Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Взаимодействие цитоскелета нормальных и трансформированных клеток с внеклеточным матриксом

Российская Академия Медишшскнх Наук Онкологический Научный Центр

Г)

I о

ОД

1 г::.) — ( 1 . 11 *

На правах рукописи УДК 616-006.04-018-092.4

Буланопа Елена Лиатолъепна

ПзанмодеЯствне цптоскслста нормальных и трансформированных клеток с внеклеточным матрнксои

(специальность 14.00.14 - Онкология)

Аптореферат --—

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории мехациамон канцероичн-.к» (рукоиодитсль - ч.1.-корр. РАН Ю.М. Васильев) Онкологическою научною центра РАМН им.Н.Н.Блохииа (директор - академик РАМН Н.Н.Транеаникоп)

Н ау ч 11 ы (1 ру ко иод и тел ь:

члеп-корр.РАН, доктор медицинских наук,

профессор Ю.М. Насильси

Официальные ошшненты'.

докюр биоло! И'агкнх наук Ii.Il. Коипин доки>|> биологических наук И.11.Терских

Ведущее уче^-ждение: Институт белка РАН (Мое к на)

Защита состоится " ЭЗ " _199(5 юда на ласедапии

специализированною Ученого еоиета (К.001.17.01) Онкологическою научного центра РАМН (11Л178, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке ОНЦ РАМП. Автореферат разослан " ЭР " 1990 года

Ученый секретарь снециалиаироиаппоюУчсиога совета доктор медицинских наук, профессор .

Н.С.Турусов

Актуальность проблемы

Одной из важнейших проблем современной онкологии является изучение механизмов инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. В норме многие тины клеток человеческого оргализма также проявляют подвижный инвазивный фенотип, например, при формировании различных желез и росте кровеносных сосудов. В этих случаях миграция клеток строго контролируется внешними факторами: химическими сигналами, межклеточными взаимодействиями и молекулами внеклеточного матрнкса. При опухолевой трансформации потеря подобного контроля над движением приводит к патологическому росту клеток, ассоциированому с инвазией экзогенного матрикса. Между тем сравнительного исследования инвазивного роста эпителиальных клеток в норме и патологии до настоящего времени проведено не было.

Цнтоскелет определяет способность клеток к движению. Наиболее важным для клеточной миграции является взаимодействие актинового цитоскелета с микротрубочками, поскольку непосредственно за движение отвечает актиновый кортскс, а за его организацию - система микротрубочек. Установлено, что для направленной миграции фибробластов но субстрату необходима ннтактная система мнкротрубочек (Vasiliev ct а/, 1970). Между тем нейтрофилы и кератоцнты способны к направленной миграции но субстрату в отсутствие системы микротрубочек (Schliwa & Honer, 1993). Важно было выяснить значение системы микротрубочек в возникновении и поддержании подвижного фенотипа эпителиальных клеток.

Многие аспекты механизмов клеточного движения были выяснены при изучении морфогенетических реакций клеток на двумерном плоском субстрате. Между тем реальное поведение клеток in vivo во многом определяется комплексным взаимодействием систем цитоскелета с трехмерным внеклеточным матриксом. В организме клетки выстилающего эпителия неподвижны, организованы в эпителиальные пласты, в которых связаны прочными межклеточными контактами. Однако в результате действия ряда факторов они могут приобретать способность к миграции. Например, выделяемый фибробластами белок HGF/SF in vitro индуцирует инвазивный рост эпителиальных клеток во внеклеточном матриксе, сопровождающийся формированием системы длинных ветвящихся трубчатых структур (Montesano et al. 1991., Soriano ct ai.% 1995). Динамику и механизмы инвазивного роста эпителиальных клеток в норме и патологии удобно изучать, i льтнвируя

клетки в трехмерных гелях, образованных компонентами внеклеточного матрикса. Роль систем цитоскелета в возникновении и сохранении шшазивного фенотипа эпителиальных клеток в ходе нормального морфогенеза, а также при инвазивном росте трансформированных энителноцитов оставалась неясной.

Цель и задачи работы

Целью настоящей диссертационной работы являлось выяснение динамики и механизмов ннвазивного роста эинтелиа ьпых клеток в трехмерном внеклеточном матриксе в норме и патологии, а также роли цитоскелетной системы микротрубочек в этих процессах. В связи с этим задачи были следующие:

1. Изучить механизмы и динамику НОР/ЗР-илдуиировашюго ннвазивного роста ^трансформированных эпителиальных клеток во внеклеточном матриксе. Для анализа роли цитоскелетной системы микротрубочек в этом процессе изучить действие колцемнда н таксола на разные стадий НСР/БР-индуцированного эпителиального морфогенеза.

2. Изучить действие опухолевого промотора 12-0-тетрадсканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) на эпителиальные клетки, культивируемые в трехмерном коллагеновом геле и роль системы микротрубочек в клеточном ответе на действие опухолевого промотора.

3. Изучить способность к иавазишюму, росту в коллагеновом геле ди^коидных эпителиальных клеток \AR-2 и клеток той же линии, устойчиво экспрессирукццих экзогенный онкоген Ы-га$. Для выяснения роли системы микротрубочек в инвазивном росте эпителиальных клеток изучить действие колцемида и таксола на этот процесс.

Научная новизна и практическая значимость работы

Изучена динамика НОР/ЗЕ-индуцированного тубулогенеза и на основании полученных нами данных предложена модель энятелиалыюш морфогенеза в коллагеновом геле. Впервые показано, что шшазивный фенотип эпителиальных клеток МОСК является обратимым и строго зависит от присутствия в среде внешнего фактора - митокина НОР/8Р.

Мсгод компьютерной морфометрии впервые применен для анализа формы эпителиальных агрегатов, культивируемых в трехмерном коллагеновом

ч

геле. Проведена компьютерная морфометрическая оценка контрольных и инкубированных с цитокином эпителиальных агрегатов клеток ¡УШСК на ранних стадиях ЬЮР/ЗР-индуцирбванного тубулогенеза (первые сутки культивирования). Сравнивались количественные параметры, описывающие форму эпителиальных агрегатов , - дисперсия и элонгация. При культивировании эпителиальных агрегатов клеток МОСК в среде, содержащей НСР/БР, статистически достоверно увеличиваются оба параметра, характеризующих степень поляризации агрегатов - дисперсия и элонгация.

Впервые проанализирована роль системы микротрубочек в НОР/8Р-индуцированном тубулогеиезе. Показано, что сохранение зависимой от микротрубочек поляризации эпителиальных клеток является необходимым условием для формирования эпитслиоцитами трубчатых структур. Система микротрубочек играет важную роль в эпителиальном морфогенезе, индуцированном цитокином.

Впервые исследовано действие опухолевого промотора 12-0-тстрадеканонлфорбол-13-ацстата (ТФА) на эпителиальные клетки МОСК, культивируемые в трехмерном коллагеновом геле. Опухолевый промотор индуцирует инвазипный рост эинтелиоцитов во внеклеточный матрикс. Однако в результате ействия ТФА эпителиальные клетки МОСК не формируют трубчатые структуры. Клетки организованы в объемные агрегаты звездчатой формы. Впервые показано, что система микротрубочек необходима для ТФА-нндуцироваиной инвазии коллагенового геля эпителиальными клетками.

Впервые показано, что ла$-трансформированные эпителиальные клетки (клон С4) приобретают способность инвазировать внеклеточглш матрикс, формируя в нем длинные узкие трубчатые структуры. Инвазивный поляризованный фенотип клеток С4 вызван экспрессией экзогенного онкогена N-/-.25 и не зависит от стимуляции внешними факторами. В данном случае имеет место автономная стимуляция инвазивного роста.

Установлено, что сохранение зависимой ' от микротрубочек поляризованной формы клетками С4 необходимо для инвазивного роста в коллагеновом геле. При культивировании агрегатов лм-трансформированных клеток в среде, содержащей таксол или колцемид, статистически достоверно уменьшаются оба параметра, характеризующих степень поляризации агрегатов - дисперсия и элонгация. Таким образом, существенную роль в инвазивном росте ^^трансформированных эпителиальных клеток во внеклеточном матриксе играет иптактная система микротрубочек..

Таким образом, теоретическое значение диссертационной работы состоит в том, что изучены механизмы HGF/SF-индуцнровашюго эпителиального морфогенеза, а также автономного шшазивного роста /зд'-трансформпрованных эпителиальных клеток в экзогенном матриксс.

Наряду с теоретическим значением, полученные данные имеют научно-прикладное значение, поскольку описанный ишшнвный рост rus-трапсформированных клеток в коллагеном геле является удобной моделью для изучения механизмов патологического роста опухолевых клеток, а также специфических агентов, способных ингибировать этот процесс.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, цитогенетикн и генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза Онкологического Центра РАМН 11 июля 1995 года.

Материалы работы докладывались на Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), па конференции "Cytoskelcton & Cell Function" - (Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 1995), на Всероссийском симпозиуме "Биология клетки и культуре" (Санкт-Петербург, 1995), на lV-ой Международной конференции. "Современные проблемы биохимии и молеуклярнон биологии. Наследие A.II.Белозерского" (Москва, МГУ, 1995).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 р; ют.

Структура и объем работы.

• Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания и обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 3> таблицы, 4Sрисунков и список литературы из Э<?2ссылок.

Материалы к методы.

Í. Описание клеточных культур, использованных в работе.

.1,.Клетки лишш.МРСК клон 20

Эпителиальные клетки MDCK (эпителий ночки собаки) клон 20 были получены в лаборатории Dr.Gherardi (ICRF Cell Interactions Laboratory, Camdridge University Medica! School). Клеткн линии MDCK клон 20 чрезвычайно чуствительны к мотогенному, но не митогенному действию HGF/SF.

Клетки культивировали на среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Sigma, USA) с 5% эмбриональной сыворотки телят при 37°С в присутствии 5% СОг.

2.Клетки линчи IAR-2

Эпителиальные клеткн IAR-2 были получены из крысиной печени (Montesano et al, 1975). В редкой культуре клетки имеют дисковндную форму; в густых культурах клетки организованы в плотные эпителиальные островки.

Клеткн культивировали на среде DMEM (Sigma, USA) с 10% эмбриональной сыворотки телят при 37°С в присутствии 5% CO¿-

3.Клон 1AR-2(C4)-Ras

Культивируемые зиителиоциты клона IAR-2(C4)-Ras представляют собой трансформированные клетки. Клон IAR-2(C4)-Ras был получен в лаборатории цитогенетики (руководитель - д.б.п. Б.П.Копнин) совместно с лабораторией механизмов канцерогенеза из эпителия линии JAR-2 путем ретровирусного переноса гена М-гд5Мп12. К-ДНК геиа N-ray*15"12 была встроена в ретровируспый вектор pPS-3-hygro, содержащий ген устойчивости к гигромицину. Вектором pPS-3-hygro-N- ras были трансфицированы упаковывающие клетки. Полученными вирусными частицами были заражены клетки IAR-2. Экспрессия гена N-ras^"12 в клетках клона IAR-2(C4)-Ras детектировалась . методом обратной транскрипции с использованием специфической затравки с последующей амплификацией полученной кДНК в ходе нолимеразцой ценной реакции. Клетки культивировали на среде DMEM (Sigma,, USA) с 10% эмбриональной сыворотки телят при 37°С в присутствии 5% С02

II.Культивирование внутри коллагепового геля

Раствор коллагена I тина получал» путем экстракции сухожилий крысиных хвостов в 0.1% уксусной кислоте в течение двух недель при 4°С. Подробно этот метод описан в работе Elsdale & Bard, 1972. Для получения коллагепового геля 0.4мл иолимеризацно,.ной смеси (0.0528мл 7.5xDMEM, 0.32мл раствора коллагена, 0.00544мл 2MNaOH) равномерно распределяли но 35-миллиметровой пластиковой чашке для культивирования (Nunc, Denmark) и инкубировали при 37°С в присутствии 5% СОг не менее 1 часа. Агрегаты эпителиальных клеток, снятые трнпсннизировапием, суспендировали в среде DMEM и сажали на коллагеновый гель. Через 1-1.5 час,, прикрепившиеся клетки промывали 2-3 раза раствором Хсшсса и заливали 0.4 мл полнмеризациониой смеси с целью получения верхнего слоя коллагепового геля. Чашки с эпителиальными агрегатами внутри коллагепового геля инкубировали при 37°С в присутствии 5% СОг "с менее 5 минут прежде чем добавить сверху DMEM. Культуры инкубировали от 1 до 7 дней в зависимости от вида опыта при 37°С в присутствии 5% СОСреду меняли через день.

III. Специфические агенты

Очищенный рскомбинапхнын мышиный HGF/SF, иыдсленный из клеток линии мышиной миеломы, траисфицироваиных kDNA HGF/SF (SF-A71d) добавляли в среду до концентрации ЮнМ.

Стабилизирующий микротрубочки агент таксол (Sigma, USA) добавляли в среду из раствора 1мМ в DMSO до концентрации 2 мкМ.

Деполимеризующий микротрубочки агент колцемнд (Sigma, USA) добавляли в среду из раствора 100 мкг/мл, в бсссывороточной среде до концентрации 0.2 мкг/мл.

Опухолевый промотор ТФА (12-0-тетрадсканоилфорбол-.13-ацетат) (Serva, Германия) добавляли в среду 'из растовора 100 мкг/мл в димстилсульфоксиде до концентрации 25 нг/мл.

IV.Экстракция и фиксация клеток

Для последующего фазово-контрасного микроскопического исследования морфологии, культуры в пластиковых чашках отмывали 1-2 раза физиологическим раствором на 0.01М фосфатном буфере (ФБР). Затем клетки фиксировали 2.5% глутаровом альдегидом па ФБР в течение' 25 минут, после чего промывали 1-3 раза ФБР.

Для последующего выявления актина клеткн отмывали 1-2 раза ФБР, а затем проводили экстракцию в течение 3 минут 1% тритоном Х-100 (Serva) на имидазолыюм буфере (состав: 50тМ нмидазол, 50тМ KCl, 0.5тМ МйС12, O.traM'EDTA, 1 тМ EGTA, 1 шМ меркантоэтанол) с добавлением 4% полиэтиленгликоля 40000 (Si^ma). Клеткн промывали 1-3 раза чистым имидазольным буфером и фиксировали 4% раствором формальдегида на ФБР в течение 30 минут, после чего промывали раствором ФБР. Все растворы, применяемые для экстракции и фиксации, предварительно нагревали до 37°С.

Для последующего выявления тубулина, виментина, кератина клетки отмывали 1-2 раза ФБР, а затем фиксировали метанолом при -10°С в течение 10 минут.

V, Фааово-коптпрастная микроскопия

Для получения фазово-контрастных изображений эпителиальных структур препараты исследовали с помощью инвертированного фотомикроскопа (Lcitz, Германия), об.32х3.2, ок.12.5х.

VI.Флуоресцентная микроскопия

Для иг-ледопапия систем цитоскелета эпителиальных клеток, культивируемых на двумерном плоском субстрате, в работе использовался метод непрямой иммунофлуоресцснции. Для выявления тубулина использовались мышиные .•юноклональные антитела к альфа-тубулину (DMfA Sigma). Для выявления виментина и кератина использовались мышиные моноклональные антитела к виментипу (RPN-1102, Amcrsh.^m, UK) и мышиные моноклональные антитела к панкератину (А45В1-В2) соответственно. Для выявления актина использовали меченый родамином фаллоидин (Sigma). Для второй инкубации использовали козьи антитела к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированные с родамином или флуоресценнизотцоцианатом (Sigma, USA)

Фиксированные описанными методами клетки инкубировали 45 минут в растворе первых антител на ФБР, отмывали 3 раза в ФБР в течение 20 минут, затем инкубировали в растворе вторых антител на ФБР в течение 45 минут. Для получения двойной иммунофлуоресцентной окраски применяли общий раствор двух первых, а затем вторых антител. Для совместного выявления актина с другими белками меченый фаллоидин добавляли в раствор вторых антител. Окрашивание Производили при комнатной температуре. Препараты заключали в* раствор поливинилового спирта в ФБР

в

и исследовали с помощью флуоресцентных фотамикросконов Aristoplanc (Leitz), об.63*12.5, ок. 10* и Opton (Zeiss) о6.40*1.25, ок. 10*.

VII. Компьютерная обработка результатов

Форму агрегатов'исследовали по методу, разработанному в работе Данна и Брауна (Dunn & Brown, 1986). Этот метод был впервые применен нами для анализа формы эпителиальных агрегатов, культивируемых в трехмерном коллагеновом геле. Анализируемые агрегаты были сфотографированы с помощью инвертированного фотомнкроскона Lcitz, об.32х3.2, ок.12.5х. Контуры увеличенных агрегатов с учетом масштаба 'ы.'ш введены в компьютер с помощью специальной координатной пластины (Summagraphics, Bitpad 2) и статистически обработаны с помощью программы, разработанной к любезио предоставленной А.Брауиом (Лондон, Великобритания). При анализе использовались два морфометрнческих индекса, характеризующих форму агрегатов: дисперсия и элонгация. Элонгация выражает степень вытяиутостн агрегатов и равняется нулю у радиалыю симметричных фигур, например у круга. Дисперсия выражает степень нзрезанноети контура агрегатов и равняется нулю у любого эллипса. Обе эти величины возрастают с увеличением степени ноляризованиости агрегатов.

Результаты и их обсуждение

¡.Роль системы микротрубочек в возникновении и поддержании поляризованного фенотипа титслиалъных клеток, культивируемых на двумерном субстрате.

Распластанные эпителноциты имеют пеполя.шзоиаипую днековвдную форму и вытягивают псевдоподии но всему периметру клетки. Генетическими или химическими факторами может быть вызвана поляризация эпителиальных клеток. В данном случае термин "поляризация" обозначает разделение края клетки на активный, формирующий псевдоподии, » стабильный участки. Поляризованные эпителиальные клетки способны к направленному движению по субстрату' Приобретение подвижного поляризованного фенотипа эпителиоцитами имеет место в ходе эмбриогенеза. Клетки карцином на определенной стадии нрогресни опухоли также становятся способны к инвазивному росту во внеклеточном матриксе. Индуцируемые внешними

факторами изменения организации эпителиоцитов представляют собой удобные модели для изучения механизмов поляризации этих клеток.

Мы проанализировали три варианта подобных изменений:

1.В результате действия цитокина HGF/SF эпителиоииты разделяются, нарушаются Межклеточные контакты в эпителиальном пласте, клетки поляризуются и приобретают способность к направленному движению по субстрату (Stoker, 1989).

2.Опухолевый промотор ТФА (12-0-тстрадсканоилфорбол-13-ацетат) вызывает обратимое изменение морфологии эпителиоцитов: тела клеток разделяются на стабильные длинные узкие отростки и подвижные ламеллы.

З.Устойчнвая экспрессия экзогенного онкогена N-ras эпителиальными клетками линии IAR-2 приводит к поляризации формы клеток (Gloushankona ct а/, 1994). Исходные эпителиальные клетки линии IAR-2 имеют днековидную неполяризованную форму и обладают широким кольцом ламеллярной цитоплазмы по периферии.

Во всех вышеизложенных случаях изменения морфологии эпителиальных клеток тесно ассоциированы с реорганизацией комплектов цнтоскелета. Однако роль каждой из систем цнтоскелста в клеточном ответе на действие хими"еских или генетических факторов оставалась неясной. Сходные процессы поляризации разных типов клеток по чувствительности к специфическим для микротрубочек агентам разделяют на зависимые н . ¿зависимые от цитоскел^гной системы микротрубочек. Морфогенетические реакции клеток, ассоциированные с высокой степенью поляризации, например, направленное движение фибробластов по субстрату иди рост нейронов, являются зависимыми от микротрубочек. Между тем миграция по субстрату пейтрофилоа н кератоцитов (клетки эпидермиса рыб) ire ингибируется специфическими агентами, -нарушающими организацию системы микротрубочек в клетке. Важно было установить к какому типу относится поляризация эпителиальных клеток.

Для решения этой задачи мы* проводили эксперименты с использованием специфических для микротрубочек агентов - колцемида и таксола. На молекулярном уровне эффекты колцемида и таксола являются различными, более того, противоположными. Колцемид' препятствует, полимеризации тубулина, основного белка микротрубочек, и таким образом приводит к быстрой разборке микротрубочек в клетке. Таксол, напротив, усиливает полимеризацию тубулина и приводит к стабилизации микротрубочек (De Brabandef ct а/, 1981). При действии таксола интегрированная система

микротрубочек, ассоциированных с центосомои, дезннтергирустся и замещается короткими свободными микротрубочками, заполняющими цитоплазму. Децентрализация системы микротрубочек таксолом, также как и деполимеризация микротрубочек колцемидом, нарушает поляризацию формы фибробластов. Более ' того, в результате действия такса л а фнбробласты приобретают характерную черту эннтелиоидного фенотипа - у клеток формируется кольцевой пучок актиновых фнламеитов <Р1с1уи5Ькта сС а/, 1994). Действие таксола не ведет к исчезновению характерного кольцевого пучка актиновых филаментов у днекоидных эпнтелпоцитов, в то время как деполимеризация микротрубочек колцемндом вызывает дез 'рганизацию этой существенной черты эпителиального фенотипа. Таким образом, возникновение и сохранение днекоидной формы эпителиальных клеток является зависимым от микротрубочек процессом. Децентрализованная система микротрубочек достаточна для поддержания неноляризованной днекоидной формы. Напротив, только централизованная система микротрубочек способна контролировать поляризованный фенотип, так как в обработанных таксолом клетках поляризация всегда является нарушенной. Так как цптоскелстная система микротрубочек способствует возникновению и иоддержатпо двух разных типов морфологической организации культивируемых клеток, можно предположить, что существуют различные принципы организации микротрубочек у эпителиоцитов и фибробластов. Для определения функции' системы микротрубочек, способствующей возникновению и поддержанию неноляризованцого дискондного фенотипа предложен термин "контра-поляризация" (ОЬивЬапкоуа а/, 1994).

В экспериментах с применением специфических для микротрубочек агентов было показано, что микротрубочки необходимы для возникновения и • сохранения поляризованного фенотипа читслиальных клеток, индуцированного химическими или генетическими факторами . Ши^та с( а], 1995., ОЬивЬапкоуа еЬ а/, 1995). Поляризованные эпителиальные клетки реагируют на действие колцемида и таксола как фнбробласты - специфические агенты вызывают деполяризацию эпителнальиых клеток.

Таким образом, цитоскелетпая система микротрубочек необходима для поддержания " поляризованного фенотипа эпителиальных клеток, индуцировапого химическими агентами - цптокнном 1ЮР/8Р и опухолевым промотором ТФА или вызванного экспрессией экзогенного онкогена Ы-/ау. Каким образом система микротрубочек регулирует форму культивируемых клеток? Можно предположить, что расходясь радиально от центра к

И

периферии, микротрубочкн обеспечивают направленный центробежный транспорт органелл, регулирующих и усиливающих ток кортикального материала от центра к активному краю, что ведет к усилению псевдоподиалыюй активности на этом участке. Перемещение органелл вдоль микротрубочек при посредстве цитонлазматического трапелокатора кинезина играет важную роль в сохранении поляризованной формы фибробластов (Rodionov ct al, 1993). В фибробластах система микротрубочек может направлять транспорт органелл в определенный участок клеточного края и тем самым способствовать поляризации формы клетки. Напротив, система микротрубочек в днекоидных эпителиальных клетках способствует распределению материала во всех направлениях клеточного края,, что приводит к возиикновеню контра-поляризацин. Молекулярные механизмы, контролирующие форму клетки при помощи системы микротрубочек, неизвестны. В ходе поляризации эпителиальных клеток, индуцированной химическими или генетическими факторами, происходит реорганизация системы микротрубочек, возможно, за счет модификации белков, ассоциированных с микротрубочками.

И.Эпип глиальпый морфогенез, индуцированный HGF/SF.

Все эксперименты, описанные выше, были проведены в двумерной системе - при культивировании клеток па плоском субстрате. Однако изучение морфогенетических реакций эпителиальных клеток на двумерном субстрате не дает полного представления о реальном поведении клеток in vivo. В организме взаимодействие фибрилл внеклеточного матрикса, подлежат«. ;í базалыгой мембраны и компонентов цитоскелета определяют форму эпителиальных клеток и их расположение в тканевых и органных структурах. Как уже было отмечено, эпителиальные клетки линии MDCK, культивируемые на двумерном плоском субстрате, под действием HGF/SF рассеиваются из островков, приобретая поляризованную форму. Между тем при культивировании внутри трехмерного коллагенового геля, клетки MDCK в результате действия цитокина формируют ветвящиеся трубчатые структуры с внутренним просветом (Montesano ct а/, 1991). В первые сутки инкубирования с KGF/SF, клетки эпителиальных агрегатов вытягивают в коллагеновый гель тонкие отростки, в отличие от контрольных эпителионитов, сохраняющих округлую форму. Отростки поляризованных эпителиальных клеток варьируют но длине (от 10 до 32 микрон) н разветвлен и ости. Нами установлено, что при действии HGF/SF статистически достоверно увеличиваются два параметра,

характеризующие степень поляризации эпителиальных агрегатов - элонгация и дисперсия (Табл.1, Рис.1). Дальнейшее инкубирование клеток MDCK в среде, содержащей HGF/SF, приводит к образованию системы длинных ветвящихся трубчатых структур на 5-6е сутки культивирования внутри коллагеног.ого геля. Проведенный нами анализ динаклки эпителиального тубулогсисза показал, что в тубулах можно' выделить два типа клеток:

-поляризованные клетки, расположенные на растущем крае ветвей трубчатых структур и вытягивающие длинные тонкие отростки в коллагеноиый гель;

-клетки, образующие стенку тубул и не формируют .е отростков. Эгн клетки по-видимому пеиоляризоваиы.

HGF/SF-iiimymipoBaiiiibift эпителиальный тубулогепез представляет собой удобную модель для изучения in vitro процессам формирования а роста иротоковых структур, выстланных эпителиальными клетками. Подобные фундаментальные морфогеиетические процессы имеют место при росте кровеносных сосудов, в ходе онтогенеза железистых органов.

ТаблицЬ 1.

МорфометрнчЬские параметры эпителиальных агрегатов клеток MDCK, культивируемых в коллагеиовоу геле в течение 24 часои.

ЭКСТЕНЗИЯ ДИСПЕРСИЯ ЭЛОНГАЦИЯ

КОНТРОЛЬ 0.4536±0.0455 0.062510.0126 0.39! 110.0424

КОЛЦЕМИД 0.3716±0.0478 0.0384Ю.0059 0.3332±0.0468

ТАКСОЛ 0.4167±0.0369 0.045910.0059 0.370810.0368

HGF/SF 1.5063±0.1282 0.714910:058 0.791410.1163

HGF/SF+ КОЛЦЕМИД 0.691110.0722 0.1768+0.6217 0,5143+0.0645

HGF/SF+ ТАКСОЛ 0.7829±0.0801 0.180410.024 0.5935Ю.0692

Средние значения ± стандартная ошибка. По 30 контуров эпителиальных агрегатов использованы для морфометрической оценки каждой группы.

К

S »

к

<u

H

S

e>

i.8 y

i.G •• 1.4 • t.2 • 1 ■• 0.8 0.6 •• 0.4 ■ 0.2 - ■ 0 -

контроль колцеипд таксол

SF

SF+ колцемнд

SF+ таксол

Рис.1. Экстсизия эпителиальных агрегатов клеток MDCK, культивируемых в коллагеновом геле в течение 24 часов. По Данну и Fiayny (Dunn & Brown, 1986) экстензия - это сумма дисперсии и элонгации. Экстсизия воз{, .стает с увеличением степени ноляризоианностн эпителиальных агрегатов.

На основании данных, полученных нами при исследовании динамики роста трубчатых структур, молено предложить следующую модель схемаэпителиальиого морфогенеза, индуцированного HGF/SF. (схема /). Эпнтелиопиты, расположенные на крае клеточных агрегатов, под действием цитокииа поляризуются и формируют длинные тонкие отростки, инвазирующие коллагеновый гель. По этим отросткам в дальнейшем происходит направленная миграция клеток в экзогенный матрнкс. Отростки находятся п постоянной динамике: они вытягиваются, прикрепляются к фибриллам коллагена пли ретрактируют. За счет миграции краевых клеток агрегатов в коллагеновый гель и размножения проксимально расположенных клеток формируется стенка трубчатых структур. На первом этапе сливаются прикрепившиеся, отростки клеток, затем соединяются тела клеток. Таким образом происходит формирование тубул. По-видимому энителиоциты, соединенные плотными межклеточными контактами перестают реагировать па действие HGF/SF. Между тем клетки, расположенные дисталыю на растущем

крае трубчатых структур, по-прежнему поляризуются и формируют длинные отростки в ответ на действие цитокина.

Схема 1.

Модель НСР/ЗР-нидуцировипного эпителиального морфогенеза.

О часов

1е сутки

НСР/З^ (-утру

Сш

бе сутки фрагмент растущего края

Дополнительным подтверждением морфогенетического действия НОР/БР на клетки МВСК, являются проведенные нами эксперименты по инкубированию 6-ти суточных культур, содержащих сформированные трубчатые структуры, в течение последующих 4 дней культивирования в чистой среде, не содержащей НСГ/БР. В от утствие стимулирующего действия цитокина характерный рост - инвазия коллагенового геля полностью прекращает I. Уже в первые сутки инкубирования в среде, не содержащей ЬЮР/БР, длинные тонкие отростки на растущих концах ветвей поджимаются и исчезают. В дальнейшем трубчатые структуры не растут в длину, новые ветвления не образуются, на растущем крае не формируются длинные тонкие отростки. Происходит лишь разрастание просвета трубчатых структур. Можно заключить, что инвазнвный фенотип эпителиальных клеток МПС К является обратимым и строго зависит от наличия в среде цитокина, т.е. и данном случае имеет место наракрипная стимуляция ипвазивною роста во шк к.к точном матриксе.

Одной из задач исследования являлся анализ неизученных механизмов поляризации энителноцитов в ходе НОР/ЗР-индуцнроваиного эпителиального морфогенеза. Для решения этой задачи были проведены эксперименты по изучению действия специфических для микротрубочек агентов - колцемида и таксола на разные стадии процесса формирования тубул. В этих опытах было показано, что для сохранения поляризованного фенотипа клеток МБСК в ходе НОР/БР-индуцированного эпителиального тубулогенеза необходима ннтактная система мнкротрубочек. В первые сутки культивирования в коллагеновом геле в присутствии НОР/БР и таксола, клетки МОСК организованы в плоские компактные агрегаты полигональной или эллипсоидной формы. Эпителиальные клетки агрегатов вытягивают в коллагеновый гель короткие (от 7 до 15 микрон) отростки. Суточные; культуры клеток МОСК, инкубируемые с 1ЮР/8Р и колцемидом, содержат компактные плоские агрегаты полигональной формы. От каждого агрегата отходит в среднем по 3 коротких отростка длиной от 6 до 17 микрон. Вст[ чаются широкие выросты, образованные одной или двумя клетками. Таким образом, таксол и колцемид. полностью ингибнруют инвазию коллагенового геля эпителиальными клетками МОСК. Морфологические наблюдения полностью подтверждаются данными морфометрии: средние значения дисперсии и элонгации агрегатов, инкубированных в среде с. НОР/ЭР и таксолом или [ЮР/ЭР и колцемидом, значительно ниже соответствующих параметров агрегатов инкубированных в .среде с НОР/БР. Между тем средние значения дисперсии и элонгации агрегатов, инкубированных в среде содержащей таксол или колцемид практически не отличались от соответствующих параметров контрольных клеток (Табл.1, Рис.1).

Колцемид и таксол полностью блокировали инвазивный рост клеток МОСК и на поздних (7е сутки) стадиях эпителиального тубулогенеза. После 4 часов действия 'специфических агентов на сформированные трубчатые структуры, длинные тонкие отростки, вытягиваемые в коллагеновый гель поляризованными клетками растущего края ветвей, поджимались и исчезали. Таким образом, поляризация эпителиальных клеток в данной системе также является зависимой от микротрубочек. Ио чувствительности к специфическим для микротрубочек агентам, эпителиальные клетки, составляющие трубчатые структуры, можно разделить на два типа:

-клетки, расположенные на растущем крас ветвей трубчатых структур и инвазирующие коллагеновый гель при помощи длинных тонких отростков, которые реагируют на действие таксола и колцемвда;

-клетки, сформировавшие стенки трубчатых структур, не образующие длинных тонких отростков и не реагирующие на специфические для микротрубочек агенты.

Выше было отмечено, что именно за счет отростков, образованных поляризованными эпителиальными клетками происходит миграция в коллагеновый гель. В этих условиях стабильная, зависимая от системы микротрубочек поляризация эпитслиоцитов необходима для формирования трубчатых структур. Т ким образом, цитоскелетная система мнкротрубочек необходима для HGF/SF-индуцированного тубулогеиеза в коллагеновом геле.

111.Действие опухолевого промотора ТФА на клетки MDCK,. культивируемые внутри колаагенового гелп.

Ранее было показано, что действие опухолевого промотора 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) иа клетки MDCK, культивируемые на двумерном субстрате, приводит к поляризации формы эпителионитов. ТФА -специфический мембранный активатор важнейшего регуляторного фермента фосфоинозитольного пути передачи сигнала с поверхности клетки -протеинкиназы С (Nishizuka, 1986). Субстратами для фосфорилирования протеинкиназой С являются многие цитоскелстные белки: миозин, а-актишш, спектрин, тропошш, белки, ассоциированые с микротрубочкамн (Fenerstein ct al, 1984, Nishizuk; ct a!, 1984, Rozengurt ct al, 1984). В норме активатором протеинкиназы С является диацилглицерол (Sharkey ct л/, 1984), продуцируемый в клетке в ответ па стимуляцию гормонами и факторами роста (Castagna, 1987, Nishizuka ct at, 1986). Нарушение регуляторных механизмов в клетке в результате гиперактивации протеинкиназы С при действии опухолевого промотора приводит к дезорганизации актинового цитоскелета, скорее всего за счет нарушения нормального процесса кругооборота его' компонентов. ТФА индуцирует такие изменения цитоскелета культивируемых клеток, как разрушение стресс-фибрилл и реорганизацию актинового цитоскелета (Kellie, 1985), редукцию фокальных и межклеточных контактов (Ben-Ze'ev, 1986, Meigs ct al, 1986, Schliwa ct al, 1984).

Нами было установлено, что опухолевый промотор вызывает инвазнвный рост клеток MDCK в коллагеновом геле. После 12 часов действия ТФА клетки, эпителиальных агрегатов-вытягивают длинные (7-25 микрон)

топкие отростки во внеклеточный матрикс. Между тем ТФА-индуцированная инвазия коллагенового геля клетками МОСК не сопровождается формированием трубчатых структур: на третьи сутки культивирования эшпелонциты цо-ирежнему организованы в агрегаты звездчатой формы. Возможное обьясиенне этого факта состоит в существенных различиях свойств отростков, формируемых эпителиальными клетками в результате действия ТФА и НСР/ЭР. Из экспериментов, проведенных на двумерном плоском субстрате, известно, что ТФА-нндуцироваиные отростки являются неподвижными, так как в них редуцирован сократимый компонент нитоскелета - акто-миозиповая система. Необходимым же условием эпителиального тубулогепеза является высокая динамичность отростков, формируемых эпителиальными клетками. НСР/ЗР-иоляризованные эпителиальные клетки уже в первые сутки культивирования начинают мигрировать в коллагеновый гель за счет сформированных отростков. Напротив, эпителиальные клетки, инкубируемые 24 часа в присутствии ТФА, не диссоциируют из эпителиальных агрегатов. Эффект ТФА обратим: при культивировании на двумерном субстрате изменения формы эпителиальных клеток исчезают через 24-36 часов инкубации а среде ТФА. Внутри коллагенового геля клетки МОСК, прикрепленные к фибриллам коллагена, не могут вернуться в исходное состояние н эннтелиоциты остаются организованными в звездчатые агрегаты на протяжении дальнейшего времени культивирования.

Для изучения механизмов ТФА-пндуцированной поляризации клеток МОСК в коллагеновом геле были проведены эксперименты с использованием специфических для микротрубочек агентов. Установлено, что таксол и колцемид ааяносгыа иигибируют -образование клетками МОСК длинных отрос псов. При культивировании в среде, содержащей ТФА и специфические для микротрубочек агенты, эпителиоциты организованы в плоские компактные агрегаты полигональной формы с 5-8 короткими (до 15 микрон) отростками. Морфологические' наблюдения полностью подтверждаются данными морфомстрни: при инкубировании эпителиальных агрегатов в среде с ТФА и колцемндом или таксолом статистически достоверно уменьшаются оба параметра, характеризующие степень поляризации агрегатов - дисперсия и элонгация. (Рис.2).

1.4

1.2 -

I

Ь 0.6 «

0.4 +

0.2

контроль колцемид таксол

тфа

тфа+ колцемид

тфа+ таксол

Рис.2. Экстензия эпителиальных агрегатов клеток MDCK, культивируемых в коллагеновом геле в течение 12 часов. По Данну и Брауну (Dunn & Brown, 1986) экстензия - это сумма дисперсии и элонганин. Экстензия возрастает с увс. ичением степени поляризованности эпителиальных агрегатов.

Таким образом, в данном случае поляризация эпителиальных клеток также относится к зависимой от микротрубочек. Для ТФА-индуцировапного инвазивного рост;, эпителиальных клеток в коллагеновом геле необходима интактная система микротрубочек.

1У.Инвааивный рост ras-трапсформированных

эпителиальных клеток в коллагеновом геле.

Эпителиальные клетки IAR-2, устойчиво окспрессирующие экзогенный онкоген N -ras (клон С4), приобретают поляризованный фнбробластоподобный фенотип. Нами было показано, что /да-трансформнрованные клетки С4 ипвазируют коллагеновыи гель и формируют в нем трубчатые ветвящиеся структуры с внутренним просветом. Исходные эпителиальные клетки IAR-2 при • культивировании в коллагеновом геле организованы в плоские агрегаты округлой формы и не выдерживают длительного инкубирования в данных - условиях. Между тем гаг-траигформировапные клетки уже в первые сутки культивирования формируют aip iau.i полигональной или вытянутой формы.

Агрегаты образованы поляризованными клетками, вытягивающими в коллагеновый гель длинные (7-35 микрон) тонкие отростки. Дальнейшее культивирование клеток С4 внутри коллагенового геля приводит к формированию множества длинных узких ветвящихся трубчатых структур на 5е сутки инкубирования.

Ранее было показано что, поляризованный фибробластоподобный фенотип клеток С4 стабилизируется за счет взаимодействия актинового цитоскслета с системой мнкротрубочек (С1ои5Ьапкоуа а!, 1995). Эксперименты с применением специфических для микротрубочек агентов показали, что шишивный рост гду-трансформированных клеток во внеклеточном матрнксе полностью блокируется колцемидом и таксолом. Специфические агенты иигкбировали формирование отростков клетками С4 как па ранних (1е сутки культивирования) так и на поздних стадиях шшазивного роста (7е сутки). В результате компьютерной обработки морфометрических данных нами показано, что средние значения дисперсии и элонгации агрегатов лде-трансформнрованных клеток, инкубированных в среде с таксолом или колцемндом, статистически достоверно ниже соответствующих параметров агрегатов, инкубированных в чистой среде (Табл.2, Рис.3).

Таким образом, поляризация клеток С4 при культивировании внутри коллагенового геля является зависимой от микротрубочек. Для инвазии экзогенного матрнкса /-^трансформированными клетками необходима интактмая цитоскелстпая система мнкротрубочек.

Если в случае НОР/ЗР-индуцнрованиого эпителиального морфогенеза внешний фактор вызывает инвазивный фенотип клеток МВСК, то в данном случае имеет место автономная стимуляция инвазивного роста.

Таблица 2.

Морфомсгрнческне параметры агрегатов трансформированных эпителиальных клеток (клон С4), культивируемых внутри коллагенового геля в течение 24 часов.

ЭКСТЕНЗИЯ ДИСПЕРСИЯ ЭЛОНГАЦИЯ

С4 2.4459±0.4465 1.5345±0.0617 0.9113±0.1091

С4+ТАКСОЛ 1.000б±0.0971 0.3329±0.0415 0.6677±0.0763

С4+ ■ КОЛЦЕМИД 1.3552±0.1215 0.03410±0.0369 1.0143±0.01099

3 Т

2.5 --

2 -

1.5 -

1

0.5

0

с4

с4+ «олпеицд с4+ таксой

Рис.3. Экстензия эпителиальных агрегатов /vas-траисформированных клеток (клоп С4), культивируемых в коллагеновом геле в течение 24 часов. ПО Данну и Брауну (Dum & Brown, 1986) экстензия - это сумма дисперсии н элонгации. Экстензия возрастает с увеличением степени иолярнзованности эпителиальных агрегатов.

В заключен! о проведем сравнительную характеристику двух систем, где иивазивныЙ рост эпителиальных клеток в коллагеновом геле вызван внешним химическим или эндогенным генетическим фактором. Инвазия внеклеточного матрикса клетками МОСК, индуцированная НСР/БР, является нормальным морфогенетнческим ответом эпителиоцитов на действие цитокииа. Инвазивиьу! фенотип клеток МОСК является обратимым и строго зависит от присутствия в среде внешнего фактора - НСР/БР. По-видимому, связывание цитокина с его рецептором с-тЫ запускает ветви сигнального пути, стимулирующие вытягивание псевдоподий. Формирование псевдоподий сопровождается сборкой микрофиламентов на активном крае клетки. Параллельно под действием неизученных молекулярных механизмов система микротрубочек реорганизуется для сосредоточения. . иссвдоподиальиой- активности па. определенном участке клсточного;края; Изменения в динамике актинового-

цитоскелета, регулируемые системой микротрубочек, приводят к приобретению дискондными эпителпоцнтами поляризованного инвазивиого фенотипа.

Для индукции инвазивиого роста в коллагеновом геле ras-трансформированных клеток не требуются дополнительные внешние факторы. Экспрессия активированного онкогена N-ras запускает те же ветви сигнального пут» в клетке, ведущие к перестройке актинового кортекса, а затем и системы микротрубочек. Ипвазнвный поляризованный фенотип клеток С4 вызван экспрессией экзогенного онкогена N-ras и является постоянным. В данном случае имеет место автономная стимуляция инвазивны > роста. Таким образом, в двух рассмотренных нами системах поляризация эпителиальных клеток ассоциирована с приобретением способности к ншшивпому росту, в коллагеновом геле. Однако механизмы индукции пноазивнрго поляризованного фенотипа эпителиальных клеток в каждом случае различны (схема 2). Для HGF/SF-индуцированного тубулогенеза критическим моментом является связывание цитокина с его рецептором на поверхности мембраны, запускающее каскад тнрозиновых протеинкиназ. Можно предположить, что далее участниками этого сигнального пути являются белки семейства Ras, контролирующие организацию актинового цитоскелета. Ras-белки индуцируют изменения в организации актинового кортекса посредством G-связывающих белков семейства Rho (Downward, 1992, Hall, 1992). Rae регулирует образование ламеллоподий и раффлинг, Rho необходим для формирования пучков микрофиламентов и фокальных контактов (Ridley ct al, 1992, Ridley & Haíl, 1992). В настоящее время показано, что rho р21 участвует в HGF/SF-иидуцированном формировании раффлоп клетками линии 308R (мышиные кератиноциты) (Takaishi ct al, 1994). Рецептор HGF/SF, белок pl90Mct связан по крайней мере, с тремя спгпальпымп путями: ras р21, фосфатидилннозитол 3-кнназы и фосфолипазы С-у, который ведет к активации протеннкиназы С и мобилизации Са2+ (Graziani ct al, 19<ií, Bardclli ct al, 1992).

В случае инвазивиого роста ras-трансформированных эпителиальных клеток, мутантиый онкоген N-гду неадекватно активирует сигнальный путь Rlio/Rac, ведущий к реорганизации актинового кортекса клетки. При этом активность самого онкогена N-ras не зависит от регулирующего действия рецепторов на поверхности мембраны Клетки и последующего каскада протеинкиназ.

Схема 2

ИНДУКЦИЯ ИНВАЗИВНОГО РОСТА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

ВНЕШНЯЯ ИНДУКЦИЯ

ВНУТРЕННЯЯ ИНДУКЦИЯ

( нор/ЗР ;

С-МЕТ

ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА _

ИАБ

т

ино

ЯАС _* ЛАМЕЛЛОПОДИИ ^

мутантнын ВАЭ

ИАС

ПУЧКИ МИКРОФИЛАМЕНТОВ

»

ино

АКТИНОВЫЙ ЦИТОСКЕЛЕТ

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

Общая черта в механизме инвазии внеклеточного матрикса эпителиальными клетками MDCK и /-¿»-трансформированными клетками -необходимость сохранения стабильной поляризованной формы клеток в ходе этого процесса, так как именно за счет динамичных длинных отростков, образуемых поляризованными эиителиоцитами, происходит миграция клеток в коллагеновый гель. Поляризация эпителиальных клеток, культивируемых в коллагеновом геле, является зависимой от системы микротрубочек. Таким образом, цитоскелстиая система микротрубочек играет важную роль как в ходе сложных морфогенетнческих процессов, таких как формирование протоковых структур эпителиальными клетками, так и в инвазивном росте трансформированных эпителиальных клеток.

В заключение можно отметить, что инвазивный рост ras-трансформированных клеток в коллагеновом геле можно рассматривать как автономный, не регулируемый внешними факторами, вариант нормального морфогенетнчсского процесса.

Выводы

1.HGF/SF индуцирует формирование ветвящихся трубчатых структур клетками MDCK, культивируемыми в трехмерном коллагеновом геле. Эпителиальный тубулогепез является удобной экспериментальной моделью для изучения таких важных морфогенетнческих процессов как формирование различных желез и рост кровеносных сосудов. 1

2. На основании анализа динамики и механизмов HGF/SF-индуцировднного эпителиального морфогенеза предложена модель этого процесса, в которой главная роль отводится поляризованным эпителиальным клеткам, инвазирующим экзогенный матрикс при помощи подвижных длинных тонких' отростков. В этих условиях сохранение стабильной поляризащш клеток • необходимо для. успешного формирования эпителноцитамн трубчатых струкур.

3.Полярнзацпя эпителиальных клеток MDCK в трёхмерном коллагеновом геле является зависимой от микротрубочек: при дезинтеграции системы микротрубочек специфическими. агентами полностью блокируется вытягивание отростков клетками в коллагеновый гель. Таким образом в HGF/SF-индуцированном тубулогеиезе важную роль играет цитоскелетная система микротрубочек.

4.Опухолевый промотор 12-0-тетрадеканонлфорбол-13-ацетат (ТФА) вызывает ннвазивный рост эпителиальных клеток МРСК в коллагеновом геле. И результате действия ТФА эпителиоциты формируют звездчатые структуры с длинными отростками. Для ТФА-индуцированной инвп ин внеклеточного матрикса необходима интактная система микротрубочек: специфические для микротрубочек агенты блокируют формирование отростков эпителиальными клеткам!.

5.Энителиальные клетки, устойчиво экспресснрующие экзогенный онкоген Ы-гау, приобретают способность инвазнровать коллагеновый гель и формировать в нем ветвящиеся трубчатые структуры. Описанные эксперименты являюпя удобной моделью для изучения механизмов патологического роста опухолевых клеток.

6.Поляризация га5-трансформированных клеток в коллагеновом геле является зависимой от микротрубочек: дезинтеграция системы микротрубочек специфическими агентами ингибирует формирование клетками отростков, вытягиваемых в экзогенный матрикс. Интактная система микротрубочек необходима для инвазии внеклеточного матрикса /"¿«-трансформированными клетками.

7.Таким образом, приведенные нами опыты показали, что сохранение зависимой от микротрубочек поляризации эпителиальных клеток необходимо для инвазивного. роста в норме и при трансформации. В случае НСР/БР-индуцированного тубулогенеза инвазивный рост эпителиальных клеток стимулируется и поддерживается внешним фактором - цитокнном. При инвазии коллагенг юго геля га^трансформированными клетками имеет место автономная стимуляция инвазивного роста, обусловленная экспрессией экзогенного онкогена N-/35.

Список литературы, опубликованной по теме диссертации.

1.E.Bulanova In collaboration with V.B.Dugina, A.Y.Alexandrova, K.Lane, J.M.Vasjliev. The role of the microtubular system in the cell response to HGF/SF. J.Cell.Science, 108, 1659-1667 (1995).

2.E.Bulanova. Microtubular systen is essential for tubulogenesis in collagen gels. In: Abstracts of the meeting "Cytoskeleton and Cell Function", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1995), p.33.

3.Е.А.Буланова, Ю.М.Васильев. Вещества, специфически нарушающие организацию микротрубочек, блокируют морфогенез эпителиальных структур. Доклады Академии Наук, т.341, номер 2, стр.284-286, (1995).

4.Е.А.Булаиова. Влияние рассеивающего фактора HGF/SF иа клеточное движение в многоклеточных эпителиальных агрегатах. Материалы международного симпозиума "Биологическая подвижность", Пущиио, 1994, стр. 211-212.

5. Е. А. Буланова. Система микротрубочек необходима для эпителиального тубулогенеза в коллагеновом геле. Цитология, 1996 (в печати).