Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИЦИНА С КЛЕТКАМИ ГИБРИДОМ, СЕКРЕТИРУЮЩИХ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ

зт/

На правах рукописи

Попова Екатерина Николаевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИЦИНА С КЛЕТКАМИ ГИБРИДОМ, СЕКРЕТИРУЮЩИХ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКОЙ

СУБЪЕДИНИЦЫ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в ФГУП "ГосНИИ генетика" и в Московском Государственном Университете (МГУ) им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

Доктор биологических наук Агапов НИ.

Кандидат биологических наук Мойсеноаич М.М.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

Лрилин A.A.

Доктор биологических наук Данилова Т.А.

Ведущая организации: ГУ НИИ вирусных препаратов

им. О.Г. Анджапаридзе РАМН

Защита состоится февраля 2004 г. в 11час. ва заседании

диссертационного совета Д 001.007.01 ГУ Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н.ФХамален РАМН

Автореферат разослан «

января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор^^ Русакова Е. В,

Актуальность темы. Рицин (R60) — токсичный лектии из семян клещевины - состоит из двух субъединиц: каталитической (А субъединица или RTA) и лектиновой (В субъединица или RIB). N-гликозидазная активность RTA по отношению к 28S рРНК эукариот влечет за собой необратимую остановку синтеза белка и гибель клетки. RTB, связывающаяся с галактоз нлированными рецепторами на поверхности клетки-мишени, обеспечивает эффективный эндоцитоз токсина во внутриклеточные компаргмешы [Rutenrer Е. et al., 1991].

Токсичность, строение, лектиновая природа - все это делает рицин и родственные ему растительные и бактериальные токсины удобными объектами для изучения механизмов эндоцитоза, везикулярного транспорта, сортипга, а также трансмембранного переноса белков. В связи с этим особенно важно получение тест-систем, в том чисде иммуноферментных, селективно выявляющих рицин и его субъединицы.

Предполагается, что в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) происходит диссоциация субъединиц рицина и транслокация RTA в цитоплазму к ее рибосоыальному субстрату [Sandvig К., van Deurs В., 2000], Однако выявить свободные субьединнцы рицина в клетке-мншенн пока не удавалось. Кроме того, в ЭР попадает настолько малое количество рицина, что он не выявляется там методами электронной микроскопии [Sandvig К. and van Deurs В., 1996). Удалось лишь показать, что при обработке клеток рекомбинантным рицином с дополнительными сайтами сульфатнрования в присутствии "SO*2*, незначительная часть токсина включает радиоактивную метку, и, следовательно, попадает в ЭР [Rapak A. et al., 1997]. Поэтому вопрос о месте и механизме транслокации рицина в цитоплазму до сих пор остается открытым. В свете этого, особый интерес представляют клетки гибридом, продуцирующие антитела против RTA и устойчивые к интоксикации рицином. Предполагается, что в этих гибридомах токсин,

транслоцнроваться и цитоплазму для осуществления шгготоксичности [Youle RJ. et al., 1987]. Поэтому подобные гибрид омы оказываются удобными моделями для исследования механизмов транслокации RTA в цитоплазму.

Особый интерес к R60 вызван возможностью создавать на «го основе щпостатики для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также противовирусные вакшшы нового поколения. Глубокое понимание особенностей взаимодействия рицина с клеткой-мишенью позволит повысить качество фармакологических препаратов на его основе, а, возможно, и расширить область его практического применения.

Цель работы: изучение особенностей взаимодействия рицина с клетками млекопитающих с использованием модельных систем на основе гибридом и тест-систем, выявляющих минимальное количество рицина и его субъеднниц.

Задач» исследования:

1. Получить гибридомы против нативного рицина, нативного агглютинина рицина (R120) и против нативной и ненативной каталитической субъединицы рицина. Оценить устойчивость полученных гибридомных клеток к интоксикации рицином.

2. Охарактеризовать полученные моноклоиальные антитела (мАт). На их основе создать тест-системы, позволяющие определять RTA, R60 и R120 в присутствии друг друга.

3. Используя полученные тест-системы оценить интенсивность процесса интерналнзашш рицина, а также определить наличие свободной RTA в супернатантах и лнзатах клеток полученных гибридом. Изучить внутриклеточное распределение секретируемых иммуноглобулинов (Îg) и рицина.

Научная новизна работы:

• Получены уникальные габридомы, секретирующие мЛт против RTA, но не R60 и устойчивые к интоксикации рицином. На их основе предложена модельная система для изучения особенностей транспорта рицина, в которой абсолютно исключено взаимодействие антител с токсином »не клетки.

• На основе полученных в работе мАт, созданы уникальные тест-системы для определения RTA, не чувствительные к R60, и теет-снстсмы, позволяющие выявлять R60 и R120 в присутствии друг друга.

• Впервые выявлена свободная RTA » клетках и супернатантах клеток, предобработанных R60.

• Показано, что в гибридомах, секретирующих мАт против RTA, с иммуноглобулинами (Ig) колоколизуется не более 2-5% внутриклеточного пула рицина. Однако, именно попадание токсина в места коло кап и и шш с Ig принципиально важно для интоксикации клетки-мишени.

Практическая значимость:

• Полученные в работе нммуноферментные тест-системы могут быть использованы в лабораторной практике для решения ряда научных проблем, а также для выявления токсичных компонентов в касторовом масле, косметике н кормах для домашних животных.

• Полученные в работе иммуносорбенты позволили значительно повысить степень очистки препаратов RI20, RTA и RTB от взаимного загрязнения.

• Фундаментальные исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой, и особенно механизмов транслокации токсина в интозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов, избавиться от побочных эффектов, возникающих при их применении, а также значительно расширить область их применения в клинической практике, в том чнеле за счет нанотехнологий.

Апробация результатов н публикации. Результаты работы были доложены на международной конференции "2nd Colloquium on Mitochondria

and Myopathies in Halle/Saale"(Germany, 2000), на Advanced FEBS Course "Mitochondria in the Cell Life and Death" (Russia, Moscow, 2001), на Advanced -FEBS Course "Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects" (Turkey, Antalya, 2001), на. межлабораторных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), на межлабораторных семинарах кафедры физиологии микроорганизмов Биологического факультета МГУ, на межлабораторных семинарах в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Май не, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании секции молекулярной биологин ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 26 ноября 2003г. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура к объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 160 страницах, иллюстрировала 35 рисунками и 10 таблицами. , Список литературы содержит 145 источников.

Материалы и методы

Выделение токсинов и их субьедннпц. R60 и R120 выделяли из семян клещевины (Ricinus communis), разделяли на субъединицы и очи шали в. соответствии с описанной методикой [Tonevitsky A.G. et al, 1990]. Дополнительно, RTA очищали методом аффинной хроматографии на 2RBK1 -сефароэе 4В, RTB и R120 - на ЯсЬ1:сефарозе-4В (2RBK1 - мышиные моноклональные анти-RTB антитела (см, ниже), Rchl - мышиные моноклоиальные аити-RTA антитела [Tonevitsky A. et al, 2002]). Вискумин (ML!) выделяли из листьев омелы белой (Viscum album) no модифицированной методике [Pfiiller R et al., 1994].

Получение гибридом к антител. Мышей линии Balb/c (НИИ биомоделей РАМН, Россия); иммунизировали R60, RTA и R120 в соответствии со

схемами втабл.1. Слияние спленоцитов с миеломой линии sp2/0 проводили на третий день после бустерной иммунизации. Миелому выращивали на среде RPMI1640 (Sigma, USA), первичные гибридомы - на среде HAT

(Sigma, USA). В случае иммунизации животных нативной RTA для отбора устойчивых к рицину гибридом в среду HAT добавляли И}*'1 »t 10*nMR60, Таблица. 1 Схемы иммунизации.

Пимутиапии нажвиыми aimi генами, схемы 1-Х Иммунизация ненятнвноЦ RTA, схема 4.

1 2 3 4

I RTA 5мкг RTA 5мкг R120 1м*г в ПЛФ RTA 5 м кг в 11АФ

11 через 14 дней RTA 5мкг НАФ R60 1м кг НАФ R120 1мкг ФСБ НАФ или ФСБ RTA 5 м кг

III через 7 да ей RTA 5м кг R60 1икг R120 1мкг RTA 5мкг

IV через 7 двей RTA 5мкг R60 1мкг R120 1м кг в ФСБ КТЛ 5мкг в НАФ

V через 7 дней RTA 2мкг R60 1мкг RI2D 1мкг RTA 2мкг

VI через 7 дней R60 1мкг R120 1ыкг

Антитела накапливали в асцитной жидкости и выделяли методом аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе (Pharmacia, Sweden). Сыворотки мышей, супернатанты гибридом и мАт анализировали при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) Системы ТИФА.

1. На иммунологическую плату сорбировали антигены (RTA, R60 или R120). Инкубировали с бычьим сывороточным альбумином (БСА), затем с мАт против токсинов или их субъединиц, потом с комплексом кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (1МТЕК, Россия).

2. На плату иммобилизовали антитела против токсинов или их субъединиц нспосредствсшю (в случае мЛт) или через кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (IMTEK, Россия) (в случае сывороток и cynepi tarai пои). После забивки платы БСЛ и инкубации с сыворотками или супернатантамн гибридом (в случае работы с чистыми мЛт этот шаг отсутствовал) последовательно проводили реакции с биотинилированиымн антигенами (1мкг/мл; RTA, R60 или R120) и с комплексом стрелтав иди line роке i шага (1МТПК, Россия).

3. На иммунологическую плату сорбировали первые мАт. После инкубации с ПСА последовательно проводили реакции с aimircitaMii (R60, RTA или R120), вторыми бнотиннлироваиными мАт (1мкг/мл) и коньюгатом стрептавндннз с il сроке лдаэой хрена.

Белки сорбировали по 1мкг в лунку 96 луночной платы (Costar, USA) в фосфатном буфере (ФСБ) следующего состава: 8мМ NaiHPOí, 1мМ NalljPO«, 0,35M NaCI, pli 7,4. Реакции проводились в стандартных условиях. Калориметрические измерения просолили при 492 нм.

Оценка устойчивости клеток к интоксикации рицином и пнекумммом. Устойчивость клеток к интоксикации ришнюм или пнекумнном оценивали по количеству восстановившегося до формазана 3-(4,5,-днмепитиозолил-2-ил)-2,5-дифенилтетрозолия бромида (МТТ) (Sigma, США) в соответствии с методикой [Agapov et al., 1999].

Выявление RTA н П60 в супсрнатэитах н лнэатэх клеток, предобработок ных R60. Клетки, нредобрабоганные R60 (20мип, 37°С), отмывали от токсина (37°С) н инкубировали (37°С, 6% COj). Супернататы при необходимости концентрировали. Клетки, отмытые ФСБ лит провал и в буфере следующего состава: 0,1М NaCÎ, ЮмМ NaiHTOj, 1% Triton Х-100 и ]мМ PMSF, pli 7,4, и центрифугировали Юмнн при SOOOrpm [Iversen et al., 2001].

Концентрацию R60 и RTA определяли при помощи полученных в работе тест-систем IRK2/2RKI и 1RAK1/2RK1.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (KJ1CM). Протоколы обработки клеток различнымилнгандами описаны в подписях к рисункам в главе «Результаты». Перед получением изображений клетки фиксировали 4%-параформальдешдом и заключали в Мовиол.

Цифровые изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Confocal Laser Scanning Microscope -CLSM (LEJCA TCS 4D, Leica Boisheim, Германия)), оборудованного аргон-криптоновым лазером.

Выявление признаков яооптоэа. Морфологические изменения ядер клеток наблюдали, выявляя дезокси-ДНК Pico Green (PicoGreen dsDNA quantitation reagent, Molecular probes). Изображения клеток были получены с помошьюКЛ С М- Протоколы получения препаратов описаны в подписях к рисункам в главе «Результаты».

—Олигонуклеосомную фрагментацию ДНК выявляли после проведения электрофореза геномной ДНК в 2% агарозиом геле согласно методике [Nobukazu Kotomatsu et. al, 1998]. ,v.

Результаты и обсуждение

Предполагается, что в ходе транспорта рицина во внутриклеточных компартментах происходит диссоциация субъединиц рицина [Santivig К., van Deurs В., 2000]. Отделение RTA может сопровождаться ее конформационными перестройками, связанными с экспонированием в водную фазу гидрофобных участков, экранированных в голотоксине RTB. Предполагается, что эти перестройки принципиально важны как для транслокацнн RTA в цитоплазму, так и для осуществления ею ферментативного катализа [Montfort W. et al, 1987 Barbieri L., 1993, Simpson J.C. et a!,, 1995; Argent R.H. et al, 2000]. Таким образом, функционально

важные участки поверхности каталитической субьелишшы рицина могут, быть экспопнрованы как в пативном голотокенне, так и возникать вследствие ко] [формацн о и н ых перестроек. Учитывая это, при получении гибридом животных иммунизировали не только голотокснаом, но н его' изолированной каталитической субъсдшпшей, иатнвноП к ненатниноП. Кроме того, животных нммунтпровали агглюшшшом рицина - токсином из ссмян клещевины, Л субьедшшцы которого отличаются от Л субъедншщ рнцняа единичными аминокислотными остатками.

В результате всех иммуннзаций бил получен 21 клон гибридом, секрстнрунмцпх мАт про тип с>бьедштц лектшов из семян клещешшы (табл.2). Из них 4 были получены в результате иммунизации животных R120 и сскрстнровхш мАт, поправленные против этого токсина (группа АКК). Остальные 17 сегрегировали мАт, направленные против субьедшшц НбО, из них 1 узнавали RTB в составе R6G (2RBK1), 10 - RTA п составе R60 (группы RK и RdK) и 6 мАт - только RTA, но не голотокенц (группа RAK).

Таблица 1 Гибридомы, полненные в работе.

Группа гибридом Количсстпо КЛОНОВ Направленность аптшел

ARK. 4 R120

RBK 1 RTB и R60

RK + RdK 6-Ы RTA и R60

RAK б RTA, но не R60

Модельная система на основе гибридом группы РАК.

Гнбрндомы, обозначенные нами 11АК (1КАК(1-б)) были получены в результате иммунизации животных нативноП КТА и сскрстиросалн мАт связывающие КТА, но не R60 (табл. 2, рнс.1). Возможно, в голотокенне В-субъедшшца создает стернческнс препятствия для взаимодействия антител группы RЛK со своими эшпопами. Эю предположение согласуется с тем,

что область контакта субъединиц рицина довольно велика (1600 A2) [Kaizin BJ.etal,, 1991 J. Возможно также, что эпнтопы, к которым направлены мАт группы RAK, формируются в результате частичного разворачивания полштептшшоЙ цепи RTA, возникающего, по мнению ряда исследователей (Simpson J.C. et al., 1995], в зоне контакта с RTB после диссоциации субъединиц рицина. В любом из этих случаев, эпитопы, к которым направлены мАт группы RAK, должны быть полностью или частично расположены в зоне контакта субъединиц.

Рисунок 1. Взаимодействие мАт группы RAK с RTA (А) и R60 (Б). ОП 492 -оптическая плотность при длине волны 492нм,

пп ляп А»

1000 1 мАт (иг/ил)

1000

-tRAK-1 - 1RAK-3 ■ ■ IRAK>5 -

. 1RAK-2 ■ IRAK >4 .IRAK-«

Результаты сендвнч-ТИФА (табл. 3) позволили заключить, что 3 мАт группы КАК направлены против одного эпитопа и 3 - против другого, и эти два эпитопа не перекрываются (табл. 4).

Все гибрндомы группы RAK. были отобраны на селективной среде, содержащей 10*ПМ Rб0 как устойчивые к интоксикации (материалы и методы). Это позволяло использовать их клетки в качестве моделей для

изучения внутриклеточного транспорта рипнна. Несомненным преимуществом модельных систем на основе гибридом ipynnw RAK перед '* описанными в литературе было то, что в них абсолютно исключено т взаимодействие антител с токсином вне клетки. Благодаря этому отпадала необходимость проведения неэффективных, трудоемких и сопряженных с i введением в систему дополнительных факторов процедур для удаления Ig из супернатантов н е поверхности клеток гибридом [Youle R.J. et al., 1987; ■ Kornfeld S.B. et al., 1991; Tonevitsky A,G. et al., 1995; Малюченко H.B. и др., • 1999].

Таблица 3, Результаты ссндвич-ТИФА.

Пары мАт, не выявляющие RTA в Пары мАт, выявляющие RTA в

сендвнч-ТИФА (при 100 нг RTA сендвнч-ТИФА (при 100 иг RTA

ОП492<0Д) OIW!)

1RAKU1RAK5 1RAKI/IRAK2

IRAK 1/1RAK6 1RAK1/IRAK3

1RAK2/1RAK3 1RAK1/IRAK4

1RAK2/1RAK4 1RAK2/1RAK5

IRAK3/1RAK2 1RAK2/1RAK6

1RAK3/1RAK4 1RAK3/1RAK5

1RAK5/1HAK6 1RAK3/1RAK6

1RAK4/1RAK5

1RAK4/1RAK6

Таблица 4. Эггитопная направленность мАт группы RA К.

антитела

Эпитоп 1 1RAK1, IRAKS, 1RAK6

Эпнтоп 2 1RAK2,1RAK3, 1RAK4

Для создания модели была выбрана гибридома 1КАКЗ. Устойчивость клеток гибридомы 111АКЗ к цитотоксическому действию рицина но сравнению с вискумином оценивалась с помошью МТТ-теста

(рис.2). В качестве контроля оценивали устойчивость к интоксикации рицином и вискушшом клеток гибридомы ТА5, секретирутощей мАт против каталитической субъединицы вискумнна. [Tonevitsky A.G. et al, 1995]. Полулетальная доза R60 для клеток 1RAK3 составляла 2*1СГ'°М, что на 2 порядка выше, чем для неустойчивых к интоксикации рицином клеток ТА5 (рис.2). Клетки 1RAK3 не проявляли неспецифической устойчивости к интоксикации вискумином. В наших экспериментальных условиях полулетальная доза вискумина для них составляла2*10"14, что на 4 порядка ниже, чем для устойчивых к интоксикации висумином клеток ТА5 (рис.2). Полученные результаты подтверждают ранее опубликованные данные о том, что устойчивость клеток гибридом к токсину обусловлена секрецией мАт против этого токсина [Youle RJ. et al., 1987]. Связывание RTA антителами, вероятно, блокирует транслокацию каталитической субъединицы п цитоплазму и, следовательно, интоксикацию клеток гибридомы.

Рисунок 2. Цитотоксическое действие рицина (А) и вискумина (Б) на клетки гибридом 1RAK3 и ТА-5. % живых клеток определяли по количеству восстановившегося M i 1.

120 \ „ПО . ¡100 i

-8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 0

1UAK3

-TA-S

Тест-системы для определения R60, R120 и RTA.

На основе полученных мЛт были созданы тест-системы для выявления токсинов из семян клещевины. Тест-система на основе пары 1RK2 и 2RK1 позволяла выявлять менее 0,3нг рицина (рис.4.А). Тест-система на основе пары ARK1 и ARK3 позволяла выявлять менее Знг агглютинина рицина (рис. 4.Б). Обе тест-системы дискриминировали токсины друг от друга.

Рнсунок 4. Тест системы на основе пар мАт 1RK2/2RK1 (А) и ARK1/ARKЗ (Б) для выявления Я60 (А) и R12G (Б). ОП492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

10 зо too i з to 30 концентрация токсинов (пг/мл)

100 300 1000

Различия каталитических субьединиц R60 и R120 по 17 аминокислотным остаткам не приводят к существенным изменениям их структуры [Rutenrer Е, et а!., 1991, Sweeney Е.С. et al. ,1997], а также каталитической активности (Barbieri L. et at, 1993], При этом R120, в отличие от R60 практически не токсичен. Возможно, различия в топографии поверхности каталитических субьединиц R60 и R120, выявляемые мышиными антителами, влияют на эффективность доставки токсинов в цитоплазму, н, как следствие, на оказываемый ими пиготоксический эффект.

На основе пар мАт 1RAK1/2RK1, и 1RAK4/1RAK.6 были получены уникальные тест-системы, позволяющие выявлять менее 0,3пг каталитической субъединицы рицина в присутствии голотоксина (рис, 5). Тест-системы, отличающие RTA от R6Q, были получены впервые в данной работе. Тест система 1RAK.1/2RK.1, позволяла определять не только свободную RTA, но и в комплексе с мАт 1RAK3. Это давало возможность использовать ее для выявления RTA в клетках гибридомы 1RAK3,

Рисунок 5. Тсст-системы на основе мАт 1RAK1/2RK1 (1, 3 и 4) и 1RAK4/1RAK6 (2 и S) для выявления RTA (!, 2) и комплекса RTA с мАт 1RAK3 (3), 4 и 5 -реакция с R60. OII492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

Выявление свободной RTA в супернатантах и лизатах клеток 1RAK3 и sp2/0, предобработанных R60.

Диссоциация субъединиц рицина и транслокация RTA в цитозоль до сих пор остается наименее изученным этапом транспорта рицина. Ни место, ни механизм диссоциации субъединиц не определены. Более того, до сих пор не удавалось детектировать свободную RTA в клетке-мишени.

Тест-система 1RAK1/2RK1 позволила впервые выявить свободную RTA в супернатантах клеток гибридомы IRAK3, предобработанных как

выбранной в качестве модели.

ОП492

0,1 OJ 1 3 10 30 100 300 1000

концентрация токсинов (кг/мл)

—«— 1 -9—1 —Л—3 -а—4 -Л—5

летальными (1000 и 100нг/мл), так и сублетальными (50 и 10нг/мл) дозами ршшна через 20 часов инкубации после отмывки от токсинов (рис. 6). Таким образом, было однозначно показано, что происходит диссоциация субъединиц токсина в клетках НШСЗ, предобработанных рицином. Присутствие КТА в супернатантах клеток, предобработанных сублетальными дозами рииина указывает на то, что каталитическая субъедншща выбрасывается из живых клеток гибридомы. Следовательно, диссоциация субъединиц происходит во внутриклеточных компартментах до транслокацин в цитозоль. Об этом же свидетельствует устойчивость данной гибридомы к интоксикации рицином.

ОП492

1

оз о*

<М 0

Рисунок б. Выявление КТА в супернатантах клеток гибридомы ШАКЗ, предобработанных рицином в концентрациях 1мкг/мл (1), 100нг/мл (2), 50иг/мл (3), 10 нг/мл (4) на 1млн. клеток через 20 часов инкубации в отсутствии токсина. 5 — контрольные клетки. ОП492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

С помощью той же тест-системы ЯГА была детектирована в лизатах клеток гибридомы 1ЯАКЗ и плазмацитомы 5р2/0, используемой в настоящей работе при получении гибридом в качестве партнера для слияния со спленоцитамя («Материалы и методы»). Клетки были кратковременно обработаны рицином в концентрации ЮОнг/мл и затем проинкубированы в течете 5 часов в отсутствии токсина.

Предварительно было показано, что супернаганты и лизаты клеток обеих линий в данных условиях обработки токсином содержат одинаковое количество рицина (рис 7). Оценки были сделаны при помоши тест-системы 1RK2/2RK1. Согласно нашим данным, с клетками обеих линий связывалось более 80 % ришша, в течение 5 часов инкубации в культуральную среду возвращалась лишь незначительная часть (3-5%) рицина. В клеточных лизатах детектировалось лишь 12-15% токсина, что согласуется с литературными данными о том, что рицин транспортируется в клетке-мищени в мембрано-связанной форме [Бушуева ТЛ. и соавт., 1992; Ramalingam T.S. etal., 1994; SandvigK. et al., 1996; Simpson J.C. etal., 1996]

4

90 SO 70 60 ■ 50 ■ 40 30 10 10 0

САСШИКЬ С

клеткой

сойерж1тя • tjnepH«ntrr»i послс S ЧМОВ яякуФмян

Рисунок 7. Выявление И60 в супернатантах (! и 2) и лизатах (3) клеток гибридомы 1ЯАКЗ и илазмаиитомы $р2/0,

предобработки! ых рицином (100 нг/мл на 1млн, клеток), 3 через 20 минут инкубации с ИбО

содержится в

.•шмт»*оосле5 (1) после 5 часов инкубации В

□1RAK3 В$р2/0

■нкуб»авн отсутствии токсина (2 и 3) ири помощи тест-системы

1RK2/2RKI. Результаты

представлены в % от добавленного к клеткам R60.

В супернатантах клеток обеих линий после 20 минут инкубации с рицином-ЯГА не детектировалась. Через 5 часов инкубации после отмывки от токсина ЯТА выявлялась в супернатанте клеток 1ЯАЮ, но не 5р2/0, а также в лизатах клеток обеих линий. Однако ее количество в лизатах клеток 1ЯАКЗ было примерно вдвое больше, чем в лизатах клеток гр2/0 (рис. 8).

Таким образом, количество свободной ЙТА в клетках 1ЯАКЗ, где транслокация КГА блокируется за > счет связывания мАт, значительно превышало ее количество в чувствительных к интоксикации рицином клетках плазмацитомы зр2/0. Полученные: результаты < свидетельствуют о принципиальной • важности: диссоциации субъединиц рицина для интоксикации клетки-мишени. .

ошв

I,« WO

о

VB

од

150 0,« W» <Ш од*

лввпы кютис чфе) 5« ЭДСЛС

«пшмтИбО

1

с)пкрмтнты

«yntfiinmu про Ji после опилен • птКбв

; ■■icjtim» ( RM □тлювчдо

Рисунок 8. Выявление ЯТА в супернахангах (1и 2) и лнзатах (3) клеток гибридомы 1КАКЗ и плазмацитомы &р2/0, пред обработанных рицином, через 20 мин. инкубации с Я60 (1) и после 5 часов инкубации в отсутствии токсина (2 и 3) при помощи тест-системы 1РАК1/2ЮС1. ОП 492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

Распределение иммуноглобулинов и рицина в клетках гибридомы 1RAK3.

Устойчивость гибридомы 1RAK3 к интоксикации рицином свидетельствует о том, что транспорт токсина в компартмент, где происходит его связывание мАт, принципиально важен для осуществления цитотоксичности. Распределение иммуноглобулинов и рицина в клетках, гибридомы 1RAK3 оценивали при помощи КЛСМ.

I'hcjiior 9. Июбрлжеиня клеток гпорлдочи ] RAK3. порученные с почошмо KJICM. Клетки, фиксированные 4% парафорчал [.дошлом и перчиоб шип» ванные метанолом (-20"С) об рай an,та ли ЗОчнп при 20"С о РНК-ачой Д (Sigma, USA) в концентрации Шч к i/мл (для 11 п Г otipaiituк*а РНК-аюЙ А отсугстповала), чатсм одновременно 1шк}биро(»али о Pieoiiieen (Molecular probes) и антимьшшнымк lg-ТРИТЦ (Sigma, USA) (А и Ь) или ConA-Atexa488 (Molecular probes) 11 аншмышшшм» lg-ТРИТЦ (It и Г) (ЗОчнн при 20°C). Изображения получены и результате лек'кшш флуоресцентного сигнала or (A) PicoGiecn (ядра), (II) Alexa-IKR (*)Р и АР) и (It и Г) ТРИТЦ (Ig), В левом верхнем углу каждого изображения горизонтальный срез, справа и снизу - смоделированные нершкапьпые срезы, линии сечення указаны. Маркеры для А н I» - 8 микрон, для U н Г -10 микрон.

шЩ IBS

В

г*?. >

г

Для выявления Ig использовали антимышиные антитела, меченные флуорохромами ТРИТЦ (рис. 9) или ФИТЦ (рис.10), В клетках также определяли расположение и морфологию ядра с помощью PicoGieen (рис. 9А, рис. 10Л и В), а также идеитифицирвапи ЭР и АГ с помощью СопА, меченного ФИТЦ (рис. 9 В). Ядра в клетках гибридомы 1RAK3 были крупные; неправильной формы: и располагались-асимметрично. Вне ядра большую часть пространства клетки занимали !g. Наблюдалась практически полная колокализация Ig с СопА (рис. 9В и Г), что свидетельствовало об их локализации в ЭР и АГ, Ig, не колокализовавшиеся с СопА, могли быть расположены в области АГ, где СопА отсутствовал или в везикулах, отпочковывающихся от транс-Гояьджи и направляющихся к плазматической-мембране. Таким образом, полученные результаты соответствовали современным представлениям о пространственной организации синтеза и секреции Ig в плазматических клетках.

Рисунок 10. Изображения, клеток гибридомы 1RAK3, полученные с помощью- KJICM. Клетки, инкубировали. с конъюгатом рицнн-А1сха5б8 [Moisenovich et al, 2002] (1мкт/мл) в течение 15мин (А и Б), 8часов (В и Г) и ЗОмин (Д'И Е), отмывали от несвязавшегося токсина ОДМ a-D-лакгозой (Sigma, USA) (только для Д и:Е), фиксировали 4% параформальдегидом

(Sigma, USA), пермиобилизовали ; метанолом (-20^), обрабатывали ЗОмин

* * ♦

при 20°С с РНК-азоЙ A (Sigma, USA) в концентрации. 10мкг/мл (для Д и Е обработав РНК-азой . А отсутствовала), затем PicoGreen (Molecular probes) (А-Г) или антимышинымй Ig-ФИТЦ'(Sigma; USA) (Д и Е).. Изображения получены в результате-детекции флуоресцентного сигнала от (А и В) PicoGrecn (ядра), (Д) ФИТЦ (Ig) й (Б, Г и Е) А1еха5б8 (рицин). В левом верхнем углу каждого изображения горизонтальный срез, справа и снизу — смоделированные вертикальные срезы, линии сечения указаны. Маркеры: А и Б - 8 микрон, В - Б - 7. микрон* >.'.. -

~ V-

Vi

Б

ШЩШ1 ^ A»--". ÔÊ3 1Ш : - "¿Й-..ж; •i ^tí . ГЩрШ^ " .''UV.V. 'О i (Ni I Ç- • J,- •" ■.-'ï -т

mm В .хша ■* -f>t"' " 1 n 1 —0-.—-I 4 ч* »■* г

"íjeít j-ÁÍ''■Л'Ч'*'-X*' 7W! ■■■■ .. ¡ -• •í- .'i т Ж

• • . V - V E

После 15мин обработки клегток гибридомы IRA КЗ R60 (1мкг/мл) морфология ядер не менялась (рис; 10А), в то "время как после длительной обработки в ядрах наблюдались изменения, характерные для терминальной стадии развития апошоза [Haie et al; 1996): фрагментация ядер (рис: 10В) и олигонуклеосомная фрагментация ДНК, визуализируемая в виде «лесенки» в агарозном геле после проведения электрофореза геномной ДНК (данные не представлены). Через 15мин-после обработки клеток тбрндомы 1RAK3 рицином, меченным флуорохромом А1еха568, токсин обнаруживался,-преимущественно, как плотное скопление в центре клетки около ядра, но не в ядре (рис. 10А и Б). Такая локализация рицина в клетке сохранялась и через 8 часов (рис. 10В и Г). Следует отметить, что риинн также детектировался на поверхности клеток (рис. 10Б и Г), откуда легко удалялся ОД M раствором a-D-лактозы (рис. 10Е). В клетках гибридомы IRA КЗ рицин практически не колоколизовался с Ig (рис. 10Д и Е). По количественным оценкам колокализацня рицина n lg не- превышала 2-5%. Однако, устойчивость клегток гибридомы-. 1RAK3 к интоксикации рицином свидетельствует о том, что именно транспорт этой незначительной части токсина в комлартменты, где. наблюдалась его колокализацня с Ig, принципиально важен для интоксикации клеток.

Выводы

1. Получено и охарактеризовано 17 новых гибридом против субъединиц рицина: 1 - против RTB н >1б - против RTA. Кроме того, получено 4 клона гибридом против агглютинина рицина. Предложена модель для изучения транспорта рицина на основе гибридом, секретирующнх мАт против RTA, но не связывающих: R60. В : предложенной модельной системе взаимодействие токсина с антителами вне клетки исключено.

2. На основе анти-RTA мАт и анти-Я120 мАт созданы тест-системы, позволяющие выявлять менее 0,3нг R60 н RTA и менее Знг R120 в

присутствии друг друга. Тест-системы, позволяющие различать КбО, Ю20 и ИТА получены впервые.

3. Впервые выявлена свободная ЯТА в супернатантах и л 1 патах клетки-мишени. Показано, что диссоциация субъединиц рицина происходит во внутриклеточных компартментах до транслокации в цитоплазму, а также, что днссодиааня субъединиц рицина необходима для интоксикации клеток.

4. Установлено, что интоксикация клеток определяется транспортом токсина в компартменты, где в гибридомных клетках присутствуют иммуноглобулины. Показано, что в эти компартменты транспортируется лишь незначительная фракция токсина (не более 2-5%).

Список сокращений

СопА Конконавалнн А

MLI Вискумин — токсин из листьев Viscum album

R120 Агглютинин рицина - токсин из семяи Ricinus communis

R60 Рицин — токсин из семян Ricinus communis

RTA Каталитическая субъединица рицина

RTB Лектиновал субъединнца рицина

АГ Аппарат Гольджп

БСА Бычий сывороточный альбумнн

KJICM Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

мАт Моноклональные антитела

МТТ , 3-(4,5,-ди мети лтиозолил-2-ил)-2,5-дифеи илтетрозол и il -бромид

МТТ-тест оценка жизнеспособности клеток" по количеству МТТ,

восстановившегося до фор мазана

ТИФА Твердофазный иммуноферментный анализ ФИШ,

ТРИТЦ, Флуорохромы, используемые в KJ1CM А1еха5б8

ФСБ ЭР

Фосфатный буфер (8мМ Na2HPOi, 1мМ NaH2P04, 0.35М NaCl, рН 7,4)

Эшзоплазматический ретикулум :

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Pletushkina, O.Ju., Popova, Е., Shchepina, L. and Chcmyak, B.V., Mitochondrial Membrane Potential, Respiration and ATP Synthesis are not Necessary for Staurosporin-mduced Apoptosis and Anti-apoptotic Action of Bcl-2 in HeLa cells, International conference "2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle/Saale'Y Germany, March 31-April 2, 2000; European Journal ofMedical Research, 2000, v. 5, № I, p.37;

2. Щепнна Л.А., Плетюшкина О.Ю., Попова E.H., Черняк Б.В., Основные митохонлриальные функции необязательны для апотоза, индуцируемого сгауроспорином, и защитного действия онкобелка Вс1-2, Международная конференция " Митохондрии, клетки и активные формы кислорода*', Пущино, 06-09 июня, 2000, стр. !72;

3. Коровника RA., Щепина Л.А., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В„ Изучение выхода цитохрома с при стауроспорин- и ФНОа-ицдуцированном апоптозе, Международная конференция студентов н аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов 2001", Москва, 0911 апреля,2001, стр.179;

4. Щепнна Л.А., Попова Е., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В. Апоггтоз клеток HeLa, вызванный фактором некроза опухолей, зависит от образования неселективных пор во внутренней мембране митохондрий, Всероссийское рабочее совещание "Митохондрии в патологии", Пущино, 28-31 мая, 2001,стр.210;

5. Shchepina, L.A., Popova, E.N., Pletjushfcina, O.Yu. and Chemyak, B.V., TNFa-induced apoptosis in HeLa cells depends on opening of permeability transition pore in mitochondrial membrane. Advanced FEBS Course: "Mitochondria in the Cell Life and Death**, Russia, Moscow, 2-7 September, 2001,p.23; :

6. Shchepina, L.A„ Popova, EiN., Pletjushkma, O.Yu. and Chemyak, B.V., Staurosporin- and TNFa-induced apoptosis and anti-apoptotic action of Bcl-2 in HeLa cells ore not linked to mitochondrial membrane potential and respiration, Advanced FEBS Course "Free Radicals, Nitric Oxide,;, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspccts", Turkey, Antalya, September 23 - October 3,2001, p. 100;

7. Щепнна Л.А., Попова E.H., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Апоптоз клеток HeLa и антнапоптозное действие онкобелка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий. Биохимия, т. 67, Хэ2, 2002, етр. 265-270;

8. Тоневицкый А.Г., Демина И.А., Агапов И.И., Фаггахава Г.В., Полова E.H., Мойсенович М.М., Комолов И.С., Халанский A.C., акад.РАН Кирпичников М.П., Цитотоксическая активность коньюгатов человеческого трансферрина и А-субьединиц растительных токсинов in vitro и in vivo МДАН т. 374,Кв4,2000, стр. 557-560;

9. ММ Мойсенович, СХ. Егорова, О.В. Челнокова, И.А. Демина, Н.Р. Полосухина, Н.В. Козловская, E.H. Попова, Г.В. Фаттахова, О.Н. Солопова, И.И. Агапов, Влияние схемы иммунизации на эпитопную направленность моноклональных антител, взаимодействующих со связывающей субьединицей вискумина.// Российский иммунологический журнал, т. 5, №4,2000, сгр. 375-384;

Ю.Попова ЕЛ., Егорова С.Г., Демина И.А., Венедиктова O.A., Агалов НИ., Мойсенович М.М. Мышиные моиоклонаяьные антитела против рииина не реагируют с агглютинином рицина.// Российский иммунологический журнал, т. 8, №3,2003, стр. 235-239.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник*» ПД № 1-00007.ОТ 23.06.2000 г. Подписано в печать 05.01.2004 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,6

Печать авторефератов 730-47-74

*-2822