Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Взаимодействие фрагментов иммуноглобулинов с супероксиданион-радикалом

л

я4 ^

лЧ^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДСВАТШСККЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОЙ) ЗНА?.ЖНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ыККРОЬКОЛОПМ ШШ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА. Н.Ф.ШШГЕИ

Ка правах рукописи

ОГАРЯН Роберт Робертович

ЗЗАШОДЕЙСТБИЗ ФРАГМЕНТОВ НШШГЛООТИНОВ С СУПЕРСШЩНИОН-РАДИКАЛОМ

14.00.36 - Аллергологи и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискакге ученой степени кандидата биологические паук

Москва - 1992

Работа выполнена б Е/Ж эпидемиологии

п КЕКробполо'гъи км. II. Ф.Гамалеи ГАьП '

Научный руководитель: профессор, член-корр. РАМН АЛ.Кульберг

Офицзааыок» оппоиенуа: доктор химических наук, профессор А.П.Швечкнн доктор биологических наук В.Г.ГалактЕокой

Ведущее учревдёшю: Центральный институт усовершенствования врачей 113 РФ

Зашта дассертапш состоится ^ в ^^ часов на заведанвя специализированного совета ЗСШ .07.01 Шй эпидемиологии'и микробиолога ем. Н.Ф,Гекатеи РАМН по адресу: ¿¿х'зй, Ыоскв~, ул.Гакатег, 1.3.

С диссертации «окно ознакомиться в библиотек? ШИсМ ш.К.Ф.Гашулч: РАй!

Автореферат разослан

Ж

Учяшй секрот^рт,

сеэциаяигкровакного соватг

доктор медшинс:аг- наук

Актуальность проблемы. В последние три десятилетия ведут-t интенсивные исследования роли продуктов распада дшлуногдо-лйнсв в регуляции'иммунитета. Было показано, "íto гомологач-ö и гегерологичние Рс--фрагмента вызцэаат поликлокальяуы актацию В-лимфоцзтов ín vivo п ¡n v¡4ro (fJajjar , 1976; Berman, ?7). Установлена такке имедноиоду ллрукдая активность Б( ав') g ?ав -фрагментов IgG, полученных с. псмощьв пепсивз (Kulb«r-g al., 1976; Евиид, 19Б2). Функциональная активность РСав'^ ?ав'~ фрагментов определяется С-концвзым гексапеааддоы, вхо-5Ш в сослав й-цзпза (Кульберг с соавт.-, 1985;-Иаргулио с ¡et., 1986). Изолцрозаккыа гексрпептид.я-его сянтетэтескиЗ юлог обладали muy н он оду ля т орн оЯ активностью, аналогичной :овоа у Р(ав')2 - Фрагменте СКулхборг с'соавг., IS86; Шбвэз юавт., 1988). ''

В свою очередь, ?(ап')2 - фрпг.моптп, долучешие с по.\<сцьв

сипл, но пэ папапиовие Гав-фрагкэпта, гизыаавг грэнзпторнив

jcsann гсгшостаза, вырагопцясоя в дзйхопснлп о лссяэдуЩЕм

кофтозом, аптизгщаи систем палпдакзвта (Kulberg, 1272;

Iber,7 at al., 1978). Эти свойства ¡?(ав')(Нкрегдепгов ясказ-ó **

яо сзяг-ать о активностью С-копегзеого гехсасзаяцдэ (CFPPSL) , хгл: нкзЕио во этому участку различаются дспетногле и папа« sue Рав-срггкэнтн IgQ. Крсггз того, tíirao усгановдсгзо, что ^.совапнцй гассапевткд. указанного строена? способа а регули-л.э активность люлфоцягов з сгтнтах in vitro (.'.йргулко о 32./ IS3S).

Совок? miccrs эгдх данных зпззивааз ва'наличие рээаообрсз-фо>м 0лпьоппосм»Я активнее?!; у пролзн-богатого аоптдаа' г-хойц-з Теклэ сзоСотва nons-яда uoraio св.«*-

> с глэздояэяиоЗ бяогаклчзсхой згэязвоогг» пептидов s пс<до1-отртвгкиг.

r 4 ~

Известно, что ти'оловые группы способны взаимодействовать с кислородными радикалами (HadUy, 1974). Кроме того, сочетание в составе коротких пептидов цистепнового и гдут &ушсвого остагксв иока? обусловить связывание пзпгадом металлов переходной валентности (VaUee, 19Э0). Присутствие в подооных пептидах остатков пролина предполагает высокую степень зависимости их активностя от динамической конформацин пептида в растворе, а агфгатический характер боковых остатков пролина допускает вероятность формирования такими пептидами в водных растворах -надмолекулярных .структур. .

Эти соображения послужили основанием для предположения, что пролин-богахые пептиды из шарнирного района Igß способны образовывать в водных растворах агрегаты, облддашдае способностью перехватывать радикалы кислорода, причем именно эти характеристики могут быть значимы для проявления биологической активности пептидов. В пользу такого предположения свидетельствуют тапке шогочиоланг-шо сведения о ванной роли радикалов кислорода в регуляции клеточного цисла в ф/!ацлональной' актив-посты »эднокоупетенгных и других клеток (Стонане, 1989; Oberky, 1334; Dornan<i, 1983).

_ До настоящего вржени (¡¿яз. получены отдельные экспериментальное доказательства участия йысокоыолвк/яярннх фрагментов IgJ в реакциях, связанных с превращениями активных форм .кислорода-.(П1здег и дрГ,-; 1938). Одаако систекштьчаское ■ изучение этоЗ .проблемы не было до настоящего времени осущестз-лено, равно как нь изучалась роль олигопептндов из аарнирногс района г захвате радикалов кислорода.

Цальа рзстояцйй работа явилось исоледоаанйе возмоз;:ооти взадмодгЗетвяя петухов из Еарнярной области шмунегдобуяшюл с суязро;ссид^ион-радтаалсн, Поскольку даученкие noirciw

оопроизводят в своей пос.тадонательяостл богатио продинач aap~ Ф1гао участки колэкули IoG лроллка и человека, представлялось зобходиша сопсстаЕлгь свойства указанных поетддсз со своЗст-lmii природных белков: IoG, его Гав-фрашептов я белков из 1таа-глобулзновэЗ фракции сыворотки, вступавдах во вэакмодеН-'в'-.о с IcG и ого фраг.ментам'1 ín vivo .

В задачи нссгодппапля бзздпло:

- исследование активности синтетичзсккх поптвддох анало-

з участка из шарнирной области IoG при Езапшдейсзвцз с супор-евданион-радикзлом 0^, а также связи стой акгизности с фязлхо-мичеекпма слойстесми пгптлдов и присутствием а сраде ионоз

- изучение роли шарнирного участка IoG для лзасмодейстляя * и Рав-фрагыеигов с

- вуясноппо возшяноста взаимодействия сикгоглчзс:«:: н;птпдов - аналогоэ участка из карзярпай об.т-гста ItC¡, - .ven-

и

собой ;i с нзкоторига белкамд (>ргг:гц1*л гкт-а-глгфлгйээ {.IrG, ¡s')^-фрагмент, гоиорезкгезг, ?-бза ецгзха зкаяздмяз

«зжздггзтаиЯ дхтг спосзбзсста зпззапшк бзлпоз иерсязз-••o» Og-,

- езгппэ злиякя яехс-горкг бэгкзз гз фгзстгз го-^а-глобу-а (гссрзаитЕПт, Э-Ллгп) пл лрырссн, схяэаезгэ о дейсетза-¡sreansncc хпедередо.

Йошпяз поду gaznar: состспт з oísapsstfmxa а

отгсгаэвпоЗ япзмагерг-агггэ приреза азсп:.:07.з2стзня сиптатага:: олагепепкздез, £сспрг™зледящих позлздо'глтс.тьность isap-кого учзегка IoG, с Уогэясвкшо, что езэеобаоста заапо-»corres с С~ у указгипкх гзатадеэ щпио зсгг-саа о? от спада хчсотаппсЗ игретецп в рззтзорг и нахся™тся з сбрзгпоЗ

зависимости от концентрации ионов 1г(~+ в растворе'. Показано • /

взаимодействие с О^ для пепсинового Р(ав^-фрагмента и 1<зС, причем эта характеристика определяется связанным с ним белковым компонентом, подучившим ранее наименование Р-белков.

Впервые установлено, что взаимодействие синтетических олигопептидов - гомологов последовательности из шарнирной области 1£С, - с 1§С, Г (ав) ^-фрагые нт ом, гоморе акта ¡¡тем, Р-бел-ками - ведет к модулированию реакционной способности указанных белков в перехвате 0^.

Теоретическое значение полученных результатов заключается в выявлении у слигопептвдов, обладающих иммуномодуляторными свойства!«, активности в перехвате 0^, а такке способности взаимодействовать с Эти данные могут углубить представления о биохимических основах функциональной активности иммуноглобулинов и продуктов их протеолитического расщепления.

Апробзмя работы. Основные результаты работы долокены на• Всесоюзном симпозиуме "Ноше методы прогноза патологического процесса" (Курск, май-июнь, 1991 г.), на I Съезде иммунологов России (Новосибирск, июнь 1992 г.). Апробация диссертации состоялась на мэклабораторной конференции НИИЭМ ил. Гамалеи РАШ

2 апреля 1992 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следящие раздели: введение, обзор литературы, материалы и методу, исследования, собственные исследования, обсундение результатов, выводы библиографический указатель, включащий источники на русском (67) и иностранных (126) языках. Диссертация изло-кена на 101 страницах машинописного текста и иллюстрирована 7 таблицами к 12 рисунками.

П^бликадии. По данным-диссертационной работы опубликовано

3 печатных труда.

- 7 -

МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВШЕ МЕТОДУ ЛССЛЭДРВАНИЯ

В работа использовались 3 синтетических пептида с общей >рмулой Х-Рго-У -?ro-Glu-Leu , где X=Cys , Ala; У=Рго, Ala, [птэзировашша по общепринятому методу в шушзЗ фззо. Пептяды Ш1 синтезированы д.х.н. В.А.Шабневшл.

Использовались коммерческие препарат ïgG человека ( Serva"), ВД-Н ("Reanal"),'феназикмотасульфат ("Serva"), тросннлй тетразолий ("Chemapol") » цатохром-с ("Serva"). Пользовался спектрофотометр Philips PU330 к многоданальныа ектрофотометр "Behrínger".

Гаша-глобулиновую фракцию сыворотки крови человека я олика получали осавдениам сульфатом аммонся прп 4.0% нэсвде-и.

P(aB)g фрагменты человеческого и кроличьего 1сД получали и обработке коммерческого препарата IcG ("Serva") пепсином,

■ О

к описано ранее (Porter, 196 9 ).

Бав-фрагменты получали обработкой Г ( аз) р-фрагке п то в па газом, с последунцэ.а блокировкой сульфгпдряльиых групп йодацэ-одом.

Пзпспногый агглвтинатгр (гсглореактакт) выдоляли из сызо^ гкя кровл здоровых доноров на сорбента $ерЬэгс'&е.4В с иммо-оизовбншш ^ав'^-фратаентом чзлозека (Фиозвскзя, 1972).

В-бзлкл человека получали по .методу, описанному рапэе ,'льберг, Еяг.стратова, 1935).

Йтт-Р-ешзоротзд' получали по опасапгзачу рэпзе методу зртова с соазт., 1983).

Препараты мембран эритроцитов человека получали "по .гчнее !саш1ому принципу (Hanahan , IS73).

И-'мунофермеитный анализ связывания гшореактанта с

F(be) 2-фрагментами и синтетическими пептидами проводили в полистиролошх планшетах "Greiner " по обще принят салу принципу. Лунки сенсибилззировалп пептидами в концентрации 20 мкг/мл или Р(ав') ¿-фрагментами (0,5 мкг/мл), в объеме 0,1 мл. •

Исследование взаимодействия различных веществ с проводили, используя ранее описанный метод {-'NtshiHmi et al., 1972) В ккгаете для спектрофотометра вносили: НАД-Н (донор электрона) - г'Ю-5-^*!*)-4}.!; феназинметасульфэт (переносчик электронов на о;) - i.i<r% нитросиниЗ гетразолиО (индикатор) - 3*10 -2*10""^Л. Реакщю ироводили в 0,1 М Трис HGI буфере, рН 7,4, при 22°С. Исследуемые препараты вносили в кювету в объеме 0,2 мл, поело чего реакцию запускали введением феназинмет2сульфата. Регистрировали прирост OriggQ, с интервалос 10 сек, в течение 3-5 мин, Скорость выраеалк в Мотах образовавшегося формазана (Ejj 6'Ю3).

Интенсивность перехвата Оо исследуемыми веществами определяли при'концентрации тетразолия 8'10-5М, НАД-Н - 1-Ю~4М. при этом скорость реакции в холостой пробе составляла 0,050+ 0,005 ед. опт. плот ./мин.

Расчет констант скорости перехвата Og (Ксуп) проводила по формуле, приме кящеЗся для характеристики перехватчиков Og в использованной шмк системе (Владимиров,Ю.А. с соавг.; 1991):

К _ Ко • (тот раз одни] , Уо _ ^

супГ [перехватчик] V«

где Ко - константа скорости реакции тетразолия с 0|, Vo иУх -

скорости реакции в холостой и опытной пробах соответственно.

Найденные в трех опытах значения К-,,^ усредняли.

Количество едошц условной активности в перехвате или

"генерации" определяли из выражения Е =

2Q0 _ х х í

где Е - количество ед., х - эффект ивгибирования или "генерации" в % от скорости реакции в контроле. Учитывали эффекта, девшие в пределах примерно 20-70$ от контроля.

Тест на окисление восстановленного цитохрома-с в присутствии Hjílg прозодкля по принципам ранее описанных методик (Pryor , 1976; Kumar al., 1985). В кювету вносили 0,75 мл восстановленного цитохрома-с (7,5'10""%) и 0,2 мл. образца или 0,1 М Трис KCI, рН 7,4. После введения 0,05 мл Hg02 3/0,1 до конечной концентрации 5 ií,I окисление цитохрома-с регистрировали по уменьшению OÍI^q.

Тест на индукцию ПОЛ проводили следующим образом. В пробирки вноси®! 0,2 мл ЗФР, НДД'Н в 0,4 мл и 0,1 мл плот-, пего осадка эритроцпгарких мембран. После введения фэкззикде-

IJ п

тасульфата (5*10 М) дроби инкубировалл 2,5 ч при 37 С. Образцы исследуемых препаратов вносили в мшен? "О" или на 20-У минуте инкубации, когда генерация Og ун".е практически отсутствовала. После осаздеякя проб ТХУ в недосадке определяли количество продуктов ЮЛ, реагирущих с тиобарбитуровоЗ кислотой, по методу, описанному ранее (Стальная, 1977),

Содержание свободных тиоловых групп определяли по реакции с парахлормеркурябензеатом (Торчинский, 1972).

фильтрацию па мембранах Amicon цроводлли в ячейках фирмы, 1сд давлением 4,5 эта (азот). Фильтрацию прерывали при достижении объема 0,5 мл над фильтром.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Я ИХ ОБСУВДЕНИЕ . . В первой серии экспериментов била исследована счособ-юсть трех синтетических гекоапелтидов к взаимодействию с су-

перохсиданион-радикалсм О,. Пептида имели следующие'формулы:

1. Oys- (Pro)g-GUi-Leu (P-Cys) - гомолог последовательности ыезду 241 и 248 остатками Н-цепи IgG кролика (базовый пептид).

2. Ala - (Pro)g-Glu-Leu (P-AIa) - аналог базового пептида.

3. Cys-Pro-AIß-Pro-Glu-Leu (Р-Ш) - гомолог последовательности меэду 223 к 235 остатками Н~цепи IgG человека.

Исследуя кияетиху восстановления тетразолия в окрашенный формазан в присутствия P-Cys (под действием Ор. установили, что, в за ей с;:!.: о ст и от ссстиоаения компонентов, пептид P-Gys способ e«: как интибирезагь ззеетагювлекпо тетразолия ("перехватывать" Og), так п ускорять этот процесс. Были рассчитаны пара- . метра перехвата и ускорзния восстаиовлеиия тетразолия для трзх поптвдез (табл.1).

Таблица I

Сравнительная активность синтетических гексапзптидш при взаимодействии с Og и тетразоллзы

Пептид. Константа скорости Усиление восстанов.

реакции с Ojj-j-'ч КСуп тетр.,усл.ед. на М~с~ 100 his'/мл

Р-Суз (l,5tO,^'I04 1,00±0,05

P-AIa I03

Р-Ш (4,0¿I,0M03 0,25

Как следует es табл.Х, базовый пептид P-Cys оказался ¡шиболее активен в перехвате Og, тогда как единичная замена остатка Pro на Ala ведет к значительному снижении реакционной способности (Р-Ш). Наличие остатка Cys является, очевидно,

решающим для способности пелтзда перехватывать СГ^, т.к. пептид P-Aïa обладает дашь.следовой активностью. С учетом литературных сведений, представляется наиболее еерел'л^и, чта основным заЯтом пептида, где происходит захват электрона с 0^. является зет а ток цистеина. Пр.ч атом возникает, видимо, промеку точный гикльный радикал (Pryor , 1974; Hadl^y , 1974). При определена свободных $Н-групл в пептиде P-Cys оказалось, что их содержание составляет всего 0,1 M на I M P-Cys , причем эта величина )е изменяется и после реакции пептида с 0^. Кроме того, доступность SH-групп в P-Cys для ртуть-содерЕапего реагента (П2Ш5) <ачетно меньае таковой в свободном цистеине, поскольку в смеси Ш'.стеи1и-Р-Су5 ; 1:2) SH-rpyrmu начинают выявляться только поело .'ого, как прореагировали с ПХМБ все SH-vpynnu цистеина, что уо-?ансвили при сравнении с параллельно тлтруеглша отдельными растрами цастеина и P-Cys.

Учитывая амфифильные свойства пролнп-богатих пептидов, гредпологалн, что такие пептлдк свободен спонтанно формировать ■ i водных растворах агрегата. В их составе способность получке-•инового остатка захватывать иеспяреиныЗ электрон возрастает :? счет того, что S-S связл оказывается етеричесяи -малодоступ-13 для контакта с компонентами водной фазы, а сродство к отпоят ельн о гидрофобному кислородлому'радлкалу увеличивается, ^акционирование раствора P-Cys последовательно на ультрэфцльг-рационных мембранах PU 10, W.5, "Amiccn", задеркаваадих юлеяуяы с мол.массой 10 уЛД, 5 кДа и 2 кДа соответствзнно, оказало, что во фракции P-Cys с мол. размерами 2-5 кДа сохра-яется более половины всей аоходной активности раствора Г-G'ys перехвате 00. Во фракция с «сл. ашссоЗ пике 2 к,Да такезэя зв-

С»

лвкость лракгически отсутствовала, а фильтру еуооть P-Cys на

фильтре VM 2 составила около 15%. Если раствор пептида предварительно шодбирозала I ч при 56°С, фильтруемость пептида на YM 2 возрастала вдвое, цри этом во фракции над фильтром активность в перехвата такке заметно, сникалась. •

Исходя из зоачоЕНости образования агрегатов цролин-бога-тьаш пептидами, было исследовано изменение реакционной способности Р-Су* при взаимодействии с неактивным пептидом Р-AIa. Реакционная способность Р-Су& существенно возрастала при добавлении к пе;лу ?~А1а, а преинкубацая такой смеси при 56^ приводила к снииешда ео активности в перехвате 0^ (табл. 2).

Таблица 2

Сравни то ль на л активность различных препаратов пептвда P-Cys в пороззате Og (в усл.ед.)

Препарат ^ Активность в перехвате

ИСХОДНЫС

Инкубированный при 564?

' P-Cys + P-AIa (I.S-IO^M), 2Z°Q

Р~Суз + P-AIs (4.I0~5M), 22°G .

P-Cys -i- P-AIa (4-IO^M), инкубированный 'при 56°G .

Обрзботанний SKcycaoa к-тоЗ

Кстрпграцкя пептвда P-Cys везде 4*IO~°LI.

По данным дифференциальной УФ-спектрсмзтрии оптическое поглощение раствора пептида ?-Cys при 200 нм падает в случае его прогревания при 56ПС, что означает упорядочение укладки цзпи (Бреслер, I97S)Напротив, npi" смерзании пептидов P-Cys

' 1,05 0,22 2,20 ' 3,00

0,20 0,20

и P-AIa дифференциальный спектр икает лолокигелкша пик при 2СО ям. 3 случае прогревания этой смеса при 200 на возникает отрицателънка пик. Вероятно, упорядочение укладка пептидной цепи связана с разрушением ре ак цч он н о ш ос ой внх агрегатов и потерей способности к перехвату 0£. Пептид р~А1я, очевидно, способен встраиваться в агрегаты P-Cys, увеличивая их активность в перехвате например, за счет иекмотБкзяярнсЯ "миграции" неспаренного электрона, описанной ранее (.Hanriksen ft al., 1976). Прогревание пептидов при SS°G ведет, возможно, к распаду их агрегатов, возрастании упорядоченности укладки пептидных цепеЗ и увеличении оптического поглощения в области максимума зкстяякцки пептидной связи.

Известен фспомея мутаротпцяоняшс переходов полияролиповых пептидов в крепких растворах оргакичзских клслот (S-tein-barg, 1961)- В папах-экспериментах оказалось, чгто фияьтруо-мость раствора Р-Суз через мембрану УИ 2 в I М уксус:; о 8 кислоте возрастала примерно з 2,5 раза; при этом фракция пзптидэ, зздеряиваамая фильтром, практически утрачизала активность в. перехвате 0^ (тобл. 2). ' ~

Тэтам сбразом, агрегата пептида P-Cys по ряду свойств подобии некоторым металлофермэптам, участвующим в реакциях с эктнвными формами кислорода (супероксиддисмутаза,- каталаза, 1ероксидаза и т.д.).

Как поикали дальиейЕЯз экспериевти, в отличие от упс-аянутых фериэатсв, активность пептида P-Cys в перехвате On находится в обратной зависимости от концепт рации иоиоз Z.4+ в )астворе (рис.1). 'Этот феномен вяесяе «оззт напоминать-"плав-генио" и инактивацию супероксиддисмутазы при включении и&бытсч- . nix ионов '"(Roe. I98í). Однако данзна результат нельзя

so ■

но-

• Рис.т I. Зависимость. скорости, восстановления тетразоляя в присутствии 2*10 .i! Р-Суа ;ст содержания в среде ZnCIg.. По оси абсцисс.'-моляраоз соотношзние ZnCL>:P-Cys ; по-оси ординат - скорость реакции в % ст контроля без P-Cys.

грактоварь однозначно, так как отсутствуют доказательства включения' Znr+" в структуру агрегатов педавда. . '

Бил изучен вопрос о.той, в какой'мере шарнирный сегмент IgJ, сиотззгсявущиО пептиду f'-Ci'S, будучи в составе макромолекулы, отвечает да'взашюдайогвзе'1§С с О-^.что било иссле- • дсваво p«H9Ó. (Пзтяез, Кульберг, Í93S) Пр'- 'олздов.ательком расизплении 1<£ кролика -'пепогном и папааном была аолучеви Р(ав)2 -И 'РазН^агшвти, •Сравнительная вкиэвоегъ JgCI и фрагментов его молзвдш приводятся в табл.- 3.

• • •. Таблица в

Активность igG, l'iaB'ígjPflB-ÍParMOHTOB во • взаимодействии с а усилении восстановления тетразоляя

Нрзларат

Ьзашодействце о С

Т' > "

«суп' м"с

усиление восстан. тетр., усл. ед.

i" ( й Е} 2 ■

Рав . !

3-Ю6

Í.S-IO1

з.гаь

I',25tp;25

Из табл. 3 следузт, что 1оС я ого РСаз'^-фрагмант обло~ " аазг заметной способностью к пэрехзату On, а для папаиасаого ?вв-фрагмента знамени о соответствующего параметра аа порядок шее. Допустимо заключать, что основной сайт модзкует IgG, от-зотственныа за перехват OÔ > расположи в шарнирной области,

«•4

соторая сохраняется з папсявовом фрагмзнте Iof< и отсутствует з папяшшвом. Это согласуется о тем фактом,что поптид P-Cys, гэ-«олагичный последовательности из ьяраириого участка Içfi, яахзо

о»

збладает способностью перехватывать 00«

«V

Далее, предположи!, что агрегата пэптнда,?-Gys »огуг зсршроваться как непосредственно в раствора, тек я а сроллп-iorarc'j шарнир;ton участке Р(ав)«*~фрагмзнтоп и Ic£J. Бршараг •(ав')2-фрагаенгоп (I ;т/ил) з Трис-буфэро дмлазовэлл протлл |&с?>шого избытка раствора- P-Cys (ID мкг/мл). В контроле диализ ¡елл против буфера. В другом варианта огыта диализ вели в присутствии I >'Л мзрка'цтоэтппола. Оказалось, что диализ ?(

/

ротиз P-Cys приводит к псвыазняа актизностп ?( гв)р в пзре.'лза-'й 0~2 примерно в 2 рзга, а в присутствии мзркаптозтанола это :овиавнке отсудстсует. Могао предполагать, что для взакмсдзгз-там молекул необходимо сохранение дисульфлдноа связи иеэд сновалептниил Баз' в рзЗопз шарнира IoG. Шло исследовано вш-кэ пептидов P-Cys я ?-Ш на способность IçG порехватагать Ор. gG человека шку бяровзжя I ч пра 22°0 о разйлчвкгл кояачзсгвсмя ептидов, а затем вносили в ремкцноннуэ сгеоь. Результата прз-одятся в тебя.4.

Таким образам, реакционная способность içG снижается з рисутствви Р-Щ, ноактивясгэ з перехвате Og я новиаюотся в рисутстБиа P-Cys , обладающего собственно?! способностью ::

Таблицэ 4

Изменение активности 1ор в перехвате О^ в присутствии пептидов Р-Ш и Р-Су^ (в усл.ед. акт.)

Количество пептида Активность в перехвате

в молях на моль 1§р —

Р-Ш Р-Суе

О 0,16 0,16

0,2 0,08 0,26 2,0 0,09 0,30

перехвату

В гамма-глобу лановой фракции сыворотки присутствует белки, которые исходя из ранее опубликованных данных (Кульберг с соавт., 1972-1978), могут связывать пролин-богатне пептиды и реагировать с 0^. Это пепси но шй аггльтинатор. - гсыореактакт (ЕР), с мол. массой около 240 кДа, и Р-бзлки, первоначально выделешие из ГР в качестве неиымуноглоб.удинового компонента, с мол .массой около 50 кДа (Кульберг, Елистратова, 1935). В наших экспериментах е системе икмуноферментного анализа ГР действительно связывался с пептидом Р-Ш (рис.2). Мы предположили, что это связывание мокет происходить в значительной мере по шарнирной области , входящего в состав молекулы ГР, поскольку конкурентное тормоаение связывания ГР с лигандом (Р( ав'^-фрагментом) было слабо выравено даже в присутствии 100-йратаого молярного избытка лоптвд.а Р-Ш. Наличие в пробах

свободного цролина ослабляло связывание ГР с Р-Ш, но не с /

Р(ев)2 (рис.2). Это позволяет допустить, что ГР взаимодействует с Р(гв)^ по одному сайту, л с пролин-богатыми пептидами

Рис. 2. Связызвпнз гомореактанта .с FCas'jg фрагментом (7.) с пептидом Р-Ш (2), фиксированными на подзстиродз. Затененные значка ~ проба' без' пролина, сзетиэ зпочгл ~ проба 5»1(Г% свободного цролияа." ' •

ила Р-Ш - пс другому'»' раса олове иному, вероятно, з еарнирном айона молекула иммуноглобулина, как составной части ГР.

Било изучено влияние, пептида Р-Ш па способность Г? и -•белков, перехватывать • Прекде всего, оказалось, что па-

о

ачетры взаимодействия ГР и Р-белков а весьма разнятся табл. 5). • ' '

Преинкубацяя ГР и Р-белков с Ю-кротгш ыодяргол лзбнг-см пептида IP—III приводила к ^сниеснии активности в перехгатз 2 от 2-х (для Р~бедкоз) до 4-х роз (для ПО.

Р-белгл, IoG человека, пептида F-Cyj и P-Iü но .влияли

Таблица 5

Сравнительная активность ГР и Р-белков з 0 перохвате 02

Препарат Взаимодействие с Усиление восстанов.-

^ул, ЬГС" тетр., усл.ед.

Гомореактант 1^),2«10° 1,1±0,05

Г-белки 8±2*10^ Отсутствует

на скорость окисления цитохрома-С под действием продуктов разлокекия Цр2> тот^а 1шк ^ в ^озе 30 мкг/мл более чем вдвое ускорял окисление цитохрома-С. Моено предположить, что в отличие от других исследований нами веществ, способность ГР участвовать в реакциях с и тетразолем связана с.передачей электрона от ГР на ^г' с°ДР°Б°ВДаи5егся разложением перокси-да водорода. За счет этого ГР способен, очевидно, вызывать и дерекясвую модификации дяпвдных субстратов. Это нредлоке-!ше было проверено нами на модели перехшсного окисления липи-доз (ЮЛ) эритроцит ер них мзыбран, вызванного сиесьа НАД-II и фен аз и^ле тз сульфата, гекервдувдеа Ор-радпхзя. ГР усиливал образование продуктов ПОЛ, реагирусщах с тиобарбитуровой кислотой, будучи внесен в пробу в концентрациях от 20 до 80 мкг/мл. Р-белки икгнбкрозали ПОЛ в концентрациях свище 20 мкг/мл. .

Раздела виз гажш-глобулиновой фракции сыворотка человека на колонке с сефадоксом С200 показало, что жмунохимиче- • ски Р-белгщ выявляются в основном во фракциях с размерами молекул 30-60 кДа и 200-250 кДа, что, вероятно, соответствует фракциям "свободных" Р-белков и гшсреактантов, яздяюдйхся

мплексом молекул иммуноглобулина и Р-белка (Кульберг, Елист- • гсоза, 1985). Исходя нз этих данных, представляется вороят-¡м, что неиммуноглобулиновыа компонент гомореактаата - Р-белок, обуславливает наличие у ГР способности взаимодействовать с а "вклад" в эту активность молекулы Ic£¡ незначителен. Это ановится очевидным при сравнении активности в перехвата IgC¡, ГР иР-белков (табл.3, 5). "Свободные" и "ассопинроввн-е с IgG" Р-белки противоположным образом воздействуют на пере-сное окисление дгаидов. Допустимо предполонить, что в у слоях in vivo ГР и.Р-бзлки такне противояолояно влияют на кн-асивность- ПОЛ, что монет, соответственно, обусловить их раз-íHoe значение для развития патологических состояний, связан-с с активацией кислородно-радикальных процессов.

Нз исключено, в частности, что установленная ранее способов ГР ускорять распад фибронекткна (Неустроева, 1990; Маргу-) о соавт., 1992) такие монет объясняться действием разлокэ-[ HgOg гоморсактантом, поскольку эти продукты расщепляют фиб-isktíih íVnrftoIS89>; ' " ■

Таким образом, в результате протеолитической деградация уноглобулинов и родственных белков зознккавт фрагменты, вза-действузцве с супероксиданион-радикалом. Реакционная способ-ть шсокомояекуляргых фрагментов мояет модулироваться олиго-тиднымд фрагментами иммуноглобулинов. Цри этом мокко распо-лгь даяние факторы.в ряд по убывания их актдвностл в перех-9-<J¡:

ГР >Р-белкп >IoCS>Р(ав)о>Раз >?-Cys >Р-Ш

О <5

Связывание олигопептидоз Р-Суз к Р-Ш с бзлдами из "левой" i

п; ряда, приводящее к модулировании способности последних грех." а ту Оо, вероятно, является одним из путей реализация

- 2Э -

уис;.:сшлягор nu х фуш:ца2 паптЕда из шарнирной области IgC, onacmiaux paase (Кульборг, IS83; Маргулкс с ооавт., 1286). Способность к перахвату а tckes к ааашзодвйстнао с Елиуноглэ-булинь?«! молот обусловить вгаяки» пгятада на пролиферации и диффзроаццровку н^унсксаштонггих глете;:.

Совокупность пойучзпних результатов пегжло их теоретического звачеш!, мосет углубагь покзкавав 'раков оппсепного явяе-кш cao кг самого распада г. о доку ioQ а очвдеиша ioG-снгатек,

- о о

проаезодшцаго в определенных услеваях по psf.oiiy адаа (Куль-

берг, Дочовс, I8S9). В cesto 'насах даших пргдсгавдяогся, что изагедэдз^сгзко с сролкн-багатоО сарняраой otíasorc-s InG пзатп-дов, харааторастш-д аБагаодаСззвая ïrCS о рк&аалеп::

ыяздарайй» способ во о&азагь влаяяаз а ио слоатокаоэ раевдпло-пи-э по району ^елдл его «олзкулк, Иодучекяно s nseso-ruvsro асевдоззиая рагуламищ ¡.:oryï оду есть осасио'Л дел разработка средств, ст^аакзадвдах цреасраха ;л;::ов, асяогьзушге в даагяоепггеоюя в лгеебта: целях.

Б H В О Д И

1. Сзь'уетгчомае гелСЕяепгсда, вэгяроа^гццгййз растет

«

шигювохогвоЁ aooseacassenajoosa cspuaraíC о&зста I^G нро~ аака к чалаки«, - B-Css г P-5I cuoctsSsa. cyaapcaca-

Дйшяалрасжгл Og. Пгютд P-Ala кааон этой споссбиости.

S* Споосйьссхь к взавг;одвеогв£чЭ о Og у «оогсдовсявйзс слагсйЗЕгазуе» зсаяоаг os состояния их агрзгировшио<яа и наличия в ссстаьа a^nuvr» остатка цисаоиза. Наисодьайй skïebho-стьв а тгерахвето обладай? агрегата поятзда ?~€уг( анмгача-одие ара&пояс гагелъао 3-4 дилера аеагада.

3. Активность агрегатов пептида P-Cys обратно зависит уг присутствия ионов Zri1*4", утрачивается после прогревания ipa 56°0 или после обработки уксусной кислотой.

4. Пепсиновый F(aB>2 фрагмент It£I кролика, з отличие от

i алейнового Ров фрагмента, обладает, подобно свойством не- • захватывать 0^.

5. Олигопептида из шарнирной области IgC способны взаимодействовать с IcG, Р{ав'^-фрагмонтом, гомореадаантом (пепсяно-¡ьм агглютинатбром).

6. Взаимодействие изученных одиголептидов о Р(ав>2 ¡рагментами, гомореактантам и Р-белкамч выражается в модулиро-ании активности указанных белков в перехвате Og*

Список работ, опубликованных по теш диссертации:

1. Оганяа P.P., Иергуляс Г.У., Бэртовз Л.М., Бабаева S.S. пализ вдталатических'характеристик Р-белков и гсмораактакта / овыэ метода прсгноза Еатологическогэ процзсса: Тезис« докла-оз Всесоюзного симпозиума. - Курск, IS9I, с.7-8. '

2. Оганян P.P., Бзртова Л.М., Кулхберг А.Я. Различие ката-цтичвскнх характеристик F( gd)0 я Раз-Фйгчоягсв luü. - Tea.

Л " <Л>

съезда иммунологов России. - Новосибирск, IS32, с.340.

3. Кульбзрг Л.Я., Оганян P.F., Шабаез З.А. Утилизация адикалов кислорода синтетическими цродян-бсгатше олйгошнгсм-:ма. - Биохимия, 1292, вап.П, c,I745rI749