Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Избирательная элиминация популяций Т-лимфоцитов человека с помощью иммунотоксинов

и 5. 9 2

Министерство здравоохранения СССР Институт иммунологии

на правах рукописи ТОПТЫГИН Андрея Юрьевич

ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ЭЛШМНАЦИЯ ПОПУЛЯЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОНОЕ1ЫЗ И!«4УНОТОК.СИНОВ

14.00.36 - Аллергология I: "ч- погня

Автореферат диссг-ртлшш на соискание ученой стрп^ни кандидата медицинских наук

Со с к па - 1Р«2>

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Института иммунологии Минздрава СССР

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Л. П. АЛЕКСЕЕВ; кандидат биологических на) А. Г. ТОНЕВИЦШ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. А. ЯРИЛИН; доктор медицинских наук, профессор Ю. И. ЗИМИН

Ведущая организация: 2-й Московский Ордена Ленина медицински институт им. Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится с-г^гг^ 1 одУл-

в &час мин. на заседании специализированного совета при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115476 Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан /^с^с^/

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.В.КОЛОБОВ

- 1 - . . j Актуальность темы. Одной 'из основных проблем фармакологии является недостаточная избирательность действия лекарственных средств,. Появление и развитие гибридонной' технологии открили возможность использования моноклоналышх антител для направленной доставки лекарстзенкж препаратов к клеткам- и тканям-мисеням. В первую очередь реализация этих идея была связана с возможностью лечения онкологических больных, з связи с тем, что именно п' этой области традиционные химиотерапевтические и радиотерапевтические средстза оказывают косное повреждаокее воздействие и на нормальные клэтки. В настоящее время достигнут значительный прогресс в создание, цитоюксических фармакологических

i

агентов направленного действиям иммунотоксинов, т. е. конъйга-тов антител, выполняпцих роль вектора, с токсинами растительного и ."и бактериального происхождекил. Первые попытки клинического использования иммунотоксикоз доказали перспективность этого направления биотехнологии. Наиболее значительные результаты били получены при использовании!! тиунотоксинов для элиминации Т-лиифоцитов из донорского костного мозга ex vivo перед пересадкой для профилактики реакции трансплантат' против' хозяина (Р'ГПХ), а такгэ при лечении пациентов с тя.таелоп стероидоустойчивол РТПХ, развивезйся после пересадки аллогенного костного мозга. Недавно описанные результату успешного использования иммунотоксинов при лечении пациентов с perr.атоидным артритом (Byers V. et al, 1990) выявили нозуп область клинического применения иммунотоксинов -лечение тя.телых аутоиммунных заболевании.

Однако, при клиническом применении иммунотоксинов сразу го выявился ряд-проблем,- Как теоретических','связанных со стратегией выбора клеток^мииеней,'так и практических, связанных, в частнос ти, с, сильной иммуногенностьо иммунотоксинов, а такта с не всег-

да достаточной избирательностью и эффективностью их цитотокси-ческого действия. '

Таким образом, использование иммунотоксинов становится для врачей методом выбора наряду с традиционными терапевтическими приемами, поэтому крайне актуальной задачей является создание новых иммунотоксинов и изучение их цитотоксических свойств для повышения избирательности и эффективности специфического действия.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось получение иммунотоксинов, избирательно элиминирующих популяции Т-лимфоцитов человека, пригодных для клинического использования. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение препаративных количеств рицина и токсина омелы ми и их изолированных субъединиц.

2. Синтез иммунотоксинов и их биохимическая характеристика.

3. Анализ цитотоксических свойств полученных препаратов иммунотоксинов. - (

4. Изучение возможности повышения избирательности и эффек-

I

тивности действия иммунотоксинов.

Научная новизну. Во время диссертационной работы,проводимой совместно с группой клеточной иммунологии Всесоюзного кардиологического центра АМН СССР под руководством к.б.н. А.Г.Тоневицко-го, впервые получен высокоэффективный иммунотоксин на основе токсина омелы МЫ, имеющий 'низкую неспецифическую активность » пригодный для клинического использования. Проведены сравнительные исследования механизмов действия иммунотоксинов, содержаш) А-субъединицы рицина и МЫ, на клетки-мишени и разработан спосос повышения эффективности иммунотоксина на основе А-цепи рицина. Получены данные о влиянии рецепторных структур на поверхност(

элиминируемых клеток и молекулярной структуры токсина в составе конъюгата на эффективность синтезированных иммунотоксинов.

Практическая значимость работы. Полученные иммунотоксины против антигена CD5 Т-лимфоцитов человека обладают высокой эффективностью и избирательностью действия, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных фармакологических препаратов. Врзможная область применения этих иммунотоксинов - обработка ло норского костного мозга In vitro перед пересадкой для удаления зрелых Т-лимфоцитов и профилактики реакции "трансплантат протип хозяина". В настоящее время проводятся преклинические испытания полученных иммунотоксинов в лаборатории радиоиммунологии Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР. Кроме того, полученные данные могут быть использованы при синтезе но вых высокоспецифических иммунотоксинов.

Публикация результатов исследования и апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I Всесоюзном иммунологическом съезде, (Сочи, 1989 г.), на V международной конференции по иммуноконъюгатам моноклональных антител в онкологии (Сан Диего, 1990 г. ) и на II международном симпозиуме по иммунотокси нам (Флорида, 1990 г.). Материалы и основные положения диссерта ции были доложены и обсуждены на расширенной конференции отдела иммуногенетики Института иммунологии ИЗ СССР (январь, 1991 г.) Основные результаты работы изложены в 3 статьях и 4 тезисах докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов:' введение, обзор литературы (3 главы), материалы и-методы,' результаты исследований (3 главы), обсуждение' полученных результатов, выводы и список . литературы ■ Пби наименований). Работа проиллюстрирована 16 рисунками и 3 табли-

- ч -

цами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выделение токсинов и их А- и В-субъединии. Рицин экстраг] ровали из семян клещевины Ricinus communis по методу Николсона Блауштеяна (Nlcolson, Blaustein, 1972), фракционировали 6i сульфатом аммония и наносили на колонку с иммобилизованный : сефарозе р-аминофенил-1-тио-р-В-галактопиранозидом (ßal-сефар! за). Связавшиеся с gal-сефарозоя рицин и агглютинин разделя. используя для элюции линейный градиент 0-120ь:М галактозы. Пос, восстановлекля межубъединичной дисульфидной связи : меркаптоэтанолом в присутствии галактозы, А- и В-субъединицы pi цина (Рд и Pg) разделяли по методу Фултона (Fulton et al.,1966 используя ионобыенную хроматографию на DEAE- и СМ-целлюлоэ( Полученные препараты А-цепи рицина дополнительно пропуск через колонку с иммобилизованным асиалофетуином для удален! следовых количеств B-цепи рицина.

Токсин омелы ML1 выделяли из семян омелы Ylscum album i аналогичной методике совместно с сотрудниками Берлинского инст! тута иммунопрепаратов и питательных сред под руководств« профессора Г. Франца. А- и В-субъединицы ML1 (MLft и ) разд( ляли используя аффинную хроматографию на иммобилизованных hi муноглобулинах.

Чистоту полученных препаратов оценивали с помощью электр< фореза в градиентном (7-22* > полиакриламидном геле в присутств! додецилсульфата натрия.

1 21

речение белков. Мечение белков I проводили иодхлорным метод! (Bale et al., 1966). Рицин, ML1 и их изолированные субъединш метили в присутствии ЮОмМ лактозы, предохраняющей от поврезш ния галактоэосвязываюших участков. Удельная активность иечеш

- 5 -5 5

ipenapaTOB составляла 5x10 -9x10 имп/.мин/мкг. 1оликлон&льнне антитела. Антисыворотки против рицина и токсина мели Mil получали иммунизацией кроликов рицином или ML1, обра-отанных формальдегидом.

оноклональные антитела. Для синтеза иммунотоксинов использова-ось моноклональное антитело' ЛТ1 против антигена CD5 Т-имфоцитов человека, предоставленное к.б.н. А.В.Филатовым лаборатория иммунохимии Института иммунологии МЗ СССР). Антите-э ЛТ1 выделяли из асцитноп жидкости мышея BALB/c двухкратным ^акционированием 50& сульфатом аммония, с последующая ионобмен-)íl хроматографией на'DEAE-целлюлозе.

1нтез иммунотоксинов. Антитело ЛТ1 обрабатывали бифункциональ-щ реагентом И-сукцинимидил-3(2-пиридилдитио )-пропмонатом :ПДП). К модифицированному антителу добавляли преобработанные тютреитолом Рд или HLA и инкубировали 10 часов при комнатной 'млературе. Конъюгаты отделяли от непрореагировавш(х молекул льфильтрацией на сефарозе CL-6B. .•

работка клеток имчунотоксиначц. Эффективность цитотоксического

йствия иммунотоксинов оценивали по ингибЛрованию включения 1 A¡

-ткшшина или С-лепцина в клетки-мишени по сравнению с обработанными клетками. Клетки вносили по 0,5-1x10^ клеток на нку в 96-луночные плансеты в 100 мкл среды RPMI 1640 с 2 мМ глутамчна, 4 мкг/мл канамицина и 10S эмбриональной телячьей зоротки. Тестируемые образцы вносили в 100 ыкл той жэ среды. :лс инкубации с препаратами в течение 1 часа, клетки отмывали,

5авляли 200 мкл све:кел среды, инкубировали 20 ч. и вносили

14 1 <5

-тимидин или С-лейцин. Инкубацию клеток с С-лейцином

'водили в безлейциновой среде. Через 10 ч. клетки переносили

стеклянные фильтры и измеряли радиоактивность в сииитил-

ляционном счетчике. Включение в необработанные клетки составляло

Одним из существенных препятствии, возникших при использовании иммунотоксинов ln vivo, явилась сильная иммуногенность входящих в их состав токсинов, затрудняющая повторное применение одного препарата. Эту проблему можно в значительной степени решить, создав панель одинаково направленных иммунотоксиноз, используя при синтезе несколько токсических белков, не обладавших перекрестной иммунореактивностыо. Мы провели сравнительный анализ перекрестной иммуногенности рицина и токсина омелы ML1, выбранных нами для синтеза иммунотоксинов. На рис.1 представлены результаты ингибирования обоими токсинами связывания меченого рицина с антителами к рицину. ML1 не ингибирует взаимодействия

3

50-150x10 имп/мин. Неспецифическое включение не превышали

3

2x10 ими/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

60

-I 600

б

Количество ингибирующвго белка в пробе (n¿)

1 о S

Рис. 1. Ингибирование рицином и ML1 связывания I-рицина с антителами против рицина.

рнцина с антителами к рицину. Аналогичный результат был получен и zfm ML1 - рицин не ингибировал взаимодействия ML1 с антисыво рэткоя к МП 1рис. 2). Таким образом, используя поликлональные антитела к рицину и ML1, мы показали, что оба эти токсина не

100,

то -

60-

2&-

Ridn

MLI

0

4-

4-

1 1Э 100

Колхексп» шЕИйпрткнцйг© toma п прсбэ (n¿)

1

'ис. 2. Иигибирование рицином и ML1 связывания I-ML1 с антителами к MU.

блаяаот перекрестной иимуиореактионостъа и -могут быть исполь-овакы при получении панели пос/зэдовательно заменяемых иммуно-экснноо, необходимой для длительной терапии, требующей много затных ¡¡леденил иыиунотоксина.

1. Слнтеэ имиунотоксикоз.

В процессе получения иииунотоксхна з антитело вводили акти рованную дисульфидную группу, обрабатывая его бифункциональным агентом - СПДП (рис 3.). На 1 молекулу антитела было введено 2 2-пиридилдисульфидных групп. После добавления очищенной А 5ъединицы рицина или А-субъединицы кал, имеоших свободную )ерхкостнуо тиольную группу, в результате тиол-дисульфидного

- в -

обмена происходило образование ковалентной дисульфидной связй между антителом и А-субъединицей токсина аналогично дисульфидной

уу >4 /Г-педеа-тетяюл

А«> . иэю&=ннзя ¿хгогятегргвия

х , ТИОЛ-ДИСМ»ИДНЫЯ ОБМЕН /

ИМКУМОТОКСИН

Рис. 3. Схема получения иммунотоксина.

связи между субъединицами в нативноя молекуле токсина. Конъюга1 отделяли от непрореагировавших молекул гельфильтрацией, Очишенный иммунотоксин при ЗОб-электрофорезе в. градиентно) 78-22* полиакриламидном геле в отсутствие 2-меркаптоэтанола бы; представлен пятью полосами, соответствующими молекулярным масса] от 160 до 310 кД (рис. 4), а в присутствии 2-меркаптоэтанола ■ тремя полосами: 30 кД (А-субъединйца токсина), 23 кД и 56 к. (легкая и тяжелая цепи иммуноглобулина). Таким . образом ЗОЭ-электрофорез полученных иммунотоксинов показал, что об: полученных конъюгата содержали гибридные, молекулы со средни: соотношением токсин/ЛТ1 равным 2 при практически полном отсут ствии непрореагировавших антител и А-субъединиц токсинов.

в с

330 кДп 220 кД.

67 кД

во кд:

12 КД

А ■

Рис. <1. Денсктограммы (A.D) SDS-Злектрофореэа (В,С) очищенного имиунотоксика с (А,3) и без (C,D) 2-меркаптоэтанола.

2. Цитотоксические свойства полученных иммунотоксинов.

Анализ ц'лтотоксических свойств иммунотоксинов приводили in vitro на СБ5-поэитивных клетках-мншенях Т-лимфобластных линий Н9 ■л Jurkat, на С05-негативных контрольных клетках В-лимфобластных линий Raji, ЕВЗ и Daudl, а также на мононуклеарных клетках периферической Крови (МПК) здоровых доноров. Способность Л'11 связываться с указанными клетками предварительно оценили с помощью непрямой иммунофлюоресценции на npoiочном цц.1 офлшпримет ре FACS-2 ( "Becton Dickinson" ) (таб. 1).'

Эффективность цитотоксического действия иммунотоксинов out нивали по ингибированию включения 3Н-тимидина или 14С-лейиина i<

Таблица 1.

Связывание моноклонального антитела ЛТ1 с клетками разных линия и стимулированными ФГА (1мкг/мл, 72 ч) МПК здоровых доноров.

Интенсивность Экспрессия

Клетки флуоресценции клетками

CD5

Контроль ЛТ1

Опухолевые В-клетки Саш11 16 16

Опухолевые В-клетки ЕВ-3 16 17 -

Опухолевые \-клетки .1игка1 11 47 + -

Опухолевые В-клетки Иа^ 17 16 -

МПК здоровых доноров 14 59 +

Опухолевые Т-клетки Н9 17 63 +

Примечание: Представлены значения моды распределения число клеток/интенсивность флуоресценции ( N канала). Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуоркмэтре FAC3 II после последовательного инкубирования клеток с JJT1 и конъюгатом ФИТЦ с кроличьими антителами против IgG мыши. Контрольные клетки инкубировали только с конъюгатом.

клетки-мишени по сравнению с необработанными клетками.. На рис 5 представлены результаты ингибирования иммунотоксином, содержащим

з

А-субъединицу рицина (ЛТ1-Рд ), включения Н-тимидина клетками-мишенями Н9, несущими на своей поверхности антиген CDS. Входящие в состав конъюгата антитело и А-цепь рицина не оказывают цито-токсического действия на эти клетки в исследованном диапазоне

концентраций, тогда как иммунотоксин практически полностью по— й

давляет пролиферацию клеток-мишеней при концентрации ЮМ.

Иммунотоксин ЛТ1-РА менее эффективно подавлял пролиферацию

Концентрация препарата (М)

Рмг. 5. З&зистсость токсического действия от концентрации им мукатокс.чна "П-Рд (1), ЛТ1 12) и Рд (3) на клетки линии КЗ 5СВ5+>.

Рис. 6. Зависимость токсического действия от концентрации им мунотоксина II) и Рд (2) на лимфоциты периферической крови, стимулированные ФГА.

мононуклеарных клеток крови, стимулированных ФГА, вследствие того, что не все отвечающие на стимуляцию ФГА мононуклеарные. клетки несут на своей поверхности антиген CD5 (рис. 6).

Одним из основных показателей цитотоксичности иммунотохсина является значение концентрации, при котором наблюдается ингиби-

рование включения метки на 50* - ИД 50. Для клеток-мишеней линий

-1 о

Jurkat и Н9 ИД 50 иммунотоксина ЛТ1-РА составлял около 3x10 М. Избирательность действия ИТ можно оценить по разности ИД ИТ для клеток, зкспрессируюгцих антиген CD5, и клеток, не несущих на своей поверхности этот антиген. С1)5-негативныэ клетки более чем на два порядка менее чувствительны к действию иммунотокскка, чем клетки-мишени (таб. 2).

Таблица 2.

Действие иммунотоксина ЛТ1-Рд in vitro на различные клетки-мишени .

Клетки

Наличие CD5

ИД 50 ИТ (М)

Опухолевые Т-клетки линии ,1иг]мЛ Опухолевые Т-клетки линии Н9 Опухолевые В-клетки линии НаЛ Опухолевые В-клетки линии 0аис11 МПК здоровых доноров

3,1x10 3,6x10

-10

■10

> Ю-7

• > 10 9,4x10

-10

+

+

+

Наибольшие различия между цитотоксическим действием ЛТ1-РА на СБ5-позитивные и на С05-негатииные клетки наблюдалась при концентрации ЛТ1-Рд 10 М (рис. 7). При этой концентрации в течение суток переживало не более ЗХ клеток мишеней, тогда как на контрольные клетки линий и Ьаиа1 ЛТ1-Рд не оказывал выра-

-7

женного цитотоксического действия и при концентрации 10 М.

в

н

о?

ЮОтаэ СП5+

13' иа СБ5—

Й С0-

1 50 " § 4020-

га

а

Л

на

1игка1 Н9 МПК ОаисИ

Рис. 7. Цитотоксическое действие иммунотоксина ЛТ1-ра при концентрации 10 М на клетки разных линия и МПК здоровых доноров.

Сравнительный анализ цитотоксическоя активности двух им-

мунотоксинов ЛТ1-Рд и ЛТ1-М1.Д показал, что оба иммунотоксина не

оказывает заметного неспецифического цитотоксического действия

-7

на контрольные клетки линии Оаи(И вплоть до концентрации 10 М и эффективно подавляют пролиферацию клеток-мишеней линии Лигкаг (рис. 8), причем конъюгат ЛТ1-М.Д оказался примерно в 80 раз более активным, чем аналогичный конъюгат. с А-цепью рицина, и почти так же эффективен, как и нативный токсин омелы МП. Чем определяются эти различия - пока не ясно,, тем более, что при значительном сходстве строения и биохимических характеристик оба нативных токсина обладают разной цитотоксической активностью (рис. 9): нативный МЫ примерно в 10 раз менее эффективно подавлял включение "Н-тимидина клетками линии ,1игка1;.

ю-4" ЯГ" Ш

Канцдатрацшг шагунотоксика. (М)

Гис. 8. Зависисмосга цито~оксиче;кого действия от коицзктрсдаи имиунотокзинов ЛТП-КИд (©,0) И ЛТ1-Рд 1Д,Х> НЕ ХЛЭ7КИ линий "иг)^ и Ваий! (и,X).

1С01

1' СО

ы 63 а.

и -

С

-•с—......

ИГД 1СГ»

Коацез1рац1Ш тск«ша. (II)

10

Рис. 9. Зависисмость цитотоксического действия от концентрации рицина |д) и МП I©) на клетки линии ДигКаг.

Таким образом, анализ цитотоксических свойств полученных нами иммунотоксинов против антигена Г лимфоциюи человека

покаывает, что, даже в отсутствие усиливающих агентов, эти им мунотоксины сравнимы или превосходят по эффективности и избирательности действия многие аналогичные иммунотоксинн, уже ислиль зуемьге в клинической практике.

3. Модулирование цитотоксичности полученных иммунотоксинов.

Одним из известных способов потенциирования циготоксическо-го действия иммунотоксинов, содержащих А-цепь рицина, является использование лизосомотропных аминов (например хлорид аммония!, замедляющих снижение рН в лизосомах, уменьшающих катаболизм им-

100 г

.......

........... *

—-— ...........

Концентрация препарата (М)

Рис. 10. Зависисмость цитотоксического действия от концентрации иммунотоксина ЛТ1-РД (1,2) и Рд (3,4) на клетки линии .1игка1 в присутствии (1,3) или в отсутствие (г.7)) '¿и мм галактозы и 10 мМ НН4С1.

мунотоксина в клетке и воздействующих на аппарат Гольджи, предположительно являющийся местом трансмембранного переноса. А-цепи рицина в цитоплазму клетки. На рис. 10 представлены результаты усиления эффективности цитотоксического действия иммунотоксина ' ЛТ1-Рд в присутствии Ш4С1. В этих условиях ИД 50 имыунотоксина для клеток линии ,1иг1мЛ оказался примерно в 20 раз меныса, при этом неспецифическая цитотоксичность изолированной А-субъединицы рицина не изменилась. Однако в присутствии несколько воз-

росла неспецифическая токсичность имыунотоксина по отношению к контрольным клеткам, поэтому избирательность действие ЛТ1-РД возросла примерно на порядок.

Однако, высокая эффективность цитотоксического действия полученных нами иымунотоксинов. так же, как и всех известных по данным литературы аналогичных иымунотоксинов,, „ на несколько по- • рядков ниже эффективности нативного рицина. Кроме того, имчуно-токсины с целой молекулой рицина значительно более эффективны, чем иммунотоксины с изолированной А-субъединицей рицина, но в ' той же степени и менее специфичны.

В процессе реализации цитотоксического действия рицина мог-но выделить четыре основных этапа: связывание с рецепторними молекулами на поверхности клетки, мнтернализация, транспорт к месту трансыембранного переноса (и районе коыплекса Гольджи! и транслокация А-субъединицы в цитоплазму. Антитело ЛТ1 способно полностью заменить В-цепь рицина* на первых двух этапах и также эффективно выполнять векторные функции' В-цепи, но, поскольку при этом эффективность цитотоксического действия ИТ оказывается значительно ниже, чем у рицина, значительный интерес представляет изучение вспомогательных свойств В-субъединицы рицина, обеспечивающих крайне высокую активность рицина, и возможности испольэо-

вания этих сволств для усиления цитотоксичности ИТ с Д-цепью ри цина. Предполагается, что В-субъедлница рицина может способстзо-еоть трамслокацни А-цепи рицина через мембрану я цитоплазму клетки.

Мы попытались увеличить эффективность действия ЛТ1-РД с помощь» направленной доставки В-цепи ' рицина к клегкам-мишеням .вместё с ЛТ1-Рд, используя высокую аффинность взаимодействия субъединиц рицина. Для этого клетки-мишени и клетки контрольной линии инкубироза,-;!! с ЛТ1-Рд в течение 45 мин. при ^С (для эа-

с.з — ЛггЬаЛ сет — :2ахиИ

I

Й

и.-.

н!

в

-1'

РТТЯ

Т-

п

5 г Ш

л/СЯСт-П, л/СОО-В. а/СВб-К. а/СБб-В.

Рис. 11. Усиление цитотоксического действия иммунотоксина

ЛТ1-Рд с помощью В-цепи рицина. А - рН 7,4, В - рН 5,0.

медления эндоцитоэа) и, после отмывки от несвязавшегося ИТ клетки инкубировали с в присутствии лактозы, предохраняюше от неспецифического взаимодействия Рв с клетками, не несущими и своей поверхности ИГ. Однако такая обработка клеток не приводил к увеличению эффективности ИТ (рис. 11А). Ранее мы показали, чт при понижении рН среды аффинность взаимодействия субъединиц ри цина значительно возрастает: при рН 5,0 в 10 раз выше, че при рН 7,4.

Проведение второй инкубации при рН 5,0 привело к увеличена цитотоксичности ЛТ1-Рд в 3 раза (рис. 11В), причем в этих уело виях ИТ не окапывал токсического действия на контрольные клетк! линии Ramos .

125

Проведение таких инкубация с меченной I Pg показали, чт<

при нейтральном рН ?в практически не связывается с клеткам:

Jurkat, независимо от наличия на их поверхности Рд~ИТ, тогда ка:

при рН 5,0 Р^ эффективно связывается с клетками, экспонирующим:

на своей поверхности ИТ, причем с каждой такой клеткой дополни-

■1

тельно связывается около 5,5x10 молекул Pg . Попадание в клетк; такого количества нативного рицина неизбежно должно приводить i ее гибели, однако в указанных условиях этого не происходило Очевидно, что в этом случае процессинг иммунотоксина с реконструированным In vitro рицином отличался от процессинга нативного рицина и это различие обусловлено отсутствием взаимодей-• ствия реконструированного рицина с рецептором. Эти данные позво-. ляют сделать вывод, что вспомогательные свойства В-цепи рицина, обеспечивающие крайне высокую эффективность цитотрксическогс действия рицина, в значительной степени рецептор-опосредованы.

Предложенный способ усиления эффективности цитотоксическогс действия может оказаться полезным при использовании ex vivo.

В настоящее время проводятся преклинические испытания полученных нами имиунотоксинов в лаборатории клинической радиоиммунологии Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР. По предварительным оценкам эти иммунотоксины обладают высокой специфической цитотоксическои активностью и не оказывают сущест венного влияния на колониеобразуюшие клетки, что потдверждае) перспективность их клинического использования. Возможная область применения полученных иммунотоксинов - обработка донорского костного мозга In vitro перед пересадкой для удаления зрелых Т лимфоцитов и профилактики реакции трансплантат против хозяина.

ВЫВОДЫ:

1. Получен иммунотоксин против антигена С1)5 'Г-лимфоцитов человека, содержащий А-цепь рицина, избирательно элиминирующий Т-лимфоииты In vitro.

2. В присутствии хлорида аммония эффективность избирательного цитотоксического действия иммунотоксина, содержащего А-цепь рицина, возрастает примерно в 10 раз.

3. Впервые синтезирован иммунотоксин против антигена СШ Т-линфоцитов человека с изолированной А-суоъединицей токсина омелы ML1, обладающий более высокой эффективностью цитотоксичес кого действия по сравнению с аналогичным имыунотоксином, содер жашм А-цепь рицина.

4. Рицин и токсин омелы ML1 не обладают перекрестной им мунореактивностью и могут быть использованы при синтезе взаиыо заменямых иммунотоксинов, необходимых для длительной терапии.

5: Полученные иммунотоксины против антигена CD5 Г лимфоцитов человека обладают высокой эффективностью и изб^ра тельностью действия, что позволяет рассматривать их в качестве

потенциальных фариакологических препаратов.

6. Предложен новая способ усиления эффективности цитотокси-

ческого действия иммунотоксинов .содержащих А-цепь рицина, не

сопровождавшийся увеличением неспецифической цитотоксичности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ:

II. Топтыгин А.Ю., Тоневицкий А.Г.. Маркс У.. Ершова Г.В., Миримано-ва Н.В. "Цитотоксические свойства иммунотоксина против антигена CD5 Т-лимфоцитов человека". Материалы 1 Всесоюзного иммунологического съезда, г.Сочи, 15-17 ноября 19ЭЯг., стр. 110

2). Тоневицкий А.Г., Топтыгин А./О., Маркс У., Филатов А,В., Алексеев Л.П. "Избирательная элиминация Т-леякозных клеток человека с помощью конъюгата А-цели рицина и ыоноклонального антитела против СВ5-антигена Т-линфоцитов", ДАН, 1939, т.307, N6, стр.1507-1511

3). Тоневицкий А.Г., Ершова Г.В., Агапов И.И., Топтыгин А.Ю., Короткова О.В., Шерекков С.Н., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. "Получение и изучение цитотоксических свойств имуунотоксина анти-С1)7/А-цеПь рицина", Ш\}Т1991^,

4). Tonevltsky A.G., Toptygln A.Yu., Mirlmanova N.Y., Malsurian N. A. "The effect of ricin B-chain on ricin A-chain immunotoxlr cytotoxicity at weak acid conditions". Antibody Immunoconjugates, and radiopharmaceuticals, v.3, HI, 1990 (Ed. S.E.Order), p.74

5). Tonevitsky A.G., Toptygin A.Yu., Zdanovsky A.G., Zdanovska M.V, Rahnsanova Y.A., Ershova G.V., Yankovsky U.K. "Expression 01 Pseudorwnas aeruginosa exotoxin A fragment - Staphyllcoccus aureus protein A fragment, gens fusions in E.ccll", Abstracts of Secom International Symposium on Immunotoxlns, June 14-16, 1990, Florida, USA. p.65

6). Toptygln A.Yu., Tonevltsky A.G., Mlrinanova N.V., Maisurian N.A Gelbln M.. Kindt A., Pfuller U., Frenz H. "The use of rici B-chain at weak conditions for enhancing ricin A-chaln lnummotoxl cytotoxicity, ibid, p.66

7). Tonevltsky A„G>,. . Toptygln A.Yu., Pfuller U., Bushueva T.L Ershova G.V,., "Gelbin:' 'H.,.'. Piullei"--' K.. .Agapov I.I., Franz H "Imaunotoxin'. "with mistletoe'-.'lectin I A-chaln and ricin A-chal directed. CD5.\ antigen -':ot -human. T-lymphocytes; comparison о efficiency- and specificity", „ International Journal о Ircir.unophartacology^ frfriCfl-fMt1^1