Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Выявление врожденной недостаточности аденилсукцитат лиазы у детей группы риска

г Г и ОЛ О г ИЮН 1997

На правах рукописи

Руднев Анатолий Юрьевич

ВЫЯВЛЕНИЕ БРОШЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ АДЕНИЛОСУКЦИНАТ ЛИАЗЫ Я ДЕТЕЙ ГРНППН РИСКА

14.00.09 - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских нацк

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена на кафедре детских болезней N.3 Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической

Медицинской Академии

Научные руководители: доктор медицинских наук,профессор,засл.деятель науки РФ И.М.Воронцов доктор медицинских наук,профессор,член-корр. Щ В1 Л.А.Данилова

Научный консультант: доктор медицинских наук,профессор Б.И.Гузева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л.В.Зрман доктор медицинских наук, профессор В.Л.Пайков

Ведущее учревдение: Санкт-Петербургский Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова

Защита диссертации состоится "____".........199? г. в "____" час.

на заседании специализированного ученого совета Д.084.12.01 Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической Медицинской Академии (194100 г. С.-Петербург, ул.Литовская,д.2). С диссертацией мояно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Академии (С.-Петербург, ул.Кантемировская, д.16).

Автореферат разослан "____"...........199?

Учений секретарь специализированного ученого совета кандидат медицинских наук,доцент

В.Л.Лисс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

йктнальность темы. Одной из актуальных проблем современной педиатрии является клиническая верификация наследственных нарушений обмена. Однако,« сояалению,диагностика наследственных нарушений обмена обычно затруднительна вследствие того,что многие из них имеют неспецифические признаки и симптомы; метаболический ацидоз, судороги, задеряку психомоторного развития, пирамидную недостаточность, гепатомегалию и т.д. Часто отмечаются затруднения в проведении дифференциального диагноза с заболеваниями других подгрупп. Несмотря на то,что к настоящему времени описано более тысячи нозологических форм наследственных нарушений обмена, существует больное числа детей с ^верифицированной "универсальной" нозологией: органическое пораяение головного мозга,умственная отсталость неясного генеза, кардиомиопатия и т. д. Такяе известно, что под "маской" так называемого неонатального сепсиса моает "скрываться" по меньшей мере 20 нозологических форм наследственных нарушений обмена, большинство из которых невозможно диагностировать без дорогостоящего хроиатографического анализа органических кислот (Cohn R. М., Roth К.,1983).

Настоящая работа посвящена изучению одного из таких заболе-ваний-врожденной недостаточности аденилосукцинат лиазы (ASL). ASL катализирует две реакции биосинтеза пуриновых нуклеотидов: образование аминоимидазолкарбоксамид риботида (AICAR) из сукцинилами-ноимидазолкарбоксамид CSAICA) риботида,а такве аденозин монофосФата (AMP) из аденилосукцината (S-ftMP). Заболевание, связанное с недостаточностью ASL, описано в 1984 г. СЗаекеп 3.,Uan den Berghe 6.,1984),является аутосомно-рецессивным дефектом биосинтеза пуринов de novo у человека (Заекеп 3. et al., 1988),характеризуется накоплением двух нуклеозидов - SftlCft riboside и сукцинил аденози-

на (Б-Ас1о) в ликворе, плазме и моче. В каибольией концентрации зти соединения обнаруниваются в моче (Лаекеп 5.еЪ а!.,1988).

Клиническая картина недостаточности включает грубую задержку психо-моторного развития,признаки аутизма,эпилептический синдром,пирамидную, экстрапирамиднув и моз1ечковую симптоматику (Лаекеп Л. е1 а!., 1988),В настоящее время выделено 4 клинических варианта заболевания, что указывает на клиническую гетерогенность недостаточности ЙБЬ.Б отечественной литературе заболевание до последнего времени не нанло отражения. В зарубежной литературе описано 25 больных с А5Ь недостаточностью (Лаекеп Л,,иап йеп ВегеПе 6.,1984;Вгее Р.К. е1 а1.,1986^оезе1 Я. е1 а1,,198б: Лаекеп Л.еЬ а1.,1988;иап <1еп ВегвЬ Р. е1 а1.,1991;5а1егпо С. е1 а1. ,1993; Кг13Ъ З.вЪ а1.,1994: УаИк В. et а1..1996).

Все известные на сегодняшний день методы диагностики врожденной недостаточности ЙБЬ основаны на обнаружении обоих вышеупомянутых нуклеозидов или одного из них в иоче (высокоэффективная жидкостная хроматография,автоматизированная ионная хроматогра-фия,метод,основанный на реакции Браттона-Мариалла и тонкослойная хроматография).Однако,при данных методах используется дорогостоящее оборудование,либо они не является экспресс-методами.Поиску и разработке эффективного экспресс-метода диагностики врожденной недостаточности А51 посвящена большая часть настоящей диссертационной работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: оптимизация выявления заболевания в контингенте детей группы риска по недостаточности аденилосукцинат лиазы.

1. Выделить группу риска по врожденной недостаточности ЙЗЬ.

2. Разработать зкспресс-метод выявления АБЬ недостаточности.

3. Провести селективный скрининг детей группы риска по врожденной недостаточности аденилосукцинат лиазы.

4.Провести оценку разработанного метода выявления А51 недос-

s

таточности.

НАНЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТ« .йпепнне на территории Российской Федерации проведен селективный скрининг по выявлении врояденной недостаточности ASL а детей группы риска.Разработан метод для проведения экспресс-диагностики заболевания. Выявлено новое свойство сукцинил аденозина,заключающееся в его сорбции на катионите Dowex 50.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.Разработанный метод позволяет проводить селективный скрининг по выявлению ASL недостаточности.В ходе апробации метода показано высокое значение показателя эффективность/стоимость.

АПРОБАЦИЯ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ.Птдяльнир полонения работы представлялись и докладывались на 8-и съезде невропатологов, психиатров и наркологов УССР С Харьков.1990 г.),на Всесоюзной конференции "Дайникавские чтения'ЧЛенинград,1991),на 2-й Всесоюзной конференции "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии'ЧСамарканд,1991),на Международной Симпозиуме "Inherited Metabolic Diseases and the Brain"(Leuven,Belgiua,1992),Ha Международной Симпозиуме "Treatment and Outcoae" (Edinburgh. United Kingdoa,1994), на Международной Конференции"1пЬогп Errors of Metabolisi"CCardiff.United Kingdon,1936). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ,3 рационализаторских предложения по данной теме утверждены Советом ВОИР ЛПМИ.

ПОЛОЖЕНИЯ.ВЫНОСИМЫЕ НА ЗА1ИТН

1.Контингент группы риска для проведения селективного скрининга с целью выявления врояденной ASL недостаточности составляют дети с задержкой психо-моторного развития, эпилептическим синдромом, аутизмом, пирамидной недостаточности, мылечной гипотонией и микроцефалией.

2.3кспресс-метод,основанный на спектрофотометрическом исследовании мочи рекомендуется для первого этапа выявления ASL недос-

гаточности в группах риска.

шжта. ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 95 страницах машинописного текста,состоит из введения, трех глав, выводов и практических рекомендаций; со-дернит 9 таблиц,19 рисунков. Список литературы включает 60 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В основу работы полонен селективный скрининг детей по выявлении врожденной недостаточности на территории Российской Федерации С Севера - Западный регион: Санкт-Петербург, Ленинградская область. Псковская, Новгородская и Вологодская области; Балтийский регион- Калининградская область).Протестированы образцы мочи, взятые у 2 056 детей возрастного диапазона от 3 месяцев до 15-лет. Возрастная группа 3-11 месяцев включала 606 детей, 1 год -5 лет И мес. -1268 и 6 -15 лет -182 ребенка. В исследуемой группе диагнозы распределялись следующим образом: "задержка психо-мо-торного развития.перинатальная энцефалопатия", "умственная отсталость неясного генеза", "детский церебральный паралич", "эпилептический синдром". Распределение обследованных детей по возрасту показано в таблице 1.

Клиническая симптоматика больных,составлявиих исследуемую группу включала грубую задержку психического развития, задержку развития речи,пирамидную (спастическая теми-, тетра-, диплегия), экстрапирамидную (хореоатетоз,мыиечная гипотония) симптоматику, мозжечковую симптоматику (мышечная гипотония, интенционный тремор), полиморфные судорожные припадки, признаки аутизма.

Учитывая цель и задачи данной работы,нами были выделены три

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕТЕЙ ИССЛЕДУЕМОЙ ГРУППЫ

ПО ВОЗРАСТУ

Таблица{

ВИДЫ ПАТОЛОГИИ ВОЗРАСТ

0-11 мес.29 дней 1 год-5 лет 11 мес. 6 лет-15 лет 11мес

п % п % п %

Перинаталь -пая энцефало-патия,задерж-ка психо -моторного развития 606 100 104 8 - -

Умственная отсталость неясного генеза - - 543 43 112 62

Детский церебральный паралич и другие органические поражения головного мозга - - 565 45 64 35

Эпилептиче- ский синдром - - 56 4 6 3

Итого: 606 100 1268 100 182 100

контрольные группы.

Первую контрольную группу составили 872 ребенка,госпитализированных в клинику пропедевтики детских болезней, обследовавшихся в стационаре кратковременного пребывания консультативно-диагностического центра Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической Медицинской Академии,а такие дети, обследованные в аллерголо-гическом и кардиоревматологическом отделениях детской городской больницы N.2.Данная группа далее обозначается как группа "здоровых детей". В этой группе была выделена подгруппа А,в которую входило 300 детей,получавших различную фармакологическую терапию: 150 детей, которые получали антибактериальные препараты С бензил-пенициллин ,ампициллин,оксациллин,эритромицин,гентамицин,левомице-тин,цефазолин,бактрим), 50 детей, получавиих нестероидные противовоспалительные препараты (ацетилсалициловая кислота,бруфен, парацетамол) и 100 детей, получавших противосудорокную терапию (фенобарбитал, дифенин.финлепсин.бензонал).

Во II группу включены здоровые дети, в мочу которых добавлялись SAICA riboside и S-Ado в различных концентрациях (п=152).

III группу составляли дети с верифицированной аденилосукци-нат лиазной недостаточностью (6 человек).

В поисках простого экспресс-метода выявления ASL недостаточности наше внимание привлек подготовительный этап, который использовался в одном из вышеперечисленных методов-тонкослойной хроматографии СТСХЗ для идентификации SAICA riboside (Hadman S.К.,Bree Р.К.et al.,1986),и,заключающийся в том,что образец мочи пропускают через катионит Dowex 50 в Н+ форме и,промыв колонку водой,получают материал для анализа в виде аммиачного элгаата (в оригинальной методике далее следует упаривание элюата в вакууме,растворение остатка в воде, двумерная ТСХ, проявление хрома-тограммы реактивом Паули и выявление на пластинке окрашенной зоны,соответствующей SAICA riboside).

Учитывая структурное сходство SAICA riboside и S-Ado,мы

предположили, что последний такие будет полностью сорбироваться на Понех 50 и затем элвироваться с него при промывке раствором 2 молярного аммиака, В экспериментах с синтезированными нами SAICA riboside и S-Ado это предположение полностью подтвердилось (Ла-зебник Т.А., Руднев А.Й.,Домкин В.Д.,1991). Далее, мы выяснили, что ультрафиолетовые спектры (УФС) SAICA riboside и S-Ado имеют практически совпадавшие максимумы поглощений, соответственно 26? и 268 нм (Carter С..Cohen L.,1956;Lukens L.. Buchanan J.M.,1959). Принимая во внимание известные из литературы значения молярных коэффициентов экстинкции SAICA riboside и S-Ado при этих длинах волн - 13 ООО (Lukens L.N.. Buchanan З.Н.,1959) и 19 200 (Carter С.,Cohen L,,1956),соответственно, и данные о концентрации этих нуклеозидов в моче больных с ASL недостаточностью 0.5-2.0 ммоль/л (Hadman S.K. et al.,1986 )Cсоотношение SAICA riboside/S-Ado обычно 1:2), мы оценили вклад поглощения нуклеозидов в области 267-268 нм при указанных концентрациях и пришли к выводу, что о присутствии этих веществ в моче можно было ба судить по УФС аммиачного злвата, получаемого так, как это указано выпе.

Статистическая обработка полученных данных,содержащихся в распределенных базах,управляемых программными средствами пакета DBASE 3PLUS, проводилась с использованием статистического программного пакета STATGRAPHICS 7.0.

2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сопоставляя ультрафиолетовые спектры аммиачных злшатов: -образцов мочи "здоровых детей" - этот термин применяется в данном случае для описания детей с нормальным уровнем активности А5Ь (группа в количестве 876 человек включала детей в возрасте 6 месяцев - 14 лет находившихся на обследовании в Клинической Больнице С-Петербургпкпй Государственной Педиатрической Медицинской

Рисунок! .Примеры УФС аммиачных элюатов

АвЬ недостаточность

нормальный уровень активности АвЬ

Академии, а такае детской городской больнице N.2);

-этих не образцов (п=152),в которые перед опытом были внесены SAICA riboside и S-Ado в разных концентрациях (средние конечные концентрации были соответственно t и 2 оМ/1);

-образцов мочи 6 детей с недостаточностью ASL (типичные НФС показаны на рисунке 1), мы пришли к закличении, что наилучшим критерием присутствия (отсутствия) SAICA riboside и S-Ado в иоче и,следовательно,критерием наличия ASL недостаточности могла бы слунить величина отношения поглощения аммиачного элшата при 270 нм(данная длина волны нами взята эмпирически и является ближайшей к максимуму в УФС обоих нуклеозидов) к поглощении злвата при 250 нм (длина волны,также была взята эмпирически и характеризует неспецифический подъем поглощения в этом регионе имевший место во всех анализируемых случаях - приблизительно 2500 образцах мочи, рисунок 1).

Описание метода: Приблизительно 1.0 ил мочи пропускают через колонку (0.7 см х 2.5 см) с Doaex 50 (100-200 меи) в Н+ форме; колонку промывают 10,0 мл воды и затем собирают элиат при промывке колонки 3.0 мл 2 М аммиака.После соответствующего разведения (обычно следует добавить 0,2-0.3 мл элюата к 2.5-3.0 мл воды)сни-мают НФС аммиачного элшата (контроль-вода; можно ограничиться измерением поглощений при 250 и 270 нм) и вычисляют отношение А2?0/А250-см.рисунок 1 (Руднев А.В.и соавг., 1991; Roudneff A.Yu. et al.,1992).

Значения отношения А270/А250 в НФС аммиачных элюатов при исследовании мочи здоровых детей располагались в интервале 0,25-0.45,причем в подавляющем большинстве случаев в интервале 0.31 - 0.39. В тех случаях, когда через Dowex 50 пропускали мочу здоровых детей с добавленными нуклеоэидами.либо производилось тестирование мочи детей с верифицированной недостаточностью ASL,эти значения попадали в интервал 0.7-1.02 (Руднев А.Ю..1991; Roudneff A.Yu. et al.,1992).

/£

Нами проведено исследование по изучению возмояного влияния различных фармакологических препаратов на НФС в регионе 250-300 нм.В ходе этого исследования мы определяли НФС аммиачных злюатов образцов мочи 150 детей, получавших антибактериальные препараты Сбензилпенициллин,ампициллин,оксациллин, эритромицин,гентами-цин,левомицетин,цефазолин,бактрим), 50 детей получавших нестероидные противовоспалительные препараты (парацетамол, ацетилсалициловая кислота,бруфен.вольтарен) и 100 детей,получавших противосу-доровную терапию (фенобарбитал,дифенин.финлепсин.бензонал).НФС в этих подгруппах были полностью идентичными спектрам группы здоровых детей (Roudneff A.Yu. et al.,1994).

Таким образом,значение отношения А270/А250 в НФС аммиачного элюата,полученного по приведенной выше методике,меньшее 0.45, свидетельствует о том,что у пациента активность ASL нормальная.Если ке значение этого отношения больше 0,70 ,то мовно достоверно утверадать.что в данном случае ASL либо совсем отсутствует,или ее активность значительно нияе нормы.В случае промеяуточ-ных значений следует проводить реакции Браттона-Маршалла на SAICA riboside (Bratton А.С., Marshall Е.К.,1939; Lalklnd Р.К. et al.,1986), либо идентифицировать последний с помощью одно- или двумерной ТСК (Jaeken 3. et al.,1988). Однако,такие ситуации являются крайне редкими (Лазебник Т.А., Руднев А.Ю., Домкин В.Д.,1991; Roudneff A. et al.,1992).

Для проведения статистической обработки полученных данных выделены три выборки:

1.Больные с недостаточностью ASL (п=6).

2.Здоровые дети,в мочу которых перед опытом добавлялись SAICA riboside и S-fldo в различных концентрациях(средние конечные концентрации были соответственно 1 шМ и 2 шМ) (п=152).

3.Здоровые дети (п=8?2).

Как видно,в данных выборках имеется неодинаковая размерность,в соответствии с чем, очевидна целесообразность применения

Рисунок 2. Графическое различие массивов А270/А250 1-й нЗ-ей выборок

Рисунок 3. Графическое различие массивов А270/А250 2-й и 3-ей выборок

Таблица 2.Сравнительная характеристика методов диагностики недостаточности А5Ь

Характеристика МЕТОДЫ

1 2 3

Авторы

de Bree P. Maddocks J. Руднев А.Ю. et al.,1986 et al.,1989 и соавт.,1992

Количество мочи,необходимое для анализа

10-20 мкл

1 мкл 10 мкл-1 мл

Использующееся

лабораторное

оборудование

Реагенты

оборудование для ТСХ

п-бутанол, уксусная кислота

зтил-ацегат

стандартный спектрофотометр

аммиак

Идентификация S-Ado

SAICA riboside

Длительность метола(в часах)

Стоимость тестирования одного образца/час (Британские фунты стерлингов)

0.11

0.23

0.5

0.09

непаракетрического критерия для их сравнения. С этой целью нами был выбран двусторонний непараметрический критерий Колмогоро-.ва-Смирнова (НККС). При сравнении 1-й и 3-ей выборки НККС составлял 4.6, что превышает теоретическое значение критерия - 2.65 (графическое изображение различий А2?0 / А250 в этих выборках показано на рисунке 2). В случае сравнения 2-й и 3-ей выборок НККС составлял 10.6 (что такие превышает 2.65).Графически различия этих массивов А2?0 / А250 показаны на рисунке 3).

Преимущества метода»описанного выше очевидна:

-Используется техника простого варианта колоночной хроматографии.

-Имеется возможность одновременного анализа большого количества образцов мочи.

-Для контроля поглощения элюатов необходим только стандартный спектрофотометр,обычно имеющийся в парке приборов клинических и биохимических лабораторий.

-В предложенном методе можно учесть оба накапливающихся в моче нуклеозида.

-Методика может быть модифицирована уменьшением (или соответственно увеличением) объема анализируемых образцов мочи,колонки и элвентов.

-Метод является классическим примером возможности использования "слепого выявления".

-Метод обладает высокой специфичностью (отсутствие ложно-отрицательных результатов).

Сравнительная характеристика предложенного метода диагностики недостаточности А5Ь с двумя другими часто использующимися методами,которые упомянуты выие,представлена в таблице 2.

ВЫВОДИ

1.Уточнены клинические критерии группы риска по врожденной недостаточности аденилосукцинат лиазы. К основный критериям относятся задеряка психо-моторного развития, полиморфные судорожные припадки, аутизм, к дополнительным - пирамидная недостаточность, мышечная гипотония,микроцефалия.

2.Разработан оригинальный и простой метод выявления недостаточности аденилосукцинат лиазы,основанный на исследовании ультрафиолетового спектра мочи.

3.На основании отсутствия лояно-отрицательных результатов и незначительного количества ложно-положительных реакций (0,14 У.) установлены высокие точность и специфичность метода выявления врожденной недостаточности аденилосукцинат лиазы.

4.Применение лекарственных препаратов (антибиотики,сульфаниламидные препараты, нестероидные противовоспалительные средства и противозпилептические препараты) не влияет на результаты разработанного метода выявления недостаточности аденилосукцинат лиазы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

{.Группу риска по врояденной недостаточности аденилосукцинат лиазы составляют дети с задержкой психо-моторного развития,эпилептическим синдромом, аутизмом,пирамидной недостаточностью, мышечной гипотонией и микроцефалией,

2.Для первого этапа выявления недостаточности аденилосукцинат лиазы в группах риска рекомендуется использовать разработанный экспресс-метод,

3.Предложенный метод адаптирован к практической медицине и может использоваться как в условиях биохимической лаборатории многопрофильной больницы,так и в амбулаторных условиях,

4.При наличии положительного результата с использованием, разработанного метода рекомендуется определение активности адени-

/сР

лосукцинат лиазы в эритроцитах.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1.Методы диагностики врожденного дефицита аденилсукциназы.//Ш1 съезд невропатологов, психиаторов и наркологов УССР: тезисы докладов,- Харьков, 1990,- С.384.Ссоавт,: Домкин В,Д..Лазебник Т.Д.)

2.Спектрофотоиетрия как основа нового метода диагностики врожденной аденилосукциназной энзимопатии.// Дойниковские чтения.-Д.:

- ВМА им. Кирова,1991.С.24-25. 3.0 новом методе диагностики врожденной аденилосукцинатлиазной энзимопатии.//Лабораторное дело. -1991. -N.9- С.26-29. (со-авт.: Домкин В.Д.,Лазебник Т.А.)

4.Метод диагностики врожденной аденилосукзиназной знзимопатии. // Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии,тезисы докладов, -М.: Мин-во Здравоохр. СССР, 1991. -С.166. Ссоавт,: Смирнов М.Н..Лазебник Т.А.,Домкин В.Д.)

5.А пен diagnostic technique for adenylosuccinase deficiency.// Annual Meeting of the SSIEM.- Leaven,Published by SSIEM.1992,-A.213.С co-authors DoHkin V.D..Lazebnik T.A.)

6.Spectrophotometry detection of Inherited adenylosuccinase deficiency.//Annual Meeting of the SSIEM.-Edinburgh,Published by SSIEM.1994. -АЛ86.(co-authors Doikin U.D..Lazebnik T.A.)

7.А пей diagnostic technique for adenylosuccinate lyase deficiency. // Journal of Inherited Metabolic Disease,1995. -Uol,18,H.3. -P.291-295.(co-authors Doakln U.D..Lazebnik T.A.,Smirnov M.N.)

8.Adenylosuccinate-lyase deficiency screening in the patients of high risk in Russia,//3ournal of Inherited Metabolic Disease, 1996. -Uol.19, Suppl.1.-P.12.(co-author Donkin U.D.)