Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Цитотоксическая активность конъюгатов на основе А-субъединиц рицина и моноклональных антител против меланомы человека

ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ А-СУБЪЕДИНИЦ РИЦИНА И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Руководитель:

кандидат биологических наук

ст. н. с. Егорова С. Г.

Научный консультант доктор биологических наук,

профессор Гусев М. В.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, Суслов А.П.

доктор медицинских наук, Барышников А.Ю

Ведущая организация: Институт Иммунологии

Защита состоится " " ^^_1996 г.

в Ж

часов на заседании Диссертационного Совета К 001.07.01 в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук Е.И.Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: В настоящее время внимание многих исследователей сосредоточено на поиске препаратов, специфически воздействующих на опухолевые ткани и не дающих побочных эффектов. Молекулярные, биохимические, генетические различия между нормальными и опухолевыми клетками, особенности метаболизма опухолевых тканей создают теоретические предпосылки для разработки методов направленной доставки лекарственных препаратов, радиоизотопов, цитотоксинов.

Перспективными фармакологическими препаратами направленного действия являются иммунотоксины на основе растительных или бактериальных токсинов и моноклональных антител (МА) против опухолевых антигенов (ОАА).

. Во многих случаях крайне трудно определить специфические маркеры на поверхности опухолевой клетки. Однако меланома характеризуется высоким уровнем экспрессии специфических антигенов, что делает использование иммунотоксинов для терапии мела-номы весьма перспективным.

Для получения иммунотоксинов наиболее часто используют растительные рибосом-инактивирующие белки. К таким белкам относятся два основных лектина из семян Ricinus communis - рицин (Р60) и агглютинин рицина (АгРбО), каталитические субъединицы которых являются специфическими N-гликозидазами, модифицирующими 28S РНК 60S субъединицы эукариотических рибосом. Одной молекулы А-субъединицы, попавшей в цитоплазму, достаточно для гибели клетки.

Целью работы было получение иммунотоксинов на основе каталитических субъединиц рицина (РТА), агглютинина рицина (АгРТА) и моноклональных антител против меланомы кожи человека и

сравнение цитотоксической активности данных иммунотоксинов vitro.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задач]

1. Получение моноклональных антител против меланомы кожи человека.

2. Выделение рицина и агглютинина рицина и их каталитичес ких субъединиц.

3. Получение иммунотоксинов против меланомы кожи человек на основе А-субъединиц рицина, агглютинина рицина и монокле нальных антител.

4. Изучение цитотоксического действия рицина, агглютинин рицина и их каталитических субъединиц на клетки меланомы чело века in vitro.

5. Сравнение эффективности действия иммунотоксинов, содер жащих разные каталитические субъединицы.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимост работы.

В результате проведенных исследований получена гибридом! B3F7, продуцирующая НА, которые избирательно реагируют < клеточными линиями меланомы кожи человека и с меланомным! клетками, выделенными из операционного материала. Определен? локализация антигена и его молекулярная масса.

Изучено действие агглютинина рицина и его А-субъединицы не клетки меланомы человека. Впервые показано, что цитотоксическое действие рицина на клетки меланомы человека примерно в 100 ра; выше агглютинина, в то время как неспецифическое цитотоксическое действие изолированных каталитических

субъединиц двух токсинов практически не отличается.

Впервые получены конъюгаты моноклональных антител ВЗР7 с А-цепью растительного цитотоксина рицина (РТА/ВЗЕ7) и с А-цепью агглютинина рицина (АгРТА/ВЗР7). Изучено действие данных иммунотоксинов на клетки меланомы человека линий МБ и МеДОо. Показано, что РТА/ВЗР7 обладает высокой эффективностью и избирательностью действия.

Монокпональные антитела ВЗР7 изотипа , специфически реагирующие с поверхностным 35-Юа антигеном клеток меланомы кожи человека линий Вго, Ме№о, МЭ, РМ55т, РМ55р, РМ2, РМЗ, является перспективным реагентом для создания тест систем для диагностики меланомы.

■ Полученный в данной работе конъюгат каталитической субъединицы рицина и моноклональных антител ВЗР7 является высокоизбирательным цитотоксическим агентом. После изучения его фармакологических свойств он может быть использован в качестве препарата для направленной элиминации клеток меланомы кожи человека.

Предложенная модельная система, состоящая из клеток-мишеней и конъюгатов моноклональных антител и разных каталитических субъединиц, является перспективной для изучения механизма действия нативных токсинов и их производных.

Апробация.

Материалы диссертации апробированы на 9-м международном конгрессе по иммунологии (23-29 июля 1995, США), на Европейском симпозиуме по биотехнологии (29 октября - 6 ноября 1995, Анкара), на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии

Биологического факультета МГУ (октябрь 1995).

Структура и объем работы. Материалы диссертаций изложены на 95 страницах машинописного текста (включая 14 рисунков, 5 таблиц) состоят из разделов: "Введение", "Обзор литературы". "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Список использованной литературы" (133 источника).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы и методы.

Материалы

В работе использовали антисыворотки против иммуноглобулинов мыши, меченные ФИТЦ (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи).

Сыворотка новорожденных телят фирмы Gibco.

Димеры агглютинина рицина (1/2АгР60) любезно предоставлены сотрудником НИИ генетики и селекции микроорганизмов Темяковым Д..

Остальные реактивы получены от фирм Sigma (США), Serva (Германия), Pharmacia (Швеция).

Клетки культивировали в пластиковой посуде фирмы Nunc (Дания) и Costar (США).

Клеточные линии MeWo, Вго, MS были любезно предоставлены сотрудником института канцерогенеза к. б. н. Матвеевой В.А. Клеточные линии FM55m, FM55p, FM3 любезно предоставлены сотрудником Датского онкологического общества Киркиным А.Ф. Остальные клеточные линии были любезно предоставлены сотрудником НИИ генетики и селекции микроорганизмов Тоневицким А. Г.. Клинический

материал предоставлен зав. отделением общей онкологии городской клинической больницы N40 д.м.н. Могилевским И.Л..

Использованы мыши линии Balb/c, полученные из питомника "Столбовая".

Методы.

Условия культивирования клеток.

Клетки культивировали в атмосфере. содержащей 6.1% углекислого газа, при 37°С, в пластиковых флаконах фирмы "Costar" (США), на среде RPMI-1640 фирмы Sigma (США), с добавлением 10% сыворотки новорожденных телят (фирма "GIBC0", США), 0,03% L-глутамина, 2 г/л бикарбоната натрия и 100 мкг/мл гентамицина. Для проведения экспериментов адгезивные клетки снимали 0,2% раствором ЭДТА в фосфатно-солевом буфере рН7.2 (ФСБ) и трижды отмывали ФСБ, центрифугированием при 1100 об. \мин.

Получение гибридомы.

Мышей линии Balb/C трижды иммунизировали внутрибрюшинно клетками постоянных культуральных линий меланомы BR0, MeWo и опухолевыми клетками, выделенными из операционного материала, и один раз - внутривенно с интервалом в 3-4 недели. При каждой инъекции вводили от одного до десяти миллионов клеток. Слияние иммунных селезеночных лимфоцитов и миеломы P3-X63.Ag8-653 проводили в полиэтиленгликоле (Мг 4000), согласно опубликованному методу ( Davidson, Gerald, 1977) с некоторыми изменениями (Егорова и др., 1989). Гибридомы клонировали методом лимитирующих разведений.

Супернатанты растущих гибридом тестировали методом непря мой иммунофлуоресценции на фиксированных формалином клетках ли нии Вго. В качестве вторых антител использовали антисыворотм против мышиных иммуноглобулинов, меченные ФИТЦ (ИЗМ им. Н.Ф.Гамалеи) в разведении 1:5. Отрицательным контролем служила кондиционированная среда, положительным - антисыворотка иммунизированной мыши.

Класс моноклональных антител определяли методом иммунодиф-фузии в геле по Оухтерлони с помощью кроличьих антител против различных субклассов иммуноглобулинов мыши.

Антитела из асцитной жидкости выделяли осаждением сульфатом аммония при 50%-м насыщении, и последующей гельфильтрацией на колонке Spherogel TSK 3000SW.

Определение молекулярной массы антигена меланомы.

Молекулярную массу антигена определяли с помощью электрофореза и иммуноблоттинга клеточного экстракта. Для этого экстракцию клеточных белков проводили неионным детергентом NP-40: 2-5*10б клеток линии MeWo суспендировали в 0.2 мл 0.5% раствора детергента в PBS и инкубировали 1 час при 4°С Полученный лизат центрифугировали 10 минут при 1000g. Супернатант отбирали и центрифугировали 30 мин. при 10000g. После электрофоретического разделения белков клеточного экстракта в 10%-м ПААГ по методу Лэммли их переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя методику "полусухого" переноса (Kynse Andersen, 1980). Нитроцеллюлозную мембрану последовательно обрабатывали MA B3F7, затем коньюгатом поликлональ-ных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, меченых

пероксидазой. Все инкубации проводили в фосфатно-солевом буфере с БСА 1 мг/мл и 0,05% Tween-20 в течении 1 ч при 37°С. В качестве субстрата для пероксидазной реакции использовали 3,3'-диашнобензидин в 50мМ Трис-HCl, рН-7, 6.

Получение А-субъединиц токсинов.

Рицин и агглютинин рицина экстрагировали из семян клещевины Ricinus communis. РТА и АгРТА получали следующим образом. Колонку с лактозил-сефарозой 4В (общая лектиновая емкость 12mg/ml) уравновешивали фосфатным буфером, содержащим 50тМ ди-гидрофосфата натрия (рН=7.2) и наносили 30 mg белка. После промывки колонки А-субъединицу элюировали 2% раствором меркапоэта-нола в том же буфере. Чистоту полученных препаратов проверяли электрофоретически и в случае необходимости повторяли процедуру очистки.

Получение иммунотоксинов.

Моноклональные антитела обрабатывали бифункциональным реагентом N-сукцинимидил-З (2 пиридилдитио) пропионатом (СПДП). На молекулу иммуноглобулина вводили 3-4 пиридилдисульфидные группы. К препарату РТА добавляли до ЮмМ дитиотреитола и после гель-фильтрации на Сефадексе G25 смешивали с модифицированными антителами. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре в течении 12 ч. Конъюгат отделяли от непрореагировавших молекул антител и А-субъединиц токсина .с помощью гельфильтрации на колонке Spherogel TSK 3000SW в системе HPLC.

Данную работу проводили совместно с доктором биологических наук А.Г.Тоневицким (НИИ генетики и селекции промышленных мик-

роорганизыов).

Определение способности МА и иммунотоксинов активирооат систему комплемента.

Предварительно снятые и отмытые клетки инкубировали 30 ми нут при 37°С, в 50 мкл. раствора, содержащего 150 мкг./мл. им мунотоксина или МА в ФСБ. Затем клетки трижды отмывали центри фугированием в 0,1 М растворе ФСБ. Клетки ресуспендировали 100 мкл. 2% раствора кроличьей сыворотки в ФСБ. Инкубировали 3i мин. при 37°С. Выживаемость клеток определяли по исключена трипанового синего.

Оценка цитотоксической активности препаратов.

Цитотоксическое действие иммунотоксинов определяли по выживаемости клеток, используя МТТ-метод (Куриляк и др., 1994). I 96-луночные планшеты вносили 2х104 клеток на лунку, культивировали сутки, затем добавляли цитотоксические агенты и инкубировали 1 час при 4°С. Затем дважды отмывали клетки в RPMI, добавляли по 100 мкл среды культивирования. Через 48 часов инкубирования в С02 инкубаторе в каждую лунку вносили по 10 мкл МТТ (5 мг/мл изотонического раствора). После 3-х часов инкубации при 37°С удаляли из лунок среду и добавляли 100 мкл ДМС0. Интенсивность окрашивания среды измеряли на спектрофотометре Multiscan (Labsysteros) при 540 нм. За 100% принималась интенсивность окрашивания клеток, культивировавшихся без токсинов. Для сравнения активности иммунотоксинов определяли их концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток (ЛД50).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные моноклональные антитела ВЗЕ7 реагировали с клетками меланомы линий MeWo, Вго, Мз, ЕМ55т, ЕМ55р, ЕМЗ. ЕМ2. Реакция наблюдалась на клетках меланомы, выделенных как из первичных опухолей, так и из метастазов, но не на аутологичных мононуклеарных клетках.

Антиген, узнаваемый антителами ВЗЕ7, имел мембранную локализацию (см. рис.1), и не обнаруживался на клетках линий 11266, Уигса1, и937, на мононуклеарных клетках крови человека, на клетках аденокарциномы лёгкого человека, а также на мышиных фибробластах линии А9.

■ Иммуноблоттинг экстракта клеток меланомы человека показал, что моноклональные антитела ВЗЕ7 реагируют с компонентом экстракта, тлеющим молекулярную массу около 35 кДа (рис.2). Элект-рофоретическое разделение экстракта проводили в редуцирующих условиях с разрушением Б-Б связей, поэтому компонент 35кДа может являться субъединицей более тяжелого компонента.

Важно отметить, что антиген ВЗР7 устойчив к фиксации формалином, параформальдегидом, и к другим фиксаторам а также к процедуре заливки в парафин. Данные методы применяются во всех патоморфологических лабораториях онкологических клиник, поэтому наши антитела могут быть использованы для уточняющей диагностики меланомы.

Из известных меланомоассоциированных антигенов, антиген, узнаваемый моноклональными антителами 131 имеет сходную молекулярную массу. Этот антиген с термолабильной детерминантом, чувствительной к действию протеаз, присутствует в виде т,шунных

...... ... ........................,

Рисунок 1. Реакция моноклональных антител ВЗР7 с клетками постоянной культуральной линии меланомы Ме^/о. Метод непрямой имму-нофлуоресценции (см. "Материалы и методы"), увеличение х400.

комплексов в сыворотке больных меланомой. Антиген был изолирован методом аффинной хроматографии и при электрофорезе давал отдельную полосу в области 35кДа. Он не экспрессировался на клетках кожи и лёгкого и кроме меланомы был обнаружен на некоторых карциномах и саркомах (Wong et al 1994).

а

35 кДа

Рисунок 2. Иммуноблоттинг лизата клеток постоянной культураль-ной линии меланомы Ме\7о и антигеннегативных фибробластов, мыши (линия А9).

1. Тяжёлые и лёгкие цепи моноклональных антител ВЗР7;

2. Лизат антигеннегативных клеток линии А9;

3. Лизат клеток меланомы линии МеИО.

Антигенная детерминанта ВЗР7 является термостабильной, т.к. после термической обработки (100°С, 5 мин) антигенная активность сохранялась. Однако, антитела ВЗЕ7 могут узнавать другую детерминанту, присутствующую на антигене

Следующим этапом нашей работы было получение иммунотоксинов. Эффективность действия иммунотоксина зависит от свойств, специфичности и изотипа используемых антител, а так же

от входящей в его состав каталитической субъединицы. Поэтому в наши задачи входило сравнить эффективность действия конъюгатов, синтезированных на основе хорошо изученного рицина и не применявшегося ранее для синтеза иммунотоксинов агглютинина рицина.

Для синтеза иммунотоксинов использовали бифункциональный реагент N-сукцинимидил-З (2 пиридилдитио) пропионат (СПДП). В результате модифицирования MA B3F7 было введено 3-4 группы СПДП на одну молекулу иммуноглобулина. После активации, А-субъедини-цы токсинов были добавлены к антителам, и смесь проинкубирована в течении 12 ч.. Полученные коныогаты очищали от свободных антител и А-субъединиц с помощью гельфильтрации. На рис.3 представлен электрофорез гельфильтрационного разделения B3F7/PTA им-мунотоксина: дорожка 1 -иммунотоксины с одной и двумя А-субъ-единицами (210 и 180kDa), дорожка 2 -иммунотоксин с одной А-субъединицей (180 kDa) и дорожка 3 - свободные антитела (150 kDa). Для дальнейшей работы были использованы иммунотоксины с одной А-субъединицей, представляющие основную фракцию при гель-фильтрации. Подобные результаты были получены и с коньюгатами А-цепи агглютинина с МА.

Изучение цитотоксичности нативных токсинов - рицина и аг-лютинина рицина показало, что их активности различаются более чем в 100 раз (рис. 4). ЛД50 на клетках линии MeWo и А9 для рицина составляла 10" ПМ, а для агглютинина 10"9М (табл.1). В тоже время, цитотокическая активность каталитических субъединиц этих токсинов была примерно равной как на клетках мишенях, так и на контрольной линии А9. Исследования аминокислотной последовательности РТА и АгРТА показали высокую степень их гомологии -

1 2

V;-N

210 ¡180 ИбО

j

Рисунок 3. ДДС-Ыа ПАА электрофорез основных фракций гепьфиль-трационной очистки иммунотоксина РТА/ВЗЯ7.

1- иммунотоксин с одной и двумя А-субъединицами рицина;

2- иммунотоксин с одной субъединицей.

3- антитела ВЗР7.

Справа указана молекулярная масса белков.

93% (Roberts L. et al., 1985). Аминокислотные замены в структуре АгРТА, по-видимому, не затрагивают активный центр этой N-гликозидазы (Robertus J.. 1988; Bradley. 1990).

По всей вероятности, значительное различие в цитотоксич-ности между рицином и агглютинином рицина связано с эффективностью трансмембранного переноса А-субъединиц этих токсинов.

Действие Р60, РТА, АгРбО и АгРТА на клетки линии МеТСо

Ю"11 кг10 Ю-9 10® 107 Концентрация Белков (М)

Р60

РТА -ж- АгРбО -А- АгРТА

Рисунок 4. Цитотоксическое действие рицина (Р60), агглютинина рицина (АгРбО), и их изолированных субъединиц (РТА и АгРТА соответственно) на клетки меланомы линии МеИо. Клетки наносили в лунки 96-луночных планшет, культивировали сутки, затем добавляли ци-тотоксические агенты в разных разведениях. Инкубировали 1 час при 4°С. Дважды отмывали ИРМ1, добавляли среду культивирования. Через 48 часов определяли жизнеспособность клеток в МТТ-тесте. Представлен результат одного из трёх типичных экспериментов.

Молекула агглютинина рицина представляет собой тетрамерную структуру, в которой дилеры А-В связаны между собой не только за счет гидрофобного взаимодействия, но и дисульфидным мостиком между остатками цистеина ( С1э81 или С1б156) А-субъединицы,

которые отсутствуют в РТА (Roberts L. et al.t 1985). Возможно, что при такой структуре каталитические субъединицы агглютинина менее эффективно. чем А-цепь рицина транслоцируются в цитоплазму клетки. Кроме того, 18 аминокислотных замен в А-цепи агглютинина могут влиять на ее гидрофобные характеристики, незначительные изменения которых может привести к снижению эффективности транслокации А-цепи и интоксикации рибосом.

Интересно отметить, что в наших экспериментах, проведенных на клетках линии MeWo, цитотоксическая активность димера агглютинина рицина не отличалась от активности целой молекулы (табл. 1) Этот факт может служить подтверждением предположения, что пониженная цитотоксическая активность молекулы агглютинина рицина обусловлена гидрофобными характеристиками каталитической субъединицы данного токсина.

Цитотоксическое действие конъюгатов B3F7/PTA и B3F7/ArPTA на контрольные антигеннегативные клетки линии АКЛ и А9 не отличалось от действия изолированных А-субъединиц.

В культуре клеток-мишеней MeWo полученные коньюгаты проявляли устойчивую цитотоксическую активность. На рисунке 5 представлено действие конъюгата А-цепи рицина с моноклональными антителами B3F7 в сравнении с действием изолированной А-субъ-единицы рицина. Активность конъюгата приблизительно на 2 порядка выше активности изолированной цепи. ЛД50 для данного иммуно-токсина составляла 2x10"9 М. Третья кривая отражает действие мо-ноклональных антител B3F7 на клетки MeWo. Видно, что данные антитела не оказывают влияния на рост клеток.

Рисунок 5. Цитотоксическое действие А-цепи рицина (РТА) и иммуно-токсина РТА/ВЗР7 на клетки меланомы линии M^Wo. Клетки наносили в лунки 96-луночных планшет культивировали сутки, затем добавляли цитотоксические агенты или антитела ВЗР7 в разных разведениях. Инкубировали 1 час при 4°С. Дважды отмывали НРМ1, добавляли среду культивирования. Через 48 часов определяли жизнеспособность клеток в МТТ-тесте.

Представлен результат одного из трёх типичных экспериментов.

На рисунке 6 представлено действие конъюгата моноклональных антител ВЗР7 с А-субъединицей агглютинина рицина в сравнении с действием изолированной субъединицы. Видно, что конъюгат обладает более высокой цитотоксичностью. ЛД50 для данного конъюгата составляет 10"8М.

Действие конъюгата АгРТА/ВЗГ7 и АгРТА на клетки линии МеТСо

-«но а юо

н

8 ео м

н во

о

К 70

8 ео н

8 50 м

л «

н

8 30 2 % 20 й

§ 10

Рисунок 6. Цитотоксическое действие А-цепи агглютинина рици на (АгРТА) и иммунотоксина АгРТА/ВЗР7 на клетки меланомы лини Ме\Уо. Клетки наносили в лунки 96-луночных планшет культивировал сутки, затем добавляли цитотоксические агенты в разных разведени ях. Инкубировали 1 час при 4°С. Дважды отмывали НРМХ, добавлял! среду культивирования. Через 48 часов определяли жизнеспособност! клеток в МТТ-тесте (См. "Материалы и методы"). Представлен результат одного из трёх типичных экспериментов.

10-12

1 1СГ10 10® 10* ю-' Концентрация велков (М)

АгРТА/ВЗР7

АгРТА

Таким образом, из полученных конъюгатов, иммунотоксин на основе А-цепи рицина обладает специфичностью действия и сравнительно высокой цитотоксической активностью. Несмотря на то, что цитотоксические свойства изолированных субъединиц не отличались, иммунотоксин на основе А-субъединицы агглютинина рицина обладал меньшей активностью (см. табл.1).

B3F7

PTA/B3F7 /комплемент /'.Га5+комплемент

+комплемент

^7pT/k/B3F7+KoumieMeirr

Рисунок 7. Способность моноклональных антител B3F7 и иммунотокси-на PTA/B3F7 активировать систему комплемента. Клетки инкубировали 30 минут при 37°С, в 50 мкл. раствора, содержащего 150 мкг/мл им-мунотоксина PTA/B3F7 или моноклональных антител B3F7 в ФСБ. После отмывки клетки ресуспендировали в 100 мкл. 2% раствора кроличьей сыворотки в ФСБ. Инкубировали 30 мин. при 37оС. Выживаемость клеток определяли по исключению трипанового синего.

Цитотоксическая активность иммунотоксинов может понижаться из-за их ферментативной деградации в лизосомах, а так же в следствии рециклинга. Поэтому, усиление цитотоксической активности иммунотоксинов in vitro возможно при использовании таких

Табл.5 Концентрации различных цитотоксических агентов, вызывающая in vitro гибель 50% клеток линии MeWo.

ЛД50

Р60 1 10"11 АгРбО 10"9

1/2АгР60 9*10

РТА 1 10'7 АгРТА 2*10

PTA/B3F7 1 2» 10"9 ArPTA/B3F7 10"8

PTA/B3F7 1 3*Ю"10 ArPTA/B3F7 4*10

+Ш4С1 1 +NH4C1

PTA/B3F7 1 2*10"10 ArPTA/B3F7 3*10"

+моненсин 1 +моненсин

ЛД50

■у 10

-г 7 -10 ■ 10

лизосомотропных агентов, как моненсин, снижающий рециклинг (Olsnes et al., 1989) и хлорид аммония, увеличивающий рН в ли-зосомах и уменьшающий деградацию иммунотоксинов (Preijers et al., 1988). В наших экспериментах эффективность действия иммунотоксинов усиливалась при использовании как хлорида гшония, так и моненсина. Важно отметить, что в присутствии данных лиго-сомотоопных агентов эффективность действия конъюгатов не отличалась (см. табл 1).

Эффекторную активность антител и иммунотоксинов на основе МА против ОАА можно увеличить применяя цитокины. Было показано, что цитокины могут усиливать экспрессию ОАА. В этой связи интересно отметить, что экспрессия антигена B3F7 возрастает при обработке клеток меланомы интерфероном V.

Кроме того, ряд цитокинов, например фактор некроза опухолей (ФНО), способны индуцировать воспалительные реакции, приводящие к геморрагическому некрозу опухолевой ткани (Minazian et al., 1994). Центральную роль в этом процессе играет анафилоксин С5а, образующийся в результате активации комплемента. Поэтому иммунотоксины на основе моноклональных антител, специфически реагирующие с ОАА и способные активировать систему комплемента могут не только вызывать комплементзависимый лизис клеток-мишеней, но и усиливать воспалительную реакцию, индуцированную ФНО (Mujo et al.. 1991).

Иммунотоксины PTA/B3F7 и ArPTA/B3F7 синтезированы на основе антител класса IgGl. Антитела данного изотипа способны активировать систему комплемента. Нами было показано, что эта активность сохранялась после конъюгации антител с каталитическими субъединицами цитотоксинов (рис. 7). Таким образом, полученные иммунотоксины могут воздействовать на клетку-мишень, как за счет цитотоксической активности каталитической субъединицы токсина, так и за счет активации комплемент-зависимых эффекторных механизмов иммунной системы что делает перспективными исследования их действия in vivo.

Выводы:

1. Получены моноклональные антитела (ВЗР7) изотипа 1^1, избирательно реагирующие с мембранным антигеном клеток меланомы человека.

2. Молекулярная масса антигена, выявляемого монокпональны-ми антителами ВЗР7 35 кДа. Антигенная детерминанта термостабильна, устойчива к действию различных фиксаторов.

3. Выделены и очищены растительные цитотоксины рицин, агглютинин рицина и их каталитические субъединицы. Разработана модельная система для изучения механизма действия нативных токсинов и их производных.

• 4. Показано, что токсичность нативного агглютинина рицина более чем в 100 раз ниже, чем у рицина. Однако, неспецифическое цитотоксическое действие каталитических субъединиц двух токсинов не отличается.

5. Получены конъюгаты А-цепи рицина и агглютинина рицина с моноклональными антителами ВЗР7. Оба конъюгата оказывали избирательное цитотоксическое действие на клетки меланомы линии МеУ/о.

6. Избирательное действие иммунотоксина на основе А-цепи рицина в 10 раз выше, чем у конъюгата с А-цепью агглютинина рицина.

7. Моноклональные антитела ВЗР7 после конъюгации с каталитическими субъединицами токсинов сохраняют способность активировать систему комплемента.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.Г.Егорова, М.Новакова, M.М.Мойсенович, И.Л.Могилевс-кий. / Характеристика моноклональных антител к меланоме кожи человека. Вестник Московского университета. Серия биология. N1 1995 стр. 66-68.

2. А.Г.Тоневицкий, Д.Е.Темяков, M.М.Мойсенович, А.Т.Шамшиев, И.И.Агапов, Ю.О.Алексеев, С.Г.Егорова, И.Г.Харитонен-ков. / Цитотоксическая активность иммунотоксинов на основе каталитических субъединиц рицина и агглютинина рицина и моноклональных антител к 35-kDa антигену меланомы человека./ Биотехнология N11, 1995 стр. 31-34.

3. С.Г.Егорова, М.М.Мойсенович, Н.В.Малюченко, И.Г.Харито-ненков./ Моноклональные антитела B3F7 против меланомы кожи человека. / Хирургические проблемы и экология. Материалы 3-го меж-дунородного симпозиума. Черновцы, 1995 стр. 72.

4. S.G.Egorova, M.M.Moisenovich, M.A.Myagkov, I.l.Mogi-levskii. D.E.Temyakov./ Prepearing monoclonal antibodies for using in immunotherapy of human melanoma./ p.148.

5. S.G.Egorova, A.F.Kirkin, M.M.Moisenovich, A.V.Miagkov, I. l.Mogilevskii, D.E.Temyakov, A.G.Tonevitskii./ Antimelanoma activity of monoclonal antibodies conjugated with ricin A-cha-in./p71.