взаимодействует с целым рядом других нуклеарных факторов, активируя или ингибируя их. Известно, что существует взаимосвязь между активностью р53 и активностью транскрипционного фактора КБ-кВ. КБ-кВ является ключевым в патогенезе БА, поскольку его активация приводит к увеличению продукции широкого спектра провоспалительных цитокинов к которым относится и ИЛ-5 [СШ$1тап I. е! а1, 2000]. Высокая клиническая эффективность глюко-кортикостероидов при БА связана с их способностью угнетать активность ядерного фактора кВ и тем самым приводить к снижению экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ-4.

В рамках данной работы (совместно с к.м.н. И.И. Иванчуком, отдел молекулярной биологии, Центральная научно-исследовательская лаборатория Сибирского государственного медицинского университета) была проведена оценка уровня экспрессии мРНК нуклеарных факторов р53 и КБ-кВ в эозинофилах, выделенных из периферической крови боль-

ных БА разной степени тяжести. Установлено, что до лечения (в периоде обострения) у пациентов легкой и среднетяжелой астмой экспрессия мРНК р53 в эозинофилах периферической крови была ниже, чем в контроле, но выше, чем у пациентов с тяжелой БА (табл. 3).

В стадии ремиссии у больных с легкой астмой этот показатель достоверно повысился по сравнению с обострением и практически не отличался от контрольных значений.

Таблица 3

Экспрессия мРНК р53 и NF-kB в эозинофилах периферической крови у пациентов с бронхиальной астмой различной степени тяжести в периодах обострения и ремиссии, M(s)

Пациенты с раз- Показатели

личной степенью р53, %

тяжести Обострение Ремиссия Обострение Ремиссия

Легкая астма (п=30) 2,7±0,22 р3=0,02 Р1 <0,001 3,62±0,47 р3<0,001 р*<0,001 21,6±0,58 р2= 0,009 р3<0,001 22,1 ±0,54

Среднетяжелая астма (п=42) 2,76±0,2 р3<0,01 Р1 <0,001 3,35±0,4 р3<0,001 24,2*0,53 р3<0,005 р'<0,001 21,3*0,63

Тяжелая астма (п=58) 2,06±0,18 р'<0,001 1,84±0,34 р]<0,001 27,6*0,39 р'<0,001 23,8±0,31 р'=0,02 р*<0,001

Контроль, Гп=30> 4,22±0,20 19,8±0,40

Примечание: п - количество обследованных пациентов, р - достоверность различий при сравнении показателей между исследуемыми группами (р1 - с контролем, рг - со среднетяжелой бронхиальной астмой, р3 - с тяжелой бронхиальной астмой, р" - достоверность различий при сравнении показателей, полученных в обострении и ремиссии.

У пациентов со среднетяжелой БА на фоне лечения наблюдалась лишь тенденция к повышению уровня мРНК р53, при этом в стадии ремиссии достоверных различий с контрольными значениями не было. У больных тяжелой астмой лечение не привело к изменению экспрессии мРНК р53, поэтому и в стадии ремиссии у этих пациентов уровень мРНК р53 был значительно ниже, чем у больных легкой и среднетяжелой БА.

Экспрессия мРНК нуклеарного факторакВ возрастала прямо пр о-порционально тяжести заболевания. Причем в обострении этот показатель был выше, чем в контроле во всех группах пациентов, за исключением больных легкой БА. На фоне лечения уровень мРНК NF-kB достоверно снизился только в группе тяжелой БА, но он оставался повышенным по сравнению с контрольными значениями и в стадии ремиссии. Кроме того, была установлена выраженная положительная корреляция между

экспрессией мРНК ИЛ-5 в периферической крови и экспрессией мРНК NF-kB в эозинофилах периферической крови больных Б A (R=0,51; р<0,001),, Эта взаимосвязь наблюдалась только в период обострения

Характеристика экспрессии мРНК рецептора ИЛ-5 (а- субъединица) в мокроте и сыворотке крови больных бронхиальной астмой

В настоящее время по данным NCBI существует семь известных последовательностей мРНК сс-субъединицы рецептора ИЛ-5. Четыре из них кодируют растворимую изоформу рецептора, три - мембраносвязан-ную. В представленном исследовании праймеры для РТ-ПЦР были подобраны таким образом, что одна пара праймеров была специфична для мРНК всех растворимых изоформ, а другая пара праймеров - для мРНК всех мембраносвязанных. В мокроте и сыворотке больных БА было проведено исследование уровня мРНК сплайс-вариантов а- субъединицы рецептора ИЛ-5, мембраносвязанной изоформы (мИЛ-5Ра) и растворимой изоформы (рИЛ-5Ра) (табл. 4).

Во всех исследуемых случаях обнаружена повышенная экспрессия рецептора по сравнению с контролем, исключение составила экспрессия мРНК рИЛ-5Ра в мокроте больных тяжелой астмой, которая была ниже, чем у легких и среднетяжелых пациентов в периоде обострения. После лечения эта разница стала еще более значимой за счет увеличения уровня мРНК рИЛ-5Ра у больных легкой и среднетяжелой БА. В периферической крови больных легкой и среднетяжелой БА в стадии обострения экспрессия растворимой изоформы рецептора была выше, чем у тяжелых больных. В стадии ремиссии различия сохранялись, но повышенная экспрессия была определена и у тяжелых больных. Уровень экспрессии мем-браносвязанной изоформы рецептора у больных тяжелой БА во всех случаях был выше, чем у больных легкой и среднетяжелой БА.

Динамика мРНК изоформ рецептора на фоне лечения различалась в зависимости от изучаемого материала. Так, в ремиссию в периферической крови у больных легкой БА экспрессия мРНК растворимой изофор-мы снижалась, у больных среднетяжелой астмой - не изменялась, тяжелой БА - повышалась. В мокроте всех пациентов с БА значения этого показателя только повышались.

Экспрессия мРНК мембраносвязанной изоформы рецептора после проведенного лечения повышалась в периферической крови и не изменялась в мокроте при легкой БА, снижалась в периферической крови и повышалась в мокроте при тяжелой БА. При среднетяжелой БА изменений не зафиксировано.

В целом после лечения наблюдалось повышение экспрессии мРНК растворимой изоформы рецептора (особенно в мокроте) на фоне незначительной динамики экспрессии мРНК мембраносвязанной изоформы.

Таблица 4

Экспрессия мРНК мембраносвязанной изоформы а-субъединицы рецептора ИЛ-5 (мИЛ-5Ра), растворимой изо-формы а-субъединицы рецептора ИЛ-5 (рИЛ-5Ра) в сыворотке крови и мокроте у пациентов с бронхиальной астмой различной степени тяжести в периодах обострения и ремиссии, Мф__

Показатели Период Пациенты с бронхиальной астмой различной степени тяжести Контроль (п=30)

Легкая (п=22) Р Р* Среднетя-желая (п=17) Р Р* Тяжелая (п=85) Р Р*

мРНК рИЛ-5Ра, % (периферическая кровь) О 32,14*4,08 0,001 р'=0,002 р3<0,001 31,18±13,09 0,615 р'=0,003 р'<0,001 18,69*17,30 <0,001 р1=0,004 7,55*3,41

Р 27,77*5,50 р'=о,оо2 р3<0,001 30,63*9,28 р1 =0,002 р3<0,001 39,58*9,31 р'=0,001

мРНК рИЛ-5Рсц % (мокрота) О 28,25*9,21 0,017 р1=0,021 р3=0,001 25,11*7,91 0,008 р'=0,038 р3=0,005 1833*5,92 0,001 ' - 16,67*6,02

Р 39,50*6,76 р'=0,007 р3<0,001 39,00*634 р*=0,005 р3<0,001 21,61*8,48 -

мРНК мИЛ-5Ра,% (периферическая кровь) о 18,90*5,11 0,001 р]=0,002 р3<0,001 26,44*17,29 0,605 р'=0,003 р3<0,001 71,31*23,96 <0,001 р'=0,001 4,55*2,62

р 23,36*2,70 р'=0,002 р3<0,001 25,69*4,06 р'=0,002 р3<0,001 54,55*14,43 р'=0,001

мРНК мИЛ-5Ра, % (мокрота) о 35,00*7,82 >0,05 р]=0,007 р3=0,011 32,89*8,55 0,678 р'=0,005 р3=0,002 44,05*10,67 0,001 р1=0,001 14,56*4,36

р 32,25*9,07 р'=0,011 р3=0,003 32,44*8,68 р'=0,005 р3=0,001 48,48*12,77 р'=0,001

Примечание: О - обострение, Р - ремиссия, п - количество обследованных пациентов, р - достоверность различий при сравнении показателей, полученных в обострении и ремиссии; р*- достоверность различий при сравнении показателей между исследуемыми группами (р1 - с контролем, р3 - с тяжелой бронхиальной астмой, р* указан только для статистически значимых различий), - - достоверные различия отсутствуют.

Было рассчитано соотношение показателей степени экспрессии мРНК мИЛ-5Ра И мРНК рИЛ-5Ра. В периферической крови отношение уровня мРНК мИЛ-5Ра К мРНК рИЛ-5Ра в обострении составило для пациентов с легкой БА 0,6; для пациентов со среднетяжелой БА - 0,85; для пациентов с тяжелой БА - 3,8, тогда как в контрольной группе это отношение равнялось 0,6. В ремиссии это соотношение определенным образом изменилось и составило 0,84; 0,83; 1,38 соответственно для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА.

В индуцированной мокроте изменения этого показателя носили иной характер. У пациентов с легкой БА в обострении эта величина равнялась 1,2; в ремиссии - 0,82. Для пациентов со среднетяжелой БА соотношение составило 1,3 в обострении и 0,83 в ремиссии. При тяжелой БА наблюдалось изменение этого показателя от 2,4 в обострении до 2,2 в ремиссии. Можно заметить, что значительная динамика этого показателя на фоне лечения наблюдалась в периферической крови у пациентов с тяжелой БА и в мокроте у пациентов с легкой и среднетяжелой БА преимущественно за счет повышения экспрессии мРНК растворимой изоформы рецептора.

Регрессионный анализ показал определенную, хотя и относительно слабую взаимосвязь между значимыми показателями функции внешнего дыхания и экспрессией изоформ рецептора. Следует заметить, что эта корреляция была значительно менее выражена, чем для показателей цитокиновой продукции.

Была установлена прямая зависимость между экспрессией мРНК мИЛ-5Ра в периферической крови и экспрессией мРНК МБ-кВ в эозино-филах периферической крови и обратная зависимость

между экспрессией в периферической крови и экспрессией

мРНК NF-kB в эозинофилах периферической крови ^=-0,35; p<0,001). Более того, в обострении была выявлена не столь выраженная, но достоверная обратная взаимосвязь между экспрессией мРНК КИ-кВ в эозино-филах периферической крови и экспрессией мРНК в мокроте

(Ы=-0,27; р=0,04).

Влияние ИЛ-5 и рекомбинантного рИЛ-5Ра на апоптоз

эозинофилов

Известно, что ИЛ-5 является одним из наиболее критичных цито-кинов, участвующих в предотвращении апоптотической гибели эозино-филов [Кау А. В., Menzies-Gow A., 2003]. Были исследованы изменения в эозинофилах, выделенных от пациентов с разной степенью тяжести, которые происходили в течение их 24-часового культивирования в среде, содержащей ИЛ-5. Первоначально при оценке апоптоза эозинофилов, полученных из крови больных БА, было установлено значительное снижение количества клеток с морфологическими признаками апоптоза в сравнении со значениями в группе здоровых доноров. Наблюдаемое количе-

ство эозинофилов с признаками апоптотической морфологии (через 12,24 часа культивирования) в группе больных БА было значительно меньшим по сравнению с группой контроля. При этом достоверных различий между группами пациентов с различной тяжестью БА не наблюдалось, поэтому данные были объединены.

На основании представленных выше результатов было показано, что растворимая форма рецептора ИЛ-5 играет важную роль в патогенезе БА, и что в случае тяжелого течения заболевания наблюдается дисбаланс в экспрессии растворимой и мембраносвязанной изоформ рецептора по сравнению с контролем и более легкими формами заболевания. Для подтверждения анти-ИЛ-5 свойств рекомбинантного рИЛ-5Ра с целью дальнейшего изучения возможности его применения в рамках основных подходов к анти-ИЛ-5-терапии, эозинофилы были культивированы в присутствии только ИЛ-5, а также ИЛ-5 и рекомбинантного одновременно. В группе здоровых доноров при добавлении в культуру эозинофи-лов ИЛ-5 наблюдалось значительное снижение апоптотической активности этих клеток по сравнению с интактной культурой. Добавление в культуру одновременно ИЛ-5 и растворимого рекомбинантного рецептора к ИЛ-5 приводило к восстановлению апоптотической активности эозино-филов периферической крови здоровых доноров.

Эти же исследования, проведенные на эозинофилах, полученных от пациентов с БА различной степени тяжести, дали несколько другие результаты. Было показано, что культивация эозинофилов, полученных от пациентов с легкой и среднетяжелой БА в присутствии ИЛ-5 и его рецептора не приводила к достоверным изменениям апоптоза, хотя определенная тенденция в снижении показателей апоптоза при добавлении ИЛ-5 наблюдалась (рис. 2А).

Действие ИЛ-5 на эозинофилы, полученные от пациентов с тяжелой БА, приводило к еще большему снижению апоптоза этих клеток через 24 часа инкубации. Добавление рекомбинантного растворимого рецептора препятствовало этому процессу (рис. 2В). Возможно рекомби-нантный рИЛ-5Ра, действуя на культуру эозинофилов in vitro, конкурирует с нативным рецептором за связывание ИЛ-5 таким образом, что не происходит связывания ИЛ-5 с его рецептором на клетке. Это приводит к нарушению проведения специфического сигнала внутрь клетки, и тем самым блокируется его антиапоптотическое действие.

Моделирование бронхиальной астмы и оценка влияния ИЛ-5 на гладкие мышцы дыхательных путей животных с экспериментальной бронхиальной астмой

Экспериментальные животные были сенсибилизированы овальбу-мином с целью моделирования БА. Была проведена оценка морфологии и функционального состояния слизистой оболочки главного, среднедолево-го бронха, мелких бронхов правого легкого интактных и сенсибилизиро-

ванных животных Однонаправленность изменений гистологической картины слизистой оболочки бронхов у морских свинок после моделирования астматического приступа и у больных атопической БА позволило использовать данную модель для изучения закономерностей патогенеза БА.

Рис. 2. Содержание эозинофилов с морфологическими признаками апоптоза в течение 24 ч культивирования с интерлейкином-5 (+ИЛ-5); интерлейкином-5 и рекомбинантным рецептором интер-лейкина-5 (+ИЛ-5/+ррИЛ-5Ра). А - культура эозинофилов периферической крови пациентов с легкой (ЛА) и среднетяжелой (СА) астмой. В - культура эозинофилов периферической крови пациентов с тяжелой бронхиальной астмой (ТА). * - р < 0,05 по сравнению с показателями в культуре эозинофилов, культивированных с ИЛ-5

Далее препараты сегментов трахеи и главных бронхов животных контрольной и экспериментальной групп были подвергнуты действию ИЛ-5, его рецептора и гистамина. Были использованы различные концентрации гистамина (10 11 — 10 4 М) и оказалось, что сегменты гладких мышц бронхов, полученных от животных с экспериментальной БА, pea-

трации 0,5 мкг/мл - на 54,63% (р<0,01, п=6), при концентрации 0,1 мкг/мл - на 43,32% (р<0,01, п=6). При этом максимальная амплитуда сокращения сегментов от сенсибилизированных животных оставалась выше амплитуды сокращения сегментов животных контрольной группы более чем на 30% (при концентрации в инкубационной среде ИЛ-5 - 0,1

мкг/мл и ррИЛ-5Ра -1 мкг/мл). Таким образом, связывая экзогенный ИЛ-5, растворимый рецептор приводил тем самым к дозозависимому уменьшению сократительных реакций сегментов как интактных, так и сенсибилизированных животных на гистаминергические воздействия. Возможные механизмы регуляции продукции ИЛ-5 Конечный уровень цитокина в периферической крови и в органе-мишени (индуцированной мокроте) определяется внутриклеточными процессами, такими как активность экспрессии соответствующего гена, регулируемая нуклеарными факторами и проявляющаяся в повышении продукции мРНК ИЛ-5, и внеклеточными белками, к которым относится ИЛ-4, запускающий активацию гена ИЛ-5 и рИЛ-5Ра, снижающая уровень ИЛ-5 посредством его элиминации. Связь высокого уровня ИЛ-5 с астмой свидетельствует о нарушении тех или иных механизмов регуляции продукции цитокина при этой патологии. Судя по тому, что экспрессия мРНК ИЛ-5 является основной дискриминирующей переменной для пациентов с легкой/среднетяжелой и тяжелой БА, именно нарушения внутриклеточных процессов (возможно генетически детерминированные) характерны для тяжелого течения болезни. Высокий уровень ИЛ-5 в мокроте ассоциирован с нарушением функции легких, что доказывают результаты регрессионного анализа. Причем экспрессия мРНК этого цито-кина в значительной степени связана с результатами функциональных легочных тестов, и эта взаимосвязь отрицательная. Поскольку мРНК не может оказывать влияния на физиологические процессы самостоятельно, становится понятным, что этот показатель отражает результаты эффектов самого белка. Высокий уровень цитокина является необходимым, но недостаточным условием для реализации комплекса ИЛ-5-опосредованных эффектов при БА. Важным является наличие экспрессии специфических рецепторов на клетках-эффекторах, к которым относятся эозинофилы и гладкомышечные клетки.

Участие сплайс-варантов рецептора ИЛ-5 в патогенезе бронхиальной астмы

При анализе полученных нами результатов было установлено, что в эозинофилах, выделенных из периферической крови больных с лег-кой/среднетяжелой БА и культивированных с ИЛ-5 в течение 24 часов, уровень мРНК мИЛ-5Р снижался. Причем уровень мРНК не

коррелировал с содержанием эозинофилов у больных легкой и среднетя-желой БА в обострении и ремиссии

соответственно), и колебания этих показателей носили разнонаправлен-

библиотека СЯтрбург { о» т -ащ, I

Q- мИЛ-5 Ре, |-рИЛ-5Ра Щ-ИЛ ЗРа.

А)

ИЛ-5

I

Легкая астма

-1 I 1'™»-

" / so*4 hattet« Активация

MAltc fl3-»t у эозииофила

Ген ИЛ-ЗР а Геи ИЛ5Р а *РНК Р И Л-5Р «

ИЛ-3

ИЛ-ЗР

ИЛ-5_|1п'"в « Ф Эли»»»—

лллллл

*РНК ИЛ-ЗР «

л^ллллдМдлафд/4

Ген ИЛ-ЗР о Гея ИЛ-ЗР о

С) Тяжелая астм»

ИЛ-5,____| | |рил-5Р. «—

/(много) 1,1 <мал°)

^ГТЧГЧГ41!]^

и > *ех4 Актив аиия

МАРК Р13-К э юшю фила

" * ^ нЛЛЛАЛЛ

мРНК. мИЛ-5Рч А^АЛлдл^глллЗ^л^-----» «ллллл

ГенИЛ-ЗРо ГеиИЛ-5Ро мРНКрИП-5Р

ИЛ-3 ИЛ-5 -

о) ; 1

ИЛ-ЗР„* ИЛ-5Р*

^ГУГГ'Г'О-^

« I < Дмдооотяька** / 1

I м<пмааш / '

* > м никимт I

«ллллл \ „пнмЛша / ллл/ч

.ЮКИЛ-ЗР« \ / л/чл^

Ч\ ^ ^ *#НКрИЛ-5Р

Гг« ИЛ-3 Ра Ген ИЛ-5 Р о

Рис. 3. Гипотетическая схема взаимодействия ИЛ-5 с его рецептором на поверхности эозинофилов в дыхательных путях (описание рисунка на следующей странице)

А) У пациентов с легкой и среднетяжелой астмой ИЛ-5 взаимодействует с мембраносвязанной изоформой рецептора (мИЛ-5Ра), и через бета-цепь фс), которая является общей для рецепторов к интерлейкину 3 (ИЛ-3) и гранулоцитарно-макрофагальному колониестимулирующему фактору (ГМ-КСФ), запускается активация сигнальных путей через Янус-киназу с активацией STAT (JAK/STAT - путь); через митоген-активирующие протеин кина-зы (МАРК — путь); через фосфатидил-инозитол 3-киназу (PI3-K — путь) и через SOX4 (собственная активность мИЛ-5Ра). Активация сигнальных путей реализуется в активации эозинофилов, повышении экспрессии гена мембраносвязанной изоформы рецептора к ИЛ-3 (тИЛ-ЗРа), снижении экспрессии гена ИЛ-5Ра, деградации мРНК мИЛ-5Ра и деградации рецепторного комплекса ИЛ-5—мИЛ-5Р—0с. При этом нативная растворимая изоформа рецептора к ИЛ-5 (рИЛ-5Р а) связывает ИЛ-5, частично блокируя его действие. В) Это приводит к снижению продукции мИЛ-5Ра и рИЛ-5Ра, повыше нию продукции мИЛ-ЗРа и формированию рецепторного комплекса тИЛ-ИЛ-3 является значительно менее специфичным цитокином для эозинофилов, вследствие чего взаимодействие ИЛ-3 с его рецептором не приводит к повторной активации эозинофилов и снижению апоптоза этих клеток. Значительное уменьшение количества рецепторного комплекса к ИЛ-5 делает бессмысленным применение анти-ИЛ-5 препаратов. С) У пациентов с тяжелой астмой наблюдается повышенная экспрессия гена ИЛ-5Р а. При этом преимущественно экспрессируется мИЛ-5Ра изоформа и в меньшей степени рИЛ-5Ра. Взаимодействие ИЛ-5 с его рецепторным комплексом приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей, однако снижение экспрессии гена ИЛ-5Ра,, деградация мРНК мИЛ-5Ра менее выражены (механизм неизвестен). D) В связи с достаточно высокой экспрессией мИЛ-5Ра, ИЛ-5 может связываться со своим рецептором и приводить к снижению апоптоза эозинофилов и их повторной активации. В этом случае использование анти-ИЛ-5 препаратов может бьпь эффективным.

——j - активация и блокирование соответственно}—►,-----j - слабая активация и слабое блокирование

соответственно.

Обнаруженные высокие концентрации этого цитокина в различных биологических жидкостях (сыворотка крови, индуцированная мокрота), а также взаимосвязь содержания ИЛ-5 с ключевыми функциональными (ПСВ и ОФВ1) и параклиническими (содержание эозинофилов в периферической крови и индуцированной мокроте) показателями БА позволяют позиционировать этот интерлейкин как ключевой медиатор, обуславливающий характерное для заболевания воспаление в целом, а не только его отдельные компоненты.

Способность ИЛ-4, вероятно через изменение активности нукле-арных факторов NF-кВ ИЛИ р53, влиять на экспрессию гена ИЛ-5, и вместе с тем, зависимость экспрессии гена самого ИЛ-4 от активности N F- KB представляет собой пример замкнутого самого на себя круга патологических процессов (рис. 4).

+ +

Персистирующее эозинофильное воспаление

Рис. 4. Механизмы развития ИЛ-5 зависимого эозинофильного персистирующего воспаления при бронхиальной астме

Известно, что воспаление при бронхиальной астме может быть аллерген-независимым и поддерживаться само по себе, именно поэтому аллергены при уже сформировавшейся сенсибилизации рассматриваются лишь как одни из множества триггеров (провокаторов) обострения заболевания. Полученные в диссертационной работе результаты позволяют предположить, что персистирующий аллерген - независимый характер воспаления при бронхиальной астме может определяться существованием положительной обратной связи в системе NF-KB — ИЛ-4, ИЛ-5, а также нарушенными процессами апоптоза клеток эффекторов. Основной проблемой тяжелой и сложноконтролируемой астмы является низкая чувствительность воспаления в бронхиальном дереве к проводимой терапии. Терапевтическая резистентность может быть генетически детерминированной, а также развиваться вследствие интенсивного синтеза цитокинов и высокой активности NF-KB, способного связывать кортикостероид и конкурировать за препарат с кортикостероидным рецептором. Высокая

активность воспаления при сложноконтролируемой астме и низкая чувствительность таких пациентов к проводимой терапии могут быть связаны не только с дисбалансом процессов сплайсинга ИЛ-5Р и дефицитом рИЛ-5Р, но и с нерегулируемыми процессами самоактивации в цепи ИЛ-4 -

- и т.д. Таким образом, полученные результаты подтверждают валидность терапевтических подходов, основанных на использовании агрессивной кортикостероидной терапии или прерывания цепи патологических событий при помощи антицитокиновых препаратов. Выбор рИЛ-5 в качестве терапевтического агента представляется оправданным, поскольку этот белок не только блокирует эффекты ИЛ-5 на эозинофилы, но также способен прямо или косвенно (через связывание ИЛ-5) снижать склонность гладкомышечных клеток бронхов к бронхоспазму. Судя по результатам исследования, наиболее перспективным представляется использовать анти-ИЛ-5 терапию у пациентов с тяжелой БА.

Выводы

1. Течение бронхиальной астмы сопровождается повышением (по сравнению с группой здоровых доноров) уровня ИЛ-5 в периферической крови и в мокроте как в период обострения бронхиальной астмы, так и в период ремиссии (за исключением больных легкой бронхиальной астмой, у которых уровень ИЛ-5 в сыворотке крови в стадию ремиссии соответствует контрольным значениям). На фоне противовоспалительной терапии уровень ИЛ-5 в сыворотке крови и мокроте снижается.

2. Экспрессия мРНК гена ИЛ-5 в сыворотке крови и в мокроте повышена при тяжелой бронхиальной астме по сравнению с легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой. Период обострения бронхиальной астмы сопровождается повышенной (по сравнению с ремиссией) экспрессией мРНК гена ИЛ-5 в индуцированной мокроте при любой степени тяжести БА. Установлена взаимосвязь уровня ИЛ-5 и экспрессии мРНК ИЛ-5.

3. Экспрессия мРНК ИЛ-5 и уровень ИЛ-4 демонстрируют обратную взаимосвязь с показателями функции легких 0<1>Ц| и ПСВ как при обострении бронхиальной астмы, так и в ремиссию. Экспрессия мРНК ИЛ-5 является наиболее значимым дискриминирующим фактором между группами пациентов с тяжелой и лег-кой/среднетяжелой бронхиальной астмой.

4. Экспрессия мРНК мембраносвязанной изоформы рецептора ИЛ-5 повышена при любой форме заболевания в периферической крови и индуцированной мокроте, в обострении и ремиссии, причем наиболее высокий уровень наблюдается у пациентов с тяжелой бронхиальной астмой. Уровень экспрессии мРНК растворимой изо-формы рецептора ИЛ-5 в мокроте повышается на фоне лечения.

Соотношение мРНК мембраносвязанной изоформы рецептора к растворимой изоформе снижено при обострении бронхиальной астмы и повышено в ремиссию за счет увеличения экспрессии мРНК растворимой изоформы.

5. Особенностью тяжелой бронхиальной астмы является устойчиво повышенная продукция ИЛ-5, сниженная экспрессия растворимой изоформы ИЛ-5 и нарушение ИЛ-5-зависимого угнетения экспрессии рецептора ИЛ-5, которые выражаются в пролонгировании эози-нофил-опосредованных патологических процессов в дыхательных путях.

6. Установлено участие NF-кВ И ИЛ-4 В регуляции работы генов ИЛ-5 и его рецептора, выражающееся в повышении экспрессии мРНК ИЛ-5, мРНК мембраносвязанной изоформы рецептора ИЛ-5 и снижении экспрессии мРНК растворимой изоформы рецептора ИЛ-5. Экспрессия мРНК р53 снижена при обострении бронхиальной астмы, но повышается в ремиссии за исключением случая тяжелой бронхиальной астмы.

7. На модели бронхиальной астмы доказано участие ИЛ-5 в формировании бронхиальной гиперреактивности за счет лиганд-рецепторного взаимодействия с гладкими мышцами бронхов. Экзогенный ИЛ-5 не приводит к повышению бронхоконстрикции напрямую, но повышает реактивность гладких мышц в ответ на действие медиаторов воспаления, таких как гистамин. При этом рекомби-нантный растворимый рецептор к ИЛ-5 ограничивает действие ИЛ-5 на гладкие мышцы бронхов.

8. Уровень апопотоза эозинофилов, полученных от пациентов с бронхиальной астмой снижен, экзогенный ИЛ-5 приводит к еще большему снижению апоптоза эозинофилов, полученных от пациентов с тяжелой бронхиальной астмой, но не влияет на апоптоз эози-нофилов, полученных от пациентов с легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой. При этом рекомбинантный растворимый рецептор к ИЛ-5 ограничивает антиапоптотическое действие ИЛ-5 на эо-зинофилы, полученные от пациентов с тяжелой бронхиальной астмой.

9. Получено доказательство возможности применения рекомбинант-ного растворимого рецептора ИЛ-5 для ограничения эффектов ИЛ-5 у пациентов с тяжелой бронхиальной астмой.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Продукция интерлейкина-5 (ИЛ-5) у больных бронхиальной астмой различной степени тяжести // Сборник работ 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН / Под ред. А.В. Завьялова, А.И.

Конопли. В 2-х частях. Часть 1. - Курск: КГМУ. - 2002. - С. 96-97 (совместно с Копьевой А.П., Лещевой И.С., Иванчуком И.И.).

2. Экспрессия мембраносвязанной и растворимой формы рецептора ин-терлейкина-5 в зависимости от уровня интерлейкина-5 при бронхиальной астме // «Науки о человеке» - Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СибГМУ. - 2003. - С. 158 - 160 (совместно с Копьевой А.П., Лещевой И.С.).

3. Влияние интерлейкина-5 на сократительную активность гладкомышеч-ных препаратов бронхов морских свинок // «Науки о человеке» - Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СГМУ. - 2003. - С. 161-162 (совместно с Лещевой И.С., Дьяковой Е.Ю., Копьевой А.П.).

4. Bcl-2 family mRNA and IL-5 mRNA expression in peripheral blood eosinophils of mild - to - moderate asthmatics // Functional Genomics — Boston, Massachusetts. - 2002. - P. 128 (совместно с Ivanchuk LI., Petrovsky F.I., Ageeva E.S).

5. Роль интерлейкина-5 в механизмах апоптотической гибели эозинофи-лов больных бронхиальной астмой // Бюллетень Сибирской медицины. -2003. - № 2. - С. 38 - 41 (совместно с Иванчуком И.И., Петровским Ф.И., Лещевой И.С., Копьевой А.П., Петровой И.В.).

6. Роль ИЛ-5 в изменении реактивности воздухоносных путей при экспериментальной бронхиальной астме // Пульмонология (13 национальный конгресс по болезням органов дыхания). - Москва. - 2003. - С. 136 (совместно с Капилевич Л. В., Дьяковой Е. Ю., Носаревым А. В.). /

7. Экспрессия интерлейкина-5 в мокроте больных бронхиальной астмой // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2003. - Т.135. - № 4. - С. 437-440 (совместно с Петровским Ф.И., Иванчуком И.И., Геренг Е.А., Огородовой Л.М.).

8. Increased interleukin-5 mRNA expression and Bcl-2 depended eosinophils apoptosis suppression in atopic asthmatics // European Respiratory Society. Annual Congress. - Vienna. - 2003. - P. 455 (совместно с Ivanchuk 1.1., Ageeva E.S., Petrovski F.I., Ogorodova L.M., Novitskiy V.V.).

9. Induced sputum free interleukin-5 level and its mRNA expression in atopic asthma // European Respiratory Society. Annual Congress. - Vienna. - 2003. -P. 548 (совместно с Ivanchuk 1.1., Kobyakova O.S., Ivanova U.V., Kopieva A.P., Lescheva I.S., Ogorodova L. M.).

10. Interleukin-12 receptor mRNA expression and corticosteroid depended eosinophil apoptosis in asthma // European Respiratory Society. Annual Congress. - Vienna. - 2003. - P. 223 (совместно с Petrovski F.I., Ivanchuk I.I., Petrovskaia I.A., Ogorodova L.M.).

11. Морфофункциональная характеристика бронхиального дерева у морских свинок при моделировании астматического приступа // Сборник научных трудов «Актуальные проблемы морфологии». - Красноярск. -

2003. - С. 41-42 (совместно с Геренг Е.А., Суходоло И.В., Капилевич Л.В., Дьяковой Е.А.).

12. Клиническая значимость определения интерлейкин-5 (IL-5) различными методами в сыворотке крови и мокроте больных бронхиальной астмой // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №4. - С. 38-41 (совместно с Огородовой Л.М., Иванчуком И.И., Кобяковой О.С., Геренг Е.А., Копьевой А.П.).

13. Сократительные реакции гладких мышц воздухоносных путей при бронхиальной астме в эксперименте // Бюллетень сибирской медицины. -2003. - №1. - С. 35-38 (совместно с Капилевич Л.В., Дьяковой Е.Ю., Геренг Е.А., Носаревым А.В.).

14. Клиническое значение исследования экспрессии гена IL-5 при бронхиальной астме. Пульмонология. - 2004. - №4. - С. 54-59 (совместно с Огородовой Л.М., Кобяковой О.С., Иванчуком И.И., Петровским Ф.И., Лещевой И.С.).

15. Антагонистические эффекты изоформ рецептора интерлейкина 5 при бронхиальной астме // Медицинская иммунология. - 2004. - № 1-2. - С. 121-126 (совместно с Иванчуком И. И., Огородовой Л.М., Лещевой И.С., Копьевой А.П., Петровой И.В., Малышевым И.Ю.).

16. Влияние рекомбинантного интерлейкина - 5 на апоптотическую гибель эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2004. - № 1-2. - С. 117-120 (совместно с Иванчуком И.И., Огородовой Л.М., Лещевой И.С, Копьевой А.П., Петровой И.В., Малышевым И.Ю.).

17. Изменение экспрессии апоптотических факторов в эозинофилах при бронхиальной астме // «Науки о человеке» - Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. -Томск: СибГМУ. - 2004. - С. 200-201 (совместно с Поповой И.С., Агеевой Е.С., Петровой И.В., Иванчуком И.И.).

18. Эффекты рецептора интерлейкина 5 при бронхиальной астме // «Науки о человеке» - Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СибГМУ. - 2004. - С. 213-214. (совместно с Копьевой А.П., Иванчуком И.И., Поповой И.С.).

19. Влияние интерлейкина-5 и рецептора интрерлейкина-5 на сократительные реакции гладких мышц воздухоносных путей в условиях формировании гиперреактивности // Сборник статей «Мембранные и молекулярные механизмы регуляции функций гладких мышц». - Томск. - 2004. -С. 32-41 (совместно с Капилевич Л.В., Огородвой Л.М., Дьяковой Е.Ю., Зайцевой Т.Н.).

20. Linkage between NO synthases polymorphisms and asthma // European Respiratory Society. Annual Congress. - Glasgow. - 2004. - P. 136 (совместно с Petrova I. V.,. Ivanchuk 1.1., Deyev I.A., Ogorodova L.M.).

21. Activity of pro- and anti- apoptotic factors mRNA expression in eosinophils of asthmatics // European Respiratory Society. Annual Congress. - Glasgow. - 2004. - P. 321 (совместно с Ivanchuk 1.1., Ageeva E. S., Petrova I. V., Ogorodova L. M,).

22. Роль нарушения регуляции апоптоза эозинофилов при бронхиальной астме у детей // Сборник научных трудов по итогам IV межрегиональной научно - практической конференции "Здоровье детей - наше будущее!". — Томск. - 2004. - С. 82-96 (совместно с Иванчуком И.И., Деевым И.А., Никитиной Л.Ю., Агеевой И.П.).

23. Сократительные реакции гладких мышц воздухоносных путей при экспериментальной бронхиальной астме: роль интерлейкина 5 в формировании гиперреактивности бронхов // Российский физиологический журнал им. Сеченова. - 2004. - Т.90. - № 10. - С. 1262-1269. (совместно с Капилевич Л.В., Огородвой Л.М., Дьяковой Е.Ю., Поповой И.С., Носаре-вым А.В., Зайцевой Т.Н.).

24. Экспрессия мРНК интерлейкина-5, мембраносвязанной и растворимой формы а-субъеденицы рецептора интерлейкина-5 в мокроте больных бронхиальной астмой // Физиология и патология иммунной системы. -2004. - Т. 8. - № 6. - С. 29 - 31. (совместно с Огородовой Л.М., Кобяко-вой О.С., Копьевой А.П., Иванчуком И.И., Лещевой И.С.)

25. Значение транскрипционного фактора р53 в механизмах апоптоза эо-зинофилов больных бронхиальной астмой // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т. 19. - № 4. - С. 57 - 59. (совместно с Иванчуком И.И., Огородовой Л.М., Петровой И.В., Агеевой Е.С., Кармалитой Е.Г., Вась-ковскиим Н. В.)

Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СГМУ Заказ № ЗА( Тираж 100 экз.

J1778®

РНБ Русский фонд

2005-4 12371