Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Тканевой уровень регуляции фенотипа гепатоцита

Г. В 9 %

АКАДЕМИЯ ^ШШСКИХ НА/К ССХР

всесоюзна онкологический идти центр

нл правах рукописи

ГЛЕЖЕРМАН Анатолий Сжонович ТКАНЕВОЙ УРОВЕНЬ РЕГ/ЛЯИШ ФЕНОТИПА ГЕПЛГШИ1Л

14-, 00. 14 - Онколем-ия

ДИСОРРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора виологи'сских наук в оорме научного доклада

Москва, 19Я1 г.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии (руководитель - чл. -корр. АН СССР, доктор биологически* наук, профессор Г, И. Абелев) Научно-исследовательского института канцерогенеза (директор - доктор медицинских наук Д. Г. За-ридэе) Всесоюзного Онкологического научного центра АМН СССР С директор - академик АНН СССР, провессор К Н Трапезников)

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН СССР,

доктор биологических наук.

профессор Л. Л. Киселев

доктор медицинских наук К. В. Ильин

доктор биологических наук А. Т. Михайлов

Ведущее учреждение - Московский Государственный Университет им. К В Ломоносова

Защита состоится ■ ¿/¿о^-У 1992 г в - //-

часов на заседании специализированного совета по защите докторских диссертаций (Д 001. 17. 01) при Всесоюзном Онкологическом научном центре АМН СССР (Москва 1154-78. Каширское июссе 24).

С диссертаций можно Знакомиться в библиотеке Всесоюзного Онкологического научног о центра АМН СССР.

Диссертация разослана " 1*> ' Л4 (Л 1992 г.

ученый секретарь специллизгфювакного совета кандидат медидонских наук

Ю. В. Шиикин

■!>.;'"!'fí í'.'iiK

' * i ОШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. ,. .:áfaí>j>ino известно, что между процессами становления ткани иЛДЧфгада в эмбриогенезе и опухолевой трансформацией есть Так, наряду с пролиферацией и экспрессией ряда онкогенов, для опухолей характерно появление в ходе их развития так называемых раково-эмбриональши антигенов - то-есть, иммунологически идентифицируемых маркеров, общих для опухолевой и эмбриональной ткани и отсутствутгхцих в покоящейся взрослой ткани. Эти раково-эмбриональные антигены во многих случаях используются в медицинской практике как достоверные маркеры возникновения опухоли. Однако они являются также великолепными инструментами для изучения процессов диффереицировки. Несомненно, что изучение контроля их синтеза в онтогенезе и канцерогенезе является фундаментальной проблемой как экспериментальной онкологии, так и биологии развития и клеточной биологии. Нам кажется, что изложенный ниже фактический материал но изучению экспрессии в паренхиматозных клетках печени - гепатоцитах - tn vivo и in vitro раково-эмбрионального сывороточного белка альфа- фетопротеина (АФП), а также ряда других печеночных маркеров, м"еет отношение не только к регуляции фенотипа индивидуальных нормальных и опухолевых гепатоцитов. но и к проблеме дифферен-цировки и гистогенеза ткани печени.

Актуальность работы определяется тем, что она посвявдна поиску новых путей регуляции Фенотипа клетки, связанных с меж- . леточными взаимодействиями, взаимодействиями клеток с внекле-очным матрикиим, изменениями клеточной формы. Под фенотипом в данном случае понимается набор признаков, объединяющих как морфологические характеристики гепатоцята, так и экспрессию различных сывороточных, цитоскелетных и мембранных маркеров, локализацию мембранных домен-специфйческих антигенов, функционирование. Еыеокппроницаемых межклеточных контактов.

Изучение регуляции экспрессии различных признаков, входя-tEjtt в этот наРср, привело нас к пониманию того, что они являются членами дискретных блоков - эмбрионального и взрослого. Нэ-сомненно. что к вышеперечисленным признакам относятся такие и проли^ративннй статус клетки, а также экспрессия онкогенов. Как экспрессия раково-эмбриональных антигенов и изоферментов, так пролиферация гепатоцитов и экспрессия ряда онкогенов, входят, как нам.представится, в "-ямбркональний" блок признаков, активно работайещий. в развивающейся и регенерирующей печени, а

так&э в гепатоцеллширных карциномах. Как в ходе зибрионалыюгс становления организации печени, так и в процессе регенерации сутэствуют регуляторнью дахаинвми, вьашзчавдие "эмбриональный* блок признаков и включагаше "взрослый".

Конечно яэ, регуляция экспресса: генов связана непосредственно с событиям!, изучение которых возмокно лишь на молекудяр-ио-биологкческоц уровне. Однако многие наблюдаем нами и другими авторами закономерности позволяют предположить суЕзэствова-ние иного уровня регуляции - тканевого. Именно изучению этоп уровня регуляции и посвящена настоящая работа. Под тканевьс уровнем в дальнейшем мы будем подразумевать весь комплекс веаи-»»действий, протекающий в многоклеточных сообществах, сосредо точась в основной на контактных взаишдействиях клеток и к взаимодействия); с внеклеточным ыатриксом. Несомненно, сюда ю следует отнести различные дистантные воздействия - ростовы «{акторы, ьюдиаторы и гормоны. Ш, однако, практически не буде рассматривать эти воздействия. Их детальное изучение заслуззша ет отдельной работы.

Цель и задачи работы. Целью настоящая диссертационной ра боты являлось изучение закономерностей экспрессии AMI и выяс снекие основных характеристик тканевого уровня регуляции эксп рессии этого белка, роли кегасяеточных взаимодействий и вааимо действий клеток с внеклеточным матриксом в регуляции синтез v АФП. В соответствии с этим задачи работы заключались в следу* цэм:

1. Поиск иммунологических маркеров, ' характеризующих прс цессы становления и нарушено« дефинитивной балочной структур печени.

2. Иымуноыорфологическое изучение закономерностей синтез АФП, в сочетании с другими маркерами геиатоцитов. в развивал вейся и регенерирующей печени швей, а также в диффер.нцирова» ных спонтанных гзпатоцеллюлярных карциномах мышей.

3. Изучение вакономерностей ре-экспрессии АФП в первичш ыонослойных культурах взрослых мьшшых гепатоцитов.

4. Конструирование модельных систем in vitro, позволяют сохранить в культуре дифференцировочные признаки гепатоцитов изучение в этих культурах закономерностей индукции и ингибищ синтеза АФП.

5. Изучение влияния компонентов внеклеточного матрикса и его физической организации на синтез АФП in vitro.

6. Изучение возможной роли вксокопроницаемых шжсветочнш контактов в регуляции синтеза АФП.

Научная новизна и практическая ценность работы. Работа относится, в основном, к фундаментальным исследованиям. В ней впервые описаны закономерности ре-экспрессии раково-эмбрионального сывороточного белка альфа-фетопротеина, позволяющие с уверенностью утверждать, что его обратимая супрессия во взрослом организме определяется межклеточными взаимодействиями. Это подтверждено как наблюдениями in vivo, так и прямыми опытами in vitro с первичными культурами взрослых гелатоцитов из интактной печени мышей. Впервые обнаружена отчетливая обратная корреляция между функционированием высокопроницаешх контактов в гепатоци-тах и экспрессией в них альфа-фетопротеина. Впервые найдено, что трехмерная организация искусственного внеклеточного матрикса в культуре гепатоцитов является необходимым и достаточным фактором ингибиции "эмбрионального" фенотипа гепатоцита. Обнаружено, что сама по себе форма гепатоцита является важнейшим фактором регуляции экспрессии фетальных и взрослых признаков в гепатоците. Описание, наряду с вышеперечисленным, топографических закономерностей распределения различных гепатоцитарных маркеров в развивахявейся, взрослой, регенерирующей печени, а такяз в первичных гепатомах позволило сформулировать и конкретизировать представления о тканевом уровне регуляции синтеза как адь-фа-фетолротеина, так и всего фенотипа гепатоцита. Эти представления открывает перспективы изучения коррекции на тканевом уровне трансформированного (опухолевого) фенотипа клеточных популяций. С этим связано основное значение работы в теоретическом аспекте. Наряду с этим, разработанные в ходе работы модели реконструкции взрослой печени в тканевой культуре гюгут иметь и практическуп ценность, поскольку они могут быть использованы для исследования различных гепатотропных препаратов in vitro, а тахяе и в других экспериментальных работах, вудцакдихся в кудь-туральных моделях печени.

Публикации и апробация работа По теш диссертации опубликовано 23 работы. Материалы работы были долояены на VII

(Marburg, PRO, 1979), VIII (Таллин, 1980), XIV (Hebnikt, Finland, 1986), XVII (Freiburg, KRG, luu9) и XVIII (Москва, 1990) ежегодных конференциях международного общества раково-эм-Срионаяьной биологин и медицины; на I соне :ко французском симпозиуме по иммунологии опухолей (Москва, 1978); на Всесоюзном совещании "Иммунологические аспекты биологии развития" ('4осква, 1982); на II соьетско-французском симпозиуме но иммунологии опухолей (Мэсква, 1986); на всесоюзном совещании "Проблемы детерминации" (Мэсква,1988); на II симпозиум "Hepatic Gene Function In Health and Disease" (Cold Spring Harbor, USA, 1989); на симпозиуме "Sapporo seminars on cancer and differentiation" (Sapporo, Japan, 1989).

МАТЕРИАЛ И МЕТОПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена в основном с помощью морфологических и иммуногистохимических и иммунохимичееких методов.

1. Изучение локализации различных антигенов в развивающейся, нормальной, регенерирующей печени мышей и в гепатомах. .

Проводились исследование локализации АФП. альбумина, тран-сферрина; меморанных антигенов гепатоци/ов мыши - т. н. антигена желчных капилляров (AT I), АГ II, рецептора к асиалсгликопроте-инам; компонентов внеклеточного матрикса - фибронектина, лами-нина, энтактина, коллагена IV типа, геиаран-сульфат протьогли-кана; элементов цитоскелета - цитокератина с мол. массой 49 кДа, виыентина и актина

Выявление вышеназванных антигиюн проводили либо неаряиьь имыунофдуоресцентным методом, либо непрямым иммунщ.ероксидаэньа иетодом, либо пероксидазним t^ годом н-моч^ных чпгител с исполь-еованием ПА1Ькомплекса. Для ымвлони»! .¡-у\ -чных и мембранньо антигенов использовали материал, залигый и парафин после фиксации либо смесью формалин ацетон-фосфагмий Oyii».;> (0.03 U,pí 6.1), либо 10Х формалином на О. IM фосфатном буфере ¡7.3, либс смесью параформ-лизин-перйодат Na l¡ ряле пл., чаев был использован материал, зафиксированный безводным ацетоном с последующ проводкой через петролейный эфир (см. Глейб*рмш и др. ,1979; Engelhardt et al. ,1979. Компоненты цитоскелета выявляли как ш криостатных срезах из нефиксированного замороденного материале с последующей фиксацией срезов либо 1071 формалином, либо ацетоном, так и на парафиновых срезах после фиксации смесью пара-

форм-лизин-перйодат На В последнем случае, депарафинированные срезы перед обработкой антителами инкубирогали в течение 30 мин с 0.25Х раствором трипсина (см. Глейберман и др. ,1984). Компоненты внеклеточного матрикез выявляли на криостатиых срезах ив нефиксированного материала с последующей фиксацией срезов либо 10Х формалином, либо ацетоном в ряде случаев для выявления сывороточных белков проводили блокировку их секреции. Для этого за 2-4 часа до фиксации мышам инъецировали внутрибрюамнно колхицин из расчета 50 ют на г веса (см.Glelberman et al. ,1980).

2. Культуры генатсщутов из взрослой интактной печени мышей

а) шнослойные культуры

Суспензию гепатоцетоз получали после перфузии печени in situ последовательно растворами ЭГТА и коллагеназы. Суспензию клеток помешзли в пластиковые бактериологические чашки Петри диаметром 40 мм, которые обычно предварительно покрывалл жла-тиной. В ряде экспериментов в качестве субстрата использовали другие компоненты внеклеточного матрикса - коллаген I типа, фибронектин, лак-шин. Культивирование проводили в среде Лейбо-вича L-15 с 107. феталыюй сыворотки (см. Глейбермаи, 1982).

б)культуры с использованием коллагенового геля Коллагеновый гель готовили из раствора уксуснокислого коллагена I типа, выделенного из хвостовых сухожилий крыс, уксуснокислый коллаген на холоду смешивали в соотношении 4:1 с 5-кратной средой Дальбекко, содержащей 0.125 М NaOH и 0.26 М NaHCOg. Затем сиесь вносили в чашки для культивирования и помешали в терюс-тат на 37°С на несколько минут для полимеризации. При культивировании внутри коллагенового геля после прикрепления гепатоци-тов к юллагеповому субстрату в чалки вносили дополнительную порцию смеси коллагена со средой для полимеризации и после окончанию полимеризации вносили полную среду для культивирования (см.Gleiberman at al. ,1989). Среду меняли ежесуточно.

в)ко-кудьтуры гепатоцитов с крысиными эпителиальными клетками печени

Методика ко-культивирования гепатоцитов с эпителиальными ¡слетками печени впервые была разработана в лаборатории Л. Gu111ouzo (см. A. Gui 1 louzo. С. Guguen-Gul 1 louzo. 1986). Ш слегка модифицировали эту методику, убрав из культуральной среды глюкокортико-иды и уменьшив клеточную плотность. В культуральнне чашки диа-

- 6 -к

метром 40 мм вносили около 3 х 10° живых гепатоцитов и после № прикрепления спустя примерно 2 часа добавляли около б х 1(Р крысиных эпителиальных клеток линии IAR-20. Среду в этих культурах меняли 2-3 раза в неделю.

3. Имцуногистологическое и иммунохимическое изучение культу гепатоцитов

Локализацию вышеперечисленных антигенов в культурах гепа тоцитов проводили непрямыми иымунофлуоресцентным и имыуноперок сидазным методами. Культуры фиксировали 10Z формалином на забу ференном физиологическом растворе с добавлением 0.05Х сапонин как в фиксатор, так и в последующие промывочные растворы и растворы антител, для пермеабиливацин клеток В ряде случае для выявления промежуточных фнламентов перед фиксацией юетк обрабатывали IX раствором тритона на физиологическом растворе Актин выявляли с помощью меченого TRITC фалловдина.

Секрецию сывороточных белков в среду изучали с помощь ивотахофореза на ацетат-целлюлозных мембранах с последующим № мунологическиы проявлением после кросс-электрофореза в агарозу содержащую антисыворотки к соответствующим белкам. В ряде сад чаев АФП в среде полуколичественно измеряли реакцией пассивнс гемаггхютинации с бараньими эритроцитами, нагруженными антит« лат к АФП (см. Глейберман,адьгорт,1984).

А. Изучение высокопроницаемых контактов в культуре

Высокопроницаемые контакты (ВПК) изучали с помощью югье» ции в клетки флуоресцентного красителя ' Лоциферового яэлтоп Инъекции проводили на люминесцентном микроскопе Ломам И-2 п< фазовым контрастом с аодноиммерсионным объективом 40х с помовд стеклянного микроэлектрода с диаметром отверстия меяьяе 1 мга Поступление красителя в клетки обеспечивалось ионофоревом. Cti пень выраженности И!К регистрировалось по двум параметрам - : числу клеток, в которые перетекал краситель за 2 »шуты пос инъекции ("степень связи") и по проценту инъекций, при котор наблюдалось перетекание в соседние клетки ("процент связи"), каадую временную точку проводилось не менее И инъекц (см. Глейберман и др. ,1987; Gleibernan et al. , 1989; Глейберма Шаровская.1990).

- 7 -

5. Антитела, использованные в работе

В работе использовали кроличьи аффинно очищенные антитела к мышиному АФП. Их выделение из соответствующих моиоспецифичес-ких антисывороток проводили на кюфюсорбете на основе цианб-ромированной сефарозы 4В, содержащем злекгрофоретически чистый АФП. Кроличьи аффинно очищенные антитела к мыпмньгм альбумину и трансферрину были предоставлены В. С. Полтораниной и К а Знгель-гардт (БОНД АМН СССР); кроличья моноспецифическая антисыворотка к мышиному рецептору к асиалогликопротеинам - Д. Ы. Беленьким (ЙБЮС АМН СССР); к коллагену IV типа мыши - Е. Ингвал (США); к фибронектину, ламинину, гепаран-сульфат протеогликану - А. В. Любимовым (ВОНЦ АМН СССР), к цитокератину 49 кДа - С. М. Трояновским (ВОНЦ АМН СССР); к виментину - И. М. Тинт (МГУ); к антигену желчных капилляров (I АГ) и к АГ II мышиных гепатоцитов -Н. И. Куприной и Т. Д. Рудинской (ВОНЦ АМН СССР).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. морфологические ЗАКОНОМЕРНОСТИ экспрессии ФЕНОТИПА ГЕПАТОЦМТА

ТОШЕЯХШП1ЧЕШ21 ПОДХОД Я ИЗУЧИВ» ПРОЦЕССОВ РЕГУЛ8ЦЭД В ПК*®"!

Основа процессов дифференцировки - это регуляция дифференциальной экспрессии генома Имея дело не с индиввдуальннш клетками, а с многоклеточными сообществами, все время сталкивается с тем, что в большинстве систем эти процессы морфологически строго упорядочены. Это с необходимостью ведет к то «у. что изучение процесса дифференцировки невозможно только сугубо шлекулярно-биологическими методами. Топобиологический подход к зтим процессам, развиваемый в настоящее время (см. Е<1е1тап, 1988), восходит к представлениям, развиваввимся в ганце прошлого столетия. В общей форме эти представления были сформулированы ОпзЪ: судьба клетки есть функция от ее положения в системе. Правильность этого положения не вызывает сомнения. Однако конкретные механизмы, позволящие связать события в ядре, индуцирующие или супрессирухэдие активность тех или иных генов, с надк-леточными событиями - изменениями в расположении клеток, изменениями их формы, изменениями их взаимодействий с соседями и внеклеточным матриксом - остаются неизвестными.

Трудности здесь связаны как с отсутствием адекватных экспериментальных подходов, так и с отсутствием (или налой раара-

- 6 -

ботанностыо) яснюс экспериментальных систем.

йзлокенные ниже данные показизаот, как нам кажется, ч печень является практически идеальной экспериментальной скет мой для работы в этом направлении.

Прежде всего, морфологически ткань печени весьш прос устроена - это однородная тсса паренхиматозных однотипных кл ток, упакованных в однослойные пласты. Пласты эти как бы jísojs рованы друг от друга системой кровеносных капилляров-синусо дов. В паренхиме в шахматном порядке распределены фггзиологлче ккз оси, определявшие направление потоков питательных введете кислорода - сосуды (система центральных вен и триад). Вся s система могла бы бьггь довольно легко формализованной к духе т орий позиционной информации. Однако эксперишнтальный цате pi пока явно недостаточен для тшеих формализация.

Наломанные ниже данные ясно сшдательсвуот о наличии kqï ротных «йханизшв, связанных с ш»клеточные взаикодейстшап взаимодействиями гепатоцитов с вкослеточииу штр.!;ксоы, а ущ с изменениям» формы отдельных гепатошггов, в регуляции экспрг с ян определенных гепатоцнтарных генов, иаркирукгдах дц^фэрош ровочные процессы в ткани печени.

каша rpáSEHLCS В ЕЗЧГ2] (Глейберман и др. ,1979; Glelberiran et al. ,1980,1983;

Гдейбериал,1982; 61ôibsr.-пзп, Abolov, 1S85) Хорошо известно, что печень является иастом синтеза под ЛчШэго количества белков ллазш крови. С ¡¡есо1;неккостьп до ашю. что б основной эти белел продуцируются гепагоцкташ. ряду с зтп«!, печень слудаг детож'.циФушЬп.-: органон. Гепатоц перерабатывает kjaccy oiœo- »¿эндогенных токсичных bge&ctb, з еативая их с помощью различных рецепторов и перерабатывая с ?дощью разнообразных ферментативных систем. Наконец, печень лпется одним иа главных дано гликогена и Еыступазт в рож: sa еаадэго органа к распределителя питательных весэств. Кб ас ■;vo'ro следует, что, крош по^дорл&шя нзобходшш длл сдаст -с^пга .¿уккцкй, в ;;рсгр&:иу де1&»реншфозкл пзчваоч •".'/Л'„:< чхекк? пз21Гчзс?во так ''Зуикцдо >

■■• \ •.' '.тСжъ'лn:o rouos: и ср.зздзйягзг '.''ЗКоТ"я ro-'tt

-. . с-!-:-:,; ет-о:хг* 2 r::ní:roííií:ií; ..•..-.•!;

3 ■ ... o..i;a л-ч^ролц^уоЕлНнгл ¡^¿тка г.;

тс? .¿у;;: .л слс-pï".

Вопрос о том, выполнятся ли все эти функции каздой клеткой. или в ткани печени есть дискретные популяции клеток, различающиеся по набору вышеупомянутых функций, в настоящее время по-видииому имеет лишь историческое значение. Саш представление о том, что в печени существуют дискретные, физиологически различающиеся клеточные популяции (а может быть даке клоны, различающиеся по экспрессии сывороточных белков) возникло из первой работы, посвященной иммунофлуоресцентноиу изучению локализации сывороточных белков в ткани печени (НатазМта е1 а1. , 1064). Эти авторы обнаружили альбумин лишь в 10% клеток, в то время, как фибриноген выявлялся лишь в IX клеток, не совпадающих по локализации с альбумин-содержавдши. В последующие 15 лет ряд авторов подтвердили эти наблюдения (см. например Энгельгардт и др. , 1972;Глейберман, 1978; ). Однако позднее оказалось, что они связаны с артефактами фиксации и подготовки тканей к имму-исгистохииическому изучению, а также с отсутствием адекватных контролей, позволяющих отличить истинные места синтеза от клеток, пассивно или активно захвативших белки крови при жизни или непосредственно в момент вырезания кусочков печени для фиксации. В действительности, как было показано рядом авторов (Баранов, Рукосуев,1979; Баранов и др.,1986), альбумин продуцируется практически всем гепатоцитами. Аналогичные данные были пофчваы с использованием блокировки секреции в отношении С-реактивного белка (КиэЬпэг.РеЫтапп. ,1978).

Йеем удалось, используя тот яэ прием - блокировку секреции белков из гепатоцитов с помощью колхицина - обнаружить в каэдом гепатоците нормальной я регенерирующей печени взрослых мыаэй альбумин и трансферрин (61е1Ьегшап аЬ а1. ,1380). Интересно, что в иктготной печена взрослых мышей наблюдались градиенты з распределении обоих белков с максимужш у портальных трактов и минимумов у центральных вен. Аналогичное градиенты были ошюаны для С-реактивного белка з печени кроликов в острой фазе воспаления (КизЬпег еЬ а1. ,1978). Важно отметить, что з первые дни после роддения градиенты в отношении синтеза альбумина и транс-Феррина отсутствуют. Все гепатоциты содержат пржзэрпо равные количества обоих белков. Градиенты возникает лишь к концу второй недели постнатальной жизни, параллельно тому, как выстраивается дефинитивная баночная структура печени. Аналогичный образом, удалось обнаружить, что в регенерирующей после отравле-

шш СС14 печени ышей такие отсутствует градиент синтеза этих двух вышеназванных белков - Есе клетки содержат разное их количество, причем на более высоком уровне, чем наиболее интенсивнс продуцирующие те же белки клетки в интактной печени. Данные эт1' Оылм позднее подтверждены с помощью иммуно-здектронкой микроскопии (Баранов и др., 1986). Следует также отметить, что альбумин и трансферрин были обнаружены во всех гепатоцитах в краткосрочной культуре интактной печени взрослых мышей (Глейбер-ман,1982; ГлейОерман.Эльгорт, 1984).

Таким образом, в отношении всех изученных белков плазы крови можно считать установленным некоторую эквивалентное« всех гепатоцитов. Характерно также, что во взрослой интактно1 печени вариации в количествах этих белков, содержащихся в цитоплазме клетки, морфологически упорядочены. Отмеченный порто-центролобулярный градиент совпадает с описанным градиентом ] степени выраженности шероховатого эндоплазматического ретикулу-ма (БсГоискег е1 а1. ,1378). Аналогичный порто-центролоОудярш градиент описан и для пролиферативноЯ активности гепатоцито] при постнатальном становлении дефинитивной организации печени ■ в первую очередь затухает синтез ДНК и пролиферация в центроло-булярной области, в последнюю очередь - в перипортальных районах, в то время как появление полиплоидных и многоядерных гепатоцитов происходит с обратным градиентом (ЬеВоиЬоп,1974).

Активность различных ферментов распределена по печени так * же соответственно порто-центролобулярному градиенту. Так раз личные формы цитохрома Р-450 (как индуцируемые, так и постояни присутствующие) имеют максимум у центральных вен. Интересно что сам процесс индукции фенУбарбитальной и метилхолантреново форм цитохрома Р-450 имеет ярко выраженный градиентный характе (Коляда,1982).

Аналогичные данные по поводу множества других ферментны систем печени суммированы ранее (см.61е1Ьегшап,АЬе1еу,1985).

Замечательный пример оппозитно-градаентного распределен« представляют собой так называемые канцероген-связывающие белк .лигандин и А-белок. Первый из них во взрослой интактной печен крыс распределен с максимумом у центральных вен, а второй -максимумом у портальных вен. 6 ходе постватального становлени организации печени можно наблюдать сначала полное отсутстви градиента, одинаковое количество этих белков в клетках. Зате градиенты обоих белков возникают, но имеют одинаковое налрав

- И -

ление. И лишь аатем возникает дефинитивная оппозитная система градиентов (Кагауалоуа еЪ а1. , 1080).

Градиентное распределение характерно и для ряда мембранных паркеров печени. Наиболее характерным в э*ом сшсле является специфический мембранный маркер гепатоцитов - рецептор к асла-догликопротеинам. этот рецептор, специфический компонент синусоидальной поверхности гепатоцитов, имеет максимум у портальных вен. Другой маркер синусной поверхности, так называемый II АГ, имеет обратный градиент.

Для многих маркеров, в первую очередь мембранных, наиболее ярким из которых является так называемый антиген келчных капилляров (или 1АГ), характерно равномерное распределение по дефинитивной ткани печен;; (l<hro!rkova, В>?1озЬарк 1 ла, 1974). Однако, в ходе постнатального становления организации дефинитивной теяни печени отчетливо виден градиентный характер появления (или перераспределения) этого маркера с максимумом у порталы лх вен и минимумом у центральных (Глейберман и др. ,1979; 61е1Ьегтап еЬ а1., 1983).

Таким образом, ткань печени как (морфологически, так и физиологически представляет собой некую непрерывную трехмерную структуру, ряд важнейших-параметров которой имеют отчетливый градиентный характер.

То, что этот градиент не является навеки застывшим и клетки способны менять уровень экспрессии тех или иных признаков в зависимости от внешних воздействий, хоропо видно из цитированных зыше данных по изменению синтеза альбуьмна при регенерации печени. В приведенных выше работах это усиление синтеза прямо связано с резкой перестройкой градиентов в печени - каждая печеночная балка в результате действия ССЦ как бы обрубается, вследствие чего градиент нарушается. Существенные изменения градиентных распределений происходят в связи с пролиферацией печени. Так, при регенерации, вызванной частичной гепатэктоми-ей, резко нарушается экспрессия цитохромов Р-450, вследствие чего печень перестает реагировать на четыреххлористый углерод. Можно было бы привести и множество других частных примеров. Однако важнее было бы найти общее правило.

Итак, если мы представляем ткань печени как систему градиентов и, если по нашему представлению экспрессия каждого инди-

вндуальиого признака в гепатоците зависит от его топографичес кого положения в этой системе, то 1)додаан быть механизм, под деряивавдий этот градиент; 2)поломка или вселенная блокада это го механизш должна временно нивелировать градиентное распреде ление признаков; 3)наконец, в градиентной системе при локальны ее нарушениях должны возникать граничные области с резко изие ненкыми характеристиками. как нам катится, все эти три усдовл выполняется в ткани печени.

Хорошо известно, что клетки в солидных тканях связаны сис те!йй различных специализированных контактов, среди которых на в данном случае будут интересовать тек называемые высокопрони цаэмые контакты (ВПК). изрфологичэским субстратом ВПК являете щзлзвыэ контакты - близко расположенные участки меьйран коатак тирующих клеток, содекащае гексагонально упакованиьге белковк глобулы с отверстием в центре. Каддая такая глобула представля ет собой полуканал. Соединившись с аналогичным подуканалоы мембране контактирующей клетки, две глобулы образуют канал, чэ рзв который из клетки в клетку способны диффундировать ионы «атаболиты и любые гидрофильные векретва с шл. массой до 100 Да. Открытие системы ВПК, превращаюсь, как выяснилось, лхйу! ткань в своеобразный физиологический синцитий, дало воьмокносл предположить, что именно эта система и выступает в роли инструмента над клеточного контроля аа поведением индивидуальных членов клеточной популяции (см. Ьоаиеазит, 1979). Более чем двадцатилетнее изучение роли ВПК в регуляции поведения клеток ш позволило пока в достаточной степени конкретизовать эту гипотезу, однако имеющиеся данные говорят о том, что резкие перестройки системы ВПК надежно коррелируют с лроцессаш морфологически упорядоченной дифференцировки в ходе эмбрионального развития млекопитающих, с процессами опухолевой трансформации. Существуют данные, что система ВПК связана с контролем морфогенеза у гидроидов и'с контролем развития у амфибий (Ьое*гепз1е1п, 1979; Ргагег ©I а1. ,1987).

Почекь, как хорошо известно, представляет собой один из наиболее ярких пршгеров ткани, объединенной с помощью ВПК в единый физиологический сшвдггшЪ Еало Оы логично предположить, что и в тканк печэни в качестве (¿зяанкзна, контролирующего под-пзрганка градипуа сьвтупагт сиетека ВГЙ1

2-ка го говорилось о том, что рзгеиератотто» процессу с

- ia -

чеки связаны с нарушениями градиентов (при том, что при реге-рации, вызванной частичной гепатзктомией, морфологически ань печени остается практически неизменной, лишь резко усили-ется пролиферация). Ряд работ убедительно свидетельствуют о и, что в процессе регенерации печени временно практически лностью исчезают ВПК (Yee,Revel, 1978;Dermtctzel et al. ,1987). о исчезновение в регенерирующей печени крыс наблюдается 28 сам после гепатэкгомии, затем после 40 часов начинается восс-новление системы ВПК. ременные параметры данного процесса хо-шо согласуются с нарушением и восстановлением в ходе регене-ции различных печеночных градиентов.

%о же касается особых граничных областей, возникающих при кальном нарушении градиентов, то речь о них пойдет ниже. Как яснилось в ходе работы, ярким маркером возникновения таких ластей является реэкспрессия во взрослых дифференцированных патоцитов змбриоспецифического сывороточного белка ал^фа-фе-протеина

2. альфа-фетопротеин как маркер тканевой нестабильности

Известно, что раково-эмбриональный сывороточный белок аль-,-фе?опротеин( АФП) синтезируется в печени как в эмбриогенезе, к и при развитии гепатоцеллкляркых опухолей. Наряду с этим, > взрослом организме синтез А® обнаруживается и при регенера-и печени. Основной излагаемый экспериментальный материал бут связан с анализом этого феномена

Ранее было убедительно показано, что синтез АФП при реге-рации печени мышей связан преимущественно с его реэкспрессией | взрослых дифференцированных предсуществующих гепатоцитах Inge 1 hardt et al. ,1976). Таким образом, по крайней мере в [«ной экспериментальной системе синтез АФП связан со своего |да "эмбрионаяизацией" взрослого гепатоцита.

СИНТЕЗ АФП ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ У ШШЯ

(Глейберман и др. ,1979,1984; Glelberman et al. ,1983) Появление AMI в крови мышей регистрируется обычно спустя te 24 часа после начала регенерации печени, вызванной как частой гепатзктомией, так и отравлением рядом гепатотоксинов, в ютшхти четыреххлористым углеродом (Абелев и др. ,1963; Баки-)в, 1968). При отравлении СС1, в каждой печеночной дольке обра-

еуются пентролоОуяарные иекрозы ухе через 6 часов оосле воздействия. Максимальных размеров они достигают к 18 часам. При этом, погибает примерно 40-45Z гепатоцитов. Огрого стандартная картина повреждения и последующей регенерации печени при это», вовдействии привела к тому, что данная модель стала очень популярной для изучения синтеза АФП в регенерирующей печени.

Известно, что в регенерирующей после отравления СС14 печени мышей реэкспрессию АФП можно выявить у мышей большинства линия примерно в 6-15% живых гепатоцитов. При этом, максимальное количество АФП-положительных клеток обнаруживается на б>9б часо! после воздействия. Подавляющее большинство АФГЬ позитивных клеток при этом локализуется преимущественно в перинекротическо! области. (Engelhardt et al. ,1076).

Этот перинекротический слой, наряду с синтезом AMI, имеез набор отчетливых характеристик - в нем происходит перераспределение элементов актинового и прекератинового цитоскелета, временная утрата мембранных доме в-специфических маркеров (т.н. антигена желчных капилляров и рецептора к асиадогл/копротеинам), изменением морфологии клеток - гепатоциты приобретают несвойственную им вытянутую, фибробластоподобную, "ползущую" морфологи». Таким образом, регенерация печени, вызванная действием СС14, а также другими гепатотоксинами (парацетамолом, аллиловыь спиртом) приводит к временному появлению вокруг некрозов слоя АФП-поз ит ив них клеток с резко измененными характеристиками.

Следует также отметить, что при регенерации печени, выз-4 ванной стандартной 2/3 гепатэктомией не наблюдается каких-либс отчетливых закономерностей в распределении АФП-содержащих клеток. о

Несмотря на то, что как в регенерации, так и при развитии печени, а также при гепатоканцерогенезе синтез АФП коррелирует с пролиферацией клеток печени, тем не менее прямая проверка связи пролиферации с синтезом показала, что взрослые „ифферен-цированные гепатоциты при регенерации печени а)могут приступа« к синтезу АФП до начала в них синтеза ДНК (Engelhardt et al., 1976); б)столь яе интенсивно синтезируют АФП в условиях блокировки синтеза ДНК постоянным введением оксимочевины (Лазарева, 1979); в)наконец, при местном локальном повреждении cxot гепатоцитов, прилеганий к некротическому участку, синтезирует АФП при полном отсутствии пролиферации (Полторанина,1981)

Следует отметить, что и в модели индукции АФП с помощью локального повреждения ткани печени перинекротический слой, состоящий из АФП-содержащих гепатоцитов, обладает теми же характеристиками, что и перинекротический слой в печен*!, регенерирующая под действием СС14 - измененная морфология, перестроенный цитоскелет, временная утрата домен-специфических мембранных антигенов.

Таким образом, как мы видим, выполняется и третье условие - локальное нарушение градиента приводит к вычленению граничного слоя с особыми характеристиками.

Ткань регенериоуюшей печени характеризуется также и другими признаками - синтезом ряда эмбриональных изоферментов (см. ЗЪар 1га, 1973), временной экспрессией ряда онкогенов (газ, Гоэ, туе) (см.ЬеГГег! еЬ а1. ,1988). Однако в этих случаях нет конкретных данных о морфологическом характере распределения даных маркеров в ткани печени.

Изложенные выше данные привели к предположению о -ом, что реэкспрессия АФП в регенерирующей печени связана с локальными нарушениями балочной структуры, с временной "индивидуализацией" гепатоцитов и выхода га из под контроля окружающих клеток (см. АЬе1еу,1978;. в1е1Ьегшап, АЬе1еу,1985).

ПЕРЕСТРОЙКИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО илтржса при регенерац ия печени

(Кис^ауЬзеуа еЬ а1. ,1990)

Немногочисленные данные, имеющиеся в настоящее время, указывают на то, что перестройки внеклеточного матрикса играют существенную роль в регенераторных процессах в печени. Так, Саг1ззоп еЬ а1. (1981) обнаружили, что при регенерации печени мышей после отравления СС14 в паренхиме печени возникает отсутствовавший там в норме белок, входящий в состав базальных мембран, ламинин. Более того, если гепатоциты из интастной печени одинаково эффективно прикрепляются к фибронектину и ламинину, то адгезия к ламинину у гепатоцитов из регенерируквдэй печени сушествепо выше, чем к фибронектину. Поскольку, как было показано позднее, увеличение количества молекул рецептора к ламинину на поверхности клетки характерно для многих, если не всех, гепатом, и, кроме того, метастазирование многих типов опухолей определяется возможностью опухолевых клеток прикрепляться к ламинин. базальных мембран, мо?кно думать о неслучайном совпадении появления в регенерирующей печени ламинина, увеличения количес-

тва рецепторов к нему, а также всех остальных перестроек гепг тоцита при регенерации, включая исчезновение ВПК и появлеш Affil Следует спметить, что появление ламинина происходит yi через несколько часов после отравления печени, то-есть, si один из самых ранних признаков начала регенерации.

Ыы изучали локализацию в нормальной, развивающейся и рег< нерирунцгй после отравления СС14 печени швей фибронекткна, ю лагена IV тип, гепаран-сульфат протеогликана, ламинина и энтш тина Существенным результатом оказалось то, что в регенериру] цЭй печени, наряду с ламинином, на поверхности всех гепатои тов, обращенной к синусоидам, появлялся и другой спецнфичесга компонент бааальных мембран энтактин. Его появление регистрир; ется уже черев несколько часов ( не более 5) после отравлен» Как и для ламинина. для энтактина был ярко выражен градиента характер распределения по паренхиме с максиму\<ами у центролоб; лярных некрозов. После заполнения некровов живыми гепатоцита! яркость окрашивания ламинина и энтактина падала, однако в св< яееаживленных районах по прежнему выявлялись весьма еаметн: количества обоих белков. Пэлное их исчезновение происходи, лишь после восстановления морфологии регенерировавшей печет

Таким образом, можно сделать вывод, что первые этапы п< рестройки ткани регенерирующей печени, приводящие к появлен физиологически изолированных гепатоцитов, способных актив: двигаться в участки поражения, связаны с появлением в паренхи по крайней мере двух специфических компонентов базальных мем ран. отсутствующих (или не выявляемых вследствие маскировки) йнтактной паренхиме.

Можно ли смоделировать и> vitro проц<~~с регенерации печ ни? По-видимому, иг имеющихся у нас в настоящий момент модел наиболее пригодна для этого система культивирования гепатоцит в трехмерном коллагеновом геле (см. в последующих главах). Л кальнов нарушение целостности геля приводит к локальным ж мо фологическмм перестройкам, очень близким по характеру к те которые наблюдаются в регенерации. Не значит ли это, что одн из пусковых моментов регенераторного процесса является наруо ние структуры внеклеточного матрикса печени? Интересно было это проверить.

тмологичвсяие закономерности синтеза афп при постиатальном

развитии пкчюш

(Глейберман и др. ,1979; Gleíborman et al. ,1983;

G]a i barman,Abolev,1985).

Замечательным оказалось то, что в ходе постнатального становления организации печени мышей и крыс затухание синтеза АФП имеет также морфологически упорядоченный характер (см. Шилова и др. , 1974;). В первые дни после рождения АФП выявляется во всех гепатоцитах. Однако к концу второй недели наблюдается резкое затухание синтеза АФП, к этому cpoicy он обычно выявляется лишь в одном слое гепатоцитов, окружающем центральные вены. На промежуточных стадиях наблюдается отчетливый порто-центральный градиент Aíí! с максимумами у центральных вен.

Исчезновение АФП из печени сопровождается морфологически видимым становлением балочной структуры, возникновением градиента альбумина, мембранных компонентов - рецептора к асалогли-копротеинам и П АГ и т.д. Наиболее интересные превращения наблюдаются с I АГ (антигеном желчных капилляров). Если в первые дни после рождения печень морфологически представляет собой рьклую неупорядоченную ткань, в которой перемешаны гепатоциты и кроветворные клетки, то с помощью окраски антителами к I АГ удается обнаружить то, что гепатоциты собраны в своеобразные ацинусн, в центре каждого из которых проходит желчный капилляр. Параллельно затуханию кроветворения в печени и выстраиванию балок (которое, как было выше указано, коррелирует с исчезновении по порто-центральному градиенту АФП) происходит и перераспределение I АГ - он начинает выявляться так же, как и во взрослой печени на контактирующих поверхностях 2-3 соседних гепатоцитов. В последнем слое центролобуляркых гепатоцитов, содержащем АФП, на этой стадии 1 АГ отсутствует.

Таким образом, здесь, как и в регенерирующей печени, имеет место отчетливая корреляция между присутствием АФП в клетках и отсутствием на их поверхности I АГ.

Кроме того, из материалов, приведенных в настоящем разделе хорош видно, что если в регенерирующей после отравления четы-реххлориетим углеродом печени мышей, а также при локальном повреждении ее т«-лкд, синтез АФП связан преимущественно с локальными крушениями балзчней структуры, то в развивающейся печени затухание синтеза ярко коррелирует со становлением дефинитивной орган изшвш по чен и.

Все это свидетельствует в польау того, что сиатеэ АФП на тканевом уровне регулируется локальными межклеточными взаимодействиями. Одной из наиболее привлекательных для нас рабочих гипотез было предположение о том, что непосредственным сигналом для включения синтеза АФП во взрослом гепатоците является его "индивидуализация", выход из под контроля со стороны контактирующих гепатоцитов. При этом, реальными кандидатами на роль ре-гуляторных механизмов могли быть различные контактные системы гепатоцитов - как мембранные белки межклеточной адгезии, так и специфические контактные структуры и, наконец, наиболее привлекательные с нашей точки зрения - высокопроницаемые межклеточные контакты (ВПК).

Экспериментальному анализу данной гипотезы будет посвящен раздел, связанный с игучением закономерностей синтеза АФП в первичной культуре гепатоцитов из интактной печени взрослых мышей. Однако прежде, чем к нему перейти, нужно вкратце остановиться на закономерностях синтеза АФП в гепатоцеллюлярных опухолях.

ТНАКЕЗЫК МЕХАКГШ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА ДСП В ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ ОПУХОЛЯХ

(Шилова,Глейберман,1884; БЬ1роуа,1Ьегтал,1985)

Ассоциации синтеза АФП во взрослом организме с гея^тоцел-лшярными опухолями явилась первым описанным феноменом, связанным с АФП (Абелев и др. ,1963). Несмотря на то, что этот феномен давно используется в медицинской практике как ранний и весьма надежный тест на возникновение гепатоцеллюлярных опухолей, а также тератокарцином яичка и яичника (см. АЬе1еу,1974). причин возоСловленин синтеза эмбрионального бежа в опухолях печени остаются неясными.

Многочисленные клинические наблюдения показывают наличие достоверной корреляции между уровнем анаплазии ткачи опухоли и количеством АФП в крови, а также числом АФП-продуцирующих клеток в опухоли. Это хорошо согласуется с развивавшишея представлениями о том, что, по крайней мере, в данном случае АФП продуцируют клетки эмбрионального типа, либо схожие с клетками-предшественниками дифференцированных гепатоцитов, иди же соответствующие клеткам, находящимся на первых ступенях диффе-ренцировочного пути гепатоцита (см. АЬе1еу,1974).

На ранних этапа химического гепатоканцерогенеза (в острой фазе) наблюдается временная вспышка синтеза АФП, который в данном случае связан как правило с молодыми клеточными формами, морфологически являющимися переходными между так называемыми "овальными клетками" (предполагаемыми клетками-предшественниками как для гепатоцитов, так и для клеток эпителия желчных протоков) и гепатоцитами. Эти переходные элементы морфологически весьма схожи с эмбриональными гепатоцитами (Tchipysheva et al. ,1977).

Интересно, что с помощью иммуноэдектронной микроскопии в регенерирующей печени мышей удалось обнаружить мелкие клетки, схожие по морфологии с клетками холангиол, содержаще как А®, так и альбумин, но не имеющие мембранных антигенов гепатоцитов (Engelhardt et al. ,1984). По-видимому, эти клетки являются эквивалентом либо "овальных клеток", либо "молодых" гепатоцитов, продуцирующих АФП в острой фазе гепатоканцерогенеза у крью. Очевидно, что эти мелкие, "молодые" клетки имеют прямое отношение к ранним этапам дифференцировочного пути гепатоцита.

Наконец, особняком стоит вопрос о синтезе АФП в морфологически доброкачественных опухолях. Были изучены спонтанные опухоли печени, возникающие к концу 2 года жизни в печени девственных самцов линии ' мышей СБА. Как выяснилось (Шилова и др., 1983), примерно треть этих опухолей были морфологически низко дифференцированными и содержали довольно много АФП-продуцирующих клеток. Морфологически эти АФП-содержаще клетки были непохожи на взрослые гепатоциты, а скорее напоминали "молодые" формы. К ним, вероятно, можно отнести все вышесказанное в отношении АФ11-продуцирующих клеток перевивных гепатом Зайделя и Морриса. Наибольший интерес, с нашей точки зрения, представляли высокодифференцированные спонтанные гепатомы, обнаруженные у большей части этих мышей. Как правило, эти опухоли состояли из клеток, морфологически мало отличимых от взрослых дифференцированных гепатоцитов. В подавляющем большинстве случаев данные опухолевые узлы были полностью АФП-отрицательными. Однако в них мойно было индуцировать появление АФП-содержащих клеток, нанеся бритвой небольшой надрез на поверхность опухолевого узла Спустя трое суток в перинекротическом слое выявлялись АФП-содержащие клетки, аналогичные тем, которые были найдены в перинекро-Т1П-. сном слое после нанесения минимального повреждения ¡штактной

печени. Таким образом, по крайней мере в дифференцированных ге-патомах механизм индукции АФП на тканевом уровне схож с таковым в регенерирующей печени. Это может свидетельствовать о том, что и здесь "эмбрионализация" клетки связана резкими локальными нарушениями структуры ткани, с изменениями межклеточных взаимодействий, с "индивидуализацией" клеток.

Данная гипотеза нуждалась в экспериментальном подтверждении. Наиболее прямой и логичный путь, как нам казалось, было получение суспензии гепатоцитов из интактной печени взрослых животных, что автоматически должно было привести к разобщению всех межклеточных контактов и к нарушению взаимодействий гепатоцитов с внеклеточным матриксом, т. е. к тотальному разрувению структуры ткани, с последующим культивированием гепатоцитов.

3. СИНТЕЗ АФП В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГЕПАТОЦИТАХ МЫШИ РЕЗЕШ1РЕССИЯ СИНТЕЗА АФП В ШЮСДОЙШИС КУЛЬТУРАХ ГЕПАТОЦЩОЕ Н СЙСГЕЫА ВШХЖШРОШЩАЕШХ КОНТАКТОВ (ВПН)

(Глейберман,1982; Глейберман,Зльгорт,1984; Глейберман и др., 1987а; Глейберман, ШэроБская,1990)

К моменту начала этой работы в литературе появились сведения о том, что в первичных культурах интактной печечи взрослых Крыс и мышей наблюдается реэкспрессия АФП (Leffert et al. ,1978; Sirica et al. ,1979; DeNechaud et al. ,1979). Однако из этих работ не было ясно, насколько эта реэкспрессия носит массовый характер, в скольких клетках она происходит, так как авторы лиш определяли количество АФП (как правило, весьма небольшое), продуцируемое в среду.

Мы провели иммуногистох^мическое изучение реэкспрессии АФ1 в монослойных культурах интактных взрослых мышиных гепатоцитов.

Оказалось, что изоляция гепатоцитов с последующим культивированием является самым мощным стимулом реэкспрессии АФП. Первые АФП-содержащее клетки появлялись в этих условиях после 2 суток культивирования. Как правило, к 5 суткам более 50Z культивируемых гепатоцитов становились АФП-продуцирующими. Следует отметить, что в этих опытах были использованы мыши С57В1/6, i печени которых in vivo при регенерации не удается обнаружит] Солее 1Z АФП-позитивных гепатоцитов. Впрочем, использование мышей других линий (AKR, BALB/c, BALB/c/J, СВА) для культивирования дало аналогичные результаты. Здесь, в отличие от ситуаци!

" РЛ -

in vivo, не были обнаружены ыежлинейнне различия. Подробнее об этом будет сказано нияе.

Синтез гепатоцитами АФП in vitro сопровождается, как и in vivo, изменением морфологии гепатоцитов, утратой домен-специфических маркеров, таких как I АГ и рецептор к асиалогликопротеи-нам, резкой перестройкой системы микрофиламентов и промежуточного цитоскелета (включая экспрессию соединительно-тканного белка промежуточных филаментов виментина), а также утратой ВПК.

Изучению последнего феномена было посвящено несколько серий экспериментов. ВПК во всех случаях исследовали с помощью флуоресцентного красителя Люцифера желтого СН, инъецируемого микроэлектродом в клетку-реципиента с последующим подсчетом через фиксированный промежуток времени числа клеток-доноров, получивших краситель. Этот метод основан на том, что флуоресцентный краситель люциферовый желтый, обладающий мол. массой около 440 Да, легко проходит через ВПК.

В ходе этих экспериментов было выяснено следующее:

1)Сразу же после выделения и прикрепления к культуральной подложке гепатоциты не имеют ВПК, первые признаки наличия ВПК появляются через 4-5 часов после прикрепления. Максимальные уровни ВПК наблюдались к. "4-48 часам культивирования, после чего происходило резкое падение обоих измеряемых показателей ВПК - числа клеток, в которые перешел краситель в течение 2 минут после инъекции и процента случаев, в которых вообще происходило перетекание.

2) Первые АФП-содержащие клетки появлялись в этих опытах как правило начиная с 3 суток культивирования; их процент нарастал параллельно падению показателей ВПК. Увеличение доли АФП-продуцирующих гепатоцитов хорош коррелировало с падением уровня ВПК.

3)Наблюдался большой разброс как между опытами, так и внутри каждой культуральной чашки по распределению АФП-содержа~ ких клеток и по степени выраженности ВПК, что, как было предположено, связано с локальными колебаниями клеточной плотности в культурах. Специальные эксперименты показали, что действительно есть корреляция между клеточной плотностью и сохранностью ВПК, а также обратная корреляция между клеточной плотность» и числом АФП- продуцируй клеток.

В поилке перейти от корреляционных закономерностей к бо-

лее наглядным прямым доказательствам мы разработали еиотеь создания в культурах градиентов клеточной плотности, что позес лило выявить некоторые новые закономерности в регуляции зксг рессии А® в культивируемых гепатоцитах.

КОНТАКПЮЕ ТОРШКЕКНЕ СЙН1ЕЗА А«I В КУЛЬТУРАХ ВЗРОС!

ГИ1АКЩГ0В (е1е1Ьегпвл еЬ а1. ,1989) Поскольку создать идеально равномерную клеточную плотное! в культурах гепатоцитах практически невозможно, мы попыталис создать, так сказать, одинаковую неравномерность - сконструирс вать градиент плотности в культуральных чашках. Для этого окхм 10®гепатоцитов помешали в пластиковые чашки диаметром 40 мм и первые 20 мин слегка вращали. В результате этого, гепатоцга собирались в центре, где в последующие 1-1,6 часа они при* реплялись и образовывали в последующем участок плотного монос лоя диаметром 3-5 мм. По периферии этого монослоя располагало более разряженный слой клеток. Кроме того, по всей остальнс поверхности чашки были рассеяны небольшие гепатоцитарные оо ровки и одиночные клетки. Плотная центральная часть монослс сохраняла эпителиальную морфологию в течение 4-6 суток культ 1 вирования. Клетки периферической части, значительно более расг ластанные, чем клетки в центре, уже к концу 2 суток культивирс вания, начиная с 3 суток вытягивались, становились веретенов! деыми, фибробластоподобными, часто образовывали полислой. То з % самое происходило и в небольших гепатоцитарных островках. Нач! ная с 3 суток в периферической части монослоя среди вытянуть клеток появлялось значительное количество'(до 257.) АФП-содержг щих. К 5 суткам их количество нарастало до 75Х. В центрально части монослоя вплоть до б'1 суток находили лишь единичш АМ1-содержащие клетки (как правило, не более 4-5Х к Б суткам) Измерение ВПК, проведенное отдельно для центральной и перифер) 4 ческой частей монослоя показало, что если до 2 суток культив! рования в обеих популяциях клеток ВПК наблюдались в 100Х случг ев, то начиная с 3 суток в периферических частях монослоя прс исходит резкое падение всех показателей ВПК, сводя их к 5 с уз кам практически к О. В то же время, в центральной части монос лоя ВПК держатся на достаточно высоком уровне в течение всех суток культивирования. (См. графики)

В культурах с аналогичным количеством клеток, не организс

степень связи [20

2 6 24 40 72, 96 , время в культуре (часы)

периферии!

-центр

120

процент

О-периферия

- центр

2 6 24 40 72 , 96 .120 время в культуре (часы)

АФП-содержащие клетки (%%)

10055

10%

1%

23%

4955

75%

24 48 72 96 , 120 . время в культуре (часы) □-периферия ЩЦ-центр

СОКОПРОНИЦАЕМЬЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ И СИНТЕЗ ЬФА-иСТОПРОТЕИНА В ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУРАХ ГЕПАТОЦИТОВ "РАДИЕНТ0М КЛЕТОЧНОЙ ПЛОТНОСТИ

ванных в плотей цонослой к состояшкз: ашь из отдэжьнш неСоль-шх островков и единичных клеток происходило практически полное падение ВПК после 2 суток культивирование. К 5 суткам обычно около 76% клеток были АФП-полохотедьишп».

Отчетливые морфологические характеристики процесса резксп-рессии АФП в культурах с градиентом клеточной плотности yi созывают на наличие контактных каханизыв, вовлеченных в регуляции экспрессии этого белка Весь этот комплекс шжно было бы назвать "контактное торможение синтеза АС1Г*. Реальный механизм этого контактного торможения требует дальнейшего детального изучения.

Все вышеизложенные данные говорят о том, что ВПК является, по крайней мере, надежным маркером сохранения "взрослого" фенотипа культивируемыми гепатоциташ. В следующих разделах мы ещэ вернемся к связи ВПК с синтезом АФП.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЗАтЖШРШСТИ ОИГЕЗ& ££Я (Глейбермак, Полторанина, 1984)

Очень важен вопрос о генетических закономерностях регуляции синтеза АФП.

При изучении междинейный различий у мышей по уровням фонового синтеза АФП во взрослом организме было установлено, чтс если у большинства линий фоновый уровень АФП в крови взрослых животных около 100 нг/мл, то у мышей линии BALB/c/J он на по, рядок выше и равен примерно 1000 нг/ыл. Гибридологические исследования показали, что этот признак контролируется одним мен-делируюиим геном, названным raf (Olsson et al. ,1977). Авторь предположили, что этот же ген контролирует межлинейные различи» в уровнях синтеза АФП и гуи регенераци". Однако же детальное ивученме этого вопроса показало, что экспрессия синтеза АФП npi регенерации печени значительно более сложный процесс (Полторанина, Сорокина, 1978). Оказалось, что существует по крайней мер« три группы линий мышей, отличающихся на порядок по уровням сил теза АФП при регенерации печени. Больиая часть линий (как нал ример SWR, AHR, СБА, А) содержат в крови на пике регенерат!) примерно 100-200 мкг/ил АФП. У мышей BALB/c/J уровень АФП око л. 1 иг/иг. Наконец, у мышей С67В1/6 и некоторых других линий уро вень АФП при регенерации в райо .е 10 мкг/мл.

Следует отметить, что есть отчетливая корреляции жвду

урсвюш Д4П з крови и процентом АШ-содержшцдх гбпатоцитоь рзгеиер1фувдей пэчени. У шв?й BALB/c/J на пике регенерации практически 100% кивых гепатоцитов являются А«Ь позитивными. •> большинства других линий со средним уровнем подъема A-Ut í3V.R. AKR и т.д.) обычно 10-15% гепатоцитов содержат АФП. Наконец, у кулей С57В1/6 число ЛФй-содеркащих клеток не превышает IX. Как видно, различия в количестве АШ-содержащих клеток на порядок вполне соответствуют различиям на порядок уровней АФП в крова.

Гибридологический анализ показал, что наследование уровня Affll при регенерации контролируется полигенной системой. Судя т> уровням АФП у гибридов, число генов, связанных с этим процес сом, не меньше 3. В отличие от фонового уровня АФП, при регенерации уровень АФП зависит тага® и от пола животных. При этом, h различных линиях характер сцепленности с полом различен (ГЬлто ранина, Со рогата, 1978).

Существенно то, что у мышей различен линий, отличающихся по уровням продукции АФП при регенерации, видны существенные различия и в шрфологии процесса регенерации. Так, у мышей С57В1/6, у которых минимален подъем АФП, очень часто отсутству ет "вползание" гепатоцитов в некротические участки, образовавшиеся вследствие действия СС14< У них часто не образуется выра яенного перинекротического слоя со всеми вышеперечисленными ха рактеристиками. В то же время, у мышей с сильным подъемом уров ня АФП (например, SWR и, особенно, BALB/c/J) этот перинекроти четкий слой выражен очень сильно. Вообще, легко наблюдается корреляция медду размерами перинекротического слоя с отсутстви ем I АГ и количество!,. АФП-позитивных клеток в нем (Глейберман Полторанина,1984).

Морфологические различия в процессах регенерации, совпади ющие с генетическими различиями в уровнях АФП, могут свидетель ствовать о том, что но крайней мере некоторые гены, контролиру юиие уровень АФП при регенерации, имеют отношение к контроля регенерациенных процессов.

Встает вопрос - точка приложения этих генов нахидт'.' "внутри" гепатоцитов, или она имеет отношение к межклеточным взаимодействиям гепатоцитов с другими клеточными типами <макро фагами, эндотрлинм. лимфоцитами и т.д.).

Косвенно на этот вопрос отвечают данные, нплученшд- >

vitro. Оказалось, что независимо от использованной линии мышей (С57В1/6, BALB/c, SVR) число АФП~содержащих клеток в культуре гепатоцитов из интактной взрослой лечени примерно одинаково и достигает более 50t. Примерно одинаковое количество АФП обнаруживается и в среде (Глейберман,1982; Глейберман,Эльгорт,1984). Интересно то, что выравнивание межлинейных различий идет не по "минимальному" уровню, соответствующему мышам С57В1/6 т vivo, а по максимальному уровню, так как АФП-позитивными являются во всех случаях подавляющее большинство гепатоцитов. Это дает возможность предполагать, что "сдерживание" подъема АФП при регенерации у мышей С57В1/6 осуществляется негепатоцитарными клетками. Перенесение гепатоцитов в культуру снимает этот контроль, и "чистые" гепатоциты при нарушении тканевой структуры синтезируют АФП на максимальном уровне. Ниже будут обсуждены возможные механизмы такого "надгепатоцитарного" контроля.

МОЛЕКУЛЫ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

(Рудинская и др. ,1987; Баранов и др. ,1907; Kuprina et al. ,1990) Изучение молекул клеточной адгезии начало развиваться с середины 70-х годов. К настоящему времени их описано достаточно много (см. Edelmann, 1988). Ряд экспериментов показывает, что первые этапы взаимодействия клеток друг с другом до возникновения контактных структур типа десмосом и т. п. определяются адгезионными молекулами. Играют ли молекулы клеточной адгезии какую* либо роль в процессах, описанных выше? Априори, следует думать что должны. Однако в настоящее время прямнх экспериментальных доказательств этому нет. Все же, как нам кажется, некоторые наш результаты имеют непосредственное отношение к данному вопросу. Речь идет об антигене желчных капилляров, он же I АГ. Как по мол. массе (около 115 кДа), так и по локализации во взрослой интактной печени мышей (желчные капилляры) и в других зпителиях (щеточная каем:« кишечного и почечного эпителиев) он практически идентичен • молекуле клеточной адгезии Cell САМ 105/110, выделенной из печени крыс. К сожалению, ни яоликдо-нальные кроличьи антитела( Khramkova,Beloshapkína, 1974), ни монок-лональные мышиные антитела Е9 и BIO, полученные наш и реагирующие с молекулой I АГ, не реагируют с какими-либо крысиными антигенами печени. Прямые опыты по изучению влияния данных конок-

летальных антител на адгезию мышиных гепатоцитов друг к другу не дали к настоящему времени абсолютно убедительных доказательств того, что данный антиген (точнее, эпитоп) участвует s межклеточной адгезии. Однако иммуноэлетронно-микроскопическое изучение культур мышиных гепатоцитов указывает на то, что I АГ имеет какое-то отношение к процессам адгезии.

Через сутки после эксплантации гепатоцитов в стандартную монослойную культуру в пластах и островках гепатоцитов I АГ выявляется, как это уже указывалось выше, на всех контактирующих друг с другом поверхностях гепатоцитов. На электронных микрофотографиях видно, что I АГ как правило локализуется на всем протяжении контактирующей поверхности клеток, при этом он выявляется и в межклеточном пространстве. В интактной печени ln vivo I АГ как правило виден лшь на поверхности клетки, обращенной в просБет желчного капилляра. Подобное растекание по всей поверхности удавалось обнаружить иногда лишь в регенерирующей печени.

В ряде случаев I АГ на контактирующих мембранах гепатоцитов локализовался в дискретных участях, которые в виде четок были видны на большом протяжении контактирующих поверхностей.

На срезах, перпендикулярных субстрату, удается выявить 1 АГ в виде дискретных многослойных образований в местах контакта гепатоцитов с подложкой. Эти образования весьма напоминают сложенную микроворсинку. Интересно, что в щеточной каемке кишечного эпителия I АГ связан именно с плэматической мембраной микроворсинок.

Четкая связь I АГ со структурами, связанными с контактом гепатоцитов с подложкой, а также наличие его на всей контактирующей поверхности гепатоцитов и в межклеточном матриксе между ними ук,1яынет на его связь с процессами межклеточной адгезии и адгезии к субстрату.

В связи с этим, еще больший интерес вызывает то, что т vjvo при регенерации и в процессе постнаталыюго становления орган.:.' i'ivui "ечени, а также при культивировании взрослых гепа-тоцитоь наблюдается четкая корреляция между отсутствием I АГ и присутствием АФП в клетке. Это лишний раз указывает на важнг> роль адгезионных взаимодействий в разбираемых здесь явлениях.

- 20 -

4, РЕКОНСТРУКЦИЯ IN VITRO ТКАНИ ВЗРОСЛОЙ ПЕЧЕНИ

Выше указывалось, uto стандартные монослойные культуры гепатоцитов не являются стабильными культуральными системами -'¡«степенно происходит утрата черт нормального дифференцировоч-чого фенотипа гепатоцита Нам же было необходимо разработать систему культивирования, позволяющую максимально сохранять "взрослые" функции гепатоцитов в культуре. Воссоздание в культуре условий, приводящих.к моделированию in vitro морфогенеза ткани взрослой печени, как нам казалось, должно было стать решающим проверочным экспериментом, подтверждающим (или опровергающим) высказанную выше гипотезу о природе тканевого уровня регуляции синтеза АФП. Нами были использованы два подхода

1. Изучалось влияние in vitro различных компонентов внеклеточного матрикса на поведение гепатоцитов.

2. Проводилось («-культивирование гепатоцитов с различными типами клеток в попытке воссоздать модель, разработанную О. Guguen-6'Jl 1 louzo и A. Guillouzo (см. С. Guguen-Gulllouzo, 1986), позволяющую длительное время сохранять взрослый фенотип гепато-<ша в культуре.

ейшие компонентов внеклеточного катрикса на взрослее 1&шиш гепатоциты в культуре

(Gleiberman et al. ,1986; 1990; Глейрерман и др. ,1987) V-

Изучал действие различных природных и искусственных полимеров на поведение гепатоцитов в культуре, мы обнаружили, что искусственный полианион декстран-сульфат( ДС) при внесении в культуральную среду в концентрациях 50-100 мкг/мл в значительной степени ингибирует распластывание гепатоцитов. На 2-3 сутки культивирования, когда в контроле гепатоциты начинают интенсивно распластываться и терять эпителио-подобную форму, гепатоциты в присутствии ДС образуют отчетливые балко-подобные структуры, состоя"не из полигональных клеток. К 3-4 суткам культивирования, когда в контрольных культурах начинается интенсивная экспрессия АФП, в культурах, обработанных ДС синтез АФП практически отсутствует. Таким образом, в результате действия ДС гепатоциты сохраняют присущую им in vivo морфологию и упаковку. При этом в значительной мере ингибирована экспрессия фетаяьного фенотипа. Другие гепатоцитарные синтезы (альбумин, трансферрин, церуллои-лазмин) не нарушаются под действием ДС.

Наряду с ингибицией распластывания и синтеза АФП. ДС вызы-

вает также существенную ингибицию пролиферации гепатоцитов. Однако если в культуральиую среду вносится элндермаяьный фактор роста, то синтез ДНК н пролиферация в присутствии ДО восстанавливается практически до уровня контрольных культур, в то время как заметная ингибиция синтеза А®1 все т остается( Гальперина, 1988).

Поскольку, как хороно известно, ДО является модельным аналогом естественного полисахарида гепаран-сульфата, то мы связали полученные нами результаты с представлениями о том, что естественные сульфатированные полианионы - глюкозоаминогликаны -могут пвляться природными регуляторами экспрессии фенотипа ге-патоцита.

Подробные исследования роли глюкозоаминогликанов и проте-огликаков в регуляции фенотипа культивируемых взрослых гепатоцитов крысы, проведенные D. Spray et al.(1987), показали, что и в их экспериментальной системе ДО, а также близкий к нему по свойствам растительный сульфатировашшй г лисахарид каррагенан поддерживают сохранение взрослого фенотипа в культуре одновременно с ингибицией распластывания гепатоцитов. Значительно более выраженными эти свойства оказались у протеогликанов. Наиболее сильным из них был гепаран-сульфат протеогликан, выделенный из печени. В то же время чистые природные глюкозоаминогликаны были практически неактивны. Интересно, что одним из признаков сохранения взрослого фенотипа гепатоцита было поддержание в культуре под действием протеогликанов функционирования ВПК. ДС и каррагенан также стимулировали BIIK, но слабее, чем протеогли-каны. В отсутствии же названных агентов ВПК в культуре крысиных гепатоцитов полностью исчезали уже после 24 часов культивирования.

Различия в действии глюкозоаминогликанов и протеогликанов объясняются, по вееЯ видимости, тем, что протеогликаны, состоящие из корового белка и нескольких связанных с ним цепей глюкозоаминогликанов, обладают значительно большей мол. массой и связывающей активностью. ДС, i-зк и каррагенан, по мол. массе (около 1000 кДА) значительно ближе к протеогликанам. Кроме того/ в них существенно выше степень сульфатирования, чем, например, в гепарине и гепаран-сульф^то, что существенно для их связывающей активности.

В нашей системе, как и у D.Spray с соавторами, действие

каррагенана на морфологию культур мышиных гепатоцитов, а также ва экспрессию ими АФП, оказалось идентичным ДС. Испробованные мэ природные глюкозоаминогликаны - гепарин, гепаран-сульфат, хондроитин-сульфат, дерматан-еульфат - были абсолютно неактивны.

Интересно и то, что дс оказывал сильное ингибирующзе действие на резкспрессию АФП во взрослых гепатощггах не только in vivo, но и in vitro. Ежесуточное внутрибрювинное введение ДС в концентрации 50 мкг/г веса тела мышам с регенерирующей после отравления СС14 печенью снижало более чем на порядок уровень АФП в крови и число АФП-с о держащих клеток в печени. При этом, регенерация печени продолжалась и протекала практически нормально. Действие ДС, однако, приводило к тому, что в перинекротическом слое незначительно снижалось количество домен-специфических мембранных маркеров, не наблюдались перестройка цитоскелета и изменение морфологии гепатоцитов.

В данном случае, однако, мы не можем быть уверены, в отличие от ситуации in vitro, что действие ДС направлено непосредс-твено на гепатоциты. Не исключено, что этот эффект может быть свяаан и с другими клеточными типами печени.. Так например, ДС и каррагенан известны как вещества, очень сильно подавляющие функциональную активность ретикуло-экдотелиальной системы, фагоцитарную активность макрофагов. Как было указано выше, регуляция уровня экспрессии АФП при регенерации может быть связана и с взаимодействием гепатоцитов с негепатоцитарныш клетами печени. Оээтому мы не можем исюгочить того, что описанный феномен связан с действием ДС на макрофаги.

Следующие серии экспериментов были направлены на изучение влияния белковых компонентов внеклеточного матрикса на экспрессию фетального фенотипа гепатоцитов.

В наших стандартных экспериментах мы использовали в качестве субстрата для культивирования желатинизированный пластик -ва подложку наносили небольшое количество 0,1 Т. раствора желатины в воде и высушивали. Гепатоциты обычно весьма слабо прикрепляются к денатурированному коллагьлу, однако в присутствии сыворотки адгезия гепатоцитов к желатине проходит весьма.успешно эа счет того, что желатина обладает большим сродством к фкб-ронектину, имеющемся в большом количестве в сыворотке. Таким образом, желатиновая'подложка является, по сути дета, фибронек-тиновой.

При использовании в качестве подложки для культивирования мышиных гепатоцигов фибронектина, коллагена 1 типа, ламинит -ш получили те же результаты, что и с желатиной. Гепатоциты прикреплялись, распластывались и приступали к синтезу А<Н1 с 3 суток культивирования.

шшьзование юшагенового гш для юздтгшкткия

ГЕПАТЩ.ТОВ (Glelbertran et al. ,1989а; 1990).

в том случае, если в качестве подложки использовался гель из полимеризованного коллагена I типа на первых порах картина была несколько иная - в первые 2 суток наблюдали существенную ингибицию распластывания (особенно при высокой клеточной плотности). Однако начиная с 3 суток появлялись вьггянутие веретено-видные гепатоциты и, начиная с этого времени, АШ-содержащие клетки. В дальнейшем, поведение гепатоцитов на слое геля из полимеризованного коллагена ничем принципиально не отличалось от культур на высушенных коллагеновых или фибронектиновых подложках.

Совершенно иная картина наблюдалась »,ри культивировании гепатоцитов внутри коллагенового геля. В этом случае распластывание клеток было еда в большей степени ингибировано. Спустя двое суток гепатоциты образовывали отчетливые балко-подобныв структуры из клеток полигональной формы с выраженными желчными капиллярами. На поверхности зкспрессировались мембранные домен-специфические маркеры - 1 АГ и рецептор к асиалогликопроте-инам. Их локализация соответствовала таковой, наблюдавшейся in vivo в интактной печени. Локализация актиновьк и цитокераттю-Bioc филаментов таю» соответствовала наблюдаемой in vivo. Полностью отсутствовали АФП-содержащие клетки все время наблюдения (вплоть до 3-10 суток культивирования). При этом, балко-подобные структуры, состояп'че из АФП-негативных клеток, обладали отчетливо выраженными высокопроницаемымл контактами (ВПК), В них не происходила экспрессия виментииа.

В ряде случаев, однако, мокко било наблюдать локальные повреждения з структуре балок. Это было связано, как правило, с повреадеинем слоя полимеризованного коллагена, покрывающего гепатоциты, или же с отлипанием верхнего слоя коллагена от коллагенового геля, находящегося под клетками. В этом случае происходило локальное изменение морфологии гепатоцитгрных пластов -

клетки выходили ив состава Салки, распластывались, в них вспыхивал синтез АФП, утрачиваюсь ВПК Все это сопровождалось утратой домен-специфических мембранных маркеров и перксг^ойкой цитоскелета, включая появление виментинсвнх филаментов

КО КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГЕПАТОЦИТОВ С КЛВТКММ ЛОМИ 1АК 20

(81в|Ьегшп «Ь а1. ,1689; 1990)

Система ко-культивирования гепатоцитов с нетрансформиро-ванными линиями эпителиальных клеток, полученных из первичных культур печени крыс, была предложена С. Ви^иеп-ОиШоиго и А.6иШоиго. ОНИ- для своих опытов использовали либо клетки линии Я)У1, либо 1А1?-20. Позднее было показано, что и клетки другого происхождения, в частности фнбробласты и эндотелий при некоторых модификациях условий культивирования также вполне пригодны для создания условий, в которых гепатоциты могут поддерживать в культуре в течение нескольких недель взрослый фенотип.

Мы в своих опытах в качестве партнера для ко-культивирования с гепатоцитами использовали линию клеток 1АК-20.

При подборе оптимальной клеточной плотности как гепатоцитов, так и клеток 1АК:20, удается четко проследить эволюцию ге-патоцитарных агрегатов. Приведенная ниже картина получена при культивировании примерно 2,5 х 105геп&тоцитов и 4-5 х Ю5клеток линии 1АЯ-20 в пластиковых чашках Петри диаметром 40 мм. В первые 3-5 суток культивирования, пока количество 1АЯ-20 еще не велико, гепатоциты ведут себя практически также, как и в стандартных монослойных культурах, описанных выше - они распластываются, утрачивают признаки эпителиальной морфологии, перестраивают цитоскелет, начинают синтезиревать виментин и АФП. Однакс постепенно пролиферирующие клетки Ш-20 начинают препятствовать распластыванию гепатоцитов, наблюдается реверсия всех вышеназванных изменений фенотипа, восстановление взрослого фенотипа гепатоцита, включая морфологию, образование типичных желчных капилляров с сответсутвующкм антигеном, дефинитивную локализацию рецептора к асиалогликопротеинам, нормализацию распределения актина и прекератина, исчезновение виментикг. и АФП. островки А®-отрицательных полигональных гепатоцитов обладают отчетливо выраженной системой ВПК.

Если в культурах создавали градиент плотности клето Ш-20, то удавалось наблюдать последовательную эволюцию изме

нений фенотипа гепатоцитов. В участках с наивысшей плотностью уже к 3-5 суткам выстраивались органотипические структуры с сохранением всех черт взрослого фенотипа гепатоцитов, в участках с наименьшей плотность» клеток IAR-20 островки из вытянутых АЯЬпродуцируювях гепатоцитов с отсутствием ВПК сохранялись вплоть до 10-15 дня культивирования. В этих же культурах был замечательно виден градиент выраженности и всех остальных фено-типических изменений - в первую очередь, сохранности мембранных маркеров.

Следует отметить, что в ко-культурах происходило очень интенсивнее отложение компонентов внеклеточного матрикса вокруг гепатоцитарных островков. Матрикс этот отчетливо выявляется с помощью стандартных гистологических окрасок типа азана по Гей-денгайну. Иммуногистохимически в нем выявляются фибронектин, коллаген IV типа, небольшие количества энтактика и ламинина. Однако необходимо Солее детальное изучение его состава.

Очень важно, с нашей точки зрения, то, что как удалось выяснить, все островки гепатоцитов с морфологией, соответствующей взрослой печени, были покрыты сверху непрерывным пластом клеток IAR-20. В то яе время островки из ползущих, АФП-содержащих гепатоцитов не имели покрывающего клеточного пласта

Таким образом, в данной экспериментальной системе, как и в случае культивирования гепатоцитов внутри коллагенового геля, сохранение (или восстановление) взрослого фенотипа гепатоцита требует трехмерной организации - в случае геля это трехмерный коллаген, в случае ко-культур - это сочетание трехмерной организации клеток-партнсюв и внеклеточного матрикса (см.табл. 1).

фенотип одиночных 1шьтнвнруеиых гепатоцитов

(Kudrjavtseva, GleiЬегпип, 1990; Gle i berman et al. ,1990)

Во всех опытах наблюдалась четкая связь ингибиции синтеза АФП с сохранением гепатоцитами типичной полигональной морфологией, сохранением ВПК и присутствием трехмерного внеклеточного матрикса

Для того, чтобы разгединить эти признаки, было проведено изучение синтеза А<Н1 в одиночных гепатоцитах, культивируемых в различных условиях. Оказалось, что одиночные гепатоциты, культивировавшиеся как внутри коллагенового геля, так и в ко-куль-туре с клетками 1AR-20 в условиях высокой клеточной плотности,

Таблица 1

фоютип гепатоцитов гри различных условиях культивирования

(5 сутки культивирования)

Условия Форма АГ I Распр. Рец. к ВПК Синтез

культивирования * акт. /ЦК аГП АФП

**

Высушенный

коллаген р

2-мерный гель

из коллагена р

3-х мерный гель

из коллагена п

Ко-культура с клетками линии п Ш-20

фибрил. фибрил. подмемб. подмен.

Обозначения:

АМ - альфа-фетопротеин; АГ I - антиген желчных капилляров; Ред. к аГП - рецептор к асиалогликопротеинам; ВПК - высокопроницаемые межклеточные контакты, л - форма клеток р - распластанная, п - полигональная; ** - распределение актина и цитокератина

фмбрмд. - неупорядоченные фибриллы, подшиб. - подмембранное кольцо;

Таблица 2

ФЕНОТИП ОДИНОЧНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИЕИРОВАНИЯ (5 сутки культивирования)

УсловияФорма культивирования *

ВПК

Синтез АФП

+

+

+

+

+

+

2-мерный гель

из коллагена р +

3-х мерный гель

из коллагена ш

Ко-культура с клетками 1АЙ-0) п

Обозначения: * - форма клеток р -

в -п -

распластанная

шаровидная

полигональная

в отличив от от одиночных гепатоцитов, культивировавшихся на сухом коллагене или на геле из полимериэованного коллагена, как правило не синтезировали AML Одиночные гепатоциты внутри кол-лагенового геля сохраняли парообразную форму. В ко-культурах при низкой клеточной плотности одиночные гепатоциты в первые дни культивирования били распластанными и их форма не отличалась от таковой в обычных монослойных культурах. При этом, эти одиночные гепатоциты были в большинстве АФП-положительными. После 4-5 дней культивирования в результате пролиферации клеток IAR-20 клеточная плотность увеличивалась и гепатоциты меняли форму, становились менее распластанными и при этом АФГ1- негативными.

Таким образом, эти опыты указывают на то, что сохранение ВПК, по-видимому, не является причиной подавления реэкспрессии АФП, а, скорее всего, ВПК является маркером сохранения в культуре органотипической организации гепатогчтарных островков» которая, в свою очередь, и обеспечивает в большинстве случаев сохранение взрослого фенотипа гепатоцита (см. табл. 2). Все же этот вывод требует других экспериментальных подтверждений.

Приведенные результаты указывают на то, что сохранение взрослого фенотипа гепатоцита может быть связано с взаимодействиями клеток с организованным трехмерным внеклеточным матриксом и с сохранением дефинитивной полярности клеток. В наших экспериментах сохранение полярности гепатоцитов, их формы - неотделимо от присутствия трехмерного внеклеточного матрикса. >Аэжет быть, эти два фактора неотделимы друг от друга в принципе.

Таким образом, создается впечатление, что переход от взрослого к фетальнсму фенотипу гепатоцита контролируется на клеточном уровне через форму клетки и связан с обратимыми переходами из полигональной 'Форш с эпителиальной полярностью в распластанную, фибробласто-подобную форму.

Поддержание полигональной формы в корме осуществляется, по-видимому, с помощь» контактных межгепатоцитарных взаимодействий и, что наиболее по назему мнению важно, регулируется контактом с трехмерным внеклеточным матриксом.

Отсюда следует, что важным элементом в регуляции экспрессии диФФсрешшроБОчных генов гепатоцита должны быть мембранные рецепторы к .члементам внеклеточного матрикса.

Следу«»? тою« подчеркнуть, что реэкспрессиа АФП - зто но

изолированный признак. По-видимому, АФП является только одним компонентом целого блока признаков, регулирующихся вместе. В этот блок, в частности, могут входить некоторые рнкогены (туе. ras, jun. Tos), ферменты типа гамма- глутамил транспептидазы, некоторые раково-эмбриональные изоферменты.

Хотелось бы также напомнить, что в морфологически высоко-дифференцированных гепатомах регуляция экспрессии А® на тканевом уровне идентична таковой в нормальной печени.

Таким образом, взаимодействия гепатоцитов друг с другом и с внеклеточным матриксом весьма существенны не только для поддержания "взрослого" фенотипа клетки, но и для экспрессии ряда признаков, связанных обычно с опухолевой трансформацией.

заключение МАРКЕРЫ ТКАНЕВОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ

Приведенные данные убедительно свидетельствуют о том, что реэкспрессия AMI во взрослом гепатоците является четким и надежным признаком локального нарушения дефинитивной тканевой структуры, то-есть, балочной организации печени. Это приводит к нарушению межклеточных взаимодействий и взаимодействий гепатоцитов с окружающим их внеклеточным матриксом. Поскольку взаимодействие клеток с матриксом (коллагенами различных типов, фиб-ронектином, ламинином и т. д.) связано со специфическими клеточными рецепторами (семейством так называемых интегринов), а также с мембранными гепгоан-сульфат протеогликанами, прогресс в этой области может быть связан с детальным изучением рецептор-ного аппарата гепатоцита, ответственного за взаимодействия с компонентами внеклеточного матрикса. В настоящее время накапливаются убедительные данные, полученные в других клеточных системах, четко показывающие, что взаимодействие рецепторов интег-риновой природы с коллагеном может служить григерным механизмом для Д1.фференцировки эпителиальных клеток (Pi gnate 111, Bodjner, 1989). Данные рецепторы могут выступать в роли своеобразных антионкогенов, а их утрата является важным этапом опухолевой пдогрессии.

Приведенные наш данные позволяют отнести AM к маркерам тканевой нестабильности. Встает вопрос, уникален ли этот маркер? Есть ли еше такие маркеры? Нам кажется, что детальное изучение должно показать, что многие (если не все) так называемые

раково-эмбриональные белки >югут быть отнесены к маркерам такого рода. Ведь неслучайно, что второй хорошо наученный рако-во-эмбриональный белок CEA экспресскруется не только при возникновении опухолей, но и при значительных воспалительных поражениях толстого кишечника. То же самое относится и к эмбриональным изоферментам, продуцирующимся как в эмбриональной, так я в опухолевой, а таю® в регенерирущей ткани (см. Shapira, 1681). Аналогичным образом ведет себя фермент гамма-глутамил транспептвдаза Пргакров такого рода мокно привести много. Важнее другое - выяснить схояи ли механизмы, регулирующие экспрессию этих белков. Изучение этого вопроса необходимо для понимания биологической сути феномена реэкспрессии всех вышеперечисленных белков. Наконец, весьма интересно, относятся ли к данной группе некоторые онкогены, чья усиленная экспрессия наблюдается на первых этапах регенерации печени - iryc, ras, ios. Их быстрая экспрессия на первых этапах активации гепатоцитов скорее свидетельствует в пользу того, что реэкспрессия онкогенов предшествует существенным тканевым перестройкам. Однако не исключено, что поддержание экспрессируемого состояния ухе определяется тканевым уровнем. Было бы очень важным понять, в какой степени тканевой уровень регуляции определяет экспрессию различных компонентов опухолевого фенотипа

ТГШШЕСЯ УРОВЫЕЬ РЕГУЛЯЦИИ ФЕНОТИПА ГЕПАТОЦНТА Итак, весь изложенный материал убедительно, как нам кажется, свидетельствует в пользу того, что экспрессия ряда гепато-цитарных функций как количественно, так и качественно определяется тканевым уровнем регуляции. Мы подошли к анализу различных составных частей этого уровня - контактные межклеточные взаимодействия (как адгезионные, так и система высокопроницаемых контактов) , взаимодействия гепатоцитов с внеклеточным матриксом. Наконец, очень важную роль, как мы убедились, играет форма клетки. Последнюю можно регулировать как за счет вышеперечисленных факторов микроокружения, так и агентами, непосредственно действующими на цитоскелет. В стороне от рассмотрения остались вопросы, связанные с действием ростовых факторов. Они подробно рассмотрим;! в оСворе н. Leffert et. al. ,(1088). Возможно также, что морфология ткани и Форма метки играют существенную роль в '7,г-кп<"-1 гр-нг-.'-гпи [i ! р,чз.пичпие факторы роста. Детальное «ну-

чение этой стороны проблемы потребует разработки новых подходов.

Все процессы, происходящие в организме, морфологически упорядочены. Сложные морфогенетические процессы, приводящие к возникновению в ходе эмбрионального развития тканевой и органной организации многочисленных потомков одной оплодотворенной яйцеклетки, могут быть представлении как сумма. элементарных морфологических процессов (см., напр. Дорфман, Черданцев, 1977), число которых конечно и ограничено. Изменения фенотипа клетки в процессе развития, регенерации и опухолевого роста также морфологически упорядочены. Несмотря на представления об опухолевой прогрессии как о неупорядоченном процессе, следует вспомнить, что наибольшее представление об опухоли можно получить дииь на морфологическом уровне. Сочетания морфологических признаков, дающие возможность поставить гистологический диагноз опухоли, хотя и велики, но ке бесконечна Именно потому, что существуют неслучайные комплексы морфологических признаков, и возможна морфологическая диагностика Уорфологический (или тканевой, что в данном случае одно и то же) уровень регуляции не может ограничиваться молекулярным. Решение морфологических проблем требует, наряду с молекулярным подходом, своих специфических инструментов исследования, своего языка и понимания важности поставленных задач.

Нам хотелось продемонстрировать важность изучения тканевого уровня регуляции для понимания динамики процессов, происходящих в ткани в процессе ее становления, регенерации и опухолевого роста Понимание конкретных механизмов, определяющих морфологическое упорядочивание биохимических процессов, происходящих в тканях и органах, кроме чисто эстетического удовольствия от приведения в единую систему данных, полученных на разных уровнях исследования, начиная от молекулярного и кончая гистологическим, даст ключ к разработке процессов регуляции поведения как индивидуальных клеток, так и многоклеточных сообдаств.

выводы

„ 1. Становление дефинитивной балочной структуры печени мышей в постнатальном онтогенезе сопровождается формированием градиентного распределения различных печеночных маркеров по паренхиме печени. К этим маркерам относятся сывороточные белки (например, альбумин и трансферрин), мембранные антигены (рецептор к асиагогликопротеинам, И АГ). Само становление дефинитивной ба-

-заочной структуры в постнаталыюи онтогенезе имеет градиентный характер, что отчзтлиео видно по характеру распределения антигена гелчных капилляров. В соответствии с градиентом становления дефинитивной полярности гепатоцитов наблюдается и градиентный характер исчезновения иэ паренхимы печени экбриоспецифичес-кого сывороточного белка альфа-фетопротеина (АФП).

2. Наруиение балочной структуры взрослой печени мышей при отравлении СС14 приводит к нивелированию градиента продукции сывороточных белков. В процессе регенерации печени, связанном с перестройкой балочной структуры, образуется особая область -перинекр^тический слой гепатоцитов, в котором происходят ярко выраженные изменения морфологии гепатоцитов, перестройка цито-кератинового и актинового цитоскелетов, утрата мембранных домен-специфических антигенов, что соответствует характеристике активно движущихся клеток. Клетки именно этого слоя и осуществляют в основном синтез АФП, наблюдаемый при регенерации печени.

3. Регенерация печени сопровождается ярко выраженными перестройками внеклеточного матрикса в паренхиме печени. Первым заметным событием при регенерации печени является появление в печеночной паренхиме двух иаясрных компонентов базальных мембран - ламинина и энтактина. Эти белки исчезают из печеночной паренхимы только после завершения основных морфологических перестроек, связанных с регенерацией.

4. Локальные нарушения структуры являются индуктором экспрессии АФП не только в регенерирующей печени, но и в спонтанных высоко-дифференцированных гепатомах мышей. При нанесении надрезов на АФП-негативные опухолевые узлы продукция АФП обнаруживается только в слое клеток, непосредственно прилегающих к месту механического повреждения. Данный слой клеток имеет такие же характеристики, как и перинекротический слой гепатоцитов при регенерации, вызванной отравлением СС14.

5. Ферментативная диссоциация ткани печени с последующей эксплантацией гепатоцитов в монослойную культуру является моеь нейшим стимулом ре-экспрессии АФП во взрослых мышиных гепатоци-тах. На 4-5 сутки культивирования до 75Х гепатоцитов в этих условиях являются АФП-положительными. Синтез АФП сопровождается изменением локализации, а затем и утратой домен-специфических мембранных антигенов, существенным изменением морфологии гепатоцитов и перестройкой цитоскелета.

6. Одинаковый уровень синтеза АФП в первичной монослойной культуре гепатоцитов наблюдается при использовании мышей различных линий - С57В1/6, СБА, BALB/c/J, различающихся на порядок по уровню синтеза и числу АФП-содержащих клеток при регенерации печени, а также резко различающихся по фоновому уровню Afffl в сыворотке взрослых мышей. Это указывает на то, что генетические элементы, ответственные за различия in vivo в фоновом уровне синтеза А® и в уровнях синтеза АФП при регенерации печени, действуют не "внутри" гепатоцита, а связаны с надклеточным, тканевым уровнем регуляции синтеза АФП.

7. Наблюдается отчетливая обратная корреляция между наличием и степенью выраженности высокопроницаемых межклеточных кон-тактов(ВПК) с одной стороны и числом АФП-содержащих клеток в культуре с другой стороны. Морфологические закономерности обнаружения АФП и ВПК в культурах с градиентом плотности гепатоцитов позволяют говорить о феномене контактного торможения синте-8а А®, сопровождающемся сохранением ВПК в местах с высокой клеточной плотностью.

8. Добавление в культуральную среду синтетического сульфа-тированного полисахарида декстран-сульфата с мол. массой 500 кДа, как аналога гепаран-сульфат протеогликана, ингибирует распластывание гепатоцитов и ре-экспрессию в них АФП в концентрациях 50-100 мкг/мл. Использование в качестве субстрата для куль тивирования гепатоцитов различных белков внеклеточного матрикса в виде высушенной подложки (фибронектин, коллаген 1 типа, лами-нин), а также полимеризованного коллагена I типа, не влияет существенным образом ни на какие-либо характеристики культуры, т на синтез АФП.

9. Трехмерная организация внеклеточного матрикса играет существенную роль в поддержании в культуре взрослого фенотипа гепатоцита. Культивирование внутри коллагенового геля ведет к образованию балко-подобных гепатоцитарных агрегатов с сохранение] дефинитивного распределения в клетках актиновых и прекератино вых филаментов, нормальной экспрессией на поверхности гепатоци тов антигена желчных капилляров, сохранением ВПК и отсутствие ре-зкспресеии АФП. В местах с локальным нарушением целостност коллагенового геля происходят перестройки культуры, полность совпадающие с описанными выше для монослойных культур, сопро вождающнеся появлением значительного числа АФП-содержащих кле

ток. Трехмерный гель из коллагена вполне моделирует, таким образом, шкроокрувание, характерное для интактной взрослой печени taseñ. Аналогичные балко-подобные структуры, возникающие в ко-культурах гепатоцитов с крысиными печеночными эпителиальными ¡слетками линии IAR-20, состоят из АФ11-отрицательных гепатоцитов н обладает Tetsi ra характеристшсаии, что н гепатоцитарные балки а ко лаге новой геле. Они такие покрыты мощным сдоем внеклеточного катрикса.

10. Строгое совпадение ыеаду сохранением полигональной форш, наличием ВПК и отсутствием синтеза АФП в гепатоците не дает возкон-юсти однозначно рескть, какой клеточный фактор является ведуглм в поддержании взрослого фенотипа гепатоцита Однако то, что культивирование одиночных гепатоцитов как внутри колла-гскового геля, так и в ко-культурах в условиях высокой клеточной плотности, предотвращает ре-экспрессию АФП при сохранении геиато1№т&.ш кераспластанкой морфологии, говорит о том, что йе-дугкм фактором в поддериании взрослого ^-нотипа гепатоцита ш-гзч слугить форма клетки.

11.11ч основе проведенных исследований можно рекомендовать описанные в работе культуральные системы (культивирование гепа-тоцктсп з тр-эул/ерном коллагене н в ico-культурах с крысиными Ие-чекоедьм! эпителиальными клеткани) для моделирования печени in vitro для детакьного изучения различных ас пестов биологии и патологии печени.

12. Таким сбразом, э работе предложена концепция тканевого уровня регуляции фенотипа гепатоцита вообще и, в частности, регуляции экспрессии раково-эмбрионального печеночного белка АШ. Этот уровень включает как межклеточные- взаимодействия, так и ззаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, при этом важную роль в поддержании взрослого фенотипа гепатоцита играет сохранение клетками своей формы. Все это указьшет на то, что непосредственное участке з регуляции фенотипа взрослого гепатоцита яркшткаэт ¡¿¿ибранниэ компоненты, ответственные за адгезионные .гаймодоястгкл клеток друг с другом, рецепторы к компонентам

л TfüL-л цитсскелет гепатоцита. ткмювой _ • пц:м ..,;-ноткпа '¡.•ункциоиипуе? не только ч «соллыш

..0 писоко-д!»(Ийренцироь«нннх гендомах. :лиг.о-':с BOBJ¡ft">-:i:;h:í' i¡ SYOT ""Oiienh r-i-

■'■•M,:;,:í.,:v;'íf*.¡!i) лл;-- ¡"М-оек'иж n'.iüa .•„;..!

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гдейбермаи А. С., Храмкова Н. И., Белошапкина Т. Д. Структура печени как возможный фактор в регуляции синтеза альфа-фетопротеина. Бшл. эксп. биол. мед., 1S79, 87, 5S5-598.

2. Glelberman A. S. , Kuprlna N.I., Rudinskaya Т. D. Structural regularities of albumin, transferrin and AFP synthesis in mouse liver. VIII Annual meeting of Int. Soc. Oncodevelopmental Biol.Med. Tallin, 1980, 32.

3- Рлейберман А. С. Синтез альфа-фетопротеина в первичных культурах взрослых гепатоцитов мыш. Бюлл. эксп. биол. мед. , 1982, S3, 65-58.

4- Glelberman A.S. , Kuprlna N. I., Rudlnskaya Т. D., Abelev й I. Alpte-fetoprotein synthesis In relation to structural peculiarities in postnatal and regenerating rouse liver. Int. J. Cancer, 1983, 32, 85-92.

5. Гдейбермаи А. С., Эльгорт Д. А. Синтез альфа-фетопротеина и других сывороточных белков в первичной культуре взрослой печеш мышей. В кн.: "Иммунологические аспекты биологии развития", ред. R Г. 5фуирв, Ы., "Наука" 1984, 141-151.

6. Гдейбермаи А. С. , Полторанина В. С. Генетически« аспекты регуляции синтеза альфа-фетопротеина и проблема межклеточных взаи модействий. В кн.: "Иммунологические аспекты биологии развития" ред. Е Г. Хрущрв, Л, "Наука", 1984, 152-158.

7. Шипе JL Я , Глейберман А. С. Индукция синтеза альфа-фетопротеина в высоко-дифференцированных спонтанных гепатомах мышей Бюлл. эксп. биол.-мед., 1984, 07, 303-304.

i

8- Глейберман А. С. , Трояновский С. М., Ванников Г. А. Перестройка цитоскелета в регенерирующей печени мышей. Бюлл. эксп. биол. мед. 1984, 98, 741-745.

9. Shlpova LYa. & Gleibarman A.S. AFP-synthesls induction In mouse hepatomas, int. J. Cancer, 1985, 35, 135-138.

10. Gletberman A.S. a Abelev a I. Cell position and cell interactions in expression of fetal phenotype of hepatocyte. Int. Rev. Cytol. , 1985, 65, 229-266.

11. Gleiberman A. S.. Galperina Т.Е. Staroverov D. B. Inhibition of AFP synthesis in adult mouse hepatocytes by dextran-sulphate in viv^i and in vitro. In: XIV annual meeting' of Int. Soc. Oncodevelopmantal Biol. Mad., Helsinki, 1986, 106.

12. Глейберман А. С., Гальперина Т. Э., Староверов Д. R. Ингибиция синтеза АФП во взрослых ышиных гепатоцитах декстран-сульфатом in vivo и in vitro. Волд. зксп. биол. мед., 1987,

13. Глейберман А. С.. Шаровская !й КХ , Левин С. Ы., Чайлахян JL U. Синтез альфа-фетопротеина и высокопронидаемые межклеточные контакты в первичных культурах взрослых мышиных гепатоцитов. Докл. АН СССР, 203. 1256-1258.

14. Баранов R Н, Глейберман А. С. , Полторанина В. II , Язова А. К. , Рудинская Т. Д., Куприна Н. И.. Антиген плазматической мембраны гепатоцита. Ультраструктурная локализация в печени, тонком ки-иечнике и первичной культуре гепатоцитов мыши, выявляемая с помощью моноклональных антител. Виол, мембр. , 1987, 4, 208-220.

15. Рудинская Е. Д., Куприна Н. И., Язова А. К. , Эскрибано М. X., Кордье Ж. , Гусев А. И. , Глейберман А. С. , Гальперина Т. 3. Изучение антигенов плазматических мембран гепатоцитов мыта с помощью моноклональных антител. Еиол. мембр. , 1937, 4, 194-207.

16. A.S. Gleiberman, Yu. Yu. Sharovskaya, L. M. Chailakh)an "Contact inhibition" of alpha-fetoprotein synthesis and junctional conminlcatlon in adult mouse hepatocyte culture. Exp. Cell Res, 1989, 184, 228-234

17. A. S. Gleiberman, E. I. Kudr javtseva, Yu. Yu. Sharovskaya and a I. Abelev. Synthesis of alpha-fetoprotein in hepatocytes is

coordlnately regulated with cell-cell and cell-matrix interactions. Itol. Biol. Med. , 1989a, 6, N. 4, 95-107

18. Glelberman A.S., E. I. Kudrjavtseva, Yu. Yu. Sharovskaya, G. I.Abelev. Regulation of alpha-fetoprotein synthesis in га use hepatocytes in vitro. In:" '89 Sapporo cancer seminars", Sapporo. 1989b, p. 50.

19. N. I. Kuprlna, V. N. Baranov, A. K. Yazova, T. D. Rudinskaya MEscribano, J. Cordier, A. S. Gleiberman and A,I.Goussev. The antigen of bile canalloull of the mouse hepatocyto: identification and ultrastructural localization. Histochemistry, 1990, S4, 179-186

20. Глейберман А. С. и Шаровская Ю. id Высокопроницаеыые контакты и экспрессия фетального фенотипа во взрослом гепатоцяте. В кн. "1,{еханизмы детерминации", ред. А.ЕЗотин, Ы., Наука, 1990, с. 207-219.

21. Gleiberman A. S., Е. 1. Kudrjavtseva, Yu. Yu. Sharovskaya and 0. I.Abelev. Tissue mechanisms involved in the regulation of AFP synthesis. In: Abstract Book of XVIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Moscow, 1990. p. 7.

22. Kudrjavtseva E. I., A. V. Ljubimov, A. S. Gleiberman, Extracellula matrix reorganization during liver regeneratica In: Abstract Book of XVI11 Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and bfedicine, Moscow, 1990, p.64.

23. Kudrjavtseva E. I., A.S. Gleiberman, Cell shape as a critical factor in the reexpression of alpha-fetoprotein synthesis ir primary culture of adult mouse hepatocytes. In: Abstract ^ooi-of XVI11 Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Moscow, 1990, p. f,4.

- 45 -

СЛИСОК ЦИТИРОВА; iMblX РАБОТ . Г. И. ЛЛе-чгв, С. Д. Перова, а И. Храмкова и др., (1963), "Биохимия". 1, 625 6jj.

!. Р. Д. Бакирпв С1ЫЭД, "БИЛЛ. эксп. биол. мед. ", N2, 45-47. 3. В Я Баранья, & А. Рукосуев (1079), "йодл. эксп. биол. мед. ", 37, 482- 485.

I. Р Н Баранов, В. С. Полторанина, А. И. Гусев (1986), "Билл. эксп. 5иол. ш'Д. ". 101, 199- 201.

5. Т. Э. Гальперина (1988), "Билл. эксп. биол. мед. ", 106, 350-353. 5. ЯГ. Дорфман, Е Г. Черданцев (1977) "Онтогенев", 8, 554-563. 7. A. lu Коляда (1У81), "Вюлл. эксп. биол. мед. ". 02. 115-116 3. М. II <£шарева (1979), "Бюлл. эксп. биол. мед.", 89, 346-349. Э. ао. Полторанина (1981), "Баял. эксп. биол. мед. ", 91, 212-215. 10. R С. Полторанины, Т. Е Сорокина (1978), "Ваял. эксп. биол. мед.", 89. 71-75.

II. Л. Я. Шилова, А. И. Гусев, Н. а Знгельгардт (1974), "Онтогенез",

Ь, 53-60.

12. Л Я. АЫпова, а А. Харьковская, а Г. Лад|. ина (1983), "Эксп. Онкология". 5, 27-31.

13. -а Е Зигелы-ардт. . А. а Г'усев, & С. Полторанина (1972), "Бшл. эксп. биил ш=Ц. ", N 9, 87-89.

14. ai.Abelev (1974), "Transpl. Rev.", 20, 3-37& "

lb. й. l.Abelev (1978), In: "Cell Differentiation а/к/ Neoplasia", (G. P. Saunders, ed.) Raven Press, NY.

16. R.N Carlsson, E. Engvali, A. Free nan et al. , (1981) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 78. 2403-2406.

17. B. De Nochaud. A. Vlron, E. Puvion (1979), "C. R. Acad. Sol. (Paris)", ZffiKser. D), 737-740.

18. R. LteimieLzel, S. Yancey. 0. Traub et al. , (1987), "J. Cell Biol.", 1С®, 1925-1934.

19. G. Fidel man (1988), "Topobiolopy" Academ. Press, N. Y.

20. N. V. F.rigeltwdt, M. N. Lazareva, ai.Abelev at al., (1976), "Nature", 233, 146-148.

21. N. V. EngeJ 'ardt, A. S. Glelberman, V. S. Poltoranina, M. N. l.azareva (1979), 1 n: "Careino-Embryoniс Proteins" (F. -G. l.ohman ed.), v.l, 111-119.

22. N. V. Engelhardt, V. N. Baranov, M. N. Lazareva et al., (1984), "Histochemistry", 80, 401-407.

23. С. E. Fraser, С. R. Green, Н. R.Bode et al. ,(198?) Science, 237, 49-55.

24. A.Guillouzo.C. Guguen-Gulllouzo (1986) ."Isolated and Cultured /fepatocytes" IHSERM, Parts.

25. У. Hamashima, Y. a Carter, A. H. Coons (1964), "J. Cell. Biol.". SO, 271-280.

26. I. D. Karavanova, T. A. Tchipysheva, V. I. Guelsteln et al., (1980), "Oncodev. Biol. Med.", 1, 375-388.

27. N. I. Khramkova, T. D. Beloshapkiria (1974) ."Nature",251,627-628.

28. I.Kushner, a Feldmann (1978), "J. Exp. Med.", 148, 466-477.

29. A. V.LeBouton (1974), "Develop. Biol.", 41, 22-30.

30. H. Leffert, Г. Moran, S.Sell et al., (1978), "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 75, 1834-1838.

31. H. Leffert, K.Koch, P. Lad et al., (1988) In: "The Liver: Biology and Pathobiology", 2nd edition, Pergamon Press, NY, 833-850.

32. W. R. Loewenstein (1979) "Biochim. Biophys. Acta", £30, 1-65.

33. M. Olsson, J. Llndahl, E.Ruoslahti (1977), "J. Exp. Med. " 145, 819-827.

34. HPiffnatelli. V. F. Bodmer (1989), "Int. J.Cancer", 44,518-523.

35. D. L. Schinucker, J. B. Mooney, A. L. Jones (1978), "J. Cell Biol.", 78, 319-337.

36. F.Shapira (1981) ."Isosymes: Curr.Top.Biol.Mad. Res.", 5, 27-7E

37. A. E. Sirica, К. V. Richards, Y. Tsukada et al., (1979), "Proc. Natl. Acad. Sci. USA". 70, 233-287.

38. D. Spray, KLFujlta, J. Sae2 et al. , (1987), "J. Cell Biol.", 106, 541-551.

39. T. A. Tchipysheva, V. I. Guelsteln, G. A.Bannikov (1977), "Int. J. Cancer", 20, 388-393.

40. A. Yee & J.-P. Revel (1977) J. Cell Biol., 70, 554-564.

Участок множительной техники еонц амн ссср

............................I I I I I ......... ,. II и

подп. • к печати 16.1231 л- закаазб! тира* 100 3x1. *