Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Выделение и некоторые свойства рецепторов тимоцитов, ответственных за розеткообразование и связывание JgG

Актуальность проблемы. Иммуноглобулины играют многогранную роль в иммунном ответе. Помимо антигенсвязывающих свойств они обладают также эффекторными и регуляторными свойствами.

Установлено, что специфическое связывание антигенов осуществляется активными центрами антител, сформированными ЛГ-концевыми участками полипептидных цепей /тяжелой и легкой/, относящимися к фрагментам молекулы иммуноглобулина.

Активация системы комплемента, фиксация на плазматических мембранах клеток, проникновение через различные физиологические барьеры осуществляется определенными участками Тс фрагмента иммуноглобулинов, сформированными только тяжелыми полипептидными цепями.

Считают, что связывание иммуноглобулинов с В и некоторыми Т лимфоцитами, макрофагами и моноцитами мояет играть существенную роль в регуляции иммунитета.

Иммуноглобулины могут присоединяться к лимфоцитам, несущим на своей поверхности специальный рецептор /9с Л / и активировать их. В частности, агрегированные нагреванием определенных субклассов способны стимулировать пролиферацию лимфоцитов селезенки А9/.

Отделимые рецепторные факторы лимфоцитов, например иммуногло-булинсвязывающий фактор и некоторые супрессорные факторы, отделяемые активированными лимфоцитами, способны связываться с , и по мнению некоторых авторов, представляют собой растворимую форму рецептора к 7с фрагменту иммуноглобулинов /57, 68, 69/.

Рецепторы к 7с фрагменту иммуноглобулинов обнаружены на поверхности как В, так и Т лимфоцитов /25/. Наряду с рецепторами к 5с фрагменту, на поверхности Т лимфоцитов обнаружены рецепторы

- zf к фрагментам иммуноглобулинов /81/.

Таким образом, способность иммуноглобулинов присоединяться к Т лимфоцитам может быть обусловлена особенностями строения как *ЗаЕ , так и Ус фрагментами Jg . Остается, однако, неясным: связана ли она со специфическими функциями этих фрагментов иммуноглобулинов, имеет ли значение антительная или комплементсвязывающая активность ^/g для присоединения их к Т лимфоцитам.

Цель работы заключалась в том, чтобы выяснить, имеет ли значение антительная и комплементсвязывающая активность для взаимодействия их с плазматической мембраной тимоцитов.

Для изучения этого вопроса необходимо модифицировать молекулу С/^/г таким образом, чтобы при устранении антительной активности и способности связывать комплемент все пептидные связи сохранились.

В качестве способа модификации может быть использован метод фотоокисления. Этот метод имеет то преимущество, что под влиянием фотооки'сления в присутствии фотосенсибилизатора разрушаются боковые радикалы определенных ароматических аминокислот /тирозина, триптофана, фенилаланина/, в то время как пепетидные связи остаются неповрежденными. В зависимости от продолжительности фотоокисления может быть разрушено лишь ограниченное количество упомянутых боковых радикалов. Поскольку пространственная конфигурация белков в водных растворах поддерживается нековалентными взаимодействиями боковых радикалов аминокислот, в том числе гидрофобными, и это в равной мере относится к иммуноглобулинам, фотоокисление может быть использовано для лишения иммуноглобулинов их ан-тигенсвязывающих свойств в мягких условиях, исключающих повреждение пептидных связей, если гидрофобные взаимодействия действительно играют существенную роль в формировании активного центра антител.

Представляет также существенный интерес значение боковых радикалов аминокислот для антигенных свойств , а также для изучения их роли в связывании комплемента.

В настоящей работе изучено взаимодействие модифицированного фотоокислением в присутствии фотосенсибилизатора /г кролика с компонентами плазматических мембран тимоцитов крысы, обладающих сродством к Jj) (г кролика, а также к аутологичным эритроцитам и эритроцитам барана.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе ло-\ казано, что адсорбцией на иммобилизированном могут быть отделены фрагменты плазматическом мембраны тимоцитов, обладающие сродством как к эритроцитам, так и к 5с и 7q% фрагментам ^gtr • В состав этих фрагментов входит гликопротеин с молекулярным весом 12 тысяч, обладающий свойствами рецептора. Этот гликопротеин характеризуется тем, что обнаруживает сродство к аутологичным и гетерологичным эритроцитам.

Показано, что способность связывать антиген и комплемент не существенная для взаимодействия ^ с плазматической мембраной тимоцитов, так как иммуноглобулины, лишенные обеих этих функций путем фотоокисления, связываются с фрагментами мембран тимоцитов, обладающими свойствами 7с рецептора.

Выяснено, что с помощью весьма несложной обработки фотосенсибилизатором, Зу (г может быть модифицирован таким образом, что его антигенсвязывающие свойства сохранятся при значительном снижении комплементсвязывающей способности и частичной потере антигенных свойств. Это обстоятельство может существенно расширить сферу применения антител в медицинской практике, так как позволяет применять более высокие концентрации иммуноглобулинов, чем это было допустимо ранее.

Принятые сокращения:

Jg - иммуноглобулины

УФ - ультрафиолетовые

КМ - карбоксиметил

ЭБ - эритроциты барана рецептор к 7с фрагменту иммуноглобулинов

АОК - антителообразущие клетки

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

I. В результате фотоокисления антител в присутствии метиленового синего при условии разрушения Чв% триптофана, 30% тирозина, 42% фенилаланина, антигеневязывающая активность, определяемая методом пассивной гемагглютинации, полностью теряется.

3. Инкубация раствора антител с метиленовым синим в темноте приводит к разрушению ароматических аминокислотных остатков, не снижает антигенсвязывающую активность, однако существенно уменьшает комплементевязывающую способность.

4. Выделены фрагменты плазматической мембраны тимоцитов, обладающие сродством к ^^ кролика и эритроцитам барана. Эти фрагменты восстанавливают способность к розеткообразованию с аутологичными эритроцитами у тимоцитов, лишённых соответствующих рецепторов при нагревании в изотонической среде.

5. В состав фрагментов плазматических мембран тимоцитов, связывающих и эритроциты барана, входит низкомолекулярный глико-протеин, обладающий свойствами Fc-рецептора и сродством к аутологич-ным эритроцитам и эритроцитам барана.

6. Взаимодействие иммуноглобулинов (Р с фрагментами плазматических мембран тимоцитов не зависит от комплементсвязывающих и антительных свойств 7

7. Часть рецепторов, ответственных за аутологичное розеткообра-зование адсорбируется только на нативном Jtffivi не адсорбируется на

2. При фотоокислении теряет комплементсвязывающую активv ность. модифицированном фотоокислением.

ЗАКЛЮЧЕН И Е

В настоящее время не существует единого мнения о числе рецепторов для иммуноглобулинов на поверхности Т лимфоцитов, равно как и единого мнения о функции этих рецепторов.

Обнаружение рецептора к Рс-фрагменту Уд tr ъ подавляющем большинстве случаев основано на розеточном тесте /129, 58/. При таком подходе Т лимфоциты взаимодействуют с эритроцитами, обработанными $Cj(r -антителами, образуя розетки, и на этом основании делается заключение, что взаимодействие Т лимфоцита с эритроцитом осуществляется с помощью специальных рецепторов для Fc фрагмента . Это обычно подтверждается тем, что Fc фрагмент тормозит реакцию розеткообразования /58/.

Представления о функции этих рецепторов возникли в связи с обнаружением растворимых рецепторов к Fc фрагменту £ , например иммуноглобулинсвязывающего фактора /68, 69/, который выполняет су-прессорную функцию. Не менее интересны данные, что Т лимфоциты, содержащие 3-е. R-у , являются предшественниками Т лимфоцитов, содержащих и секретирующих супрессорные факторы, обладающие сродством к Fc фрагменту ^ £ / /145, 147, 148/.

Кроме того выяснилось, что аггрегированный человека способен тормозить реакцию бласттрансформации в смешанной культуре лимфоцитов и если удалить клетки, несущие /€ , из числа стимулирующих клеток, тормозящее действие отменяется /101/.

На этом основании можно заключить, что Fc рецептор играет существенную роль в индукции бласттрансформации в смешанной культуре лимфоцитов.

Принято считать, что рецептор к Fc фрагменту возникает только на активированных Т лимфоцитах /85/.

К FcR+ Т лимфоцитам относятся Т клетки суирессоры, клетки, реагирующие в смешанной культуре против сенсибилизированных антителами аллогенных клеток мишеней. К ним также относятся Т клетки, активируемые конканавалином А /79/.

То, что клетки супрессоры относятся к РСй!" Т лимфоцитам подтверждено не всеми авторами. Существуют данные о том, что среди FcR1" Т лимфоцитов нет клеток супрессоров /128/. Тем не менее наличие FcR у клеток супрессоров сомнений не вызывает, так как удалось выделить из Т клеток растворимый FcR, обладающий супрес-сорным действием /68, 146, 147, 148/.

К FcR" тимоцитам относятся Т клетки хелперы, а также клетки, реагирующие в смешанной культуре против аллогенных клеток мишеней, и клетки, активируемые фитогемагглютинином /79, 25, 74/.

Остается неясным, представляют ли FcR^ и FcR" лимфоциты две различные линии, или одна из них может оказаться предшественницей другой.

Известно, что взаимодействие Т лимфоцитов киллеров с клетками мишенями осуществляется не только благодаря наличию специфических рецепторов на поверхности Т лимфоцитов. Для развития цитотоксичес-кой реакции необходимо прочное присоединение лимфоцитов к клеткам мишеням /136/.

Таким образом, специфическое распознавание антигенов необходимо, но недостаточно для развития цитотоксической реакции.

Очевидно, существенная роль принадлежит также и другим структурам с менее выраженной специфичностью. В частности это относится и к Рс-рецептору, что подтверждается экспериментальными данными. Аггрегированный rfflG- человека тормозит активность как стимулирующих, так и отвечающих клеток в смешанной культуре лимфоцитов /Ю1/. Антитела против j/fl, -антигенов также подавляют стимулирующую активность лимфоцитов. Это относится и к антителам против

-микроглобулинов. Согласно /139/, эти результаты свидетельств уют о тесной связи между рецепторами, через которые происходит стимуляция в LILCj. Fc-рецептором и За. -подобным антигеном. Отсюда следует, что мембранным структурам Т лимфоцитов, обладающим сродством к Уд (г принадлежит существенная роль в реакциях бласттрансформации, цитотоксичности и, возможно, клеточной кооперации. Взаимодействие Уд с лимфоцитами может осуществляться как через Fas, так и через Fc фрагмент. Гоффман и соавторы обнаружили, что в составе рецепторов Т лимфоцитов содержится рецептор к Бав фрагменту /81/. Однако не ясно, зависит ли взаимодействие JgG с лимфоцитами от способности Рав-фрагмента связывать антиген и от свойства Fc-фрагмента активировать комплемент.

Для исследования взаимодействия У$(г с фрагментами мембран Т лимфоцитов нами был разработан способ их выделения, который заключался в инкубации тимоцитов с иммобилизированным и последующим разрушении клеток, отмывании не связавшегося материала и элюировании связавшихся структур в кислой зоне рН.

Выделенная таким способом структура обладает сродством не только к Удв- , но и к эритроцитам барана. Установлено, что она представляет собой сложный аггрегат молекул, который диссоциирует на отдельные компоненты в присутствии ионного детергента - до-децилсулыоата Я(Х /50, 51/.

Эта структура относится к плазматической мембране Т лимфоцитов в силу таких соображений:

I. Она входит в состав рецепторов, ответственных за взаимодействие с аутологичными эритроцитами в реакции розеткообразова-ния.

Как известно, рецепторы, ответственные за розеткообразование, могут быть отделены от Т лимфоцитов нагреванием в среде Хенкса при 45°С в течение I часа без серьезного повреждения плазматической мембраны. Это было показано iTLencfed и соавторами /98/ на лимфоцитах периферической крови человека.

Оказалось, что при таком нагревании I лимфоциты сохраняют жизнеспособность, по данным исключения красителя, однако не образуют Е розеток. Добавление надосадочной жидкости, полученной от прогретых лимфоцитов, восстанавливает эту способность. При прогревании тимоцитов, последние также теряют способность к аутоло-гичному розеткообразованию. Эта способность восстанавливается после добавления надосадочной жидкости, полученной от прогретых тимоцитов. Из надосадочной жидкости методом сорбции на целлюлозе была выделена структура, агглютинирующая аутологичные эритроциты и эритроциты барана. Эта структура, по данным электрофореза в полиакриламидном геле, не отличается от таковой, полученной методом прямой инкубации тимоцитов с иммобилизированным /2/. По видимому, рецепторы к Fc-фрагменту могут быть отделены от Т лимфоцитов при их нагревании в среде Хенкса при 45°С в течение I часа.

Известно также, что растворимые формы Fc-рецептора могут отделяться Т лимфоцитами при культивировании их в изотонических средах при 37°С /68, 77/. Кроме того, существуют косвенные данные о пространственной связи рецепторов, ответственных за распознавание аутологичных и аллогенных клеток, с рецепторами к Fc-фрагменту

Поскольку не менее 95 % тимоцитов остаются жизнеспособными после прогревания, по данным исключения красителя, есть основания считать, что прогревание в указанных условиях не приводит к сколько-нибудь серьезному повреждению мембраны. Поэтому агглютинирующая эритроциты структура, скорее всего, слущивается с поверхности клетки, а не выделяется из цитоплазмы.

2. Структура, взаимодействующая с Jfj& и эритроцитами барана, содержится в препаратах мембран тимоцитов, выделенных с помощью сага розного градиента по Корнфельд и Симерс /88/. В таких препаратах лимфоцитов, по данным электронной микроскопии, содержатся все визикулярные структуры плазматической мембраны лимфоцитов /88/.

Эта структура была выделена из препаратов мембран с помощью сорбции на иммобилизированном С^ (г .

3. Не менее важным аргументом в пользу принадлежности агглютинирующей структуры к плазматической мембране Т лимфоцитов служит то обстоятельство, что в составе агглютинирующей структуры тимоцитов содержится антиген, который зкспрессирован на плазматической мембране многих Т лимфоцитов.

Взаимодействие выделенной нами структуры с эритроцитами могло быть обусловлено другим рецептором, отличным от рецептора, взаимодействующего с . Однако, дальнейшее изучение взаимодействия структуры с эритроцитами барана с помощью реакции гемагглютинации показало, что именно tfflG' блокирует способность этой структуры связываться с эритроцитами. Это позволяет считать, что сродство мембранной структуры тимоцитов к эритроцитам и обусловлено одним и тем же соединением.

С другой стороны, торможение агглютинации эритроцитов барана или аутологичных эритроцитов, вызванное изучаемой структурой, может быть связано с небольшой примесью других белков в составе сывороточного иммуноглобулина. Чтобы оценить такую возможность, для торможения агглютинации эритроцитов крысы агглютинирующей структурой использовали антитела против эритроцитов барана, очищенные методом аффинной хроматографии. При этом установлено, что способность тормозить агглютинацию устраняется после удаления антител адсорбцией эритроцитами барана.

Таким образом, сродство агглютинирующей структуры именно к иммуноглобулинам не вызывает сомнений.

Торможение реакции агглютинации, вызванной мембранной структу

- 99 рой, с помощью , обусловлено преимущественно свойствами Fcфрагмента . Это показано в реакции торможения агглютинации Fc-фрагментом кролика.

Рав и Fc фрагменты кролика были получены путем обработки папаином и разделены методом хроматографии на 1Ш-сефадек-се. При этом выяснилось, что агглютинация, вызванная агглютинирующей структурой тимоцитов, одинаково тормозится Рав и Рс фрагментами.

В том случае, когда для агглютинации используется очищенное агглютинирующее вещество, Fc фрагмент тормозит агглютинацию в меньшей концентрации, чем Рав фрагмент и нативный , т.е. очищенное вещество мембранной структуры тимоцитов обладает большим сродством к Рс фрагменту, чем к Рав фрагменту. По-видимому, очищенное агглютинирующее вещество представляет собой один из Рс рецепторов плазматической мембраны тимоцитов.

Учитывая то обстоятельство, что агглютинирующая структура ге-терогенна, можно допустить, что в ее составе содержится не только рецептор к Рс фрагменту, но и к Рав фрагменту .

Сродство очищенного агглютинирующего вещества равно как и агглютинирующей структуры тимоцитов к Уд G- не зависит от способности связывать комплемент и антиген. Это установлено с помощью применения для торможения реакции агглютинации модифицированного . Поскольку известно, что пространственная конфигурация активного центра антител поддерживается нековалентными, в том числе гидрофобными связями, можно было ожидать, что разрушение ароматических радикалов аминокислот, входящих в состав , приведет к устранению антигенсвязывающих свойств. При этом молекулярный вес не изменяется и его пептидные связи не разрушаются. Потеря иммуноглобулинами антигенсвязывающих свойств при фотоокислении, в избранных нами условиях, была подтверждена на припере антител против альбумина, выделенных методом иммуносорбции.

Фотоокисление в видимой области света в присутствии фотосенсибилизатора дает несколько иной результат, чем окисление ароматических боковых радикалов с помощью бромсукцинимида /49/ и отличается также от фотоокисления в УФ области /280 нм/ /132/. Установлено, что остатки триптофана, принадлежащие активному центру на-тивной молекулы антитела, мало доступны химической модификации /49/. Окисление остатков триптофана бромсукцинимидом в водно-солевых растворах не происходит, и иммуноглобулины не теряют антиген-связывающей активности. Остатки триптофана становятся доступными окислению Л -бромсукцинимидом лишь в присутствии денатурирующего агента /9М мочевины/ и такая химическая модификация остатков триптофана в присутствии мочевины приводит к потере антигенсвязывающих свойств. Этот результат свидетельствует о важно!'! роли аминокислотных остатков триптофана в построении активного центра антител, а также о том, что необходимые для стабилизации пространственной конфигурации активного центра антител остатки триптофана находятся в гидрофобном окружении и их контакт с полярными молекулами растворителя ограничен.

Избирательное разрушение аминокислотных остатков триптофана достигалось также облучением раствора антител монохроматическим УФ светом с длиной волны 280 нм /132/. При этом разрушаются не только аминокислотные остатки, которые доступны растворителю.

Применение фотосенсибилизатора и облучение в видимой области приводит к фотоокислению аминокислотных остатков, доступных растворителю и фотосенсибилизатору. Остальные ароматические аминокислотные остатки не должны разрушаться, так как раствор иммуноглобулина не поглощает свет в видимой области. Фотоокисление в этих условиях не приводит к полному разрушению боковых радикалов ароматических аминокислот. Однако, этих сравнительно небольших повреждений достаточно для полной потери не только антигенсвязывающих свойств иммуноглобулинов, по данным реакции пассивной гемагглютинации, но и их способности связывать комплемент.

Фотоокислеиные иммуноглобулины не теряют способности взаимодействовать с мембранной структурой Т лимфоцитов. Более того, после фотоокисления сродство С1(}(г к агглютинирующей структуре возрастает. Возможно, что в результате фотоокисления углеводные остатки, входящие в состав tyfi' , легче взаимодействуют с Рс рецептором в результате перестройки молекулы Cfgtr .

Потеря комплементсвязывающих свойств иммуноглобулинами при фотоокислении, по-видимому, не связана с разрушением боковых радикалов ароматических аминокислот, так как для значительного снижения комплементсвязывающей активности достаточно инкубации иммуноглобулина с фотосенсибилизатором в темноте.

Известно, что восстановление единственной дисульфидной связи в шарнирной области молекулы -антител кролика оказывает существенное влияние на реализацию эффекторных функций антител при взаимодействии с антигеном. Активность антител в реакции связывания комплемента снижается на 40 /Ь, а в реакциях прямой и обратной кожной анафилаксии - соответственно на 60 % и 70 %, Изменения антигенсвязывающих свойств восстановленных антител в реакции пассивной гемагглютинации не наблюдали /39/.

При фотоокислении антигенные свойства изменяются мало, поэтому можно предположить, что для взаимодействия иммуноглобулинов с мембраной Т лимфоцитов остается достаточно неповрежденных детерминант.

Очевидно боковые ароматические радикалы аминокислот Fc и FaB фрагментов [ffl (г не играют роли при взаимодействии этих фрагментов с агглютинирующей структурой. В реакции торможения агглютинации выяснилось, что фотоокислеиные фрагменты способны тормозить реакцию агглютинации бараньих эритроцитов как очищенным агглютинирующим веществом, так и агглютинирующей структурой тимоцитов в наименьшей концентрации по сравнению с интактными фрагментами.

Восстановление розеткообразования после добавления к прогретым и отмытым тимоцитам агглютинирующей рецепторной структуры, сорбируемой на иммобилизированном Уд (г , свидетельствует о том, что Уд 0- способен связывать рецепторы, обладающие сродством к эритроцитам.

Ранее было показано, что это относится как к аутологичным, так и к ксеногенным эритроцитам. Можно предположить, что в состав структуры, сорбируемой на Уд (г , входят различные рецепторы, не-ковалентно связанные между собой. Однако, восстановление розеткообразования очищенным гликопротеином и торможение агглютинации, вызванной им, Рс фрагментом Уд(г свидетельствует о том, что сродством к Уд (г и эритроцитам обладает одно и то же соединение.

Таким образом, по крайней мере один из рецепторов, обладающий свойствами Fc рецептора, способен связываться с эритроцитами. Этот рецептор обнаружен в мембранах тимоцитов, а также в составе рецепторов, ответственных за розеткообразование и отделяемых от тимоцитов при нагревании.

Существование такого рецептора косвенно подтверждается данными*^ ^oct Сх,£6. t которые наблюдали торможение розеткообразования Т лимуоцптани, присоедшшвш-пп агрегированный С^ С/58/.

Агглютинирующая структура тимоцитов содержит также специфические рецепторы, способные взаимодействовать лишь с определенными участками . Это утверждение основано на том, что кролика, подвергнутый фотоокислению, сорбирует с поверхности тимоцитов агглютинирующую структуру, способность которой восстанавливать розеткообразование значительно меньше, чем у агглютинирующей

- 103 структуры, сорбируемой неизмененным иммобилизированным .

Процессы распознавания антигенов и активирования лимфоцитов, согласно современным представлениям, разобщены во времени. Активация лимфоцитов осуществляется, по-видимому, в обход антигенрас-познающих рецепторов. Как известно, Т-клеточные митогены могут вызывать поликлональную активацию Т лимфоцитов /119/. Вместе с тем, при воздействии антигенов активируются лишь те клоны, которые специфически связались с антигеном. Распознавание чужеродного антигена, например вируса, Т клетками возможно только тогда, когда чужеродный антиген связан с аутологичным, иными словами чужеродный антиген разпознается Т клетками лишь в "контексте" своих. По-видимому, для распознавания антигенов и активации Т лимфоцитов важное значение имеет пространственное взаимоотношение рецепторов, распознающих антиген и передающих активирующий сигнал.

Именно эта область остается в настоящее время наименее изученной.

Представленные выше данные позволяют утверждать, что рецепторы, распознающие аутологичные клетки и, по-видимому, ответственные за ристрикцию, пространственно связаны с Рс£, через который происходит активация лимфоцитов.

Для понимания молекулярных механизмов активации клона и его селекции, взаимоотношение распознающих и активирующих рецепторов играет решающую роль, так как взаимодействие именно этих рецепторов предшествует всем последующим событиям, связанным с антигенной стимуляцией. По-видимому, пространственная связь FcR и рецепторов, ответственных за аутологичное распознавание, не случайна и свидетельствует о том, что в ходе взаимодействия с антигеном активироваться могут те лимфоциты, которые способны распознавать аутологичные антигены, удовлетворяя требованию ристрикции по аутологичным антигенам, например антигенам главного комплекса гистосовмес

- 104 тимости или другим антигенам.

- lUi)