Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Выявление антидиабетической активности вновь разработанных нейропротекторных препаратов

На правах рукописи

Озерова Ирина Витальевна

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИДИАБЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВНОВЬ РАЗРАБОТАННЫХ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 СЕН ПЬ

Москва-2015

005561976

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова» (ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Островская Рита Ушеровна

Официальные оппоненты: ,

доктор биологических наук, профессор

заведующий кафедрой физиологии человека и животных

Биологического факультета

ФГБОУ ВО «Московский государственный

Университет имени М.В. Ломоносова» Каменский Андрей Александрович

кандидат медицинских наук ассистент кафедры фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный Медицинский университет»

Минздрава России Болотова Елена Владимировна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени И.В. Евдокимова» Минздрава России

Защита состоится " / ¿-.А-/ 2015 г. в/^^Аасов на заседании диссертационного

совета Д.001.024.01 на базе Ф^БНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8 и на сайте www.academpharm.ru.

Автореферат разослан" "_ 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) относится к числу основных причин смертности населения в большинстве стран мира, и каждые 10-15 лет количество больных диабетом удваивается (Дедов, И.И. Сахарный диабет: развитие технологий в диагностике, лечении и профилактике (пленарная лекция) II Сахарный диабет. 2010. № 3. С. 6-13). По данным Международной федерации диабета (IDF) в настоящее время более 382 миллионов человек в мире больны этим заболеванием, а к 2035 году их количество возрастет до 592 млн. По числу больных диабетом Россия занимает 5-ое место в мире.

Самым распространенным видом СД (90-95% от общего числа случаев) является сахарный диабет второго типа (СД 2) - сложное гетерогенное расстройство, характеризующееся сочетанием прогрессирующего снижения чувствительности к инсулину (инсулинорезистентность, ИР) и неадекватной компенсационной секреции инсулина (в начале болезни она не только не снижена, а часто и повышена), что является результатом дисфункции ß-клеток поджелудочной железы. СД прогрессирует, что способствует развитию осложнений, таких, как сердечно-сосудистые заболевания (Мкртумян, A.M. Уровень гликемии как фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний // Сахарный диабет. 2010. №3. С. 80-82; Дедов И.И., Шестакова М.В. Сахарный диабет и сердечно-сосудистые заболевания: состояние проблемы // Сахарный диабет. 2004. № 4. С. 2-6), нефропатия (Шестакова М.В., Шамхалова М.Ш. Диабетическая нефропатия: клиника, диагностика, лечение; Ред. академика И.И. Дедов. Москва, 2009. 28 е.), ретинопатия (Aiello, L.M. Perspectives on diabetic retinopathy // Am J Ophthalmol. 2003. V. 136, № 1. P. 122-135) и нейропатия (Мкртумян, А.Ф. Лечение сахарного диабета и его осложнений. РМЖ. 2002. Т. 10, №17. С. 773-7). Перечисленные осложнения регистрируются у 40—55% больных и являются причиной роста смертности от СД (Сунцов Ю.И., Болотская Л.Л., Маслова О.В., Казаков И.В. // Сахарный диабет. 2011. № 1.С. 15-18).

На сегодняшний день предупреждение и терапия СД 2 затруднено недостаточной эффективностью применяемых средств в отношении защиты секреторной функции ß-клеток и наличием побочных эффектов: для производных сульфонилмочевины характерно развитие вторичной резистентности, для бигуанидов - гепатотоксичность и повышение риска развития кардиоваскулярной патологии. Применение ингибиторов дипептидил-пептидазы-IV (ДПП-4) повышает частоту развития панкреатита и рака поджелудочной железы (Шестакова Е.А., Галстян Г.Р. Ингибиторы ДПП-4: сравнительный анализ представителей группы // Проблемы эндокринологии. 2012. № 1. С. 61-66). Для многих антидиабетических веществ характерно развитие гипогликемии, нарушений функций желудочно-кишечного тракта. Вышеизложенные факторы определяют необходимость продолжения активного поиска новых терапевтических стратегий, в частности, обеспечивающих воздействие одновременно на несколько основных звеньев заболевания, и, при этом, направленных на предотвращение прогрессирования диабета на стадии его развития (Спасов, A.A., Петров В.И., Чепляева Н.И., Ленская К.В. Фундаментальные основы поиска лекарственных средств для терапии сахарного диабета 2-го типа // Вестник РАМН. 2013. № 2. С. 43-49; Тюренков, И.Н., Куркин Д.В., Болотова Е.В., Бакулин Д.А., Ломкина Е М. Десять новых мишеней для разработки

лекарственных средств для лечения СД 2 и метаболического синдрома // Сахарный диабет. 2015. №1. С. 101-109; Сахарный диабет 2 типа. Проблемы и решения: учеб. пос. 2-е издание, переработанное и дополненное. Аметов A.C. // Москва. ГЭОТАР-Медиа, 2014. 1032 е.).

Внимание исследователей последних лет привлекает вопрос о сходстве патогенетических механизмов нейродегенеративных заболеваний и диабета: развитие инсулинорезистентности, дефицит нейротрофических факторов, нарушение метаболизма глюкозы, накопление свободных радикалов, дефицит антиоксидантных систем, накопление провоспалительных цитокинов, мисфолдинг протеинов (ß-amyloid в нейронах, islet amyloid polypeptide, IAPP, в поджелудочной железе), избыточная активность глюкокортикоидов и дефицит холинергических процессов (De la Monte, S.M. Brain Insulin Resistance and Deficiency as Therapeutic Targets in Alzheimer's disease // Current Alzheimer Research. 2012. V. 9, № 1 № 35-66; Островская Р.У., Ягубова C.C. Общность механизмов болезни Альцгеймера и диабета: пути фармакологической коррекции. Психиатрия 2014. Т. 61, №1. С. 35-43).

Наряду с этим, в литературе имеются немногочисленные, но весьма убедительные данные о существенной общности механизмов регуляции функций нейронов и ß-клеток поджелудочной железы: наличие общих факторов роста и дифференцировки, электрическая возбудимость, наличие сходных энзимов, пептидов. Это сходство нейронов и ß-клеток поджелудочной железы проявляется также в механизмах их повреждения, включающих дефицит нейротрофических факторов и недостаточность антиоксидантных систем при болезни Альцгеймера (БА) и при СД 2 (Toth, С. Diabetes and neurodegeneration in the brain // Handbook of Clin Neurol. 2014. V. 126. P. 489-511). Это, в свою очередь, может быть основанием для использования общих подходов к лечению этих заболеваний. Вопрос о целесообразности использования антидиабетических препаратов для замедления прогрессирования нейродегенеративных процессов при БА до сих пор остается открытым. Ведутся отдельные экспериментальные исследования, но подведение итогов клинической оценки инкретиномиметиков у пациентов с БА, первоначально анонсированное на июль 2014 года, отложено до июля 2016 года (Bristol Myers Squibb, протокол NCT01255163).

Вопрос о том, могут ли нейропротекторные вещества проявлять защитные свойства в отношении функции панкреатических ß-клеток и обладать вследствие этого антидиабетической активностью, ранее не исследовался. В нашей работе в качестве таких потенциальных антидиабетических соединений были изучены оригинальные нейротропные препараты, сконструированные в ФГБНУ «НИИ фармакологи имени В.В. Закусова». Эти препараты при всём различии их химической структуры и типа нейротропной активности объединяет общее свойство - наличие нейропротекторного эффекта, в основе которого лежит способность ослаблять проявления оксидативного стресса и усиливать экспрессию нейротрофических факторов в нейрональных клетках.

Степень разработанности проблемы. Роль пептидов в качестве многокомпонентных регуляторов широкого спектра функций организма привлекает в последние годы нарастающее внимание исследователей. Однако, практическое применение пептидов в качестве медицинских препаратов, в том числе для лечения диабета, затруднено их низкой биологической устойчивостью. Развиваемый в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» дипептидная концепция создания нейротропных препаратов продемонстрировала

свою эффективность созданием таких оригинальных препаратов, как дипептидный ноотроп Ноопепт, дипептидный нейролептик Дилепт, дипептидный анксиолитик ГБ-115. Однако созданные в Институте нейропротекторные дипептиды, такие как Ноопепт (Seredenin, S.B., Voronina Т.А., Gudasheva Т.А., Ostrovskaya R.U., Rozantsev G.G., Skoldinov A.P., Trophimov S.S., Halikas J.A., Garibova T.L. // US Patent. 1995. No. 5,439,930), дипептидные НГФ-миметики (Середенин С.Б., Гудашева Т.А. 2010. Патент РФ №2410392), с точки зрения наличия антидиабетической активности ранее не изучались. Это же относится и к оригинальному созданному в Институте селективному анксиолитику с нейропротекторными свойствами на основе бензимидазола Афобазолу (Середенин С.Б., Бледнов А.Ю., Савельев В.Л. Патент РФ 2061686; Бюл. изобрет., № 16. 1996). Выявленная в нейрорецепторных исследованиях способность Афобазола связываться с сп-рецепторами привлекает особый интерес к этому веществу в свете известных литературных данных о роли дефицита этих рецепторов в патогенезе диабета.

Цель исследования. Изучение на стрептозотоциновых моделях СД 2 эффектов мультитаргетных нейропротекторных препаратов, сконструированных в НИИ фармакологии имени В В. Закусова: дипептидных миметиков НГФ на основе 4-ой петли молекулы НГФ крысы и человека, ГК-2 и ГК-2 (Н), селективного анксиолитика Афобазола и его основного метаболита М-11, ноотропного препарата Ноопепт.

Основные задачи исследования.

1. Разработка режимов моделирования начальной и развитой формы стрептозотоцинового (СТЗ) диабета у крыс.

2. Оценка антигипергликемических эффектов дипептидных миметиков НГФ: ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(Ы-моносукцинил-Ь-глутамил-Ь-лизина), (HOOC-(CH2)2-CO-Glu-Lys-NH)2(CH2)s и ГК-2 (Н) (гексаметилендиамид бис-М-моносукцинил-глицил-Ь-лизина), (HOOC-(CH2)2-CO-Gly-Lys-NH-)2(CH2)6.

3. Исследование влияния НГФ-миметика ГК-2 на показатели гемостаза и фибринолиза у интактных и диабетических животных в экспериментах ex vivo.

4. Изучение антигипергликемического действия анксиолитического препарата Афобазола (5-этокси 2-[2-(морфолино)этилтио]-бензимидазола дигидрохлорид) и его основного метаболита М-11 (92-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этоксибензилимидазола гидрохлорид).

5. Исследование антидиабетического эффекта дипептидного ноотропного препарата Ноопепт (этиловый эфир Ы-фенилацкетил-Ь-пролилглицина; ГВС-111).

6. Изучение механизма антидиабетического действия Ноопепта, проявившего наиболее выраженную антидиабетическую активность.

Научная новизна. Впервые на модели начальных фаз диабета, или преддиабета, создаваемой путём повторного введения подпороговых доз СТЗ, выявлены антидиабетические свойства оригинальных нейропротекторных препаратов: дипептидных миметиков НГФ, ГК-2 и ГК-2 (Н), ноотропа Ноопепта и селективного анксиолитика Афобазола. Показана их способность нормализовать базовый уровень гликемии и ослаблять выраженность нарушений толерантности к глюкозе. НГФ-миметик ГК-2 и дипептидный ноотропный препарат Ноопепт показали быстро развивающуюся активность, вследствие чего

были изучены на модели развитого диабета, в условиях которой они предотвращали такие признаки заболевания, как гипергликемия, снижение прироста массы тела и изменения болевой чувствительности.

В экспериментах ex vivo впервые выявлен гипокоагуляционный эффект оригинального низкомолекулярного системно-активного аналога НГФ, ГК-2.

Впервые показано, что по выраженности антигипергликемических свойств и влияния на толерантность к глюкозной нагрузке на экспериментальной модели преддиабета, Ноопепт не уступает эталонному препарату Ситаглиптину.

Получены доказательства цитопротекторного действия Ноопепта. Выявлен новый механизм антигипергликемического действия Ноопепта - способность восстанавливать уровень инкретина ГПП-1 и инсулина, сниженных при диабете.

Научно-праю-ическая значимость.

Данные об эффективности Ноопепта на моделях начальных фаз диабета и развитого диабета и новые данные о механизмах его антидиабетического действия могут быть включены в регистрационное досье для получения разрешения на проведение клинических исследований эффективности препарата у больных СД 2. Полученные в работе данные делают целесообразным дальнейшее изучение дипептидных миметиков НГФ в качестве потенциальных средств фармакотерапии сахарного диабета. Учитывая тот факт, что стрессогенные воздействия служат одним из факторов возникновения диабета, дальнейшее изучение антигипергликемических свойств анксиолитика Афобазола может иметь особую научно-практическую значимость.

Методология и методы исследования. Для моделирования стадии начальных форм диабета использовали низкую дозу СТЗ (30 мг/кг, Sigma), вводимую в течение трйх последовательных дней, а для моделирования развитого диабета - среднюю дозу (40-45 мг/кг), вводимую однократно. В экспериментах применяли различные режимы внутрибрюшинного (в/б) и перорального введения соединений: профилактическое, терапевтическое и их комбинация. Используя глюкометр One Touch Ultra (USA), проводили определение фонового уровня глюкозы (натощак) в крови (обе модели диабета) и толерантности к глюкозной нагрузке (стадия начальных фаз диабета) после введения в/б раствора глюкозы в дозе 1000 мг/кг. Массу тела измеряли каждые 3-4 дня. Болевую чувствительность в тесте tail-flick исследовали с помощью прибора Analgesia test, Tail-flick, Type 812 фирмы "Hugo Sachs Elektronik" (Germany). Проводили биохимические исследования - определяли содержание малонового диальдегида (МДА), гликированного гемоглобина (HbAlc), инсулина, ГПП-1, активность ДПП-4 в плазме крови и post mortem морфометрический анализ образцов поджелудочной железы с определением доли и инсулиновой активности ß-кпеток. Для исследования показателей гемостаза (запись тромбоэластограммы (ТЭГ) на тромбоэластографе Хеллиген) и фибринолиза (фибринолиз в эуглобулиновой фракции) проводили эксперименты ex vivo.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Общность механизмов регуляции функций панкреатических ß-клеток и нейронов, сходство патогенетических основ их повреждения свидетельствуют о целесообразности изучения нейропротекторных веществ на предмет наличия у них

антидиабетического действия. Для изучения отобраны оригинальные нейропротекторные препараты, созданные в ФГБНУ «НИИ фармакологи имени В В. Закусова».

2. Используемые режимы введения диабетогенного токсина СТЗ позволяют моделировать различные фазы развития диабета: начальную (стадия глюкозотолерантностн на фоне практически нормального фонового уровня сахара в крови) при повторном введении малой дозы СТЗ (30 мг/кг) и развернутую формы (повышенный фоновый уровень глюкозы в крови и потеря массы тела) при введении средней дозы СТЗ (40-45 мг/кг). По нашим данным содержание инсулина в плазме составляет 48% от контрольного уровня - доказательство развития СД 2. Введение высоких доз СТЗ (50-70 мг/кг) в поисковых фармакологических исследованиях нецелесообразно ввиду существенной гибели животных.

3. Изученные соединения (НГФ-миметики, Ноопепт, Афобазол и его метаболит М-11) восстанавливают фоновый уровень глюкозы, улучшают толерантность к глюкозной нагрузке на моделях преддиабета и развитого диабета. Оригинальный дипептидный миметик НГФ, ГК-2, сочетает антигипергликемический эффект с антитромботическим, что может иметь важное научно-практическое значение в свете известных представлений о повышенном риске тромбообразования в условиях множественной микрососудистой патологии, характерной для диабета.

4. Высокая антигипергликемическая активность, близкая по выраженности эффекту стандартного антидиабетического препарата Ситаглиптина, выявлена у Ноопепта. Большая выраженность его эффекта в условиях перорального введения по сравнению с внутрибрюшинным позволила предположить наличие у Ноопепта инкретиномиметического действия. Это предположение подтверждено в экспериментах с определением содержания инкретина ГПП-1 и инсулина в плазме крови: Ноопепт устраняет характерный для диабета дефицит этих эндогенных факторов контроля гликемии. Инкретиномиметический эффект Ноопепта может составить основу его цитопротекгорного действия в отношении ß-клеток поджелудочной железы.

Степень достоверности. Работа выполнена на большом экспериментальном материале с использованием адекватных методов исследования; статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием современных методов математической статистики и анализа полученных данных.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на конференции «Инновации в фармакологии: от теории к практике» (Санкт-Петербург, 2014).

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии в получении исходных данных, систематизации и апробации результатов исследования. Автором лично выполнена экспериментальная часть диссертации, сформулированы основные положения и выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 7 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 тезис доклада. 1 заявка на Патент «Вещества, обладающие антидиабетической активностью (ГК-2)» (per. номер 2013129711, заявлено 28.06.13).

Объем и структура диссертации: Диссертационная работа изложена на 168 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель включает 249 публикаций, из них 64 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на 439 самцах белых крыс Вистар (питомник «Столбовая») с исходной массой тела 250-300 г. Содержание животных в виварии соответствовало Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Для моделирования диабета использовали диабетогенный токсин стрептозотоцин (Sigma), используя разные дозы и режимы введения: низкая доза токсина (30 мг/кг), вводимая в течение трех последовательных дней, моделировала стадию преддиабета. а средняя доза (40 мг/кг), вводимая однократно, моделировала развитой диабет.

В качестве исследуемых веществ с предполагаемыми антигипергликемическими свойствами использовали следующие фармакологические препараты, синтезированные в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»: Ноопепт (0.5 мг/кг в/б и 5 мг/кг перорально), оригинальные димерные дипептидные миметики НГФ, ГК-2 (0,5 мг/кг) и ГК-2 (Н) (0,1 мг/кг), вводимые в/б, Афобазол (1 мг/кг в/б и 5 мг/кг перорально) и его активный метаболит М-11 (перорально 5 мг/кг). В качестве препарата сравнения использовали ингибитор ДПП-4, Ситаглиптин, (Янувия, «Мерк Шарп и Доум Б.В.», Нидерланды), вводимый перорально в дозе 5 мг/кг.

В экспериментах применяли различные режимы введения исследуемых соединений:

1. профилактическое введение. Крыс разделяли случайным образом на 3 группы: пассивный контроль (крысам ежедневно вводили ФР в течение 29 суток), активный контроль (режим введения СТЗ описан выше в зависимости от модели диабета) и опытная группа, крысам которой в течение 14 суток вводили вещество, затем СТЗ, далее в течение последующих 14 суток вводили ФР.

2. терапевтическое введение. Схема введения первым двум группам (пассивный и активный контроли) аналогична таковой для предыдущего режима введения. Опытную группу составили крысы, которым сначала в течение 14 суток вводили ФР, затем СТЗ, а сразу после СТЗ начинали вводить вещество (14 суток).

3. комбинированное введение (профилактика-^-терапия). Схема введения первым двум группам аналогична предыдущим режимам. Крысам опытной группы ежедневно вводили соединение до и после введения СТЗ.

Для регистрации диабета в экспериментах проводили определение фонового уровня (натощак) глюкозы в крови (обе модели диабета) и толерантности к глюкозной нагрузке (стадия преддиабета) - через I и 2 часа после в/б введения раствора глюкозы в дозе 1000 мг/кг. Кровь брали из хвостовой вены, определение проводили с помощью глюкометра One Touch Ultra (USA). В экспериментах по определению показателей гемостаза кровь брали из подключичной вены.

Для характеристики сравнительной активности препаратов в динамике был рассчитан показатель антигипергликемической активности (Аг) по формуле:

|Аг = глк.СТЗ - глк.(СТЗ + препарат) / Глк.СТЗ - глк.ФР х 100%|, где: глк. СТЗ - уровень глюкозы в плазме крови в группе активного контроля; глк. (СТЗ + препарат) - уровень глюкозы в плазме крови в опытных группах; глк. ФР - уровень глюкозы в крови в группе пассивного контроля.

Измерение массы тела исследуемых животных проводилось каждые 3-4 дня. Тест на болевую чувствительность tail-flick (метод «отдергивания хвоста») проводили с помощью алгезиметра фирмы "Hugo Sachs Elektronik" (Germany).

Исследовали влияние Ноопепта на содержание одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов, малонового диальдегида (МДА) в плазме крови крыс', добавляя 20 мкл 0,485 M соли Мора, дальнейшего инкубирования (37°С, 30 мин), добавления к полученным образцам 1030 мкл 0,9% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (Serva) в 50% уксусной кислоте и окончательного инкубирования (80°С, 60 мин). Оптическую плотность охлажденных образцов измеряли на спектрофотометре DU-50 (Beckman-Coulter, США) в полумикрокювете при 532 нм. Расчет количества МДА проводили на основании значения коэффициента молярной экстинкции cm" . Все измерения проводили в 3-х

параллелях.

Для проведения дальнейших биохимических и морфометрических исследований животных декапитировали, образцы крови использовали для биохимических определений, а поджелудочной железы - для морфометрических. В биохимических исследованиях1 применяли наборы для лабораторной диагностики крыс методом иммуноферментного анализа: для количественного определения гликированного гемоглобина (HbAlc) - Rat Glycated hemoglobin Ale, GHbAlc ELISA Kit, CSB-E08140 r, Cusabio; для инсулина - Rat Insulin, INS ELISA Kit, CSB-E05070 r, Cusabio; для ГПП-1 - Rat glucagon-like peptide-1, GLP-1 ELISA Kit, CSB-E08117 r, Cusabio. Оптическую плотность измеряли при 450 нм в микропланшетном ридере (MR580 Microelisa autoreader, Dynatech product). Активность ДПП-4 оценивалась в двух версиях экспериментов: in vitro и in vivo. Определение активности ДПП-4 осуществляли на основании определения продуктов гидролиза субстрата Gly-Pro-7-амино-4-метилкумарина (Bachem) флуорометрически на спектрофлуорометре LS-5B (Perkin-Elmer) при длинах волн 380 нм (возбуждение) и 460 нм (флуоресценция).

Для морфометрических исследований2 образцы органов поджелудочной железы фиксировали в жидкости Буэна в течение 12 часов, затем проводили обезвоживание в восходящем ряду спиртов с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 7 мкм окрашивали параформальдегид фуксином (ПАФ) по Гомори в модификации Майоровой и изучали в световом микроскопе Leitz Aristoplan GMBH при увеличении 1600. Микрофотографии срезов образцов поджелудочной железы обрабатывали в программе Image J, v.l.45. При анализе срезов методом точечного счета определяли долю инсулин-

1 совместно с гл. научным сотрудником лаборатории психофармакологии ФГБНУ НИИ фармакологии пмени В.В. Закусова, доктором биологических наук, профессором H.H. Золотовым.

1 Совместно с ведущим научным сотрудником лаб. клинической и экспериментальной гистопатологии НИИ

патологии и патофизиологии, канд. биол. наук А.Б. Мичунской.

продуцирующих ß-клеток - соотношение площади, занимаемой ß-кпетками в мкм2, к общей площади островка, принятой за 100%. Оценивали также среднюю интенсивность окрашивания островков, передающую информацию о количественном содержании инсулина в ß-клетках, при помощи ПАФ и данных измерения плотности почернения микрофотографий.

В экспериментах ex vivo (внесение ГК-2 в плазму крови здоровых и диабетических животных) кровь для исследования показателей гемостаза и фибринолиза брали из яремной вены при помощи шприца, содержащего 3,8% раствор цитрата натрия (соотношение 9:1) в разные сроки эксперимента (до 45 суток) и проводили запись тромбоэластограммы (ТЭГ) на тромбоэластографе Хеллиген, а также определяли фибринолиз в эуглобулиновой фракции3. Полученные результаты позволяли оценить ряд параметров гемостаза: г - время реакции тромбинообразования, к - время начала образования сгустка, появления фибриновых нитей, та - максимальная амплитуда и угол а; и вычислить показатели плотности сгустка (И-;;;;;;-) и индексы коагуляции (I=160xtga и ci=ma/r+k).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в пакете программ Biostat с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Данные представлены в виде (М ± SEM). Результаты считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Модель начальных форм диабета, или преддиабета.

На первом этапе исследования был изучен эффект всех перечисленных выше препаратов на модели начальных форм диабета, в условиях которой уровень гипергликемии, измеренный натощак в период максимальной выраженности (4-е сутки после введения СТЗ), не превышал 12 Ммоль/л, а уже через 9 суток после введения токсина приближался к норме (5-7 Ммоль/л). Важно подчеркнуть, что даже в отдалённых сроках после окончания введения СТЗ (19-е сутки) при наличии близкого к норме базового уровня глюкозы толерантность к глюкозной нагрузке оставалась нарушенной. Известно, что стадия глюкозотолерантности предшествует развернутой клинике сахарного диабета (Дедов, И.И., Шестакова, М.В. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом // Сахарный диабет, приложение, выпуск 5. 2011. № 3). Клинические проявления диабета возникают только тогда, когда поражение охватывает не менее, чем 70 % инсулин продуцирующих клеток поджелудочной железы (Holman R.R. Assessing the potential for ß-glucosidase inhibitors in prediabetic states // Diabetes Res Clin Pract. 1998. V 40. P. 21-25; Wajchenberg, B. L. ß-Cell Failure in Diabetes and Preservation by Clinical Treatment // Endocrine Reviews. 2007. V. 28. № 2. P. 187-218). Тот факт, что в условиях использованной модели дробного введения толерантность остается нарушенной на фоне практически нормального фонового уровня в отдаленные сроки после введения СТЗ, а масса тела животных не изменяется в течение всего опыта, дает основание считать, что этот режим введения СТЗ позволяет моделировать основные черты начальных фаз диабета, или преддиабета.

3 Совместно с ст. научным сотрудником лаборатории защитных систем крови биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, кандидатом биологических наук Лютовой Л.В.

ГК-2 при терапевтическом в/б введении уже на следующий день после введения СТЗ, во-первых, снижал высокий показатель фонового уровня глюкозы, во-вторых, улучшал переносимость глюкозной нагрузки - показатель толерантности глюкозы достоверно не отличался от такового в группе пассивного контроля (Рис.1.А). В последующие дни также имело место улучшение переносимости глюкозной нагрузки (Рис. 1 .Б).

Рисунок.1. Влияние оригинального димерного дипептидного миметика ГК-2 на фоновый уровень глюкозы крови крыс (Миоль/л) и показатели гипергликемин через 1 час и 2 часа после глюкозной нагрузки на модели преддиабета (М ± SEM):

20 - IS

А) на 4-ые сутки

.......... .....-................±

Б) на 19-ые сутки

II

nh

3j

i 6 I 4

фон

ПСТЗ+ФР

>СТЗ+ГК2

Примечание: *• достоверные отклонения р<0.05 по непара-иетрическому пара-иетру Митш-Уитни относительно пассивного контроля; H - достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни относительно активного контроля.

Следующими соединениями, изученными на модели преддиабета, стали оригинальный селективный анксиолитик и нейропротекторный препарат Афобазол и его основной метаболит М-11. Эксперименты были выполнены как в условиях в/б, так и перорального терапевтического введения, показатели антигипергликемической активности которых представлены в таблице 1. Афобазол при обоих путях введения проявлял антигипергликемическое действие, что соответствует данным, полученным в лаборатории лекарственной токсикологии В.В. Забродиной на модели гестационного диабета (Zabrodina, V.V., Slireder, E.D., Shreder, O.V., Dumev A.D., Seredenin S.B. Impaired prenatal development and glycemic status in the offspring of rats with experimental streptozotocin-induced diabetes and their correction with afobazole // Bull Exp Biol Med. 2014. V. 158, № 1. P. 16-20). Сравнение динамики изменения его эффективности при в/б и при пероральном путях введения свидетельствует о том, что пероральное введение эффективнее снижает показатели нарушений толерантности, а на фоновый уровень лучше влияет в/б введение. Что касается метаболита Афобазола, то на начальных этапах эксперимента он даже ухудшает показатели гликемии, а антигипергликемический эффект развивается лишь к концу эксперимента.

Таблица.1.

Показатели антнпшергликемнческой активности Афобазола его активного метаболита М-11 фонового уровня глюкозы крови крыс и гипергликемии через 1 час и 2 часа после введения глюкозы (1000 мг/кг в/б) на модели преддиабета.

Название группы 4-ый день после введения СТЗ 12-ый день после введения СТЗ 19-ый день после введения СТЗ*

Фон 1 час 2 часа 1 час 2 часа 1 час

Аг% Афобазол в/б 76,5 47,65 -2,96 71,54 82,25 24,85

Аг% Афобазол per os 30,44 62,66 56,85 59,06 101,58 63,82

Ar% М-11 -76,82 -6,71 9,2 -12,90 28,76 41,97

Следующим изученным препаратом стал оригинальный пролин-содержащий дипептид, Ноопепт (Gudasheva, Т. A., Voronina Т.А., Ostrovskaya R.U., Rozantsev G.G., Vasilevich N.I. et all. Synthesis and antiamnestic activity of a series of N-acylprolyl-containing dipeptides // European Journal of Medicinal Chemistry. 1996. V. 31, № 2. P. 151-157), проявляющий, помимо ноотропных свойств, также комплекс нейропротекторных эффектов (Ostrovskaya, R.U., Vakhitova Y.V., Kuzmina U.Sh. et al. Neuroprotective effect of novel cognitive enhancer noopept on AD-related cellular model involves the attenuation of apoptosis and tau hyperphosphorylation // J Biomed Sci. 2014. V. 21, № 1. P. 74). Ноопепт как при в/б, так и пероральном введении проявлял антигипергликемическую активность, при этом он нормализовал базовый уровень гликемии и достоверно ослаблял выраженность нарушений толерантности к глюкозе. Сравнение антигипергликемического эффекта Ноопепта в условиях перорального и в/б введения указывает на то, что при пероральном введении он выражен максимально как по показателю фоновой гипергликемии, так и по толерантности к глюкозной нагрузке (Табл.2). На всех этапах измерения уровень глюкозы достоверно не отличался от такового у крыс группы пассивного контроля, а относительный антигипергликемический показатель Аг практически в течение всего эксперимента превышал 90% и даже достигал 103% через час после глюкозной нагрузки на 12-ые сутки после введения токсина. При в/б введении Ноопепта его антигипергликемический эффект был менее выраженным, как по величине, так и по длительности.

Таблица.2.

Сравнение антнгнпергликемического эффекта Ноопепта в условиях перорального и внутрибрюшинного введения (в дозах 5,0 и 0,5 мг/кг соответственно) на модели преддиабета (M±SEM). _

Группа 4-ый день после первого введения СТЗ 12-ый день после введения СТЗ 19-ый день после введения СТЗ*

Фон 1 час 2 часа Фон 1 час 2 часа Фон 1 час

ФР + ФР 5,33±0,03 6,67±0,18 5,1±0,22 3,9±0,1 5,43±0,09 4,4±0,1 3,98± 0,16 4,7±0,4

СТЗ +ФР 13,1±2,16* 16,06± 1,36* 15,41± 1,96* 5,74±0,57* 10,63±1,13* 9,66± 1,46* 4,98± 0,33* 9,63±0,53*

СТЗ +Ноопепт per os 5 мг/кг 5,54±0,14# 6,07± 0,39# 6,15± 0,25# 3,91±0,12# 5,18±0,26# 4,34± 0,08# 4,32± 0,19№ 5,85±0,4ff

Аг% Ноопепт per os 90,4 93,35 91,7 96,9 103 102,2 73 84,2

СТЗ+ Ноопепт 0,5 мг/кг в/б 5,39±0,31 8,77±1,06л 8,3 8± 0,95л 5,07±0,5 10,4311,56 6,95± 1,02Л 4,45± 0,26 8,36±0,72

Аг% Ноопепт в/б 94,95 67,63 68,18 35 3,9 52.1 53 25,76

Примечание: *- достоверные отклонения р<р,05 по непараметрическаму параметру Манна-Уитни между группами пассивного и активного контролей: И- достоверные отклонения р<0,05 между группами активного контроля и опытной, которой вводили Ноопепт 5 мгУкг per os; А- достоверные отклонения р<0,05 между группа ми активного контроля ш опытной, которой вводили в/б Ноопепт в дозе 0,5 мг/кг в/б

Представление о сравнительной активности изученных соединений по показателю толерантности к глюкозной нагрузке дает Рис. 2.

Рисунок. 2. Сравнение относительного показателя антигипергликемичеекой активности исследуемых соединений на всех сроках измерений через 1 час после глюкозной нагрузки на модели начальных форм диабета.

100

£ 40

20

80

60

0

LI

Ноопепт ГК-2 Ноопепт Афобазол Афобазол М-11 -20 per os в/б в/б per os в/б

□ 4-ый день И19-ыйдень

2. Модель развитого диабета.

На втором этапе работы на модели развитого диабета были исследованы димерный дипептидный миметик ГК-2 и ноотроп Ноопепт. В условиях этой модели в полном соответствии с литературными данными (Szkudelski, Т. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in В Cells of the Rat Pancreas // Physiol. Res. 2001. V. 50. № 6. P. 536-546) в этих экспериментах наблюдалась устойчивая гипергликемия до 17-24 Ммоль/л с момента первого определения (на 4-ые сутки после введения СТЗ) и в течение всего периода проведения экспериментов (28 суток). Наблюдалось также выраженное снижение массы тела.

Были изучены две модификации 4-ой петли нативной молекулы НГФ: ГК-2 и ГК-2(Н). Применялся комбинированный режим введения препаратов - до и после введения токсина. Показано, что дипептид ГК-2 достоверно снижал содержание глюкозы в крови с нарастающим эффектом: на 4-ые сутки Аг составлял 62,1% (Рис.3.А), к 17-ым суткам он увеличился до 81,5% и сохранялся на этом уровне до конца эксперимента (Рис.3.Б). ГК-2 полностью препятствовал снижению прироста массы тела крыс. ГК-2(Н) также снижал содержание глюкозы в крови уже через 3 дня после введения СТЗ (14 дней профилактики): Аг вначале составлял 42,1% (Рис.2.А), затем увеличивался и на 17-ые сутки Аг был равен 61,4%, а на 28-ые - 79% (Рис.3.Б). ГК-2(Н) также ослаблял действие токсина на массу тела крыс, и к концу эксперимента животные начали набирать вес. Важно отметить, что антидиабетический эффект обоих препаратов сохранялся после отмены препарата.

Рисунок 3. Динамика изменения уровня глюкозы в крови у крыс с комбинированным (профилактическим и терапевтическим) внутрибрюшинным введением оригинальных димерных дипептидных миметиков ГК-2 на модели развитого диабета:

А) на 4-ые сутки

Б) на 28-ые сутки

■ ГК-2 +СТЫК-2

РФРСТЗ-ФР

■ ГК-2 (1|)+СТЗ*ГК-2 (h)

□ ФР+ФР ■ гк 2 +СТЗ-ГК 2

ОФР+сгс*ФР ■ ГК-2 (L)'CTl-I К 2 (Ь)

Примечание: *- достоверность различий по Манна-Уитни .между пассивным контролем (ФР) и активным контролем (СТЗ), р<0,05; ~ - достоверность различии между группами активного контроля (СТЗ) и опытными группами (введение в/б ГК-2 (Н) О,1 мг/кг и ГК-2 0,5 мг/кг), р<0,05.

Во время этих экспериментов мы обратили внимание на то, что образование сгустка после взятия крови из хвостовой вены у диабетических животных, которым вводили ГК-2, проходило более медленно, чем у здоровых животных и диабетических, не леченых дипептидом. В связи с этим были выполнены исследования (в условиях ex vivo, т.е. соединение вносили в плазму крови), в которых определяли показатели гемостаза по расшифровке тромбоэластограммы (ТЭГ) и активности фибринолиза по скорости лизиса сгустка эуглобулинов. У диабетических крыс наблюдалась гиперкоагуляция с максимально выраженным изменением гемостаза (ускорение генерации тромбина) и резкое возрастание индексов коагуляции ci и I при замедленном лизисе эуглобулинового сгустка, свидетельствующие об опасности возникновения тромбоза, максимально выраженной через 10 суток после введения СТЗ. Добавление к плазме диабетических крыс соединения ГК-2 (10"5М) приводило к нормализации этих показателей на всех этапах измерения. У интактных животных ГК-2 также оказывает гипокоагуляционное действие, однако этот эффект менее выражен, чем у диабетических крыс. То же самое касается и фибринолитической активности: при внесении в плазму больных крыс соединения ГК-2 скорость фибринолиза нарастала. У интактных животных также наблюдалось ускорение фибринолиза под влиянием ГК-2, однако оно было менее выраженным.

Эксперименты с Ноопептом проводились с тремя режимами введения препарата: комбинированным (профилактика и терапия), профилактическим либо лечебным. Показано, что при комбинированном режиме в/б введения препарат полностью устранял гипергликемический эффект СТЗ, как во время введения препарата (Аг=95,2%), так и после его отмены (через 14 суток), что подчеркивает наличие у Ноопепта, отмеченного и в экспериментах с ГК-2, важного эффекта последействия: антигипергликемический эффект

сохранялся на высоком уровне и был равен 96,8% (Табл.3). Показано, что профилактическое введение несколько превышает по эффективности терапевтическое - показатель Аг к концу эксперимента составлял при этих режимах введения Ноопепта 67,6% и 52% соответственно (Табл.3). Характерное для данной модели диабета снижение массы тела также полностью предотвращалось применением Ноопепта во всех режимах - животные не только не худели, но даже и прибавляли в весе (Рис. 4).

Таблица 3.

Содержание глюкозы в крови у крыс в экспериментах с различными режимами внутрибрюшинного введения Ноопепта в дозе 0,5 мг/кг на модели развитого диабета (М ± SEM).

Группы На 4-ые сутки после CT3 или ФР На 14-ые сутки после СТЗ или ФР На 28-ые сутки после СТЗ или ФР

Пассивный контроль - 5,91±0,13 5,91 ±0,13

Активный контроль - 16,96±3,57; р<0,05 16,8±4,1; р<0,05

Профилактика+ терапия Ноопептом - 6,44±0,07; р<0,05 6,26±0,24; р<0,05

Аг - 95,2% 96,8%

Пассивный контроль б,22±0,18 5,9±0,13 -

Активный контроль 20.1±1,87; р<0.05 20,27±3.2; р<0,05 -

Профилактика Ноопептом I4,4±I,81; р<0,05 10,55±1,66;р<0,05 -

Аг 41% 67,6% -

Пассивный контроль 6,22±0,18 5,8±0,12 6,1±0,2

Активный контроль 19,3±2,33; р<0,05 21,9±2,45; р<0,05 24,4±4,28; р<0,05

Терапия Ноопептом 20,33±2,88; р<0,05 15,95±3,52; р<0,05 14,88±3,76;р<0,05

Аг - 37,30% 52,00%

Рисунок 4. Предотвращение эффекта потери массы тела крыс на стрептозотоциновой модели диабета в условиях комбинированного введения Ноопепта (14-ые сутки); так и после его отмены (28-ые сутки), (М ' SEM).

Примечание: *- достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между группами пассивного и активного контролен; # - достоверные отклонения р<0,О5 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между опытными группами и группой активного контроля.

В этих экспериментах проводилось также определение порога болевой чувствительности в тесте tail-flick. (TSE Analgesia System, USA), в котором отмечали латентный период отдергивания хвоста. Известно, что диабет часто сопровождается явлениями диабетической невропатии. В наших экспериментах этому соответствовало снижение порога болевой реакции у крыс, которым вводился СТЗ - с 3,01±0,34 сек в группе пассивного контроля до 2,16±0,35 сек. Ноопепт повышал порог болевой чувствггтельности до 4,63±1,22 сек.

Механизм антигипергликемпческоП активности Ноопепта.

Биохимические и морфометрические исследования.

Учитывая наличие у Ноопепта выраженной и быстро развивающейся антидиабетической активности, представляло интерес уточнить некоторые механизмы его действия.

Известно, что диабет 2-го типа является многофакторной патологией. В его патогенезе, помимо инсулиновой резистентности и дефицита нейротрофических факторов, важнейшая роль принадлежит накоплению свободных радикалов в сочетании с дефицитом антиоксидантных систем. Эффективность Ноопепта по этим параметрам ранее была продемонстрирована на нейрональных тканях в условиях нормального уровня глюкозы (Pelsman, A., Hoyo-Vadillo, С., Gudasheva, T., Seredenin S.B., Ostrovskaya R.U. et al. GVS-111 prevents oxidative damage and apoptosis in normal and Down's syndrome human cortical neurons // Int.J. Devi. Neuroscience. 2003. V. 21, № 3. P. 117-124; Менджерицкий A.M., Лысенко A.B, Демьяненко C.B., Прокофьев В.H., Гудашева T.A. и соавт. Процессы перекисного окисления липидов в коре больших полушарий головного мозга и плазме крови молодых крыс с высоким уровнем тревожности при эмоциональном стрессе; защитный эффект ноотропного дипептида ГВС-111 // Нейрохимия. 2003. Т. 20, № 4. С. 281-286). Представляло интерес изучить влияние Ноопепта на свободно-радикальное окисление (по показателю МДА) на модели СТЗ-диабета. В совместных экспериментах с профессором H.H. Золотовым было показано, что СТЗ повышает уровень МДА с 0,61±0,02 Ммоль/л в группе пассивного контроля до 1,85±0,22 Ммоль/л в группе диабетических крыс, а Ноопепт нормализует этот показатель (0,58±0,05 Ммоль/л), т.е. устраняет это проявление оксидативного стресса.

Известно, что в ЖКТ образуется ряд гормонов, которые выделяются в ответ на прием пищи и потенцируют глюкозостимулированную секрецию инсулина: глюкагоноподобный полипептид-1 (ГПП-1) и гастроингибирующий полипептид (ГИП) (Elliott, R.M., Morgan L.M., Tredger J.A., Deacon S., Wright J. et all. Glucagon-like peptide-1 (7-36)-amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute postprandial and 24-h secretion patterns // J Pediatr Endocrinol Metab. 1993. V. 138, №1. P. 159-166). При диабете активность системы инкретинов снижена, главным образом за счет снижения секреции ГПП-1 (Vilsboll, T., Krarup, Т., Deacon, C.F., Madsbad S., Holst J.J. Reduced postprandial concentrations of intact biologically active glucagon-like peptide 1 in type 2 diabetic patients // Diabetes. 2001. V. 50, № 3. P. 609-613). При этом установлено, что пероральное введение глюкозы стимулирует секрецию инсулина в большей степени, чем ее внутривенное введение. Этот феномен был обозначен, как инкретиновый эффект.

Полученные данные о большей выраженности антигипергликемической активности Ноопепта в условиях перорального введения по сравнению с таковым при внутрибрюшинном введении позволили предположить возможность вовлечения в реализацию его действия инкретиновых механизмов

Поскольку сами инкрстины являются короткоживущими пептидами, для увеличения длительности их действия применяются ингибиторы ДПП-4 - фермента, расщепляющего инкретины. Препаратом «золотого стандарта» из этой группы является перорально активный антидиабетический препарат Ситаглиптин.

Нами были проведены эксперименты, в которых Ноопепт и Ситаглиптин сравнивались как по антигипергликемической активности, так и по биохимическим эффектам.

Показано, что оба препарата снижают фоновую гипергликемию, по влиянию на этот показатель Ноопепт близок Ситаглиптину, а по способности нормализовать толерантность к глюкозной нагрузке даже его превосходит (Табл.4).

Таблица 4.

Влияние Ноопепта и Ситаглиптина на фоновый уровень глюкозы крови крыс (Ммоль/л) и показатели гипергликемии через 1 час и 2 часа после глюкозной нагрузки на модели начальных форм диабета (М ± БМ). _

4-ый день после введения СТЗ 12-ый день после введения СТЗ 19-ый день после введения СТЗ

Фон I час 2 часа Фон 1 час 2 часа Фон 1 час

ФР +ФР 4,98± 0,24 5,28± 0,13 5,1± 0,13 3,82± 0,17 5,5±0,18 4,46± 0,1 3,98± 0,16 4,7±0,4

СТЗ+ФР 10,84± 1.31* 17,15± 1,74» 17,93± 2,05* 6,74± 1,4* 15,67± 1,75* 9,86± 1.9* 5,27± 0,44* 2±1,9*

СТЗ+ Ноопепт рег 05 5,54± 0,14# 6,07±0, 39# 6,15± 0,25# 3,91± 0,12# 5,18± 0,26# 4,34± 0,08# 4,3 2± 0,19# 5,85± 0,4#

Аг% Ноопепт рег оя 90,4 93,35 91,7 96,9 103 102,2 73 84,2

СТЗ+ Ситаглиптин 5 мг/кг рег о5 5,11± 0,28# 10,0± 1,3» 7,25± 1,25# 4,8± 0,13# 6,04± ОМ 5,9± 0,43 # 4,78± 0,29 8,81± 0,8#

Аг% Ситаглиптин 5 мг/кг рег 05 97,9 59,9 83,5 66,4 94,6 73,3 37,9 43,6

Примечание: * - достоверность р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между группами пассивного и активного контролен; # - достоверность р<Р.05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между опытными группами и группой активного контроля.

На следующем этапе были выполнены эксперименты, в которых сравнивали влияние этих препаратов на содержание в плазме инсулина и ГПП-1. Показано, что СТЗ вызывает достоверное снижение уровней инсулина и ГПП-1, которое полностью устраняется введением как Ноопепта, так и Ситаглиптина (Рис.5.А.Б).

Рисунок 5, Содержание в плазме крыс четырёх экспериментальных групп:

А) Инсулина (нмоль/л) Б) ГПП-1 (peg/ml)

in "

ill

CTi+HooniBl СТСКГатвглншив

12000 : 10000 mm \ 6000 4000 2000

СТЗ-Hoonem СП+Ситаглнптив

Примечание: *- достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическаму параметру Манна-Уитни между группами пассивного и активного контролен; # - достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между опытными группами и группой активного контроля.

При морфометрической оценке проводился анализ средней активности инсулин продуцирующих клеток по двум параметрам: по окрашиванию островков с помощью ПАФ (Табл. 5) и по измерению плотности полученных микрофотографий (Рис.6).

Рисунок 6. Плотность инсулин продуцирующих Р-клеток поджелудочной железы:

А) Норма Б) Диабет В) Ноопепт Г) Ситаглиптин

61088 46368 54349 59848

Плотности почернения микрофотографий (Рис. 6), рассчитанные в программе Image J, v.1.45, передают условную информацию о насыщенности инсулином ОЛ. Видно, что в активном контроле она намного ниже, чем в пассивном, а оба препарата восстанавливают указанный показатель. Эти данные согласуются с результатами непосредственного измерения интенсивности по окрашиванию островков с помощью ПАФ. Они свидетельствуют о протекторном эффекте исследуемых соединений по отношению к р-

клеткам: СТЗ снижал интенсивность в 2,9 раза по отношению к группе пассивного контроля, а Ноопепт и Ситаглиптин восстанавливали этот показатель (Табл. 5).

Таблица 5.

Сравнение влияния Ноопепта и Ситаглиптина на среднюю площадь ß-клеток островков Лангерганса (мкм2), (М ± SEM).

Группа Доля ß-клеток % Интенсивность окрашивания по ПАФ

ФР+ФР 71,91±2,49 2,2+0,05

СТЗ+ФР 23,03+6,12 * 0,76+0,12 *

СТЗ+Ноопепт 77,3+4,23 # 1,79+0,23 #

СТЗ+Ситаглиптин 73,33+5,6 # 2,18+0,28 #

Примечание: *- достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между группами пассивного и активного контролей; Ü - достоверные отклонения р<Р,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между опытными группами и группой активного контроля.

Эти данные подтверждены также результатами точечного анализа: доля ß-клеток у активного контроля уменьшена в 3 раза по сравнению с группой пассивного контроля, тогда как у животных, которым вводился Ноопепт или Ситаглиптин, она восстанавливается до значений пассивного контроля и даже превышает его (Рис.7, Табл.5).

Рисунок 7. Восстановление Ноопептом и Ситаглиптином активной части (средняя площадь, мкм2) островков Лангерганса, содержащей ß-клетки, в исследуемых группах на модели преддиабета (М ± SEM).

3500 3000 2500 ^ 2000 г 1500 1000 500 0

ГП"

ФР+ФР СТЗ+ФР СТЗ+Ноопепт СТЗ+Снтаглшпин

□ Средняя S ОЛ. мкм2 □ Средняя S активной части. мкм2

Примечание: *- достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между группами пассивного и активного контролей; # - достоверные отклонения р<0,05 по непараметрическому параметру Манна-Уитни между опытными группами и группой активного контроля.

Таким образом, в настоящей работе впервые показана способность Ноопепта устранять характерный для диабета дефицит ГПП-1 и инсулина. Выполненный морфометрический анализ позволил получить убедительные доказательства цитопротекторного действия Ноопепта в отношении р-клеток поджелудочной железы.

Известно, что инкретины обладают нейротрофической активностью: активируют процессы неогенеза и пролиферации ß-клеток, препятствуя их апоптозу (Tarabra, Е, Pelengaris, S., Khan, M. A Simple Matter of Life and Death—The Trials of Postnatal Beta-Cell Mass Regulation // International Journal of Endocrinology. 2012. V. 2012. Article 516718). Поскольку Ноопепт восстанавливает сниженный при диабете уровень ГПП-1, можно предположить, что именно этот, инкретинопозитивный эффект Ноопепта, является основной причиной его цитопротекторного действия.

***

В целом, полученные в работе данные свидетельствуют о наличии антидиабетического эффекта у оригинальных нейропротекгорных препаратов, синтезированных в НИИ Фармакологии имени В В. Закусова. Представления о важнейшей роли в патогенезе диабета дефицита нейротрофических факторов и недостаточности антиоксидантных систем в поджелудочной железе диктуют целесообразность дальнейшей разработки миметиков НГФ и селективного анксиолитика Афобазола в качестве антидиабетических средств. Отмечено, что оригинальный дипептидный миметик НГФ, ГК-2, сочетает антигипергликемический эффект с антитромботическим, что может иметь важное научно-практическое значение в свете известных представлений о повышенном риске тромбообразования в условиях множественной микрососудистой патологии, характерной для диабета. Что касается Афобазола, интерес к этой молекуле обусловлен также теми обстоятельствами, что для него показана способность связываться с а г и мелатониновыми - МТ-3 рецепторами (Середенин С.Б., Воронин М.В. Нейрорецепторные механизмы действия Афобазола // Экспер имент. и клин, фармакология. 2009. Т. 72, № 1. С. 3-11), а при диабете имеет место их дефицит (Simsek, N., Kaya M., Kara A., Can I., Karadeniz A., Kalkan Y. Effects of melatonin on islet neogenesis and beta cell apoptosis in streptozotocin-induced diabetic rats: an immunohistochemical study // Dornest Anirn Endocrinol. 2012. V. 43, № 1. P. 47-57; Mardon K, Kassiou M, Donald A. Effects of streptozotocin-induced diabetes on neuronal sigma receptors in the rat brain. Life Sei. 1999. V. 65, №23. P. 281-286). Интересно отметить, что на начальных фазах развития диабета, в период максимальной эффективности Афобазола, его метаболит М-11 не проявлял антигипергликемическую активность. Поскольку Афобазол проявляет агонистические свойства в отношении, главным образом, el-рецепторов и, в меньшей степени -мелатониновых МТ-3 рецепторов, а М-11, в основном, - в отношении МТ-3 рецепторов, полученные данные можно трактовать как доказательство ведущей роли ai-рецепторов в реализации антигипергликемического действия Афобазола. Учитывая тот факт, что стресс является одним из факторов риска развития метаболического синдрома и диабета, выявленные свойства Афобазола могут расширить показания к применению этого эффективного анксиолитика. Полученные впервые данные о цитопротекторном действии Ноопепта в отношении ß-клеток поджелудочной железы соответствует современным представлениям (Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S.M., Wagner, B.K. Targeting the pancreatic ß-cell to treat diabetes // Nature Reviews Drug Discovery. 2014. V. 13, № 4. P 278-289) о том, что разработка малых молекул, действие которых направлено на стимуляцию пролиферации инсулин продуцирующих клеток поджелудочной железы, является перспективным этиотропным направлением поиска антидиабетических средств.

Выводы

1. Применяемые режимы введения диабетогенного токсина стрептозотоцина позволяют воспроизвести в опытах на крысах основные черты: а) начальной формы СД 2 (избирательное нарушение толерантности к глюкозной нагрузке при сохранении нормального базального уровня гликемии и отсутствие изменений массы тела) - при повторном введении токсина в течение последовательных 3-х дней в малой дозе, 30 мг/кг. б) развитого диабета (базальная гипергликемия, потеря массы тела, полиурия, гиперестезия) -при однократном введении средней дозы 40 мг/кг.

2. Дипептидный миметик 4-ой петли НГФ, соединение ГК-2, в условиях в/б введения в дозе 0,5 мг/кг ослабляет нарушение толерантности к глюкозной нагрузке на модели начальной формы диабета на всех сроках измерений. Соединения ГК-2 и ГК-2 (Н) на модели развитого диабета в условиях их в/б введения в дозах 0,5 мг/кг и 0,1 мг/кг соответственно снижают повышенный фоновый уровень глюкозы в крови как в условиях профилактического и комбинированного введения, так и через 2 недели после их отмены. На этой модели на всех сроках измерений НГФ-миметики предотвращают характерные для данной модели диабета потерю веса и полиурию.

3. Однократное в/б введение СТЗ в дозе 40 мг/кг вызывает ускорение генерации тромбина, возрастание индексов коагуляции при замедленном фибринолизе. Добавление к плазме диабетических крыс соединения ГК-2 (10-М) в экспериментах ex vivo ведёт к замедлению процесса тромбообразования, проявлению фибриндеполимиразионного эффекта, снижению плотности сгустка и индексов коагуляции.

4. Анксиолитический препарат Афобазол в условиях как в/б (1 мг/кг), так и перорального (5 мг/кг) введения ослабляет нарушение толерантности к глюкозной нагрузке. Этот эффект развивается медленнее, чем при введении ГК-2, но к концу эксперимента (19-ые сутки) показатели толерантности приближаются к норме. Основной метаболит Афобазола М-11 в условиях его перорального введения (5 мг/кг) также ослабляет нарушение толерантности к глюкозной нагрузке, при этом антигипергликемический эффект проявляется с еще большей задержкой, чем у Афобазола.

5. Дипептидный ноотропный препарат Ноопепт на модели начальных форм диабета (в условиях в/б и перорального введения в дозах 0,5 и 5 мг/кг соответственно) снижает выраженность гипергликемии и ослабляет нарушение толерантности к глюкозной нагрузке. При пероральном способе введения его эффективность более выражена, чем при в/б. По выраженности антигипергликемической активности Ноопепт близок к эталонному антидиабетическому препарату Ситаглиптину. На модели развитого диабета в условиях различных режимов в/б введения (профилактика, терапия и их комбинация) в дозе 0,5 мг/кг Ноопепт снижает выраженность гипергликемии и потерю веса. Антидиабетический эффект препарата сохраняется после его отмены.

6. На модели СТЗ-диабета Ноопепт (0,5 мг/кг, в/б) устраняет проявления оксидагивного стресса, нормализуя содержание продуктов перекисного окисления в плазме крови. Ноопепт (5 мг/кг, per os), как и Ситаглиптин, восстанавливает сниженные при диабете уровни инсулина и инкретина ГПП-1 в плазме крови. Ноопепт проявляет цигопротекторную

активность в отношении р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, повышая их долю (%) до показателей пассивного контроля.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основе результатов проведенных исследований, рекомендуются:

1. Полученные в работе данные делают целесообразным дальнейшую разработку вопроса об использовании нейропротекторных препаратов с целью профилактики и лечения диабета.

2. Рекомендуется использование модели преддиабета для поиска фармакологических средств профилактики диабета и терапии его начальных форм.

3. Целесообразно дальнейшее изучение оптимальных режимов введения Афобазола, а также исследование механизмов его антигипергликемического действия.

4. Рекомендуется продолжение изучения дозозависимости ангигипергликемическпх эффектов и механизмов действия ГК-2 в качестве потенциальных средств фармакотерапии сахарного диабета.

5. Полученные данные об антидиабетическом действии Ноопепта могут быть использованы при составлении регистрационных документов для проведения клинических испытаний эффективности препарата у больных СД 2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Островская, Р.У. Эффективность Ноопепта на стрептозотоциновой модели диабета у крыс [Текст] / Р.У. Островская, И.В. Озерова, Т.А. Гудашева, И Г. Капица, Е.А. Иванова, Т.А. Воронина, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2012. -Т. 154, № 9. - С.317-321.

2. Озерова, II. В. Изучение эффекта димерного дипептидного миметика N0? человека на модели диабета у крыс [Текст] / И.В. Озерова, П.Ю. Поварнина, Р.У. Островская, Т.А. Гудашева, Т.А. Воронина, С.Б. Середенин // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2013.-Т. 76,№5.-С. 10-13.

3. Поварнина, П.Ю. Антидиабетическая активность оригинального дипептидного миметика фактора роста нервов [Текст] / П.Ю. Поварнина, И.В. Озерова, Р.У. Островская, Т.А. Гудашева, С.Б. Середенин // Доклады академии наук. Физиология. - 2013. - Т. 449, №3. -С. 364-366.

4. Островская, Р.У. Сравнительная активность пролинсодержащего дипептида "Ноопепт" и ингибитора дипепгидил-пегтгидазы-4 ситаглиптина на модели развивающегося диабета у крыс [Текст] / Р.У. Островская, И.В. Озерова, Т.А. Гудашева, И.Г. Капица, Е.А. Иванова, Т.А. Воронина, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 9. - С. 317-321.

5. Озерова, И.В. Динамика некоторых показателей гемостаза и фибринолиза при развитии стрептозотоцинового диабета у крыс [Текст] / И.В. Озерова, Р.У. Островская, Л.В. Лютова // Тромбоз гемостаз и реология. - 2013. - № 4. - С. 57-61.

6. Озерова, И.В. Гипокоагуляционный эффект оригинального миметика фактора роста нервов ГК-2 [Текст] / И.В. Озерова, JI.B. Лютова, Р.У. Островская, Т А. Гудашева, С Б. Середенин // Эксперим. и кпинич. фармакология. - 2013. - Т. 76, № 9. - С. 11-14

7. Островская, Р.У. Ноопепт восстанавливает показатели инкретиновой системы при моделировании диабета у крыс [Текст] / Р.У. Островская, H.H. Золотов, И.В. Озерова, Е.А. Иванова, И.Г. Капица, К.В. Тарабан, А.Б. Мичунская, Т.А. Воронина, Т А. Гудашева, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157, № 3. -С. 321-327.

Тезисы:

1.Островская, Р.У. Новые подходы к лечению болезни Альцгеймера и диабета, основанные на концепции сходства их патогенетических механизмов [Текст] / Р.У. Островская, И.В. Озерова / Материалы конференции «Инновации в фармакологии: от теории к практике», Санкт-Петербург, 2014// Обозрение психиатрии и медицинской психологии имени В.М. Бехтерева. Приложение. - 2014. - С. 137-138.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аг - показатель антигипергликемической активности

БА - болезнь Альцгеймера

ГПП-1 - глюкагоноподобного пептида-1

ДПП-4 - дипептидил-пептидаза-1У

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИР - инсулинорезистентность

МДА - малоновый диальдегид

НГФ (ЫОР) - фактор роста нервов

ОЛ - островок Лангерганса

ПАФ - параформальдегид фуксин

СД 2 - сахарный диабет 2 типа

СТЗ - стрептозотоцин

ТЭГ - тромбоэластограмма

Подписано в печать:

08.07.2015

Заказ № 10904 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru