Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы

На правах рукописи

Попова Екатерина Николаевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИЦИНА С КЛЕТКАМИ ГИБРИДОМ, СЕКРЕТИРУЮЩИХ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКОЙ

СУБЪЕДИНИЦЫ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в ФГУП "ГосНИИ генетика" и в Московском Государственном Университете (МГУ) им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

Доктор биологических наук Агапов И.И.

Кандидат биологических наук Мойсенович М.М.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ярилин А.А.

Доктор биологических наук Данилова Т.А.

Ведущая организация:

ГУ НИИ вирусных препаратов им. О. Г. Анджапаридзе РАМН

февраля 2004 г. в 11ас. на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 ГУ Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18)

Защита состоится

«7^»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « января 2004 г,

я

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Актуальность темы. Рицин (R60) - токсичный лектин из семян клещевины - состоит из двух субъединиц: каталитической (А субъединица или RTA) и лектиновой (В субъединица или RTB). N-гликозидазная активность RTA по отношению к 28S рРНК эукариот влечет за собой необратимую остановку синтеза белка и гибель клетки. RTB, связывающаяся с галактозилированными рецепторами на поверхности клетки-мишени, обеспечивает эффективный эндоцитоз токсина во внутриклеточные компартменты [Rutenrer Е. et al., 1991].

Токсичность, строение, лектиновая природа - все это делает рицин и родственные ему растительные и бактериальные токсины удобными объектами для изучения механизмов эндоцитоза, везикулярного транспорта, сортинга, а также трансмембранного переноса белков. В связи с этим особенно важно получение тест-систем, в том числе иммуноферментных, селективно выявляющих рицин и его субъединицы.

Предполагается, что в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) происходит диссоциация субъедениц рицина и транслокация RTA в цитоплазму к ее рибосомальному субстрату [Sandvig К., van Deurs В., 2000]. Однако выявить свободные субъединицы рицина в клетке-мишени пока не удавалось. Кроме того, в ЭР попадает настолько малое количество рицина, что он не выявляется там методами электронной микроскопии [Sandvig К. and van Deurs В., 1996]. Удалось лишь показать, что при обработке клеток рекомбинантным рицином с дополнительными сайтами сульфатирования в

35с /-л 2-

присутствии SO4 , незначительная часть токсина включает радиоактивную

метку, и, следовательно, попадает в ЭР [Rapak A. et al., 1997]. Поэтому

вопрос о месте и механизме транслокации рицина в цитоплазму до сих пор

остается открытым. В свете этого, особый интерес представляют клетки

гибридом, продуцирующие антитела против RTA и устойчивые к

интоксикации рицином. Предполагается, что в этих гибридомах токсин,

связанный антителами в секреторных компартменох, не может- — • •

*J »"ОС, НАЦИОНАЛЬНАЯ i { БИБЛИОТЕКА {

транслоцироваться в цитоплазму для осуществления цитотоксичности [Уои1е Ю. й а1., 1987]. Поэтому подобные гибридомы оказываются удобными моделями для исследования механизмов транслокации ЯТЛ в цитоплазму.

Особый интерес к Я60 вызван возможностью создавать на его основе цитостатики для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также противовирусные вакцины нового поколения. Глубокое понимание особенностей взаимодействия рицина с клеткой-мишенью позволит повысить качество фармакологических препаратов на его основе, а, возможно, и расширить область его практического применения.

Цель работы: изучение особенностей взаимодействия рицина с клетками млекопитающих с использованием модельных систем на основе гибридом и тест-систем, выявляющих минимальное количество рицина и его субъединиц.

Задачи исследования:

1. Получить гибридомы против нативного рицина, нативного агглютинина рицина (Я120) и против нативной и ненативной каталитической субъединицы рицина. Оценить устойчивость полученных гибридомных клеток к интоксикации рицином.

2. Охарактеризовать полученные моноклональные антитела (мАт). На их основе создать тест-системы, позволяющие определять ЯТЛ, Я60 и Я120 в присутствии друг друга.

3. Используя полученные тест-системы оценить интенсивность процесса интернализации рицина, а также определить наличие свободной ЯТЛ в супернатантах и лизатах клеток полученных гибридом. Изучить внутриклеточное распределение секретируемых иммуноглобулинов (]^) и рицина.

Научная новизна работы:

• Получены уникальные гибридомы, секретирующие мАт против RTA, но не R60 и устойчивые к интоксикации рицином. На их основе предложена модельная система для изучения особенностей транспорта рицина, в которой абсолютно исключено взаимодействие антител с токсином вне клетки.

• На основе полученных в работе мАт, созданы уникальные тест-системы для определения: RTA, не чувствительные к R60, и тест-системы, позволяющие выявлять R60 и R120 в присутствии друг друга.

• Впервые выявлена свободная RTA в клетках и супернатантах клеток, предобработанных R60.

• Показано, что в гибридомах, секретирующих мАт против RTA, с иммуноглобулинами (Ig) колокализуется не более 2-5% внутриклеточного пула рицина. Однако, именно попадание токсина в места колокализации с Ig принципиально важно для интоксикации клетки-мишени.

Практическая значимость:

• Полученные в работе иммуноферментные тест-системы могут быть использованы в лабораторной практике для решения ряда научных проблем, а также для выявления токсичных компонентов в касторовом масле, косметике и кормах для домашних животных.

• Полученные в работе иммуносорбенты позволили значительно повысить степень очистки препаратов R120, RTA и RTB от взаимного загрязнения.

• Фундаментальные исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой, и особенно механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов, избавиться от побочных эффектов, возникающих при их применении, а также значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международной конференции "2nd Colloquium on Mitochondria

and Myopathies in Halle/Saale"(Germany, 2000), на Advanced FEBS Course "Mitochondria in the Cell Life and Death" (Russia, Moscow, 2001), на Advanced FEBS Course "Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and г Clinical Aspects" (Turkey,- Antalya, 2001), на межлабораторных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), на.межлабораторных семинарах кафедры физиологии микроорганизмов Биологического факультета МГУ, на межлабораторных семинарах в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании секции молекулярной биологии:ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 26 ноября 2003г. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация ч состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация; изложена на 160 страницах, иллюстрирована 35 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 145 источников.

Материалы и методы

Выделение токсинов и их субъединиц. R60 и R120 выделяли из семян клещевины (Ricinus communis), разделяли: на субъединицы и очищали в соответствии; с описанной методикой [Tonevitsky A.G. et al, 1990]. Дополнительно; RTA очищали методом аффинной хроматографии на 2RBKl-ceфapoзe 4В, RTB и R120 - на Rchl-ceфapoзe-4B (2RBK1 - мышиные моноклональные: анти-RTB? антитела (см. ниже), Rchl - мышиные моноклональные анти-RTA антитела [Tonevitsky A. et al, 2002]). Вискумин (МЫ) выделяли из листьев омелы белой: (Viscum album) no модифицированной методике [Pfuller R. et al., 1994].

Получение гибридом и антител. Мышей линии Balb/c (НИИ биомоделей РАМН, Россия); иммунизировали R60, RTA и R120 в соответствии со

схемами в табл.1. Слияние спленоцитов с миеломой линии sp2/0 проводили на третий день после бустерной иммунизации. Миелому выращивали на среде RPMI1640 (Sigma, USA), первичные гибридомы - на среде HAT

(Sigma, USA). В случае иммунизации животных нативной RTA для отбора устойчивых к рицину гибридом в среду HAT добавляли 10"12 и 10-11 М R60. Таблица. 1 Схемы иммунизации.

Иммунизация нативными антигенами, схемы 1-3. Иммунизация: ненативной RTA, схема 4.

1 2 3 4

I RTA 5мкг RTA 5мкг - R120J 1мкг вПАФ RTA 5мкг в ПАФ

II через: 14 дней RTA 5мкг НАФ R60 1мкгНАФ R120 1 мкг ФСБ НАФ или ФСБ: RTA 5мкг в НАФ

III через 7 дней RTA 5мкг, R60 1мкг R120 1мкг в ФСБ RTA 5мкг

IV через 7 дней RTA 5мкг R60 1мкг- R120 1мкг RTA 5мкг

V через 7 дней RTA 2мкг R60 1мкг R120 1мкг RTA2mkt

VI через 7 дней R60 1мкг R120 1мкг

Антитела накапливали в асцитной жидкости и выделяли методом аффинной хроматографии, на протеин А-сефарозе (Pharmacia, Sweden). Сыворотки мышей, супернатанты гибридом и мАт анализировали, при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) Системы ТИФА.

1. На иммунологическую плату сорбировали антигены (RTA, R60 или R120). Инкубировали с бычьим сывороточным альбумином (БСА), затем с мАт против токсинов или их субъединиц; потом с комплексом кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (IMTEK, Россия).

2. На плату иммобилизовали антитела против токсинов или их субъединиц непосредственно (в случае мАт) или через кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (IMTEK, Россия) (в случае сывороток и супернатантов). После забивки платы БСА и инкубации с сыворотками или супернатантами гибридом (в случае работы с чистыми мАт этот шаг отсутствовал) последовательно проводили реакции с биотинилированными антигенами (1мкг/мл; RTA, R60 или R120) и с комплексом стрептавидин-пероксидаза (IMTEK, Россия).

3. На иммунологическую плату сорбировали первые мАт. После инкубации с БСА последовательно проводили реакции с антигенами (R60, RTA или R120), вторыми биотинилированными мАт (1мкг/мл) и коньюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена.

Белки сорбировали по 1мкг в лунку 96 луночной платы (Costar, USA) в фосфатном буфере (ФСБ) следующего состава: 8мМ Na2HPO4, 1мМ КаН2РО4, 0,35М NaCl, pH 7,4. Реакции проводились в стандартных условиях. Калориметрические измерения проводили при 492 нм.

Оценка устойчивости клеток к интоксикации рицином и вискумииом. Устойчивость клеток к интоксикации рицином или вискумином оценивали по количеству восстановившегося до формазана 3-(4,5,-диметилтиозолил-2-ил)-2,5-дифенилтетрозолия бромида (МТТ) (Sigma, США) в соответствии с методикой [Agapov et al., 1999],

Выявление RTA и R60 в супернатантах и лизатах клеток, предобработанных R60. Клетки, предобработанные R60 (20мин, 37°С), отмывали от токсина (37°С) и инкубировали (37°С, 6% СО2). Супернатанты при необходимости концентрировали. Клетки, отмытые ФСБ лизировали в буфере следующего состава: 0,1М NaCl, 10мМ Na2HPO4, 1% Triton X-100 и 1мМ PMSF, рН 7,4, и центрифугировали 10мин при 5000rpm [Iversen et al., 2001].

Концентрацию R6G и RTA определяли при помощи полученных в работе тест-систем 1RK2/2RK1 и 1RAK1/2RK1.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ).

Протоколы обработки клеток различными лигандами описаны в подписях к рисункам в главе «Результаты». Перед получением изображений клетки фиксировали 4%-параформальдегидом и заключали в Мовиол.

Цифровые изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Confocal Laser Scanning Microscope -CLSM (LEICA TCS 4D, Leica Bensheim, Германия)), оборудованного аргон-криптоновым лазером.

Выявление признаков апоптоза. Морфологические изменения ядер клеток наблюдали, выявляя дезокси-ДНК PicoGreen (PicoGreen dsDNA quantitation reagent, Molecular probes). Изображения клеток были получены с помощью КЛСМ. Протоколы получения препаратов описаны в подписях к рисункам в главе «Результаты». Олигонуклеосомную фрагментацию ДНК выявляли после проведения электрофореза геномной ДНК в 2% агарозном геле согласно методике [NobukazuKotomatsu et. al, 1998].

Результаты и обсуждение

Предполагается, что в ходе транспорта рицина во внутриклеточных компартментах происходит диссоциация субъединиц рицина [Sandvig К., van Deurs В., 2GGG]. Отделение RTA может сопровождаться ее конформационными перестройками, связанными с экспонированием в водную фазу гидрофобных участков, экранированных в голотоксине RTB. Предполагается, что эти перестройки принципиально важны как для транслокации RTA в цитоплазму, так и для осуществления ею ферментативного катализа [Montfort W. et al, 1987 Barbieri L., 1993, Simpson J.C. et al., 1995; Argent R.H. et al, 2GGG]. Таким образом, функционально

важные участки поверхности каталитической субъединицы рицина могут быть экспонированы как в нативном голотоксине, так и возникать вследствие конформационных перестроек. Учитывая это, при получении гибридом животных иммунизировали не только голотоксином, но и его изолированной каталитической субъединицей, нативной и ненативной. Кроме того, животных иммунизировали агглютинином рицина - токсином из семян клещевины, А субъединицы которого отличаются от А субъединиц рицина единичными аминокислотными остатками.

В результате всех иммунизации был получен 21 клон гибридом, секретирующих мАт против субъединиц лектинов из семян клещевины (табл.2). Из них 4 были получены в результате иммунизации животных R120 и секретировали мАт, направленные против этого токсина (группа ARK). Остальные 17 секретировали мАт, направленные против субъединиц R60, из них 1 узнавали RTB в составе R60 (2RBK1), 10 - RTA в составе R60 (группы RK и RdK) и 6 мАт - только RTA, но не голотоксин (группа RAK).

Таблица 2 Гибридомы, полученные в работе.

Группа гибридом Количество клонов Направленность антител

ARK 4 R120

RBK 1 RTB и R60

RK + RdK 6+4 RTA и R60

RAK 6 RTA, но не R60

Модельная система на основе гибридом группы RAK.

Гибридомы, обозначенные нами RAK (lRAK(l-6)) были получены в результате иммунизации животных нативной RTA и секретировали мАт связывающие RTA, но не R60 (табл. 2, рис.1). Возможно, в голотоксине В-субъединица создает стерические препятствия для взаимодействия антител группы RAK со своими эпитопами. Это предположение согласуется с тем,

что область контакта субъединиц рицина довольно велика (1600 A2) [Katzin BJ.etal., 1991]. Возможно также, что эпитопы, к которым направлены мАт группы RAK, формируются в результате частичного разворачивания полипептидной цепи RTA, возникающего, по мнению ряда исследователей [Simpson J.C. et al., 1995], в зоне контакта с RTB после диссоциации субъединиц рицина. В любом из этих случаев, эпитопы, к которым направлены мАт группы RAK, должны быть полностью или частично расположены в зоне контакта субъединиц.

Рисунок 1. Взаимодействие мАт группы RAK с RTA (А) и R60 (Б). ОП 492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

мАт (нг/мл)

1RAK-2 IRAK-4 1RAK-6

Результаты сендвич-ТИФА (табл. 3) позволили заключить, что 3 мАт группы ЯЛК направлены против одного эпитопа и 3 - против другого, и эти два эпитопа не перекрываются (табл. 4).

Все гибридомы группы - ЯЛК были отобраны на селективной среде, содержащей 10-11М К60 как устойчивые к интоксикации (материалы и методы). Это позволяло использовать их клетки в качестве моделей для

изучения внутриклеточного транспорта рицина. Несомненным преимуществом модельных систем на основе гибридом группы-RAK перед описанными в литературе было то, что в них абсолютно исключено взаимодействие антител с токсином вне клетки. Благодаря этому отпадала необходимость проведения неэффективных, трудоемких и сопряженных с введением в систему дополнительных факторов процедур для удаления Ig из супернатантов и с поверхности клеток- гибридом - [Youle FIX et al., 1987; Kornfeld S.B. et al., 1991; Tonevitsky A.G. et al., 1995; Малюченко Н.В. и др., 1999];

Таблица 3. Результаты сендвич-ТИФА.

Пары мАт, не выявляющие RTA в сендвич-ТИФА (при 100 нг RTA ОЩ»<0,2) Пары мАт, выявляющие RTA в сендвич-ТИФА (при 100 нг RTA on^äi)

1RAK1/1RAK5 1RAK1/1RAK2

1RAK1/1RAK6 1RAK1/1RAK3

1RAK2/1RAK3 1RAK1/1RAK4

1RAK2/1RAK4 1RAK2/1RAK5"

1RAK3/1RAK2 1RAK2/1RAK6

1RAK3/1RAK4 1RAK3/1RAK5

1RAK5/1RAK6 1RAK3/1RAK6

1RAK4/1RAK5

1RAK4/1RAK6

Таблица 4. Эпитопная направленность мАт группы RAK.

антитела >

Эпитоп 1 i Эпитоп2 IRAKI, 1RAK5,1RAK6 1RAK2, 1RAK3, 1RAK4

Для создания модели была выбрана гибридома 1&ЛК3. Устойчивость клеток гибридомы 1&ЛК3 к цитотоксическому действию рицина по сравнению с вискумином оценивалась с помощью МТТ-теста

(рис.2). В качестве контроля оценивали устойчивость к интоксикации рицином и вискумином клеток гибридомы ТА5, секретирующей мАт против каталитической субъединицы вискумина [Tonevitsky A.G. et al, 1995]. Полулетальная доза R60 для клеток 1RAK3 составляла 2* 10-10М, что на 2 порядка выше, чем для неустойчивых к интоксикации рицином клеток ТА5 (рис.2). Клетки 1RAK3 не проявляли неспецифической устойчивости к интоксикации вискумином. В наших экспериментальных условиях полулетальная доза вискумина для них составляла 2* 10-14, что на 4 порядка ниже,* чем для устойчивых к интоксикации висумином клеток ТА5 (рис.2). Полученные результаты подтверждают ранее опубликованные данные о том, что устойчивость клеток гибридом к токсину обусловлена секрецией мАт против этого токсина [Youle R.J. et al., 1987]. Связывание RTA антителами, вероятно, блокирует транслокацию каталитической субъединицы в цитоплазму и, следовательно, интоксикацию клеток гибридомы.

Рисунок 2. Цитотоксическое действие рицина (А) и вискумина (Б) на клетки гибридом 1&ЛК3 и ТА-5. % живых клеток определяли по количеству восстановившегося МТТ.

Тест-системы для определения R60, R120 и RTA.

На основе полученных мАт были созданы тест-системы для выявления токсинов из семян клещевины. Тест-система на основе пары 1RK2 и 2RK1 позволяла выявлять менее 0,3нг рицина (рис.4.А). Тест-система на основе пары ЛЯЮ и ЛЯЮ позволяла выявлять менее Знг агглютинина рицина (рис. 4.Б). Обе тест-системы дискриминировали токсины друг от друга.

Рисунок 4. Тест системы на основе пар мАт 1RK2/2RK1 (А) и ARK1/ARK3 (Б) для выявления R60 (А) и R120 (Б). ОП492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

Различия каталитических субъединиц R60 и R120 по 17 аминокислотным остаткам не приводят к существенным изменениям их структуры [Rutenrer E, et al.,1991, Sweeney Е.С. et al. ,1997], а также каталитической активности [Barbieri L. et al., 1993]. При этом R120, в отличие от R60 практически не токсичен. Возможно, различия в топографии поверхности каталитических субъединиц R60 и R120, выявляемые мышиными антителами, влияют на эффективность доставки токсинов в цитоплазму, и, как следствие, на оказываемый ими цитотоксический эффект.

На основе пар мАт 1RAK1/2RK1, и 1RAK4/1RAK6 были получены уникальные тест-системы, позволяющие выявлять менее 0,3 нг каталитической субъединицы рицина в присутствии голотоксина (рис. 5). Тест-системы, отличающие RTA от R60, были получены впервые в данной работе. Тест система IRAKI/2RK1, позволяла определять не только свободную RTA, но и в комплексе с мАт 1RAK3. Это давало возможность использовать ее для выявления RTA в клетках гибридомы 1RAK3, выбранной в качестве модели.

Рисунок 5. Тест-системы на основе мАт 1RAK1/2RK1 (1, 3 и 4) и 1RAK4/1RAK6 (2 и 5) для выявления RTA (1, 2) и комплекса RTA с мАт 1RAK3 (3), 4 и 5 -реакция с R60. ОП492 -оптическая" плотность при- длине волны 492нм.

Выявление свободной RTA в супернатантах и лизатах клеток 1RAK3 и sp2/0, предобработанных R60.

Диссоциация субъединиц рицина и транслокация RTA в цитозоль до сих пор остается наименее изученным этапом транспорта рицина. Ни место, ни механизм диссоциации субъединиц не определены. Более того, до сих пор не удавалось детектировать свободную RTA в клетке-мишени.

Тест-система 1RAK1/2RK1 позволила впервые выявить свободную RTA в супернатантах клеток гибридомы 1RAK3, предобработанных как

ОГО92

концентрация токсинов (нг/мл)

летальными (1000 и 100нг/мл), так и сублетальными (50 и Юнг/мл) дозами рицина через 20 часов инкубации после отмывки от токсинов (рис. 6). Таким образом, было однозначно показано, что происходит диссоциация субъединиц токсина в клетках 1&АК3, предобработанных рицином. Присутствие ЯТЛ в супернатантах клеток, предобработанных сублетальными дозами рицина указывает, на то, что каталитическая субъединица выбрасывается из живых клеток гибридомы. Следовательно, диссоциация субъединиц происходит во внутриклеточных компартментах до транслокации в цитозоль. Об этом же свидетельствует устойчивость данной

Рисунок 6. Выявление ЯТЛ в супернатантах клеток гибридомы 1&ЛК3, предобработанных рицином в концентрациях 1мкг/мл (1), 100нг/мл (2), 50нг/мл (3), 10 нг/мл (4) на 1 млн. клеток через 20 часов инкубации в отсутствии токсина. 5 -контрольные клетки. ОП492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

ЯТЛ была детектирована в лизатах клеток гибридомы 1&ЛК3 и плазмацитомы :?р2/0, используемой в настоящей работе при получении гибридом в качестве партнера для слияния со спленоцитами («Материалы и методы»). Клетки были кратковременно обработаны рицином в концентрации 100нг/мл и затем проинкубированы в течение 5 часов в отсутствии токсина.

гибридомы к интоксикации рицином.

С помощью той же тест-системы

Предварительно было показано, что супернатанты и лизаты клеток обеих линий в данных условиях обработки токсином содержат одинаковое количество рицина (рис 7). Оценки были сделаны при помощи тест-системы 1RK2/2RK1. Согласно нашим данным, с клетками обеих линий связывалось более 80 % рицина, в течение 5 часов инкубации в культуральную среду возвращалась лишь незначительная часть (3-5%) рицина. В клеточных лизатах детектировалось лишь 12-15% токсина, что согласуется с литературными данными о том, что рицин транспортируется в клетке-мишени в мембрано-связанной форме [Бушуева Т.Л. и соавт., 1992; Ramalingam T.S. et al., 1994; Sandvig К. et al., 1996; Simpson J.C. et al., 1996]

Рисунок 7. Выявление R60 в супернатантах (1 и 2) и лизатах (3) клеток гибридомы 1RAK3 и плазмацитомы sp2/0,

предобработанных рицином (100 нг/мл на. 1млн. клеток), через 20 минут инкубации с R60

содержится в

ляитах после 5 (1) после 5 часов инкубации в часов»

инкубации отсутствии токсина (2 и 3) при

помощи 1RK2/2RK1.

представлены;

тест-системы Результаты в % от

добавленного к клеткам R60.

В супернатантах клеток обеих линий после 20 минут инкубации с рицином RTA не детектировалась. Через 5 часов инкубации после отмывки от токсина RTA выявлялась в супернатанте клеток 1RAK3, но не sp2/0, a также в лизатах клеток обеих линий. Однако ее количество в лизатах клеток 1RAK3 было примерно вдвое больше, чем в лизатах клеток sp2/0 (рис. 8).

Таким образом, количество свободной RTA в клетках 1RAK3, где транслокация RTA блокируется за счет связывания мАт, значительно превышало ее количеством в чувствительных к интоксикации с рицином клетках плазмацитомы sp2/0. Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной важности диссоциации субъединиц рицина для интоксикации клетки-мишени..

Рисунок 8. Выявление RTA в супернатантах (1 и 2) и лизатах (3) клеток гибридомы 1RAK3 и плазмацитомы sp2/0, предобработанных рицином, через 20 мин. инкубации с R60 (1) и после 5 часов инкубации в отсутствии токсина (2 и 3) при помощи тест-системы 1RAK1/2RK1. ОП 492 -оптическая плотность при длине волны 492нм.

Распределение иммуноглобулинов и рицина в клетках гибридомы 1RAK3.

Устойчивость гибридомы 1RAK3 к интоксикации рицином свидетельствует о том, что транспорт токсина в компартмент, где происходит его связывание мАт, принципиально важен для осуществления цитотоксичности. Распределение иммуноглобулинов и рицина в клетках гибридомы 1RAK3 оценивали при помощи КЛСМ.

Рисунок 9. Изображения клеток гибридомы 1RAK3, полученные с помощью КЛСМ. Клетки, фиксированные 4% параформальдегидом и пермиобилизованные метанолом (-2G°C) обрабатывали З0мин при 2G°C с РНК-азой A (Sigma, USA) в концентрации Юмкг/мл (для В и Г обработка РНК-азой А отсутствовала), затем одновременно инкубировали с PicoGreen (Molecular probes) и антимышиными Ig-TРИTЦ (Sigma, USA) (А и Б) или ConA-Alexa488 (Molecular probes) и антимышиными ^^Р^Щ (В и Г) ^мин при 2G°C). Изображения получены в результате детекции флуоресцентного сигнала от (A) PicoGreen (ядра), (В) А1еха488 (ЭР и АГ) и (Б и Г) TРИTЦ (Ig). В левом верхнем углу каждого изображения горизонтальный срез, справа и снизу - смоделированные вертикальные срезы, линии сечения указаны. Маркеры для А и Б - 8 микрон для В и Г -Ю микрон.

Для выявления Ig использовали антимышиные антитела, меченные флуорохромами ТРИТЦ (рис. 9) или ФИТЦ (рис.10). В клетках также определяли расположение и морфологию ядра с помощью PicoGreen (рис. 9А, рис. 10А и В), а также идентифицирвали ЭР и АГ с помощью СопА, меченного ФИТЦ (рис. 9 В). Ядра в клетках гибридомы 1RAK3 были крупные, неправильной формы и располагались асимметрично. Вне ядра большую часть пространства клетки занимали Ig. Наблюдалась практически полная колокачизация Ig с СопА (рис. 9В и Г), что свидетельствовало об их локализации в ЭР и АГ. Ig, не колокализовавшиеся с СопА, могли быть расположены в области АГ, где СопА отсутствовал или в везикулах, отпочковывающихся от транс-Гольджи и направляющихся к плазматической мембране. Таким образом, полученные результаты соответствовали современным представлениям о пространственной организации синтеза и секреции Ig в плазматических клетках.

Рисунок 10. Изображения клеток гибридомы 1RAK3, полученные с помощью КЛСМГ Клетки инкубировали с конъюгатом рицин-А1еха568 [Moisenovich et al, 2002] (1мкг/мл) в течение 15мин (А и Б), 8часов (В и Г) и ЗОмин (Д и Е), отмывали от не связавшегося токсина 0,1М a-D-лактозой (Sigma, USA) (только для Д и Е), фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma, USA), пермиобилизовали метанолом (-20°С), обрабатывали ЗОмин при 20°С с РНК-азой A (Sigma, USA) в концентрации еЮмкг/мл (для Д и Е обработка РНК-азой А отсутствовала), затем; PicoGreen (Molecular probes) (А-Г) или-антимышиными Ig-ФИТЦ (Sigma, USA) СД«и Е). Изображения получены в результате детекции флуоресцентного сигнала от (А и В) PicoGreen (ядра), (Д) ФИТЦ (Ig) и (Б, Г и Е)*А1еха568 (рицин). В левом верхнем углу каждого изображения горизонтальный срез, справа и снизу -смоделированные вертикальные срезы, линии сечения указаны. Маркеры: А и Б - 8 микрон, В - Е- 7 микрон.

-Л С""

. . ,. „«--AiIT ». -v.J.«« j«** M"

p- / w

- Vf

S-2_

i* г С

» ? ) S '

/Л

* ' 'jf .. ÍJ» * : ö* m ч ■-.■a-- : " • ...... ' - r* - * , Ké ^ : . О ^ - * '' ^ -V.

A — -A ; ' n IJ чЛ îi

i /

ri

Д )

M'.. ; -•- .-.-¿С- *'• t': Г* "-4^.. •С?-:'.* -

..г, if. ..iLT.,» . г

~ ^^д _ k 1 Л Ч^гЫ* л -Vy ,-7t V»»y . ■»• , v. \ i --»■»* y^fy , - '-С 1 , "V „i - -" * w - • *W * \ ... - " •

—7'—г— i V " ? < ^ • . . - If . Д

- i .í ».

if;

*

F.

После 15мин обработки клеток гибридомы 1RAK3 R60 (1мкг/мл) морфология ядер не менялась (рис. 10А), в то время как после длительной обработки в ядрах наблюдались изменения, характерные для терминальной стадии развития апоптоза [Hale et al, 1996]: фрагментация ядер (рис. 10В) и олигонуклеосомная фрагментация ДНК, визуализируемая в виде «лесенки» в агарозном геле после проведения электрофореза геномной ДНК (данные не представлены). Через 15мин после обработки «клеток гибридомы 1RAK3 рицином, меченным флуорохромом Alexa568, токсин обнаруживался, преимущественно, как плотное скопление в центре клетки около ядра, но не в ядре (рис. 10А и Б). Такая локализация рицина в клетке сохранялась и через 8 часов (рис. 10В и Г). Следует отметить, что рицин также; детектировался на поверхности клеток (рис. 10Б и Г), откуда легко удалялся 0,1М раствором a-D-лактозы (рис. 10Е). В клетках гибридомы 1RAK3 рицин практически не колоколизовался с Ig (рис. 10Д и Е). По количественным оценкам колокализация рицина и Ig не превышала 2-5%. Однако, устойчивость клеток гибридомы 1RAK3 к интоксикации рицином свидетельствует о том, что именно транспорт этой незначительной-части токсина в компартменты, где: наблюдалась его колокализация с Ig, принципиально важен для интоксикации клеток.

Выводы

1. Получено и охарактеризовано 17 новых гибридом против субъединиц рицина: 1 - против RTB и 16 - против RTA. Кроме того, получено 4 клона гибридом против агглютинина рицина. Предложена модель для изучения транспорта рицина на основе гибридом, секретирующих мАт против RTA, но не связывающих: R60. B предложенной модельной системе взаимодействие токсина с антителами вне клетки исключено.

2. На основе анти-RTA мАт и aHTH-R120 мАт созданы тест-системы, позволяющие выявлять менее 0,Знг R60 и RTA и менее Знг R120 в

присутствии друг друга. Тест-системы, позволяющие различать Я60, Ш20 и ЮЛ. получены впервые.

3. Впервые выявлена свободная КГЛ в супернатантах и лизатах клетки-мишени. Показано, что диссоциация субъединиц рицина происходит во внутриклеточных компартментах до транслокации в цитоплазму, а также, что диссоциация субъединиц рицина необходима для интоксикации клеток.

4. Установлено, что интоксикация клеток определяется транспортом токсина в компартменты, где в гибридомных клетках присутствуют иммуноглобулины. Показано, что в эти компартменты транспортируется лишь незначительная фракция токсина (не более 2-5%).

Списоксокращений

СопА MLI

Конконавалин А Вискумин - токсин из листьев Viscum album Агглютинин рицина - токсин из семян Ricinus communis

Rl 20 R60 J RTA

Рицин - токсин из семян Ricinus communis

Каталитическая субъединица рицина

Лектиновая субъединица рицина

Аппарат Гольджи

Бычий сывороточный альбумин

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Моноклональные антитела

3-(4,5,-диметилтиозолил-2-ил)-2,5-дифенилтетрозолий бромид

оценка жизнеспособности клеток по количеству МТТ, восстановившегося до формазана Твердофазный иммуноферментный анализ

RTB

АГ

БСА

КЛСМ:

мАт

МТТ

МТТ-тест

ТИФА

ФИТЦ, ТРИТЦ,

А1еха568

Флуорохромы, используемые в КЛСМ

ФСБ ЭР

Фосфатный буфер (8мМ Na2HP04, 1мМ NaH2P04, 0,35М NaCI, рН 7,4)

Эндоплазматический ретикулум

Списокработ, опубликованныхпо темедиссертации

1. Pletushkina, OJu., Popova, Е., Shchepina, L. and, Chernyak, B.V., Mitochondrial Membrane Potential, Respiration and ATP Synthesis are not Necessary for Staurosporin-mduced Apoptosis and Anti-apoptotic Action of Bcl-2 in: HeLa cells, International conference "2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle/Saale", Germany, March 31-April 2, 2000; European Journal of Medical Research, 2000, v. 5, № I, p.37;

2. Щепина Л.А., Плетюшкина О.Ю., Попова E.H., Черняк Б.В., Основные митохондриальные функции необязательны для апоптоза, индуцируемого стауроспорином, и защитного действия онкобелка Bcl-2, Международная конференция "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода", Пущино, 06-09 июня, 2000, стр. 172;

3. Коровкина Н.А., Щепина Л.А., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Изучение выхода цитохрома с при стауроспорин- и ФНОа-

. индуцированном апоптозе, Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов 2001", Москва, 0911 апреля, 2001, стр. 179;

4. Щепина Л.А., Попова Е., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В. Апоптоз клеток HeLa, вызванный фактором некроза опухолей, зависит от образования неселективных пор во внутренней мембране митохондрий, Всероссийское рабочее совещание "Митохондрии: в патологии", Пущино, 28-31 мая, 2001, стр. 210;

5. Shchepina, L.A., Popova, E.N., Pletjushkina, O.Yu. and Chernyak, B.V., TKFa-induced apoptosis in HeLa cells depends on opening of permeability transition pore in mitochondrial membrane, Advanced FEBS Course "Mitochondria in the Cell Life and Death", Russia, Moscow, 2-7 September, 2001, p.-23;

6. Shchepina, L.A., Popova, E.N., Pletjushkina, O.Yu. and Chemyak, B.V., Staurosporin- and TNFa-induced apoptosis and anti-apoptotic action of Bcl-2 in HeLa cells are not linked to mitochondrial membrane potential and respiration, Advanced FEBS Course "Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects", Turkey, Antalya, September 23 - October 3,2001, p. 100;

7. Щепина Л.А., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Апоптоз клеток HeLa и антиапоптозное действие онкобелка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий. Биохимия, т. 67, №2, 2002, стр. 265-270;

8. Тоневицкий А.Г., Демина И.А., Агапов И.И., Фаттахова Г.В., Попова Е.Н., Мойсенович М.М., Комолов И.С., Халанский А.С., акад.РАН Кирпичников М.П., Цитотоксическая активность коньюгатов человеческого транс феррина и А-субъединиц растительных токсинов in vitro и in vivotfДАН т. 374,№4,2000, стр. 557-560;

9. М.М. Мойсенович, С.Г. Егорова, О.В. Челнокова, И.А. Демина, Е.Р. Полосухина, Н.В. Козловская, Е.Н. Попова, Г.В. Фаттахова, О.Н. Солопова, И.И. Агапов, Влияние схемы иммунизации ? на эпитопную направленность моноклональных антител, взаимодействующих со связывающей субъединицей вискумина.// Российский иммунологический журнал, т. 5, №4,2000, стр. 375-384;

ЮЛопова Е.Н., Егорова С.Г., Демина И.А., Бенедиктова О.А., Агапов И.И., Мойсенович М.М. Мышиные моноклональные антитела против рицина не реагируют с агглютинином рицина.// Российский иммунологический журнал, т. 8, №3,2003, стр. 235-239.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007.от 23.06.2000 г. Подписано в печать 05.01.2004 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,6

Печать авторефератов 730-47-74

»-2822

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия белкового токсина рицина (R60) из семян клещевины с клетками гибридом. Молекула R60 образована двумя субъединицами: каталитической (А или RTA), обладающей N-гликозидазной активностью в отношении p28SPHK эукариот, и пектиновой (В или RTB). Рицин проникает в клетку в результате эндоцитоза и достигает своей цитоплазматической мишени (p28SPHK) в ходе многостадийного внутриклеточного транспорта [Sendvig K.and van Deurs В., 2000]. Это делает его удобным объектом для изучения физиологически важных клеточных процессов, например рецептор-опосредованного эндоцитоза лектинов, везикулярного транспорта, сортинга, рециклинга и транслокации белков в цитозоль.

Высокая токсическая активность каталитической субъединицы рицина позволяет использовать ее для конструирования иммунотоксинов и других препаратов направленного действия для терапии опухолевых, аутоиммунных заболеваний, а также для обработки трансплантируемых органов [Sandvig and van Deurs, 1996; Kreitman, 1999]. Обсуждается также возможность создания вакцин нового поколения на основе рицина. Были получены химерные молекулы, состоящие из рекомбинантной каталитической субъединицы рицина с инактивированным ферментативным центром, лектиновой субъединицы и короткого пептида [Smith D.C., et al., 2003]. Пептид презентировался на поверхности клеток в комплексе с MHCI, после чего наблюдалась активация специфичных CD8+ Т клеток.

Гибридомные клетки, продуцирующие мАт против токсинов, эффективно используются как удобные модельные системы для изучения некоторых этапов транспорта белков [Youle R.J., Colombatti М., 1987]. В основе этих модельных систем лежит предположение, что причиной устойчивости гибридом, секретирующих мАт против токсинов, является происходящее во внутриклеточных компартментах связывание их антителами. Однако в описанных в литературе модельных системах связывание антител с токсином вне клетки невозможно было исключить полностью. Кроме того, для предотвращения взаимодействия токсина с антителами вне клетки или во внутриклеточных компартментах в системы вводились дополнительные факторы, которые могли повлиять как на внутриклеточный транспорт токсина, так и на жизнеспособность (viability) клеток гибридомы [Youle R.J., Colombatti М., 1987; Kornfeld SB, 1991; Малюченко Н.В., 1999]. Получение устойчивых к интоксикации рицином гибридом, секретирующих мАт, специфически узнающих каталитическую субъединицу, но не голотоксин, позволяет разрешить сомнения относительно корректности «гибридомной модели».

Транспорт токсина в компартмент, где происходит его связывание мАт, принципиально важен для осуществления цитотоксичности. Анализ распределения рицина и секретеруемых мАт с помощью конфокальной микроскопии позволяет количественно оценить их колокализацию, и, возможно, определить компартмент, в котором происходит это взаимодействие в гибридомной клетке.

Изучение устойчивости гибридом, полученных к ненативным токсинам - один из перспективных подходов, позволяющий в ряде случаев визуализировать конформационные изменения белков, сопряженные с их внутриклеточным транспортом [Малюченко Н.В и соавторы, 1997; Малюченко Н.В и соавторы, 2000].

Анализ внутриклеточной локализации и цитотоксичности родственных лектинов растительной и бактериальной природы таких как рицин, агглютинин рицина, вискумин, волкенсин, дифтерийный токсин, псевдомонадный экзотоксин А, холерный токсин, шига-токсин и других, в совокупности с изучением их строения может оказаться эффективным для выявления структур, вовлеченных во внутриклеточный транспорт лектинов. Изучение строения токсинов подразумевает комплексный методологический подход не только с помощью РСА и сайт-направленного мутагенеза, но и серологического анализа, атомно-силовой микроскопии, а также ТИФА.

Изучение динамики процессов эндоцитоза и рециклинга, а также детекция минорных фракций токсинов и их субъединиц в клетке требует точной количественной оценки. Эти задачи позволяют решать специфичные высокочувствительные тест-системы на основе мАт. Кроме того, тест-системы для детекции рицина могут быть использованы для его выявления в парфюмерных изделиях, касторовом масле и кормах для домашних животных.

Взаимное загрязнение препаратов субъединиц токсинов, а также взаимное загрязнение R60 и R120 создает определенные трудности, как при изучении биологии растительных токсинов, так и при использовании в медицине иммунотоксинов и вакцин на основе субъединиц R60. Эта проблема может быть во многом решена за счет использования специфичных иммуносорбентов.

Цель работы: изучение особенностей взаимодействия рицина с клетками млекопитающих с использованием модельных систем на основе гибридом и тест-систем, выявляющих минимальное количество рицина и его субъединиц.

Задачи исследования:

1. Получить гибридомы против нативного рицина, нативного агглютинина рицина (R120) и против нативной и ненативной каталитической субъединицы рицина. Оценить устойчивость полученных гибридомных клеток к интоксикации рицином.

2. Охарактеризовать полученные моноклональные антитела (мАт). На их основе создать тест-системы, позволяющие определять RTA, R60 и R120 в присутствии друг друга.

3. Используя полученные тест-системы оценить интенсивность процесса интернализации рицина, а также определить наличие свободной RTA в супернатантах и лизатах клеток полученных гибридом. Изучить внутриклеточное распределение секретируемых иммуноглобулинов (Ig) и рицина.

Научная новизна работы.

Получены уникальные гибридомы, секретируюгцие мАт против RTA, но не R60 и устойчивые к интоксикации рицином. На их основе предложена модельная система для изучения особенностей транспорта рицина, в которой абсолютно исключено взаимодействие антител с токсином вне клетки.

На основе полученных в работе мАт, созданы уникальные тест-системы для определения RTA, не чувствительные к R60, и тест-системы, позволяющие выявлять R60 и R120 в присутствии друг друга.

Впервые выявлена свободная RTA в клетках и супернатантах клеток, предобработанных R60.

Показано, что в гибридомах, секретирующих мАт против RTA, с иммуноглобулинами (Ig) колокализуется не более 2-5% внутриклеточного пула рицина. Однако, именно попадание токсина в места колокализации с Ig принципиально важно для интоксикации клетки-мишени.

Практическая значимость.

Полученные в работе иммуноферментные тест-системы могут быть использованы в лабораторной практике для решения ряда научных проблем, а также для выявления токсичных компонентов в касторовом масле, косметике и кормах для домашних животных. Полученные в работе иммуносорбенты позволили значительно повысить степень очистки препаратов R120, RTA и RTB от взаимного загрязнения.

Фундаментальные исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой, и особенно механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов, избавиться от побочных эффектов, возникающих при их применении, а также значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий.

1. Обзор литературы.

1.1 Токсичные лектины из семян клещевины. Особенности трехмерной организации их молекул.

Рицин (R60) и агглютинин рицина (R120) - родственные лектины из семян клещевины (Ricinus communis). R60 — гетеродимерный белок, состоящий из каталитической, A (RTA), и лектиновой, В (RTB), субъединиц, соединенных одной дисульфидной связью. Молекула R120 образована двумя рициноподобными гетеродимерами (АВ), соединенными дисульфидной связью. Токсичность данных белков обусловлена N-гликозидазной активностью А субъединиц по отношению к 28S рибосомальной РНК эукариот, приводящей к потере необратимо модифицированной рибосомой сродства к фактору элонгации II и, как следствие, остановке синтеза белка и гибели эукариотической клетки. В-субъединицы связываются с гликозилированными рецепторами на клеточной поверхности, что необходимо для эндоцитоза токсинов. Эндоцитированные белки транспортируются от поверхности клетки в цитоплазму к их рибосомальной мишени.

R60 и R120 входят в группу в разной степени гомологичных токсических лектинов - рибосоминактивирующих белков II типа (РИБ II). Помимо рицина и агглютинина рицина группа РИБ II включает растительные токсины - вискумин (mistletoe lectin I или MLI), mistletoe lectin II и III (MLII и MLIII соответственно), абрин, модецин, волкенсин, эбулин 1 и некоторые другие, а также бактериальные - дифтерийный токсин, псевдомонадный экзотоксин А, шигатоксин и другие. Рентгеноструктурный анализ (РСА) рицина, абрина, вискумина и агглютинина рицина выявил структурное сходство этих белков [Rutenber Е., Robertas J.D, 1991; Hung С.Н. et al., 1993; Tahirov TH et al., 1994; Krauspenhaar R. et al., 1999; Sweeney E.C. et al, 1997]. Структура рицина изучена подробнее структур других РИБП. Принимая во внимание гомологию аминокислотной последовательности РИБП, данные РСА рицина часто используются для определения структуры других РИБП методом молекулярного замещения.

1.1.1 Структура связывающих субъединиц рицина и агглютинина рицина.

В-субъединица рицина представляет собой гликопротеин из 262 аминокислотных остатков с молекулярной массой около 31 кДа, содержащей два сайта N-гликозилирования (рис.1). Молекула RTB образована двумя сферическими доменами (1 и 2) с диаметром 30 А [Montfort et al.,1987; Rutenber Е., Robertas J.D, 1991]. Между доменами наблюдается выраженная гомология (32%) последовательности аминокислотных остатков [Willifranca et al., 1981]. Каждый из доменов состоит из четырех субдоменов: X, а, |3 и у (рис. 1). Три из которых, а, (3 и у, гомологичны (20%) между собой и имеют сходную конфигурацию. Они содержат около 40 аминокислотных остатков, и образуют структуру «трилистника». Субдомены X образованы первыми 16 аминокислотными остатками каждого домена (1-16 и 135-150 соответственно). Структура связывающей субъединицы рицина стабилизирована сетью гидрофобных взаимодействий между а.о. субдоменов, а также четырьмя дисульфидными связями, образованными Cys20- Cys39 и Cysl51- Cysl64 внутри а-субдоменов и Cys63- Cys80 и Cysl90-Cys207 внутри (3-субдоменов. Еще одна, пятая, дисульфидная связь в молекуле рицина образована Cys4 В субъединицы и Cys259 А субъединицы. В-субъединицы рицина и агглютинина рицина различаются по 41 аминокислотному остатку и гомологичны на 81% (рис 1) [Roberts L.M., 1985].

Рисунок 1.

Б.

RTB ------------advcmd ре рivrivgrngl cvdvrdgrfhngnaiq lwpck sntdanql

ARTB sllirpwpnfnadvcmdpepivrivgrmglcvdvtgeeffdgnрiqlwpcksntdwnql RTB wtijcrdntirsngkclttygyspgvyvmitdcntaatdatrwqiwdngtiinprsslvia ARTB wtxirkdstirsngkcltiskssprqqwi yncstatvgatrwqiwdnrtiinprsglvla RTB at s gns gt tltvqtniyavsqgwlptnntqpfvttivglyglclqansgqvwiedс ssek ARTB at s gns gtkltvqtniyavsqgwlptnntqpfvttivglygmclqansgkvwledсtsek RTB aeqqwalyadgsirpqqnrdncltsdsniretwkilscgpassgqrwmfkndgtilnly ARTB ae qqwalyad gsirpqqnrdnclttdanikgtwkil s cg pas s gqrwmfknd gt ilnly RTB sglvldvrasdpslkqiilyplhgdpnqiwlplf ARTB nglvldvrrsd p slkq11vh pfhgnlnqiwlplf

А. Третичная структура связывающей субъединицы рицина (код модели в NCBI 2AAJ)

Б. Аминокислотные последовательности связывающих субъединиц рицина и агглютинина рицина [Roberts L.M., 1985].

В-субъединица R60 содержит два хорошо охарактеризованных аналогично устроенных углеводсвязывающих центра. Первый локализован в субдомене 1а, второй - в субдомене 2у [Rutenber et al., 1991]. Существуют также свидетельства существования третьего, неидентичного двум первым, углеводсвязывающего центра, расположенного в ip субдомене [Venkotesh et al., 1997, Frankel et.al 1996, Steeves et al. 1999].

Первый и второй галактозосвязывающие центры представляют собой неглубокие карманы на поверхности белка, дно кармана образовано консервативным трипептидом, включающим 24-26 а.о. в первом сайте и 236-238 во втором. В верхней части кармана расположена ароматическая боковая группа Тгр37 в первом и Тгр248 во втором сайтах. Положение молекулы галактозы фиксировано сетью водородных связей с боковыми группами нескольких полярных аминокислотных остатков, локализованных в углеводсвязывающих сайтах, и гидрофобным взаимодействием с боковой группой соответствующего аминокислотного остатка Тгр (рис. 2). Консервативные а.о. Asp22 в первом сайте и Asp234 во втором являются ключевыми для первичного взаимодействия со связываемыми сахарами. Атом Odi этих остатков образует водородную связь с Сз-гидроксилом связываемого сахара. При этом положение боковой группы Asp фиксируется водородной связью атом 0D2 - с Ne2 консервативного амида Gln47 в первом углевод-связывающем сайте и Gln256 во втором. Каждый Сз-гидроксил галактозы также формирует сильные водородные связи с атомами ND2 Asp46 в первом сайте и Asp255 во втором. Сеть водородных связей в первом углевод-связывающем сайте более сложная, чем в сайте 2, в котором NE2 Gln35 образует раздвоенную водородную связь с С4- и Сб-гидроксилами. В сайте 2 аналогом Gln35 является

11е246 и вместо водородной связи образуется гидрофобный контакт с атомом Сй сахара.

Согласно данным РСА кристаллов R120 в комплексе с (3-D-галактозой [Савочкина Ю. А., 2002], В-субъединица R120 организована аналогично В-субъединице рицина. Она образована двумя доменами, состоящими из четырех субдоменов, пространственно расположенными так же как домены и субдомены RTB. Вторичная структура связывающих субъединиц обоих токсинов характеризуется отсутствием а-спиральных участков и наличием [3-складок и неупорядоченных цепей.

Рисунок 2

КГВ ARTB

Строение углеводевязывающих центров в !а и 2у субдоменах В субъединиц рицина и агглютинина рицина [Савочкина Ю.А, 2002г] (с любезного согласия автора).

S04№S

Согласно данным РСА [Sweeney Е.С. et al, 1997; СавочкинаЮ. А., 2002г], в молекуле ARTB функционирует только один углеводсвязывающий центр, расположенный в субдомене 1а. Его структура представлена на рис.2. В ARTB, как и в RTB, Тгр37 образует гидрофобный контакт с молекулой галактозы. Аналогично Asp22 (Od1 и 0D2), Asn46 (ND2) и Gln35 (NE2) в RTB, в ARTB Asp22 (Od1-C4 gal), Asn46 (Nd2-C3 gal), Lys40 (Nz-C3 gal) и Gly25 (N-C4 gal) образуют водородные связи (рис. 2). Боковая группа Lys40 фиксирована в нужном положении водородной связью с Glu26. Таким образом, различия в формировании водородных связей с галактозой в рицине и агглютинине рицина обусловлены заменами Asp25 на Gly25 и Gly26 на Glu26. В области 2у субдомена R120, соответствующей второму углевод связывающему центру R60, галактоза отсутствует, хотя внешняя поверхность сохраняет форму открытого кармана (рис. 2). Вероятно, утрата углеводсвязывающей активности в 2у субдомене R120 связана с заменами Туг248 на His248 и А1а237 на Arg237. Обе указанные замены приводят к увеличению положительного заряда на данном участке, что препятствует правильной ориентации молекулы галактозы, и, следовательно, образованию водородных связей с соответствующими боковыми группами аминокислотных остатков. Кроме того, результаты, полученные на мутантных RTB, свидетельствуют о том, что гидрофобный контакт Туг248 с молекулой галактозы во втором углеводсвязывающем центре рицина необходим для удержания сахара в зоне контакта [Rutenber et al.,1991; Lehar et al.,1994].

Согласно данным сайт-специфического мутагенеза, рекомбинантные RTB, несущие замены в субдоменах 1а и 2у, сохраняли лектиновую активность. В то время как В-цепь рицина, которая имела замены в субдоменах 1а, 1р, 2у по аминокислотам, участвующих в стекинг-взаимодействиях, Trp37—»Ser, Tyr248—»His, Tyr78—»His, теряла способность связываться с галактозидами, находящимися как в составе асиалофетуина, так и на поверхности клетки [Frankel А.Е., 1996]. При изучении биологической активности in vitro и in vivo гетеродимеров, содержащих мутантную RTB, показано, что при вышеуказанных заменах происходит значительное снижение токсичности химерных белков. Величина 1С50 в экспериментах на клеточной линии лейкемии человека HUT 102 составила 5* 10"9М, в экспериментах in vivo LD50 составила 10 мкг/мышь. Тогда как эти значения для рицина составили 4* 10"12 М и 75 нг/мышь соответственно [Fu et al., 1996]. Однако, в субдомене 1р отсутствуют остатки, эквивалентные Asp22 и Asp46 (la) Asp234 и Asp255 (2у), которые образуют водородные связи с гидроксильными группами при атомах СЗ и С4 галактозы. Возможно, возникновение комплекса с галактозой обусловлено полярными взаимодействиями боковых радикалов аминокислот с ОН-группами при атомах С2 и С4, и, таким образом, нельзя ожидать, что аминокислоты, занимающие аналогичное положение в пространстве, будут консервативны как для сайта 1(3, так и для хорошо изученных сайтов la и 2у.

Углеводная специфичность и рецепторы рицина.

Рицин и агглютигин рицина связываются с концевой галактозой поверхностных гликопротеинов и/или гликолипидов клеток. Оба токсина связывают простые сахара, такие как галактоза и лактоза. Методом равновесного диализа с мечеными сахарами были определены константы аффинности углеводсвязывающих центров рицина [Shimoda et al., 1985] и агглютинина рицина [Podder et al., 1974]. Согласно полученным результатам сродство к галактозе двух углеводсвязывающих центров рицина значительно различается и равно при 4°С 2800 М"1 и 35000 М"1, и при 25°С 3000 М"1 и 19000 М"1 для первого и второго центров соответственно. Аналогичные результаты были получены для лактозы. Константа ассоциации R120 с галактозой при 5°С равна 1,2 мМ"1 [Podder et al., 1974], то есть, сравнима с константой первого низкоаффинного углеводсвязывающего центра рицина.

Baenziger и Fiete (1979) показали, что константа связывания рицина с концевой галактозой в составе олигосахаридов в 1000 раз превышает константу связывания с отдельной молекулой галактозы или лактозы [Baenziger J.U., Fiete D, 1997]. Рицин не связывается с олигосахаридами, содержащими концевой N-ацетилгалактозамин. Сиаловая кислота, присоединенная к галактозе в положении а2—>6 в 2-4 раза снижает константу связывания рицина с Gal. Наибольшая константа связывания рицина с сахаром (14.4x106 М"1) наблюдается при взаимодействии с олигосахаридом, содержащим три остатка галактозы.

Галактозид-связывающую активность рицина изучали методом рентгено-структурного анализа, используя разветвленный олигосахарид с двумя концевыми остатками галактозы [Rutenberg and Robertus, 1991]. Расстояние между двумя галатозосвязывающими участками рицина (70 А) не позволяет одной молекуле рицина одновременно связывать два концевых остатка галактозы одного олигосахарида. Однако концевые остатки Gal олигосахарида связывают две молекулы рицина. Таким образом, разветвленные рецепторы могут связывать разные молекулы рицина без стерических затруднений.

Большинство галактозо-содержащих олигосахаридов клеточной поверхности имеют структуру, очень схожую с той, которой обладают углеводные цепи фетуина. N-связанные олигосахариды белка асиалофетуина взаимодействуют с рицином, причем константа аффинности превосходит 107М"\ Steeves et al (1999) предполагают, что для лиганда подобной структуры характерны многоточечные взаимодействия с поверхностью всего углевод-связывающего субдомена, а не только с самим «карманом». Возможно, это и объясняет 1000-кратное увеличение константы аффинности при связывании олигосахаридов.

Было показано, что рицин способен связывать N-ацетилгалактозамин (GalNAc) , но только в сайте 2. Rutenber и Robertus (1991) отмечали, что N-ацетильная группа галатозамина и остаток Asp44 могли бы создать стерические напряжения в сайте 1, тогда как в сайте 2 N-ацетильная группа экспонирована в водную фазу. Агглютинин рицина лишен такой способности, что, вероятно, сопряжено с отсутствием у ARTB второго углеводсвязывающего центра [Baerziger et al., 1979].

Любая клетка является потенциальной мишенью для растительных РИБ II, так как имеет на своей поверхности концевые остатки галактозы, поэтому эти белки действуют неизбирательно. Количество рецепторов для разных токсинов на поверхности клеток отличается. Например, на мембране клеток Hela имеется 3x107 рецепторов для рицина и абрина и только 2x105 для вискумина [Тоневицкий и др., 1995]. При изучении взаимодействия рицина с клетками-мишенями выяснилось, что на поверхности клеток различных популяций существуют как низкоаффинные так и высокоаффинные рецепторы [Leonard et al., 1988, Decastel et al., 1989]. Кроме того, на эндотелиальных клетках печени и макрофагах показано, что рицин связывается не только с рецепторами, содержащими концевые остатки галактозы, но и с поверхностными маннозными рецепторами через остатки маннозы олигосахаридов, входящих в состав рицина. Это обеспечивает альтернативный путь поступления токсина в клетку [Magnusson et al., 1991, Simmons et al., 1986].

1.1.2 Структура каталитических субъединиц рицина и агглютинина рицина.

Каталитические субъединицы R60 и R120 представляют собой глобулярные гликопротеины с двумя сайтами гликозилирования. Существуют две в разной степени гликозилированные формы А-субъединиц рицина и агглютинина рицина, которые выявляются с помощью SDS-PAGE-электрофореза в виде двух полос, соответствующих примерно 29 kDa [Hegde R. and Podder S.K., 1998]. Структура RTA (рис. 3) сформирована тремя доменами: первый включает 1-117, второй - 118-210 и третий -211-267 аминокислотные остатки. Первый домен включает пять р-складчатых участков и две ос-спирали (А и В), второй - 5 ос-спиралей (C-G), третий - одну а-спираль (Н), а также петли и взаимодействует с двумя другими доменами, и с В-субъединицей (рис 3) [Rutenber Е., Robertus J.D, 1991]. Согласно данным PC А вторичная структура и общая организация А-субъединиц рицина и агглютинина рицина существенно не различаются [Sweeney Е.С. et al, 1997; Савочкина Ю. А., 2001г]. Каталитические субъединицы рицина и агглютинина рицина не содержат внутренних дисульфидных связей и их третичная структура стабилизируется сетью полярных и гидрофобных взаимодействий. А1 и А2 -субъединицы агглютинина соединены дисульфидной связью длиной 2,13А, образованной Cysl56.

А-субъединицы R60 и R120, как и других РИБ II, - N-гликозидазы, субстратом которых являются рибосомальные 28S РНК эукариот. Они осуществляют выщепление аденина (А4324 в клетках печени крыс) входящего в состав полностью консервативного тетрануклеотида GAGA, расположенного в петле или стеблевой части 28S РНК [Endo et. al., 1987; Gluck et al.,1994]. Распознавание А-субъединицей консервативного тетрапептида GAGA, по-видимому, зависит от его конформации в рибосоме. Так, для выщепления аденина из очищенной 28S рРНК или 20-35-членных синтетических олигонуклеотидов, включающих сайты депуринизации а-сарцина-рицина, требуются более высокие концентрации RTA, чем для депуринизации нативной рибосомы [Endo et al., 1988]. Кроме того, несмотря на консервативность сайта депуринизации, чувствительность рибосом разного происхождения к RTA заметно различается: растительные рибосомы намного устойчивее к RTA, чем рибосомы клеток млекопитающих и дрожжей, а рибосомы прокариот - полностью резистентны [Lord et al., 1991].

Представление о механизме ферментативного катализа, осуществляемого А-субъединицей, основано на данных рентгено-структурного анализа рицина и комплекса рекомбинантной А-субъединицы рицина с аналогами субстрата аденил(3'-5')-гуанозином и формицин монофосфатом, а также данных о ферментативной активности мутантных форм А-субъединицы [Monzingo and Robertus, 1992]. Данная модель построена по аналогии с детально охарактеризованным механизмом расщепления АМФ-нуклеозидазой связи между аденином и рибозой в АМФ.

Рисунок 3.

Б.

RTA mvpkqypiinettagatvqsytnfiravrgrlttgadvrheipvlpnrvglpinqrfilv ARTA ifpkqypiinfttadatvesytnfiravrshlttgadvrheipvlpnrvglpisqrfilv RTA e l snhael s vtlald vtnaywgyragn s A y f fh pdnqedAEAit hl ftdvqnryt fafg ARTA e l s n hae l s vtlald vtnaywgc ragns ay f fh pdnqed aeait h lftdvqn s ft fafg RTA gnydrleq lagnlrenielgngpleeaisalyyystggt qlptlarsfxiсiqmiseaar ARTA gnydrijsqlgg-lrenielgtgpledaisalyyystcgtqiptlarsfmvciqmiseaar RTA fq yIE gemrtrir ynrr sapdpsvitlen s wgrl s T Al qe snqgafas pi q lqrrng s kf ARTA fqyiegemrtrirynrrsapdpsvitlenswgrlstAIqesnqgafas piqlqrrngskf

RTA svydvsIlIP11almvyrcappp---

ARTA nvydvs xlIPIialmvyrcapppssqf

А. Структура каталитической субъединицы рицина (код модели в NCBI 2AAI) Б. Аминокислотные последовательности каталитических субъединиц рицина и агглютинина рицина [Roberts L.M., 1985].

Согласно модели, предложенной Monzingo и Robertus (1992) (рис. 4), консервативные Giul77 и ArglSO непосредственно участвуют в депуринизании. Argl80 образует водородную связь с N3 атомом аденозина (протонирует его), что облегчает разрыв гликозидной связи N9-C1. Glul77 поляризует молекулу воды, локализованную в активном центре. Затем происходит реакция нуклеофильного замещения: атом кислорода поляризованной воды атакует связь N9-C1 и замещает атом N9 аденозина, протон воды переходит к N9 атому аденозина.

Рисунок 4.

RTA ARTA

Строение ферментативных центров А субъединиц рицина и агглютинина рицина [Савочкина Ю.А., 2002] (с любезного разрешения автора).

Результаты, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза RTA, свидетельствуют, что в случае замены Glu I 77 на Ala роль G ] и 1 77 может выполнять G!u208, также локализованный в кармане активного центра, хотя такой мутант в 5 раз менее активен, чем белок дикого типа, а замена Glu208 на Asp не влияет на ферментативную активность RTA. Двойной мутант Glu 1 77А1а GIu208Asp практически не активен [Frankel et al., 1990]. Участие положительно заряженной боковой группы Argl80 в ферментативном катализе была показана на мутантной RTA в которой Arg 180 был заменен на Lys или на His [Frankel et al., 1990]. Ферментативная активность мутанта Arg 18 О/Lys была только в 4 раза ниже, а мутанта Arg 18 О/His в 1 ООО раз ниже активности нативной RTA.

Инвариантные ароматические аминокислотные остатки Туг80 и Туг 123 участвуют в связывании субстрата [Ready М.Р. et al., 1991]. В комплексе рекомбинантной А-субъединицы рицина с аденил(3'-5')-гуанозином и формицин монофосфатом пуриновое кольцо аналога субстрата фиксируется между ароматическими кольцами Туг80 и Туг123 с помощью стекинг - взаимодействия. При этом плоскость пуринового кольца практически параллельна ароматическому кольцу Туг80. Положение Туг80 в комплексе отличается от его положения в свободной А-субъединице поворотом, для которого необходим разрыв водородной связи с Gly 121. По данным мутагенеза, замена инвариантных Туг80 и Туг123 на ароматический Phe снижала ферментативную активность RTA лишь в 15 и в 7 раз соответственно. В то время как их замена на Ser снижала активность в 160 и 70 раз соответственно [Ready et al.; 1991].

Инвариантный Туг21 принимает участие в формировании структуры активного центра, образуя водородную связь с атомом О Metl74. В данном сайте спираль Е образует изгиб, в результате чего ключевые для ферментативного катализа аминокислотные остатки Glul77 и Argl80, оказываются на поверхности кармана активного центра.

Кроме описанных инвариантных аминокислотных остатков А-субъединицы РИБП содержат другие высококонсервативные аминокислотные остатки, например Asn 78, Argl 34, Glnl73, Glu208 и Asn209, функция которых пока не известна. Возможно, они также участвуют в формировании и стабилизации структуры активного центра или связывании каталитической субъединицы с субстратом.

Механизм действия А-субъединиц рицина и агглютинина рицина, по-видимому, идентичен [Lord and Roberts, 1996]. Как и у рицина, каталитический центр агглютинина рицина располагается в открытом кармане А-субъединицы и содержит ключевые аминокислотные остатки Glul76, Arg 179, Тгр210, Туг80 и Туг 123 (рис. 4). Его пространственное строение аналогично строению каталитического центра рицина (рис. 4) [Савочкина Ю.А., 2002]. В кармане активного центра агглютинина рицина, также как и у рицина, локализована одна молекула воды, W277, которая образует водородные связи с ключевыми аминокислотными остатками Glul76 ОЕ2, Glul76 ОЕ1, Argl79 NH1 и Cln207 О. Очевидно, локализованная в ферментативном центре агглютинина рицина молекула W277, также как у рицина, является непосредственным участником реакции N-гликозилирования.

1.1.3 Межсубъединичные взаимодействия в рицине и агглютинине рицина.

Каталитическая и лектиновая субъединицы рицина и агглютинина рицина соединяются в голотоксинах дисульфидной связью, образуемой 259 (258 в R120) в А-субъединицах и 4 в В-субъединицах остатками цистеина. В результате взаимодействия ЫН2-концевых аминокислотных остатков В-субъединицы с СООН-концевым участком А-субъединицы формируется удлиненная структура, которая содержит экспонированную на поверхность молекулы R60 дисульфидную связь [Montfort et al., 1987; Weston et al., 1994]. С помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением

2,5 А показано, что область контакта между А- и В-субъединицами рицина равна 1600 А, что составляет примерно 14% от общей поверхности каждой субъединицы [Katzin et al., 1991]. А и В субъединицы рицина кроме ковалентной S-S-связи удерживаются вместе сетью полярных, гидрофобных и стеккинг-взаимодействий боковых групп аминокислотных остатков, в зоне контакта [Krauspenhaar et al., 1999] (табл. 1). Участвующие во взаимодействиях аминокислотные остатки субъединиц расположены группами по всей поверхности контакта.

Таблица 1.

RTA RTB

Полярные взаимодействия

Asn223 Asp7

Gln224 Asn7

His40 Asp95

Asp245 Alal34

Arg235 Vail 42

Glnl83 Asn222

Ile250 Asn222

Leu253 Asn222

Arg235 Phe264

Try184 Phe264

Glu41 Lys221

Гидрофобные взаимодействия

Prol51 Phe220

Pro251 Pro262

Ile252 Pro262

Ala251 Pro262

Стекинг-взаимодействия

Phe241 Phel41

Phe241 Phe264

Tyrl84 Phe264

Дисульфидная связь

Cys4 Cys260

Аминокислотные остатки RTA и RTB, взаимодействующие друг с другом в области контакта субъединиц, по [Krauspenhaar et al., 1999].

После разделения субъединиц экспонируются скрытые в нативном токсине гидрофобные участки субъединиц. Показано, что свободная RTA способна взаимодействовать с липидными мембранами [Ramalingam et al., 1994; Utsumi et al., 1984; Utsumi et al., 1987 Utsumi et al., 1988] за счет гидрофобного участка, экранированного в нативном токсине [Simpson J.C., 1995]. Возможно, погружение RTA в мембрану инициирует процесс ее транслокации в цитоплазму, однако, не исключено, что встроенная в мембрану RTA может транспортироваться к месту транслокации за счет рециркуляции мембран. Предполагается, что встроившись в мембрану RTA приобретает конформацию «расплавленная глобула», и после завершения транс-мембранного переноса в цитоплазме происходит восстановление глобулярной структуры RTA, сопровождающееся перегруппировками в субстрат-связывающем сайте, необходимым и для активации фермента [Argent R.H., 1994; Argent R.H., 2000].

Несмотря на высокую гомологию аминокислотной последовательности, а также сходства в способах укладки А- и В-цепей рицина и агглютинина рицина, существуют различия в нековалентных межсубъединичных взаимодействиях этих белков. Согласно данным РСА, в молекуле R120 присутствует 4 дополнительных гидрофобных контакта по сравнению с R60. [Савочкина Ю.А., 2002]. Более плотный контакт между А- и В-субъединицами в R120 по сравнению с R60 может быть одной из причин различий в биологической активности этих родственных токсинов.

А1- и А2 -субъединицы агглютинина соединены дисульфидной связью длиной 2,13А, образованной Cysl56. Cysl56 расположен в гидрофильной петле между D и Е а-спиралями ARTA [Sweeney Е.С. et al, 1997]. В А-цепи рицина на месте данного аминокислотного остатка находится С1у157. А-субъединицы агглютинина рицина удерживаются вместе также за счет гидрофобных взаимодействий между аминокислотными остатками с113по118 [Савочкина Ю.А., 2001 ]. В данной области в молекуле рицина вместо Serl 1 бнаходится положительно заряженный аминокислотный остаток Argl 15. Положительный заряд боковой цепи Argl 15, по-видимому, является препятствием для сближения указанных областей А-субъединиц рицина.

R120 - не единственный тетрамерный РИБП. Для рицина, абрина и вискумина была показана способность к самопроизвольной тетрамеризации в растворах [Tahirov et al., 1995, Sweeney et al., 1998, Малюченко H.B., 2003]. Причем рицин и абрин образуют тетрамеры в результате взаимодействия их А- субъединиц, а вискумин - в результате взаимодействия В-субъединиц. Значение тетрамеризации РИБП пока не известно. Однако следует отметить, что токсины, образующие более стабильные тетрамеры, такие как агглютинин рицина или вискумин, обладают меньшей токсичностью в отношении клеток млекопитающих, нежели рицин или абрин [Barbieri L., 1993].

1.1.4 Синтез рицина. Мультигенное семейство, кодирующее рицин и агглютинин рицина.

Рицин синтезируется в виде препрорицина - полипептида длиной в 576 аминокислотных остатков, который включает в себя добавочную N-концевую сигнальную последовательность из 35 остатков, 267 остатков RTA, связывающий линкер из 12 остатков и 262 остатка RTB [Lord J.M., 1982; Lord J.M., 1985]. N-концевая сигнальная последовательность обеспечивает транспорт препрорицина в просвет ЭР. В ЭР препрорицин подвергается ко-трансляционным модификациям: отщепляется сигнальная последовательность сигнальной пептидазой, полипептид гликозилируется, внутри его формируются все пять дисульфидных связей, присутствующих в рицине. Модифицированный таким образом препорорицин называют прорицин. Прорицин перемещается путем везикулярного транспорта из ЭР через аппарат Гольджи в вакуоль растительной клетки. Транспорт прорицина в ЭР и аппарате Гольджи сопровождается некоторыми слабо охарактеризованными пост-трансляционными модификациями. В вакуоли кислые эндопротеазы вырезают из прорицина все оставшиеся N-концевые аминокислотные остатки и состоящий из 12 АК остатков пептид-линкер между RTA и RTB. Т.о. образуется соединенный дисульфидной связью гетеродимер рицин [Lord J.M., Roberts L.M., 1996]. Биосинтез агглютинина рицина протекает сходным образом [Roberts and Lord, 1981].

Рицин и агглютинин рицина кодируются семейством генов [Tregear et а1.,1992]. В растительной клетке одновременно синтезируются различные варианты рицина и агглютинина рицина. Об этом свидетельствуют как анализ клонов к ДНК [Ladin B.F., 1987], так и серологический анализ лектинов, выделенных из семян клещевины [Hagde R., Podder S.K., 1998]. Согласно данным, полученным Ladin B.F (1987) и сотрудниками, клоны кДНК разделяются на два класса, различающихся по кодированию некоторых аминокислотных остатков, включая аминокислотные остатки с заряженными боковыми группами. Серологический анализ рицина, выделенного из семян клещевины, также позволяет разделить варианты рицина на две основные группы (примерно по

12 вариантов в группе), различающиеся диапазоном pi. Так называемые рицин I и II при изоэлектрофокусировании образуют полосы в диапазоне 6,0-7,4 pi, рицин III - в диапазоне 8,2-8,2 pi. Анализ изолированных субъединиц рицина, выделенных из общей фракции рицина, и его субфракций, выявил неоднородность как В, так и А субъединиц. Рицин III составляет 30% общего количества рицина. Любопытно, что анализ связывания А-субъединицы рицина с аденином показал, что примерно 30% от общего количества рицина связывается с аденином с высокой аффинностью (3,3* 103М" 1) и 70% - с низкой (0,35* К^М"1) [Hagde R., Podder S.K., 1998]. Авторы предполагают, что высокой аффинностью обладает рицин III. Сравнивая диапазоны pi рицина, субфракций рицина, агглютинина рицина, субъединиц этих лектинов, а также основываясь на данных о связывании А-субъединицами аденина, исследователи предполагают, что ген агглютинина рицина мог возникнуть в результате слияния гена из группы I и II с геном из группы III. Это предположение согласуется с ранее полученными данными для так называемых рицина D и рицина Е. Рицин D и присутствующий в семенах таиландской клещевины рицин Е, описанные Araki и Funatsu [Araki Т., Funatsu G., 1987], различались диапазоном pi, их первичная структура различалась по некоторым заряженными аминокислотным остаткам. Анализ кДНК рицина D, рицина Е и одного из димеров агглютинина рицина [Araki Т., Funatsu G, 1987] показал, что А цепи рицина D и рицина Е идентичны, в то время как В-цепь рицина Е образована N-концевой половиной рицина D и С-концевой - агглютинина рицина. Предполагается, что рицин D представляет собой варианты рицина I и II, а рицин Е - варианты рицина III, описаных Hegde и Podder [Hagde R., Podder S.K., 1998].

Выводы:

1. Получено и охарактеризовано 17 новых гибридом против субъединиц рицина: 1 - против RTB и 16 - против RTA. Кроме того, получено 4 клона гибридом против агглютинина рицина. Предложена модель для изучения транспорта рицина на основе гибридом, секретирующих мАт против RTA, но не связывающих R60. В предложенной модельной системе взаимодействие токсина с антителами вне клетки исключено.

2. На основе анти-RTA мАт и aHTH-R120 мАт созданы тест-системы, позволяющие выявлять менее 0,3нг R60 и RTA и менее Знг R120 в присутствии друг друга. Тест-системы, позволяющие различать R60, R120 и RTA получены впервые.

3. Впервые выявлена свободная RTA в супернатантах и лизатах клетки-мишени. Показано, что диссоциация субъединиц рицина происходит во внутриклеточных компартментах до транслокации в цитоплазму, а также, что диссоциация субъединиц рицина необходима для интоксикации клеток.

4. Установлено, что интоксикация клеток определяется транспортом токсина в компартменты, где в гибридомных клетках присутствуют иммуноглобулины. Показано, что в эти компартменты транспортируется лишь незначительная фракция токсина (не более 2-5%).