Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Клиническая, гормональная и молекулярная характеристики различных форм врожденной дисфункции коры надпочечников

На правах рукописи

Калинченко Наталья Юрьевна

КЛИНИЧЕСКАЯ, ГОРМОНАЛЬНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ВРОЖДЕННОЙ ДИСФУНКЦИИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ

(14.00.03.-Эндокринология)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005г.

Работа выполнена в ГУ Эндокринологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук (директор - академик РАМН, профессор И.И.Дедов)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.А. Петеркова

Научный консультант-

доктор биологических наук, профессор П.М.Рубцов

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор В.В.Носиков

доктор медицинских наук, профессор Е.И.Марова

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «25» марта 2005г в 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.013.01 в ГУ Эндокринологического Научного Центра РАМН по адресу. 117036, Москва, ул. Дм.Ульянова,11

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ЭНЦ РАМН Автореферат разослан « » 2005г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Т В.Семичева

7 VО 33 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы:

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) занимает одно из лидирующих мест по частоте распространенности среди наследственных заболеваний. Одна из ее наиболее частых форм: дефицит 21-гидроксилазы встречается в среднем 1 случай на 1:10.000-15.000, достигая в отдельных этнических группах 1:128. Такая частота встречаемости ВДКН наряду с вариабельностью ее клинической картины - от острого надпочечникового криза в раннем перинатальном периоде и ложного гермафродитизма с ошибочным установлением паспортного пола до незначительного гирсутизма и дисменореи у девочек в подростковом возрасте - требует от современной эндокринологии усовершенствования методов диагностики заболевания.

В настоящее время принято выделять 6 вариантов ВДКН: 1) дефицит протеина (липоидная гиперплазия надпочечников, синдром Прадера); 2) дефицит Зй-стероиддегидрогеназы, 3) дефицит 17-а-гидроксилазыЛ7,20-лиазы [Р450с17] (синдром Беглиери); 4) дефицит 21-гидроксилазы [Р450с21]; 5) дефицит 11-11 -гидроксилазы [Р450с11]; и 6) дефицит Р450 оксидоредуктазы. До начала 90-х годов их диагностика основывалась только на клинико-гормональных маркерах. Однако, степень клинических проявлений ВДКН, особенно редко встречающихся форм и, соответственно, гормональные изменения могли значительно варьировать в рамках одной и той же формы заболевания, что приводило к ошибочной постановке диагноза и неправильному лечению.

Внедрение за последние годы в клиническую практику методов молекулярно-генетического анализа позволило значительно улучшить диагностику ВДКН. В настоящее время, в ряде развитых стран мира, анализ генов, приводящих к развитию различных форм ВДКН, является одним из наиболее значимых методов в диагностическом поиске при подозрении на наличие той или иной формы заболевания. Знание мутации в гене, кодирующем дефектный фермент, позволяет не только предсказать тяжесть течения заболевания, но и проводить пренатальную диагностику, при наличии в семье отягощенной наследственности. В серии популяционных исследований стран Европы и Америки молекулярно-генетический анализ гена СУР21, дефекты в котором приводят к развитию дефицита 21-гидроксилазы, позволил выявить ряд наиболее распространенных мутаций в этом гене, что легло в основу разработки и внедрения скрининга дефицита 21-гидроксилазы в этих странах.

РОС. нлччоплльная

Г.ИЬ.!!"0ТГКЛ С.Петербург

2воф*К

В России до последнего времени методы молекулярно-генетического анализа при диагностике ВДКН не использовались. Из всех форм заболевания в нашей стране диагностировался только дефицит 21-гидроксилазы на основании клинических и гормональных данных, маркеры диагностики других форм заболевания разработаны не были. В этой связи представляется актуальным изучение клинических особенностей различных форм ВДКН, разработка алгоритма их гормональной верификации и внедрение методов молекулярно-генетического анализа для усовершенствования дифференциальной диагностики ВДКН с другими формами нарушения стероидогенеза. Разработка и внедрение в клиническую практику методов молекулярно-генетического анализа также позволит осуществлять пренатальную диагностику заболевания в семьях с отягощенным по данному заболеванию анамнезом.

Учитывая распространенность дефицита 21-гидроксилазы, представляется актуальным изучение встречаемости различных мутаций в гене СУР21 в Российской популяции и разработка методов молекулярной скрининговой диагностики для наиболее частых мутаций.

Цель исследования:

Разработка критериев клинической, гормональной и молекулярно-генетической диагностики различных форм ВДКН. Проведение популяционного анализа частоты распространенности молекулярных дефектов СУР21 в России, и разработка методов молекулярно-генетического скрининга для наиболее распространенных в Российской популяции мутаций в гене СУР21

Задачи исследования:

1. Изучить клинические характеристики и особенности нарушений надпочечникового стероидогенеза при различных формах ВДКН

2. Сравнить диагностическую значимость различных гормональных показателей при проведении дифференциальной диагностики различных форм ВДКН

3. Исследовать характер мутаций в генах, кодирующих Б^Я протеин, фермент 11-^-гидроксилазу и фермент 17-ст-гидроксилазу/17,20-лиазу

4. Оценить характер и частоту различных мутаций в гене СУР21 среди Российской популяции

5. Разработать методы скрининговой молекулярно-генетической диагностики для наиболее распространенных мутаций в гене СУР21

Научная новизна

Впервые в России проведена комплексная оценка и проанализированы особенности стероидогенеза при различных формах ВДКН, использован мультистероидный анализ плазмы крови для дифференциальной диагностики ВДКН Впервые в нашей стране исследованы молекулярно-генетические основы дефекта протеина, дефицита ферментов: 11-0-гидроксилазы, 17-а-гидроксалазы/17,20-лиазы и 21-гидроксилазы. Описаны 12 новых мутаций в генах СУР11В1, СУР17 и СУР21.

Впервые в России проведен анализ слекгра мутаций в гене СУР21, выявлены наиболее распространенные мутации и определена частота их встречаемости в Российской популяции. Внедрен в практику метод аллель-специфической ПЦР для их скрининговой диагностики.

Практическая значимость

Проведенный анализ позволил изучить клинические особенности и определить критерии гормональной диагностики различных форм ВДКН, разработать алгоритм их дифференциальной диагностики.

Внедрены в клиническую практику методы молекулярно-генетической диагностики различных форм ВДКН

Проведенные исследования позволили оценить распространенность наиболее часто встречаемой формы ВДКН - дефицита 21-гидроксилазы в нашей популяции, выделить 8 наиболее частых мутаций, приводящих к его развитию. На основании полученных данных разработан скрининговый метод молекулярно-генетической диагностики дефицита 21-гидроксилазы для этих мутаций.

Впервые в России проведена молекулярно-генетическая пренатальная диагностика заболевания в семье уже имевшей больного ребенка.

Апробация работы.

Основные результаты исследования по материалам диссертации были доложены на Съездах Европейского Общества Детских Эндокринологов (1997, 1998, 2001, 2202), межотделенческих научных конференциях ЭНЦ РАМН (Москва, 1997,1998, июнь 2004г), ежегодной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы эндокринологии» в ГУ ЭНЦ РАМН (Москва, апрель 2004г.).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, который содержит 5 отечественных и 193 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 8 рисунками.

Содержание работы

Материалы исследования: Работа основана на результатах обследования 116 больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников, из которых 100 пациентов имели дефицит 21-гидроксилазы, 8 пациентов - дефицит 11-/?-гидроксилазы, 7 пациентов - дефицит 17-аг-гидроксилазы/17,20-лиазы и 1 пациент - дефект STAR протеина.

Методы исследования:

оценка физического развития проводилась на основании антропометрических показателей - длинны и массы тела Измерение роста проводилось на ростомере Харпендена фирмы "Holstein Ltd.,Crymych, Dyfed" с точностью до 0,1см Показатели роста и скорости роста сравнивали с данными перцентильных таблиц роста и скорости роста, разработанных для детей Европейской популяции. (Tanner J.M., Whitehouse R.H.). Показатели роста выражались в виде SDS роста ( Standard Deviation Score), который рассчитывался по формуле: SDSpocTa=(x-X)/SD, где х-рост пациента, X - средний рост для данного хронологического пола и возраста (50-я перцентель), SD - стандартное отклонение роста для данного пола и хронологического возраста

Оценка степени дифференцировки костного возраста проводилась по данным рентгенографии кистей, по методу Greulich and Pyle.

Оценка полового статуса проводилась по 5-бальной системе Tanner J.M. - Marshall, отдельно для лобкового оволосения (Р), наружных половых органов (G), молочных желез (Ах). Изменение строения наружных гениталий оценивалась по 5 бальной шкале, разработанной Prader.

Ультразвуковое исследование надпочечников, органов малого таза проводились с использованием стационарных ультразвуковых аппаратов "Hewlett Image Point"

(США), Sonos 4500, 5500 ("Philips", США) и датчика 7,5 и 10МГц в отделении функциональной диагностики ГУ ЭНЦ РАМН (зав.отд., д.м.н., |В.Я.Игнатк0в1)

Гормональные исследования крови - определение концентрации адренокортикотропного гормона (АКТГ), 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП), 11-дезоксикортизола, дегидроэпиандростерон сульфата (ДГЕА-С), кортикостерона, тестостерона (Т), кортизола в сыворотке крови, активности ренина в плазме (АРП) проводилось в лаборатории гормонального анализа ГУ ЭНЦ РАМН (руководитель -д.м.н., профессор Н.П.Гончаров) методом радиоимунного анализа по методике Н.П.Гончарова.

Мультистероидный анализ с одновременным определением в плазме крови альдостерона, кортикостерона ("В"), 11 -дезоксикортикостерона (ДОК), прогестерона, 17-гидроксипрогестерона, 11-дезоксикортизола ("S"), кортизола, кортизона, андростендиона и тестостерона проводился методом радиоимунного анализа после экстракции и выделения стероидов с помощью ВЭЖХ по методике Sippel! et al. (1978), в лаборатории отделения детской эндокринологии (руководитель -профессор Вольфганг Зиппель) детской клиники университета Христиана Альбрехтса (Киль, Германия). Стероидный профиль у больных с дефицитом Р450с17 исследован до и спустя 60 мин после стимуляции АКТГ (в/в, 250 мкг).

Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории гормонов и рецепторов Института молекулярной биологии им. Энгельгардта (руководитель -профессор Рубцов П.M ) и в лаборатории отделения детской эндокринологии (руководитель - профессор Вольфганг Зиппель) детской клиники университета Христиана Альбрехтса (Киль, Германия) и включали:

Выделение геномной ДНК пациентов из периферических лейкоцитов проводилось с использованием стандартных методов (Сэмбрук с соавт.1989).

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием экзон-специфических праймеров для генов STAR, СУР11В1, СУР21, СУР17 подобранных на основании анализа нукпеотидной последовательности генома человека. С помощью ПЦР были амплифицированы 3 фрагмента гена CYP11B1: фрагмент 1 -включающий экзоны 1 и 2, фрагмент 2 - экзоны 3-5, и фрагмент 3 - экзоны 6-9. Ген СУР 17 был амплифицирован с помощью 4-х фрагментов: фрагмент1 - включающий 1 экзон, фрагмент 2 - экзоны 2 и 3, фрагмент 3 - экзоны 4-6 и фрагмент 4 - экзоны 7,8 STAR ген был амплифицирован с помощью 2 фрагментов, включающих экзоны 2-3 и 4-8 соответсвенно. Условия ПЦР подбирались индивидуально для каждой

пары праймеров, с учетом стандартных этапов ПЦР: начальная денатурация ДНК

5

проводилась при 95С - 3', с последующими 30-40 циклами, включавшими этапы: денатурации ДНК 94С 30", отжиг праймеров 54-64С 30-90" и достраивание ДНК 72С 30-90", по окончании циклов ПЦР продукт выдерживался на 72С 10' для окончательной достройки ДНК. Результат ПЦР проверялся путем электрофареза на 1% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиум бромида. Реакция ПЦР проводилась в объеме 50 мкл, которые включали 1мкг ДНК, 2,5 Ед Taq ДНК полимеразы, 200 мМ прямого и обратного праймеров, 0,2 мМ каждого из dNTP, 10 мМ Tris-HCI, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCI.

Анализ и идентификация наиболее распространенных 8 мутаций в гене СУР21 с использованием аллель-специфической ПЦР проводился по методике A. Wedeil и Н. Luthman с модификациями, по описанному выше протоколу в два этапа На первом этапе селективно амплифицировался только СУР21 с праймерами, комплиментарными к участку гена CYP21, который отсутствует (делетирован) в псевдогене CYP21P На втором этапе использовались праймеры, последний нуклеотид на З'-конце которых, соответствовал нормальной или мутантной последовательности (аллель-специфические праймеры). Реакция проводилась отдельно для каждой пары праймеров в присутствии дополнительного контрольного праймера.

Секвенирование Прямое секвенирование генов проводилось ручным методом или с использованием автоматического секвенатора ABI PRISM Model 310 (Perkin Elmer, USA).

Результаты и обсуждения.

Клиническая характеристика дефекта STAR протеина, дефицита 17-а-гидроксилазы/17,20-лиазы, дефицита 21-гидроксилазы и дефицита 11-/?-гидроксилазы в Российской популяции

В зависимости от клинических проявлений дефицита 21-гидроксилазы, в литературе выделяют три формы заболевания: сольтеряющую, вирильную и неклассическую. В наше исследование были включены 70 пациентов с сольтеряющей формой заболевания и 30 пациентов с вирильной формой заболевания.

Мы пользовались следующими основными критериями при распределении пациентов по группам:

Сольтеряющая форма заболевания: наличие в анамнезе сольтеряющего криза (рвота, слабость, гиперкалиемия, гипонатриемия), ложный женский гермафродитизм

(ЛЖГ) или вирилизация у девочек, увеличение наружных гениталий и ускорение физического и полового развития у мальчиков.

К группе с вирильноО формой заболевания были отнесены пациенты со сходными клиническими проявлениями ВДКН, но с отсутствием водно-электролитных нарушений.

Дефицит 11-^-гидроксилазы нами был заподозрен у 8 пациентов на основании следующих клинических признаков (таб 1): ложный женский гермафродитизм или вирилизация у девочек/ увеличение наружных гениталий и ускорение физического и полового развития у мальчиков и наличие артериальной гипертензией.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов с дефицитом 11-/9- гидроксилазы

№ и инициалы пациентов Воз-т постановки диагноза СУР2Г/СУР11" рост КВ половое развитие АД фенотип

1 В.И. 3/9 148 18 Р5С5Те8т1 150/110 ППР

2У.А. 6/13 150 18 Р5С5Те6т1 130/80 ППР

ЗУ И. 3/8 139 13,5 Р5СЗТе4т1 140/90 ППР

4 А.А. /9 150 18 Р565Те8т1 145/100 ППР

5 А.А. 17 140 13,5 Р5(34Те6т1 100/70 ППР

бО.П. 2/14 164 13 Р504Те4т1 140/90 ППР

7Е.Д. 1/13 150,7 16 Р5ВЗ 130/80 ЛЖГ

8С.Д. 1/14 153,7 16 Р5В2 130/90 ЛЖГ

* возраст постановки ошибочного диагноза - дефицит 21-гидроксилазы

"возраст постановки диагноза - дефицит 11-^-гидроксилазы

У всех наших пациентов - 2 девочек и б мальчиков отмечалось значительное ускорение физического и полового развития Наружные половые органы у девочек были вирилизированы - Ргас!ег 3-4 при рождении, у мальчиков отмечалось увеличение полового члена, частые эррекции, лобковое оволосение. АД варьировало в зависимости от возраста диагностики заболевания, но у всех превышало возрастную норму.

Особенностью клинического проявления дефицита 11-^-гидроксилазы является отсутствие выраженного повышения АД в первые годы жизни, что приводит к

ошибочной диагностике вирильной формы дефицита 21-гидроксилазы. Пациенты №№ 1,2,4,6,7,8 наблюдались в детском отделении ЭНЦ РАМН с диагнозом дефицит 21-гидроксилазы, однако повышение АД в возрасте 4-7 лет, явилось причиной пересмотра диагноза. Пациентам №3 и N05 (таб 1) диагноз был заподозрен на основании наличия в семье старшего ребенка с данной формой ВДКН.

Дефицит 17-а-гидроксилазы/17,20-лиазы заподозрен у 7 пациентов на основании сочетания артериальной гипертензии с ложным мужским гермафродитизмом (ЛМГ) при 46ХУ генетическом поле и половым инфантилизмом при 46ХХ генетическом поле, (таб.2)

Таблица 2 Клиническая характеристика пациентов с дефицитом 17-а-гидроксилазы/ 17,20-лиазы

Пац. № 1 2 3 4 5 6 7

Кариотип 46,ХУ 46,ХУ 46,ХУ 46,ХУ 46,ХХ 46,ХУ 46,XX

Фенотип женский женский женский женский женский женский женский

Возраст* 26 лет 32 года 34 года 39 лет 38 лет 24 года 27 лет

Начапьн. проявлен ия 4 года гонады, при грыжесе чении 12 лет отсутст. пубертат, "СТФ" у сестры 5 лет гонады, при грыжесе чении 4 года гонады, при грыжесе чении Первич. аменорея 9 лет гонады, при грыжесеч ении Первич. аменорея

Половое развитие Р1, В1 Р2, В2 Р2, ВЗ Р2, ВЗ ? Р1, ВЗ РЗ, В4

АДмм.рт ст 200/140 220/140 200/120 200/110 200/110 140/90 220/150

Гонады удалены в паховых каналах, 8 мл слева-удалена, справа -в паху, 8 мл удалены поликисто зные яичники (УЗИ) удалены поликисто зные яичники (УЗИ)

Надпочеч ники гипер плазия гипер плазия вторич аденома гипер плазия вторич аденома лев. удален гиперпл вторич аденома ? гипер плазия гипер плазия вторич аденома

Калий (ммоль/л) 3.2 34 5,0 3.7 Нет данных 4.3 3.2

* - возраст установления диагноза дефицит Р450с17

Дефицит 17-а-гидроксилазы/17,20-лиазы у всех пациентов был диагностирован уже в половозрелом возрасте. 5 пациентов с кариотипом 46,ХУ и ложным женским гермафродитизмом длительно наблюдались с диагнозом синдром тестикулярной феминизации, 2 пациента с кариотипом 46,XX наблюдались у гинеколога по поводу полового инфантилизма и первичной аменореи. Артериальная гипертензия у этой группы больных в детстве расценивалась как проявление вегето-сосудистой дистонии, а в последующем они наблюдались кардиологами с диагнозом эссенциапьная гипертензия.

Дефект STAR протеина был заподозрен у одной пациентки на основании сочетания врожденной надпочечниковой недостаточности, правильного строения наружных гениталий и женского кариотипа 46ХХ.

Гормональная характеристика дефекта STAR протеина, дефицита 17-0-гидроксилазы/17,20-лиазы, дефицита 21-гидроксилазы и дефицита 11-/?-гидроксилазы. Оценка диагностической значимости различных гормональных показателей при проведении дифференциальной диагностики форм ВДКН

Для гормонального подтверждения дефицита 21-гидроксилазы всем больным измерялся уровень 17-ОНП, Т, ДГЕА-С и АРП (таб.3).

Уровень 17-ОНП, как субстрата для 21-гидроксилирования у всех наших больных с дефицитом 21-гидроксилазы на фоне отсутствия лечения был значительно повышен »37,8 нмоль/л (0,6-6,2 нмоль/л), превышая пределы чувствительности метода.

Учитывая интактность образования андрогенов при данной ферментативном дефекте и гиперстимуляцию надпочечников АКТГ, вследствие недостаточности кортизола, у пациентов отмечается повышение уровня андрогенов - ДГЕА-С, Т.

Таблица 3. Содержание в сыворотке 17-ОНП, Т, ДГЕА-С и АРП у пациентов с дефицитом СУР21

норма сольтеряющая вирильная

17-ОНП нмоль/л 0,8-6,2 »37 »37

ДГЕА-С нмоль/л 100-600* >600* >600*

АРП нг/л/ч 1,9-5,4 >5,4 (до 30) 1,9-7

* зависит от возраста

Повышение уровня ДГЕА-С по сравнению с возрастной нормой было выявлено у всех наших пациентов, и может использоваться как один из косвенных

диагностических признаков данной формы ВДКН. Активность ренина в плазме была повышенной у всех пациентов с сольтеряющей формой ВДКН. У пациентов с ВФ повышение АРП было выявлено только у незначительной части больных и обычно сочеталось с отсутствием компенсации заболевания. Это объясняется антагонистическими по отношению к альдостерону свойствами 17-ОНП.

При нарушении 11-р-гидроксилирования происходит накопление предшественников данного этапа гидролиза - дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола, поэтому измерение этих гормонов является наиболее диагностически значимым при проведении дифференциальной диагностики между дефицитом 11-£-гидроксилазы и 21-гидроксилазы. Так у всех наших пациентов с дефицитом 11-Д-гидроксилазы уровень 11-дезоксикортизола был повышен более чем в 2 раза. Тогда как при дефиците 21-гидроксилазы он находился в пределах нормы. 17-ОНП так же повышен у этих пациентов, что часто используется как критерий для ошибочной постановки диагноза дефицита 21-гидроксилазы. Мультистероидный анализ плазмы был проведен у двух наших пациентов №1 и №7. В обоих случаях было выявлено значительное повышение ДОК, 11-дезоксикортизола, андрогенов при недостаточной концентрации кортизола и кортикостерона (таб.4).

Таблица 4. Результаты мультистероидного анализ плазмы у пациентов №1 и №7 с дефицитом 11-0-гидроксилазы

Стероиды (нг/мл) Б-ной 1 (В. И.) Б-ной 7 (Е. Д.)

Альдостерон 0,42 (0,01-0,3) 0,02 (0,01-0,3)

Кортикостерон 0,68 (0,10-9,4) 0,29(0,10-9,4)

Дезоксикортикостерон 8,37 (0,02-0,46) 11,1 (0,02-0,46)

Прогестерон 1,8(0,03-0,34) 1,77 (0,03-0,34)

17-ОНП 19,7 (0,2-0,8) 5,0 (0,15-1,20)

11 -Дезоксикортизол 58,0(0,06-1,7) 47,3(0,06-1,7)

Кортизол 144 (18,6-269,4) <1 (18,6-269,4)

Кортизон 1,0 (2,6-35,5) 1,0(2,6-35,5)

Тестостерон 16,3 (0,4-2,0)

Андростендион 84,0 (0,8-8,0)

Дефицит 17-р-гидроксилазы/17,20-лиазы. У 6 из 7 пациентов (сыворотка у пациента №5 не была доступна), был заподозрен на основании повышенного базального уровня кортикостерона. У пациентов №№2, 3,4 и 6 стероидный профиль был исследован до и спустя 60 мин после стимуляции АКТГ (в/в, 250 мкг) (таб 5).

Таблица 5. Результаты мультистероидного анализа плазмы до и после в/в введения АКТГ у пациентов №2, №3,№4 и №6 с дефицитом Р450с17.

Стероиды Норма Пациент 2 Пациент 3 Пациент 4 Пациент 6

(нг/мл) 0' АКТГ 0' АКТГ 0' АКТГ 0' АКТГ 0' АКТГ

Альдостерон 0,020,05 0,040,20 0,21 0,21 0,17 0,15 0,14 0,12 0,15 0,14

"В" 1,258,28 20,975,0 31,8 30,2 22 51,6 23,7 50,3 21,8 52,7

ДОК 0,020,07 0,090,38 2,49 2,49 1,06 1,12 1,28 1,67 0,33 0,25

Прогестерон 0,070,32 0,310,83 2,85 3,11 1,47 1,53 2,4 1,89 1,64 1,69

17-ОНП 0,621,66 1,163,25 1,28 1,11 0,74 0,59 0,31 0,24 0,91 1,06

„д. 0,270,95 1,063,43 0,16 0,12 0,08 0,04 0,09 0,13 0,92 0,5

Кортизол 76,7-187 153,7339 19 25 20 23 24 19 87 82

Кортизон 16,5-24 14,925,6 <1 <1 <1 <1 1 1 2 2

Андростендион 0,6-2,0 0,1 0,01 0,78 0,30 0,17

Тестостерон 2,0-8,0 0,12 0,01 0,33 0,08 0,06

"Б"-11-дезоксикортизол, "В" - кортикостерон

и

У всех обследованных больных отмечалось снижение базальных и (или) стимулированных уровней 17-ОН-прогестерона, 11-дезоксикортизола, кортизола, кортизона, андростендиона и тестостерона, в то время как концентрации прогестерона, кортикостерона и ДОК были значительно повышены, что свидетельствовало о сочетанной недостаточности 17-а-гидроксилазы и 17,20-лиазы. Интересно, что у пациента с незначительно выраженной артериальной гипертензией (Мв 6} степень повышения ДОК была минимальной. Несмотря на повышение концентраций его предшественников, уровни самого альдостерона после стимуляции А1СГГ были в пределах нормы. Последнее отражает особенности регуляции клубочковой зоны коры надпочечников, функция которой определяется, прежде всего активностью ренин-ангиотензиновой системы, а не стимулирующим эффектом АКТГ. При дефиците 17-а-гидроксилазы избыточная продукция стероидов с минералокортикоидной активностью (ДОК) приводит к подавлению активности ренин-ангиотензиновой системы, что и объясняет нормальный уровень альдостерона.

При дефекте STAR протеина происходит нарушения синтеза всех надпочечниковых стероидов на самых ранних этапах, поэтому при данной форме ВДКН в крови обнаруживается снижение как кортизола, так и его предшественников, а также значительное повышение активности ренина в плазме вследствие недостаточности минералокортикоидов, и компенсаторная повышение АКТГ. Так, у нашей пациентки уровни 17-ОНП и ДГЕА-С находились на нижней границе нормы, тогда как уровень АКТГ составил ЗОООмг/л, (таб.6)

Таблица 6. Уровень гормонов крови у пациентки с дефектом StAR протеина

гормоны АКТГ мг/л 17-ОНП нмоль/л ДГЕА-С нмоль/л АРП нг/л/ч Натрий ммоль/л Калий ммоль/л

Т.А. 3000 0,6 40 19 139 5,7

норма 10-60 1,5-6,2 100-300 0,5-4 120-150 3,6-5,2

Молекулярно-генетическая характеристика дефекта STAR протеина, дефицита 17-о-гидроксилазы/17,20-лиазы, дефицита 21-гидрокеилазы и дефицита 11-/J-гидроксилазы.

Как было показано ранее в основе развития всех форм ВДКН лежит дефект в гене, кодирующем последовательность данного фермента или протеина.

Молекулярно-генетические исследования СУР11В1

Молекулярно-генетический анализ гена СУР11В1 у больных с клинически и гормонально заподозренным дефицитом 11-/?-гидроксилазы выявил следующие мутации (таб.7):

В первом случае проведен анализ ДНК, как самого пациента, так и его родителей. У пробанда обнаружена гомозиготная мутация во 2-ом экзоне - делеция одного нуклеотида в в кодоне 124 (124с)еЮ). Данная мутация приводит к сдвигу рамки считывания и формированию стоп-кодона в 3-м экзоне (кодон 144), что предопределяет синтез укороченного белка. Родители оказались гетерозиготными носителями мутации (рис.1). Данная мутация при дефиците Р450с11 выявлена впервые.

Рисунок 1. Родословная и фрагмент нукпеотидной последовательности пациента №1: делеция в нуклеотида в 124 кодоне н ,,

46.ХУ, гомозиготен по мутации 46,ХУ, гетерозиготен по муташ 46,XX мутация отсутствует I I (^Ш 46.ХХ, гетерозигота по мутации

о

сГЗз

I

У пациентов №2 и №3 выявлена составная гетерозиготная мутация - Е371Х и 13448С. Анализ ДНК матери выявил наличие мутации Е371Х в гетерозиготном положении. Кровь отца не анализировалась. Мутация Е371Х приводит к образованию стоп-кодона в 6 экзоне и выявлена впервые. Я448С, уже была описана ранее у пациента с дефицитом СУР11В1

13448Н также была выявлена в гетерозиготном положении у пациента №8, имеющего делецию одного нуклеотида в 394 кодоне И394Д1 на другой аллели, мать оказалась

13

гетерозиготной носительницей 394с1е1А мутации, приводящей к формированию стоп-кодона в 429 положении и синтезу неполноценного белка.

У пациентов №4 и №5, являющихся сибсами, выявлена гомозиготная мутация 1299Р в 5 экзоне, их родители состояли в близкородственном браке. Данная мутация приводит к замене лейцина, гидрофобной аминокислотой с неполярным радикалом на гистидин, аминокислоту с полярно-заряженным радикалом.

Гомозиготная мутация С5285Н в 5 экзоне - была выявлена у пациента №6, кровь родителей не анализировалось При данной мутации происходит замена глутамина, полярной аминокислоты с незаряженным радикалом на гистидин, аминокислоту с полярно-заряженным радикалом. Ранее данная мутация описана не была.

Обе заменные мутации, 1-299Р и 0285Н, располагаются высоко-консервативном участке энзима, участвующем в переносе протонов, поэтому любые изменения полярности в данном регионе будут приводить к снижению активности фермента. Ни одна из выше приведенных мутаций ранее описана не была.

Таблица 7. Спектр мутаций в гене СУР11В1, обнаруженных при обследовании пациентов с подозрением на дефицит 11-£-гидроксилазы

Пациент Изменение Экзон Изменение Гетерозиготность

№ нуклеотидов аминокислоты у членов семьи

1 124de!G 2 Стоп кодон 144 Отец и мать

2,3 GAG- TAG 6 Е371Х Мать

CGC-TGC 6 R448C

4, 5 GTG-»TTG 6 L299 отец и мать

6 CAG- CAC 5 Q285H Не

исследовались

7 insCTG484 8 Lins3nt Не

исследовались

8 394delA 6 Стоп кодон 429 Мать

CGC-* CAC 6 R448H

У пациента №7 анализировалась только ДНК пробанда. Выявлена гомозиготная мутация - вставка дополнительного триплета CTG (insCTG464) в 8-м экзоне (рис.2). Такой же молекулярный дефект был обнаружен ранее в семье иранских евреев, и по

данным эксперимента in vitro было доказано, что эта мутация приводит к значительному снижению активности Р450с11.

Рисунок 2 Фрагмент нуклеотидной последовательности гена СУР11В1 пациента №7, вставка дополнительного триплета CTG

▼

«Г ВС I • Г [ ее * • С Г «С т «С АС

Экзон8.контооль

Молекулярно-генетические исследования СУР 17

Исследование гена СУР 17 было проведено у 6 из 7 больных (табл 8).

Таблица 8. Характеристика дефектов гена СУР17, выявленных у пациентов с дефицитом 17-<7-гидроксилазы/17,20-лиазы

Семья Пациент Изменение Экзон Изменение Гетерозиготност

№ № нуклеотидов аминокислоты ь у членов семьи

1 1 287: CGG->CAG 1 R96Q не исследована

II 2,3 1078: GTG->TTG 6 V360L отец, мать, здоровый брат

III 4, 5 GTG-yTTG 6 V360L отец и мать

IV 6 1039: CGT->TGT 6 R347C отец и здоровый

1246: CGT-VTGT 8 R416C брат

У одного пациента была выявлена гомозиготная мутация в экзоне 1. В данном

случае была обнаружена транзиция С->А в положении 287, что привело к замене

15

аргинина (CGG) на глютамин (CAG) в кодоне 96 (рис.3). У сибсов в семьях II и III (пациенты 2-5) была выявлена одинаковая мутация в экзоне 6 (нуклеотид 1078), приведшая к замене валина (GTG) на лейцина (TTG) в кодоне 360 (рис 4) В обеих семьях родители были гетерозиготными носителями данной мутации. Гетерозиготная мутация V360L была также выявлена у здорового сибса в семье 2

Рисунок 3. Фрагмент нуклеотидной последовательности гена CYP17 пациента №1 (а) и контрольного образца (б). Обнаружена гомозиготная мутация - транзиция G-»A в положении 287, приведшая к замене аргинина (CGG) на глютамин (CAG) в кодоне 96.

а) ^ б) ^

Наконец, у пациента 6 была обнаружена составная гетерозиготность по двум мутациям: в экзоне 6 (замена аргинина на цистеин в кодоне 347), и в экзоне 8 (замена аргинина на цистеин в кодоне 416). Ни одна из обнаруженных мутаций не была опубликована ранее.

Рисунок 4. Родословная семьи №2 и фрагменты нуклеотидной последовательности гена СУР17 пациент №2 и отца. Мутация в кодоне 360, приведшая к замене валина (вТв) на лейцина (ТТв).

7

мvwv

4б,ХУ, женский фенотип гомозиготен по мутации 46.ХУ, мужской фенотип, гетерозиготен по мутации 46,ЮС, женский фенотип мутация отсутствует

46 ДХ, женский фенотип, гетерозигота по мутации

Молекулярно-генетические исследования СУР21

Основываясь на данных литературы, что при дефиците 21-гидроксилазы наиболее распространенными дефектами гена являются 8: делеция/крупная перестройки гена, I2spl, I172N, P30L Q318X, R356W, V281L, insT1768 которые встречаются в 90-95% случаев заболевания, на основании данных научной литературы мы разработали аллель-специфическую ПЦР для определения этих мутаций у наших больных В случае не обнаружения ни одной из этих мутаций у пациента мы проводили прямое секвенирование гена Нами были выявлены следующие изменения в гене СУР21В- 26 случаев делеции /крупной перестройки гена (26%); 56 случаев гомозиготных мутаций, из которых 26 - мутация сплайсинга во втором интроне I2spl (26%); 17 - I172N (17%); 5 - P30L (5%); 3 - Q318X (3%); 2 -R356W(2%), 1- вставка Т в 1768 положении (insT1768, 1%); 1- C169R; 1- W302R, а также 10 случаев сочетанной гетерозиготности, 6 из которых составили мутации I2spl/I172N, I2spl/P30L и по одному случаю каждой из следующих мутаций -I172N/Q318X, P30UI172N, I172N/W19X, R356W/insT1768 (Таб.9).

Мутации C169R, W19X и W302R ранее описаны не были Все три мутации были выявлены у пациентов с СФ заболевания. Мутация W19X приводит к образованию стоп-кодона и нарушению транскрипции полноценного белка.

Для определения функциональной значимости заменных мутаций C169R и W302R в развитии заболевания нами был проведен их функциональный анализ, который показал, что данные мутации приводят к снижению активности 21-гидроксилазы на 91% и 90% соответственно (рис 5).

Рис 5 Функциональная активность мутаций C169R, I172N, V281L, W302R in vitro

17-ОРП Прогестерон

J J rl J

J s S

мутация в СУР21

Таблица 9. Результаты молекулярно-генетического анализа 100 пациентов с дефицитом 21-гидроксилазы

Мутация Процент встречаемости Форма заболевания (%)

Делеция 26% (26) СФ 100%

Pro30Leu 5% (5) ПФ 100%

12 splice AA/AC-vAG 26% (26) ПФ 11,5% СФ 88,5%

lnsT1768 1%(1) СФ 100%

In2spl/P30L 3% (3) ПФ 100%

I172N 17% (17) СФ31%ПФ 69%

I2spl/I172N 3%(3) ПФ 75% СФ 25%

Q318X 3% (3) СФ 100%

R356W 2% (2) ПФ 100%

C169R Впервые описанная мутация СФ

W302R Впервые описанная мутация СФ

I172N/Q318X, 1 (1%) СФ

P30L7I172N, 1 (1%) ПФ

I172N/W19X, 1 (1%) СФ

R356WAinsT1768L 1 (1%) СФ

He найдено СФ 5; ПФ 3

Р - пролин, 12вр1 -сплайсинг во втором интроне, I. - лейцин, V - валин, О - глютамин, Р - аргинин, \Л/ - триптофан, ¡пвТ1768 - вставка Т в 1768 положении, С - цистеин I - изолейцин, N - аспарагин X - стоп-кодон, ПФ- простая вирильная форма, СФ - сольтеряющая форма

У 8 пациентов, несмотря на наличие клинических и гормональных маркеров дефицита 21-гидроксилазы, мутаций в кодирующей части гена обнаружено не было

Среди пациентов, которым диагноз был подтвержден молекулярно-генетически, отмечалась генотип-фенотипическая корреляция проявления заболевания для некоторых из мутаций (таб 9). Так, все 27 случаев делеции/крупной перестройки гена обнаружены лишь у пациентов с сольтеряющей формой. 12вр1 выявлена у 26 пациентов, среди которых 23 с сольтеряющей формой. 12эр1/1172М и 12бр1/Р301 чаще выявлялись у пациентов с вирильной формой ВДКН, так среди 6 пациентов с данными мутациями 5 имели вирильную форму Замена Р301. при

анализе наших данных во всех 5 случаях была выявлена у пациентов с вирильной формой заболевания В случае мутации I172N по нашим данным четкой генотип-фенотипической корреляции нет, так среди 17 пациентов с данной мутацией сольтеряющая форма была диагностирована у 7 (31%).

Наличие фенотип-генотипической корреляции соответствует степени нарушения функции гена при различных мутациях. Так, при СФ мутации приводят к 100% потере активности фермента, тргда как при ВФ активность снижена только на 70-95%.

Разработанная методика аллель-специфической ПЦР и полученные данные позволили провести пренатапьную диагностику заболевания в одной семье, где у старшего ребенка был диагностирован дефицит 21-гидросилазы, сольтеряющая форма, подтвержденная генетическим анализом. Анализ ворсины хориона от беременной матери на аналогичную мутацию, выявленную у старшего ребенка, мутации не выявил. Основываясь на результатах генетического анализа беременность была сохранена и в последствии родился здоровый ребенок.

Молекулярно-генетические исследования STAR гена

При исследовании STAR гена у нашей пациентки была выявлена мутация W147X, приводящая к формированию стоп-кодона, вследствие чего синтезируется укороченный белок со сниженной функциональной активностью.

ВЫВОДЫ:

1. Молекулярно-генетический анализ является методом выбора при диагностике лилоидной гиперплазии коры надпочечников, дефицита М-а-гидроксилазы/17,20-лиазы и дефицита 11-£-гидроксилазы

2. Наиболее значимыми клинико-гормональными характеристиками редких форм ВДКН являются:

При дефекте ЭМЯ - сочетание первичной надпочечниковой недостаточности, женского фенотипа и снижения всех стероидных гормонов, на фоне повышения активности ренина в плазме и АКТГ

При дефиците 17-а-гидроксилвзы/17,20-лиазы - сочетание ЛМГ или женского инфантилизма с избытком минералокортикоидов, проявляющемся низкорениновой гипертензией и повышением кортикостерона и дезоксикорткостерона

При дефиците 11-р-гидроксипаэы - сочетание периферического ППР у мальчиков и ЛЖГ у девочек с низкорениновой гипертензией и повышением 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона.

3. Измерение 17-ОНП не является достаточным критерием для диагностики дефицита 21-гидроксилазы

4. У пациентов с генетически неподтвержденным диагнозом дефицит 21-гидроксилаза необходимо исключать наличие дефицита 11-£-гидроксилазы

5. Все мутации, выявленные при дефиците 17-ст-гидроксилазы/17,20-лиазы клинически характеризовались сочетанным дефицитом обоих ферментов, однако при гетерозиготной мутации Р347С/К416С отмечалось незначительное повышением АД, что свидетельствует о преобладании 17,20-лиазной недостаточности при данном дефекте

6 Наиболее распространенными дефектами гена СУР21 в Российской популяции являются: делеция/крупная перестройки гена, 12зр1, 1172М, Р301_, 0318Х, Р356У/, \Z281L, ¡П8Т1768

7. Для некоторых мутаций в гене СУР21 была выявлена генотип-фенотипическая корреляция, делеция/крупная перестройка гена и мутация 12зр выявлялась у пациентов с сольтеряющей формой, РЗОЬ была обнаружена только у

пациентов с вирильной формой заболевания. Мутация 1172М встречалась при обоих формах.

8. Частота встречаемости наиболее распространенных мутаций в гене СУР21 в Российской популяции не отличается от других Европейских популяций

9. Аллель-специфическая ПЦР является методом выбора для выявления наиболее распространенных мутаций в гене СУР21

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для проведения дифференциальной диагностики между редкими формами ВДКН и другими нарушениями стероидогенеза рекомендуется проведение мультистероидного анализа как наиболее расширенного исследования гормонального профиля

2. Молекулярно-генетическое обследование рекомендуется проводить при любом подозрении на нарушение стероидогенеза для избежания ошибочного диагноза

3. Дефицит 17-йг-гидроксилазы/17,20-лиазы должен быть включен в план дифференциальной диагностики синдрома ЛМГ и первичной аменореи

4. При подозрении на вирильную форму дефицита 21-гидроксилазы, необходимо проводить дифференциальную диагностику с дефицитом 11-0-гидроксилазы, вне зависимости от присутствия в симптомокомплексе артериальной гипертензии и гипокалиемии

5. Методы молекулярно-генетического анализа могут быть рекомендованы для пренатальной диагностики различных форм ВДКН в семьях, уже имеющих больного ребенка.

Список публикаций:

1. Два случая дефицита 17-сг-гидроксилазы-17/20 лиазы (Р450 с17) Проблемы эндокринологии 1998 №6, 39-43/ Тюльпаков АН, Калинченко СЮ, Рожинская ЛЯ, Козлов ГИ, Калинченко Н.Ю., Гончаров НП, Колесникова ГС, Бронштейн МИ, Курило ЛФ

2 Клиническая, гормональная и молекулярно-генетическая характеристика недостаточности Р450с17 (17о-гидроксилаза/17,20-лиаза) Проблемы эндокринологии 2001 №1, 20-26/ Тюльпаков А.Н., Калинченко Н Ю., Калинченко С.Ю., Рожинская Л.Я., Платонова Н.М., Гончаров Н.П., Колесникова Г.С., Петеркова В.А., Петер М., Зилпель В.

3. Два случая врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленных дефицитом Р450с11: клинико-гормональная и молекулярная характеристики. Проблемы эндокринологии 2003 №3 39-42 / Калинченко Н Ю., Тюльпаков А Н, Петеркова В.А, Семичева Т В , Петер М , Зиппель В.

4. Молекулярно-генетический анализ гена СУР21 у пациентов с врожденной дисфункцией коры надпочечников, обусловленной дефицитом 21-гидроксилазы: спектр мутаций и фенотип-генотипическая корреляция. Проблемы эндокринологии 2005 №1 3-6 / Дедов И.И., Калинченко Н Ю., Семичева Т.В., Кузнецова Э.С., Баканова Т.Д., Свердлова П С., Прасолов В С , Петеркова В.А., Рубцов П.М., Тюльпаков А.Н.

5 Late diagnosis of male pseudohermaphroditism due 17-o-hydroxylaseM7,20-lyase deficiency a case report. Horm Res 1997;48 (suppl 2): p. 112/ Kalintchenko NU, Kalintchenko SU, Kolesnikova GS, Goncharov NP, Kopshev SN and Tiulpakov AN

6. Six cases of 17-a-hydroxylase/17,20-lyase deficiency: clinical, hormonal and molecular findings. Horm Res 1998; 50 (suppl 3): p.112./ AN Tiulpakov, NU Kalintchenko, M Peter, SU Kalintchenko, NP Goncharov, AB Okulov, VA Peterkova, and WG Sippell

7. Clinical, hormonal and molecular findings in two patients with 11/?- hydroxylase deficiency Horm Res 1998;50 (suppl 3)' p.104/ NU Kalintcenko, AN Tiulpakov, M Peter, TV Semicheva, VA Peterkova, and Sippell WG.

8. The spectrum of molecular defects in the CYP21B gene in Russian patients with 21-hydroxylase deficiency. European Society for Pediatric Endocrinology (ESPE 2002) Madrid, Spain, Horm Res. 2002 (suppl 3) / N. Kalintchenko, P.Rubtsov, T. Semitcheva, E. Kuznetsova, V.Peterkova and A. Tiulpakov

t

í

»

Отпечатано в ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 1,0 п.л. Бумага New SvetoCopy.

РНБ Русский фонд

2005-4 41033

s 4 ' ! ;

i ¿ *

\ * с i / 1235