Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Высокодозная программная риск-адаптированная терапия лимфомы из клеток мантии.

Воробьев Владимир Иванович

ВЫСОКОДОЗНАЯ ПРОГРАММНАЯ РИСК-АДАПТИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ЛИМФОМЫ ИЗ КЛЕТОК МАНТИИ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1 ¡¡АР 7014

МОСКВА-2014 г.

005546509

005546509

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

д.м.н., профессор Домрачева Елена Васильевна к.м.н., доцент Кравченко Сергей Кириллович Официальные оппоненты:

1. Тумян Гаяне Сепуговна, доктор медицинский наук, профессор кафедры онкологии государственного бюджетного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, ведущий научный сотрудник отделения химиотерапии гемобластозов Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Федерального агентства

научных организаций;

2. Луговская Светлана Алексеевна, доктор медицинский наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики государственного бюджетного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства

Здравоохранения Российской Федерации.

Ведущее научное учреждение: Ведущей организацией рекомендуется Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Д. Рогачева» Министерства Здравоохранения Российской Федерации;

Защита диссертации состоится «23» апреля 2014 года в 14^_часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 125167, Москва, Новый

Зыковский проезд, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации Автореферат разослан « // » марта 2014 года И.о. ученого секретаря диссертационного совета,

доктор медицинских наук Галстян Г.М.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AJ1T - аланинаминотрансфераза ACT — аспартатаминотрансфераза

аутоСКК — аутологичные стволовые кроветворные клетки

аутоТСКК — трансплантация аутологичных стволовых кроветворных клеток

БПВ - беспрогрессивная выживаемость

БРВ - безрецидивная выживаемость

БСВ - бессобытийная выживаемость

г/л — грамм в литре

Гр - фей

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт КМ - костный мозг KT — компьютерная томография ЛДГ — лактатдегидрогиназа

J1KM - лимфома из клеток мантии (ЛКМЗ - лимфома из клеток мантийной зоны) OB - общая выживаемость

ОО — общий ответ (полные ремиссии + частичные ремиссии) ПР - полная ремиссия

ПСКК — плюрипотентная стволовая кроветворная клетка способная к

мультилинейной дифференцировке

ПХТ — полихимиотерапия

УЗИ — ультразвуковое исследование

4P - частичная ремиссия

BEAM(R) — программа ПХТ, включающая кармустин 300 мг/м2 в -6 день; цитарабин 200 мг/м2 2 раза в день с -5 по -2 дни; этопозид 200 мг/м2 2 раза в день с -5 по -2 дни; мелфалан 140 мг/м2 в -1 день; (ритуксимаб 375 мг/м2 в 0-й день непосредственно перед выполнением аутоТСКК) FISH - флюоресцентная гибридизация in situ

MIPI(b) - международный прогностический индекс для лимфомы из клеток мантии (Ь — биологический).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Лимфома из клеток мантии (JIKM) составляет около 5% от всех неходжкинских лимфом и диагностируется преимущественно у мужчин старшей возрастной группы. Характеризуется наличием патогенетической транслокации t(l I;14)(ql3;q32), или ее редкими вариантами t(2;ll)(pll;ql3) и t(ll;22)(ql3;ql 1), приводящими к перестройке протоонкогена CCND1 в локусы генов иммуноглобулинов. В результате развивается гиперэкспрессия ядерного белка-регулятора клеточного цикла циклина D1, что приводит к многократным повторным входам клетки в S-фазу.

В 90% случаев заболевание представлено агрессивно протекающей лимфомой, вовлекающей различные группы лимфатических узлов, селезенку, костный мозг, периферическую кровь, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), печень, орбиту и другие экстранодальные органы. В 10% случаев характеризуется многолетним течением с преимущественным вовлечением селезенки, костного мозга и периферической крови.

Особенностью заболевания является рецидивирующее течение, несмотря на различные режимы терапии. Нами высказано предположение, что одной из причин рецидивирующего течения JIKM может быть раннее возникновение патогенетических нарушений, например, в плюрипотентной стволовой кроветворной клетке, способной к мультилинейной дифференцировке (ПСКК). Примером такого события является хронический миелолейкоз (XMJI) - патогенетическая t(9;22)(q34;ql 1) выявляется в большинстве клеточных линий включая В- и Т-лимфоциты. Подобные исследования выполнены у больных с фолликулярной лимфомой - заболевании, характеризующимся рецидивирующим течением. Патогенетическая t(14;18)(q32;q24) не выявлена в ПСКК, в том числе и в CD34+CD19+ клетках-предшественницах В-лимфопоэза. В отношении лимфомы из клеток мантии описаний подобных исследований на сегодняшний день не существует.

Применение (Я)СНОР-подобных курсов эффективно только в достижении общего ответа (ОО): полные ремиссии (ПР) достигаются в трети случаев, а медиана бессобытийной выживаемости (БСВ) составляет 16-20 месяцев. В связи с этим в последние два десятилетия общей тенденцией является максимально возможная интенсификация индукционной терапии, с включением трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток (аутоТСКК) в первую линию терапии и использование анти-С020 антител на всех этапах лечения.

Для интенсификации индукционной терапии JIKM используются высокие дозы цитарабина и/или метотрексата. Это сопряжено с развитием гематологической токсичности IV степени (ст.), высоким риском тяжелых инфекционных осложнений и острой почечной недостаточности. Медиана возраста больных JIKM, которым предполагается проведение интенсивной индукционной полихимиотерапии (ПХТ), колеблется от 50 до 60 лет. У трети больных из этой группы выявляется сопутствующая патология, хроническая почечная недостаточность и/или гипоплазия костномозгового кроветворения. Это приводит к невыполнению высокодозной ПХТ в полном объеме у 30-50% больных, уменьшению числа больных достигших ПР, укорочению БСВ и ОВ.

Например, снижение дозы цитарабина в индукционной ПХТ с 12 до 4 г/м2 ведет к уменьшению сроков БСВ с 5,5 до 3 лет, хотя ПР достигаются в 89 и 84% случаев соответственно. Это подталкивает на поиск оптимальной по переносимости и эффективности индукционной ПХТ у больных с сопутствующей патологией в возрасте 55-65 лет. Альтернативой высоким дозам цитарабина и метотрексата могут явиться курсы ПХТ, включающие гемцитабин и оксалиплатин. Их высокая эффективность многократно продемонстрирована в терапии рецидивов и резистентных форм лимфопролиферативных заболеваний, включая ЛКМ.

С целью высокодозной консолидации у больных ЛКМ моложе 65-70 лет используется аутоТСКК, причем её применение возможно и у пациентов с частичной ремиссией (ЧР) заболевания. Это позволяет увеличить как БСВ, так и ОВ, что продемонстрировано в прямых сравнительных проспективных исследованиях. Несмотря на различную токсичность интенсивной индукционной терапии и наличие сопутствующей патологии, выполнение аутоТСКК с использованием режима кондиционирования по схеме ВЕАМ(Я) возможно у большинства больных ЛКМ в возрасте до 65 лет.

Интенсивная индукционная ПХТ и аутоТСКК позволили увеличить продолжительность жизни больных и снизить процент рецидивов заболевания: медиана ОВ достигла 10 лет, а медиана БСВ - более 7 лет. Тем не менее, рецидивирующее течение ЛКМ диктует необходимость поиска возможных вариантов поддерживающего лечения. Терапия ритуксимабом после среднедозной ПХТ у пожилых пациентов увеличила не только БСВ, но и ОВ. Однако данных об эффективности поддерживающей терапии ритуксимабом после высокодозной индукционной ПХТ и аутоТСКК у больных с ЛКМ нет.

Цель исследования. Изучение эффективности, выполнимости и токсичности программной риск-адаптированной терапии больных лимфомой из клеток мантии в возрасте до 65 лет.

Задачи:

1. Разработать алгоритм обследования больного с ЛКМ до начала терапии, включающий высокочувствительную диагностику вовлечения костного мозга, эндоскопические методы исследования желудочно-кишечного тракта с обязательными множественными биопсиями слизистых, выполнение люмбальной пункции для оценки клеточного состава ликвора.

2. Оценить индивидуальную переносимость первого курса ПХТ по схеме II-ЕРОСН и выделить наиболее значимые факторы прогноза развития тяжелых и неконтролируемых осложнений для дальнейшей стратификации больных в разные по интенсивности терапевтические группы.

3. Провести анализ эффективности и выполнимости альтернирующих схем индукционной терапии 11-ЕРОСН/11-НО-Ме1-АгаС и Я-ЕРОСН/Я-ОЮЮХ, оценить время достижения полной ремиссии, адекватность мобилизации аутологичных стволовых кроветворных клеток и реализуемость трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток.

4. Оценить токсичность схем индукционной терапии R-EPOCH, R-HD-Met-AraC, R-GIDIOX и поддерживающей терапии ритуксимабом после трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток.

5. Определить наличие t(lI;14)(ql3;q32) у больных JIKM до лечения в следующих клеточных линиях: гранулоциты, моноциты, клетки-предшественницы экспрессирующие антиген CD34, Т-лимфоциты, нормальные В-лимфоциты и эритрокариоциты.

Научная новизна.

Создан протокол высокодозной полихимиотерапии больных лимфомой из клеток мантии моложе 65 лет, учитывающий индивидуальную переносимость индукционной терапии.

Продемонстрирована высокая эффективность гемцитабин и оксалиплатин содержащих схем полихимиотерапии в индукции ремиссии больных JIKM с сохранением возможности адекватной мобилизации стволовых кроветворных клеток.

Определена токсичность поддерживающей терапии ритуксимабом после высокодозной индукционной терапии и трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток у больных JIKM.

Показано, что t(l I;14)(ql3;q32) встречается только в опухолевых В-лимфоцитах, коэкспрессирущих CD5 и CD 19 и не выявляется в других линиях кроветворения, в том числе в клетках-предшественницах, экспрессирующих CD34.

Научно-практическая ценность работы.

Разработан протокол обследования и высокодозной терапии больных JIKM моложе 65 лет с учетом индивидуальной переносимости индукционной терапии.

Определена эффективность лечения больных лимфомой из клеток мантии по протоколу терапии JIKM3-2010.

Оценена токсичность альтернирующих схем индукционной терапии R-EPOCH/R-HD-Met-AraC, R-EPOCH/R-GIDIOX и поддерживающей терапии ритуксимабом после трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток.

Внедрен метод флюоресцентной гибридизации in situ в клетках различных популяций, выделенных на флюоресцентно-активированном клеточном сортере.

Положения, выносимые на защиту

1. Создан высокоэффективный протокол лечения больных лимфомой из клеток мантии моложе 65 лет, основанный на использовании альтернирующих (чередующихся) курсов ПХТ по схемам R-EPOCH/R-HD-Met-AraC или R-EPOCH/R-GIDIOX, аутоТСКК (BEAM-R) и поддерживающей терапии ритуксимабом.

2. Гематологическая токсичность первого индукционного курса ПХТ по схеме R-EPOCH, развитие тяжелых инфекционных осложнений и наличие признаков почечной недостаточности являются достаточными критериями выбора схемы альтернирующей индукционной ПХТ: R-EPOCH/R-HD-Met-AraC или R-EPOCH/R-

GIDIOX. Это позволяет значительно уменьшить риск развития жизнеугрожающих осложнений, связанных с гематологической и негематологической токсичностью.

3. В группе больных, получивших терапию по схеме R-EPOCH/R-HD-Met-AraC+ayToTCKK+R-поддержкэ, ПР достигнуты в 96,2% случаев, 3-летняя БСВ составила 78%, 3-летняя ОВ - 80%, гематологическая токсичность IV ст. развивалась в 100% случаев. Летальность, связанная с лечением, составила 3,8%.

4. В группе больных, которым проводилась терапия по схеме R-EPOCH/R-GIDIOX+ayToTCKK+R-поддержка, ОО достигнут в 93% случаев, ПР достигнуты в 80% случаев; 3-летняя БСВ составила 79%, 3-летняя ОВ — 93%, гематологическая токсичность IV ст. развивалась в 74,5% случаев, летальность составила 0%.

5. Адекватная мобилизация и сбор аутологичных стволовых кроветворных клеток периферической крови выполнен у 87,2% больных. У 12,8% больных выполнены эксфузии костного мозга: у 8% (2 из 25) больных из группы, которым проводилась терапия по программе R-HD-Met-AraC и у 21,4% (3 из 14) пациентов, кому проводилась терапия по схеме R-GIDIOX.

6. Поддерживающая терапия ритуксимабом в дозе 375 мг/м2 1 раз в 3 месяца в течение 3 лет после выполнения высокодозной индукционной ПХТ и аутоТСКК у больных ЛКМ сопровождалась высокой частотой инфекционных осложнений. В группе R-HD-Met-AraC осложнения I-II ст. констатированы в 44% случаев, III-IV ст. — 0%. В когорте R-GIDIOX осложнения I-II ст. развились в 50% случаев, III-IV ст. — в 14%. У 6/14 (43%) больных из группы R-GIDIOX поддерживающая терапия ритуксимабом прерывалась на 3 и более месяца из-за развития рецидивирующих инфекционных осложнений. У 2/14 терапия остановлена через 6 и 12 месяцев.

7. Транслокация t(l I;14)(ql3;q32) встречается только в опухолевых В-лимфоцитах, коэкспрессирущих CD5 и CD 19 и не выявляется в других линиях кроветворения, в том числе в клетках-предшественницах, экспрессирующих CD34.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, 4 в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены в научно-клиническом отделении химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний с функциональной биохимической группой (оХГЗиИТ) ФГБУ ГНЦ МЗ РФ, обсуждены и доложены на Гематологическом декаднике (Москва 2010-2012 гг.), IX Российской конференции «Злокачественные лимфомы» (Москва 2012 г.), на международных конференциях: 16th Congress of European Hematology Association (Лондон, 2011), American Society of Hematology (Атланта, 2012), 18th Congress of European Hematology Association (Стокгольм, 2013) (Постерные доклады).

Апробация диссертации состоялась на проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови и порфирии» 06 ноября 2013 г. (Протокол №8).

Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов

исследования, двух глав собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 8 отечественных и 258 иностранных источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 21 рисунком и 2 схемами.

Диссертация выполнена в научно-клиническом отделении химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний с функциональной биохимической группой (ХГЗиИТ, заведующий отделением - к.м.н., доцент Кравченко С.К.) и лаборатории кариологии (заведующая лабораторией - к.м.н. Обухова Т.Н.) в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор — академик РАМН Савченко В.Г.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

С мая 2008 г. по сентябрь 2013 г. в проспективное исследование, инициированное ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ (директор — академик РАМН проф. Савченко В.Г.), включено 46 больных с диагнозом лимфома из клеток мантии в возрасте от 29 до 64 лет (медиана 55 лет): 35 (76%) мужчин и 11 (24%) женщин. Протокол обследования и лечения больных JIKM моложе 65 лет (JIKM3 2010) одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ.

40 больным индукционная ПХТ и аутоТСКК выполнены в отделении ХГЗиИТ ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. 2 пациентам терапия в полном объеме проведена в отделении химиотерапии лимфом и трансплантации костного мозга МНИОИ им. П.А. Герцена (заведующая отделением — к.м.н. Тюрина Н.Г.). 4 больным индукционная терапия проведена в отделении химиотерапии гемобластозов ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (заведующий отделением — д.м.н. Османов Е.А.), в отделении гематологии Ярославской ОКБ (заведующая отделением - Ротанова М.Н.), в отделении гематологии ОКОД №1 г. Волгограда (заведующий отделением — к.м.н. Капланов К.Д.) и в химиотерапевтическом отделении Пермского краевого онкодиспансера (заведующая отделением — Хоринко A.B.). Данным 4 пациентам аутоТСКК выполнены в отделении ХГЗиИТ ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Эксфузии аутологичных клеток костного мозга 5 больным и аутоТСКК одной пациентке выполнены в отделении трансплантации костного мозга (заведующая отделением - к.м.н. Кузьмина JI.A.). Поддерживающая терапия ритуксимабом всем пациентам проводится по месту жительства.

Диагноз JIKM устанавливался на основании морфологического и иммуногистохимического исследования биоптата опухоли или иммунофенотипического исследования методом проточной цитофлюориметрии клеток крови или костного мозга в соответствии с критериями классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной Организации Здравоохранения 2008 года. Обязательным доказательством диагноза JIKM служило выявление при цитогенетическом исследовании в клетках опухоли t(l I;14)(ql3;q32).

Таблш(а 1. Характеристика больных с диагнозом ЛКМ включенных в исследование.

Параметры п=46 (100%)

Возраст, диапазон (лет): 29-64

<50 13(28%)

50-59 20 (44%)

>60 13(28%)

Медиана возраста (лет) 55

Пол: Мужчины 35 (76%)

Женщины 11 (24%)

Концентрация ЛДГ выше нормы 24 (52%)

Стадия (Ann Arbor): IE 1 (2%)

II 0 (0%)

III 1 (2%)

IV 44 (96%)

Наличие В-спмптомов 23 (50%)

ECOG 0-1 27 (59%)

>2 19(41%)

Наличие Bulky-disease 9 (20%)

Увеличение селезенки (один из размеров > 130 мм) 24 (52%)

Вовлечение ЖКТ (всего) 34 (74%)

Визуально 27 (59%)

При гистологическом исследования «слепых» биоптатов 7(15%)

Вовлечение костного мозга 42 (91,3%)

Лейкоцитоз более 30*109/л 5(11%)

Цитологический вариант: Классический 37 (80%)

Плеоморфный 3 (7%)

Бластоидный 6(13%)

Ki-67: <10 20 (43%)

11-29 15(33%)

>30 11 (24%)

М1Р1ь: Низкий 13 (28%)

Промежуточный 15(33%)

Высокий 18(39%)

п — количество больных.

Протокол обследования больного ЛКМ.

Создан протокол обследования больного с впервые установленным диагнозом лимфома из клеток мантии, который включал: сбор анамнеза, опрос больного и физикальный осмотр; лабораторные и инструментальные исследования до начала терапии:

1. Общий анализ крови (в т.ч. ретикулоциты + тромбоциты).

2. Биохимический анализ крови (в том числе ЛДГ).

3. Общий анализ мочи, проба Реберга, определение клиренса креатинина.

4. Коагулограмма (АЧТВ, ПТИ, тромбиновое время, фибриноген).

5. Определение маркеров вирусных гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции.

6. Электрокардиография (ЭКГ), эхокардиография.

7. Биопсия лимфоузла или другого пораженного органа, диагностическая лапароскопия или лапаротомия, особенно в случаях изолированного вовлечения внутрибрюшных и забрюшинных органов.

8. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования лимфатического узла или другой ткани опухоли с обязательным определением экспрессии следующих антигенов: CD5, CD10, CD20, CD23, CD34, cyclinDl и Ki-67, при возможности SOX 11. Возможно выполнение иммунологического исследования методом проточной цитофлюориметрии клеток костного мозга, крови или лимфоузла (CD5, CD 10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD43, FMC7, CD38, TdT, CD3, Ki-67).

9. Выполнение цитогенетического исследования в клетках лимфоузла, другой ткани опухоли или костного мозга/крови для выявления t(l I;14)(ql3;q32).

10. Трепанобиопсия костного мозга (билатеральная) с выполнением иммуногистохимического исследования (CD5, CD19, циклин D1).

11. Пункция и получение аспирата костного мозга (определение вовлечения костного мозга при отсутствии гистологических признаков методом FISH, с использованием проточной цитофлюориметрии или выявление В-клеточной клональности методом ПЦР по реарранжировкам генов IgVH).

12. Ультразвуковое исследование (УЗИ) периферических и внутригрудных лимфоузлов, органов брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза, щитовидной железы, молочных желез, подкожных образований; у мужчин — предстательной железы, у женщин — малого таза.

13. Компьютерная томография (KT) органов шеи, грудной клетки и брюшной полости; при вовлечении паренхиматозных органов - с внутривенным контрастированием. KT костей лицевого скелета, орбит и головного мозга по показаниям.

14. Выполнение люмбальной пункции с цитологическим исследованием ликвора для исключения нейролейкемии.

15. Эзофагогастродуоденоскопия и фиброколоноскопия с обязательными биопсиями слизистых, даже при отсутствии визуальных признаков вовлечения. «Слепые» биопсии выполняются в желудке, двенадцатиперстной кишке, в сигмовидной кишке, поперечной ободочной и слепой кишке.

16. Иммунохимическое исследование белков сыворотки крови и мочи.

17. Магнитно-резонансная томография органов малого таза, головного и спинного мозга по показаниям.

18. Осмотр гинеколога, криоконсервирование спермы (по показаниям).

19. Группа крови, резус фактор, фенотип.

20. Консультация нефролога при специфическом поражении почек.

21. Консультация эндокринолога по показаниям. Компенсированный сахарный диабет не является противопоказанием для проведения программной ПХТ.

Контрольные обследования (рестадирования) с целью оценки эффективности ПХ'Г проводились после 2, 4, 6 и 8 курсов ПХТ и после аутоТСКК.

Контрольное обследование больного включало:

1. Общий анализ крови;

2. Биохимический анализ крови;

3. КТ и УЗИ всех вовлеченных органов.

4. ЭГДС и ФКС выполняются после 4 и 8(6) курсов ПХТ, а в случае сохранения вовлечения слизистых ЖКТ после индукционной терапии - после аутоТСКК.

5. Исследование костномозгового кроветворения, в т.ч. с использованием высокочувствительных методов (ПЦР, проточная цитофлуометрия) проводилось перед началом 6 или 8 курсов ПХТ, после которых планировалась мобилизация и сбор аутоСКК.

При достижении ПР после 4-го курса ПХТ на основании данных КТ, УЗИ и эндоскопических исследований контроль костномозгового кроветворения осуществлялся перед 6 курсом. При констатации достижения костномозговой ремиссии после 6-го курса выполнялся сбор аутоСКК и далее проводился курс высокодозной консолидации по схеме BEAM-R с аутоТСКК.

6. Позитронно-эмиссионная томография выполнялась через 4-5 недель после аутоТСКК при наличии остаточных образований.

Распространенность опухолевого процесса на момент установления диагноза оценивали по классификации Ann Arbor.

Протокол терапии больных ЛКМ в возрасте до 65 лет.

Всем 46 пациентам с впервые установленным диагнозом ЛКМ моложе 65 лет, включенным в исследование, проводился первый курс ПХТ по схеме Я-ЕРОСН.

В зависимости от развившейся токсичности после первого курса по схеме Я-ЕРОСН, все больные делились на две группы:

- в первую группу включались пациенты для проведения максимально интенсивной терапии с использованием высоких доз метотрексата и цитарабина;

- во вторую - больные для проведения менее интенсивной терапии, основанной на использовании гемцитабина и оксалиплатина (схема 1).

Схема 1.

Схема терапии пациентов с лимфомой из клеток мантии моложе 65 лет.

R-EPOCH

R-GIDIOX ^

Таблица 2. Критерии выбора ветви терапии (К-ЕРОСН/Я-НМА или К-ЕРОСН/К-_С ¡РЮХ) после первого курса по схеме Е-ЕРОСН_

Параметры оценки после К-ЕРОСН Высокодозная ветвь R-EPOCH/R-HD-Met-AraC I группа Среднедозная ветвь R-EPOCH/R-GIDIOX II группа

Лейкопения Лейкопения III ст. (лейкоциты менее 2,0* 10%) не более 3 суток Лейкопения III ст. длительностью более 3 суток или лейкопения IV ст. (лейкоциты менее 1,0*109/л)

Инфекционные осложнения Отсутствие жизнеугрожающих инфекционных осложнений и лихорадки более 38,0°С Сепсис, пневмония, некротическая энтеропатия,

Почечная недостаточность Нет признаков, в т.ч. компенсированной стадии Острая почечная недостаточность и другие токсические осложнения III-IV ст.

В первую группу (ветвь R-HD-Met-AraC, R-HMA) включались больные, у которых после первого курса ПХТ по схеме R-EPOCH не развивались лейкопения III ст. более 3 суток и тяжелые инфекционные осложнения III-IV ст., отсутствовали любые признаки почечной недостаточности и другие токсические осложнения III-IV ст. Пациентам из этой группы второй курс ПХТ проводился по схеме R-HD-Met-AraC (ритуксимаб 375 мг/м2 в 0 день, метотрексат 1000 мг/м2 однократная инфузия за 24 часа в 1 день, цитарабин 3000 мг/м2 2 раза в день во 2-3 дни).

Критериями включения пациентов во вторую группу (ветвь R-GIDIOX) служили: развитие после первого курса ПХТ по схеме R-EPOCH гематологической токсичности III ст. более 3 суток или гематологической токсичности IV ст., возникновение серьезных инфекционных осложнений III-IV ст., наличие любых признаков почечной недостаточности и/или других токсических явлений III-IV ст. Больным, включенным во вторую группу, после первого курса ПХТ по схеме R-ЕРОСН проводился курс ПХТ по схеме R-GIDIOX (ритуксимаб 375 мг/м2 в 0 день, гемцитабин 800 мг/м2 в 1 и 4 дни, оксалиплатин 120 мг/м2 во 2 день, иринотекан 100 мг/м2 в 3 день, дексаметазон 10 мг/м2 в/в в 1-5 дни, ифосфамид 1000 мг/м2 в 1-5 дни).

В дальнейшем, в обеих группах, курсы ПХТ альтернировались (чередовались): пациентам в первой группе проводилась терапия по схеме R-EPOCH/R-HD-Met-AraC, во второй - R-EPOCH/R-GIDIOX. В зависимости от времени достижения полной ремиссии проводилось от 6 до 8 курсов терапии (3-4 цикла, схема 1).

Длительность одного курса ПХТ вместе с посткурсовым периодом составляла 21 сутки, т.е. первый день следующего курса был 22 днем от 1 дня предыдущего. При развитии тяжелых инфекционных осложнений и/или длительной панцитопении длительность курсового и посткурсового периода увеличивалась до 28 суток.

Развитие лейкопении III ст. более 3 суток или лейкопении IV ст. у пациентов моложе 55 лет со значительным вовлечением в опухолевый процесс костного мозга и развитием панцитопении до начала ПХТ при отсутствии других серьезных осложнений и сопутствующих заболеваний не служило причиной перевода больного в группу R-EPOCH/R-GIDIOX.

При удовлетворительной переносимости курса R-EPOCH, а именно, при отсутствии инфекционных осложнений и лейкопении IV ст., дозы этопозида, циклофосфамида и доксорубицина в последующих курсах увеличивались на 20-25% от стандартных.

Сбор аутоСКК осуществлялся после 6 или 8 курсов ПХТ, в зависимости от момента достижения полной ремиссии заболевания. В случае отсутствия ПР, но достижении 4P, в т.ч. и при сохранении вовлечения костного мозга после 8 курсов ПХТ сбор аутоСКК выполнялся.

Минимально необходимое количество CD34+ клеток для выполнения аутоТСКК составляло 2,0*106/кг. Непосредственно перед первым лейкоцитаферезом вводилось 375 мг/м2 ритуксимаб с целью уменьшения возможной контаминации трансплантата CD20+ клетками — «очистка» трансплантата in vivo.

Всем больным, кому полностью проведена индукционная ПХТ, выполнено не менее 6 введений ритуксимаба.

При неудовлетворительной мобилизации аутоСКК из периферической крови выполнялась эксфузия костного мозга.

Кондиционирование всем пациентам проводилось по схеме BEAM-R. Ритуксимаб в дозе 375 мг/м2 вводился в 0-й день непосредственно перед аутоТСКК с целью уменьшения возможной контаминации трансплантата CD20+ клетками.

При сохранении остаточных опухолевых образований после аутоТСКК больным выполняли позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ). При наличии очагов метаболической гиперфиксации проводилась лучевая терапия в дозе 36 Гр только на остаточные образования.

После развития у двоих больных ранних рецидивов с изолированным вовлечением центральной нервной системы, с ноября 2011 г. всем пациентам проводится профилактика нейролейкемии. Она включает 4 люмбальные пункции с интратекальными введениями 30 мг цитарабина, 15 мг метотрексата и 4 мг дексаметазона в период индукционной ПХТ. Кроме того, профилактика нейролейкемии осуществлена у больных, кому аутоТСКК выполнена после ноября 2010 г.

Поддерживающая терапия ритуксимабом в дозе 375 мг/м2 1 раз в три месяца в течение 3 лет начиналась через три месяца после аутоТСКК.

Для оценки степени токсичности использовалась шкала токсичности ВОЗ.

После аутоТСКК осмотр больных и контрольные обследования выполнялись 1 раз в 3 месяца в течение первых трех лет в дни введений ритуксимаба, далее — 1 раз в 6 месяцев.

Определение t(ll;14)(ql3;q32) методом FISH в различных популяциях клеток, выделенных с использованием флюоресцентно-активированного клеточного сортера.

Исследованы аспираты костного мозга 12 первичных больных с цитогенетически доказанным диагнозом JIKM, включая двух больных с бластоидным вариантом заболевания.

Выделение популяций клеток с использованием флюоресцентно-активированного клеточного сортера.

После согласия больного аспират костного мозга получали из гребня подвздошной кости, используя не менее двух пункций. Суммарный объем составлял 9 мл — 6 пробирок с ЭДТА по 1,5 мл.

Полученную взвесь костномозговых клеток фильтровали (фильтры РПсоп с диаметром пор 50 мкм), двукратно отмывали фосфатно-солевым буфером с добавлением 1% раствора бычьего альбумина (5-я фракция, рН=7,3) и осаждали центрифугированием при 400g в течение 5 минут при температуре +4°С 2 раза.

После отмывки материал инкубировали с моноклональными антителами в темноте при температуре +4°С в течение 30 минут. Для каждого антитела концентрацию определяли индивидуально методом титрования

Таблица 3. Панель антител для проведения мечения клеток.

Проба с антителами Выделяемая популяция

CD45 (FITC), CD34 (РЕ) Клетки-предшественницы: СГО4+ С045<1пп

CD5 (FITC), X (РЕ), CD19 (РегСР-Су5.5) или CD5 (АРС), к (FITC), CD 19 (РЕ)* Клетки ЛКМ: С05+СШ9+ Х/к+

CD5 (FITC), X (РЕ), CD 19 (РегСР-Су5.5) или CD5 (АРС), к (FITC), CD19 (РЕ)* Нормальные В-лимфоциты: С05-С.019+

CD45 (FITC), CD 14 (РЕ) Моноциты: С045+С014+

CD45 (FITC), CD14 (РЕ) Гранулоциты выделялись по боковому светорассеянию (Б5С), исключая полигон моноцитов

CD45 (FITC), CD3 (РЕ) Нормальные Т-лимфоциты: С045+003+

CD45 (FITC), CD235(GIyA) (РЕ) Эритрокариоциты: С045-С0235(01уА)+

*определение тональности проводилось предварительно.

После окончания инкубации эритроциты лизировали использованием BD FACS Lysing Solution. Лизирующий буфер в рабочей концентрации при температуре 37°С добавляли к костному мозгу в соотношении 9 частей лизирующего буфера к I части исследуемого материала. Инкубацию в термостате при температуре +37°С проводили в течение 10 минут. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием при 400g в течение 5 минут при температуре +4°С, двукратно отмывали добавлением 9 частей фосфатно-солевого буфера с 1% раствором бычьего альбумина (5-я фракция, рН=7,3) и центрифугированием при 400g в течение 5 минут при температуре +4°С.

Сортировка клеток проводилась на клеточном сортере F ACS Vantage SE (использованное сопло (nozzle) 70 мкм, давление 26 psi, частота 42 кГц). В качестве обжимающей жидкости использовался раствор BD FACS Flow. Фракции клеток выделяли сначала по светорассеянию, а потом по следующим сочетаниям антигенов:

- Гранулоциты выделялись по боковому светорассеянию (side scattering, SSC), исключая полигон моноцитов (CD45+CD14+); моноциты и лимфоциты располагались по светорассеянию в общем полигоне.

Дальнейшее разделение популяций проводилось по следующим сочетаниям антигенов:

- Клетки-предшественницы: CD34+CD45dim;

- Клетки опухоли: CD5+CD19+Ä/K+;

- Нормальные B-лимфоциты: CD5-CD19-;

- Моноциты: CD45+CD14+;

- Т-лимфоциты: CD45+CD3+;

- Эритрокариоциты: CD45-CD235(GlyA)+.

После выделения на клеточном сортере, чистоту полученных популяций клеток анализировали на проточном цитометре FACS CantoII (исследовали не менее 1000 событий). Дополнительную инкубацию с антителами не выполняли.

После оценки чистоты, клетки осаждали центрифугированием при 400g в течение 5 минут при температуре +4°С, отмывали от фосфатно-солевого буфера раствором ледяной уксусной кислоты и метанола 1-2 раза (в зависимости от количества клеток в образце). Нанесение клеток на предметные стекла осуществляли в цитоспиновой центрифуге (Cellspin II Tharmac, 1000 оборотов в минуту, 8 минут), благодаря чему, все клетки наносились на определенный участок предметного стекла диаметром менее 5 мм.

Флюоресцентная гибридизация in situ.

В работе использовали ДНК-зонд LSI IgH/CCNDl Dual color, Dual Fusion Translocation Probe (Vysis).

Гибридизацию выполняли по протоколу фирмы-производителя Vysis для локусспецифических и центромерных проб (http://www.vvsis.com).

Программа работы Hybrite включает в себя нагревание до 75°С в течение 2 минут (денатурация) с последующим снижением температуры до 37°С и поддержанием ее в течение всего периода инкубации (гибридизация).

Визуализацию сигналов проводили под флюоресцентным микроскопом Zeiss-Axioscope с использованием тройного фильтра DAPI/ORANGE/GREEN. В каждом случае по возможности анализировали 200 интерфазных ядер с четкими сигналами.

Оценка результатов гибридизации.

Ядра с двумя красными и двумя зелеными сигналами или одним красным, одним зеленым и одним желтым сигналами считали негативными (без транслокации). Ядра с одним красным и одним зеленым сигналами от нормальных хромосом 11 и 14 и двумя желтыми (слитными) сигналами от дериватов 11-й и 14-й хромосом считали позитивными, т.е. с транслокацией t(l I;14)(ql3;q32).

Чувствительность метода в каждом конкретном случае определяли чистотой, полученной на клеточном сортере популяции клеток.

Статистическая обработка данных.

Анализ выживаемости проводился по методу Каплана-Мейера (при сравнении выживаемости использовался log-rang критерий). Исследовались общая

выживаемость (время отсчитывалось от начала ПХТ до летального исхода от любой причины или последней информации о больном) и бессобытийная выживаемость (от начала ПХТ). Данные представлены в виде медианы (и размаха), среднего арифметического ± стандартное отклонение и абсолютных чисел (проценты).

С целью нахождения предикторов летального исхода выполнен многофакторный анализ (методом логистической регрессии). Многофакторный анализ проведён в два этапа. Вначале выполнен одномерный анализ, в результате которого были выделены статистически значимые факторы, которые в дальнейшем были подвергнуты многофакторному анализу.

Статистическую обработку результатов проводили в лаборатории биостатистики ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующий лабораторией - к.т.н. С.М. Куликов, с.н.с. Э.Г. Гемджян).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты лечения по протоколу ЛКМЗ-2010.

В группу максимально интенсивной терапии К-ЕРОСН/11-ЕШ-Ме1-АгаС(К-НМА) были отнесены 28/46 пациентов, в группу Я-ЕРОСН/Я-ОШЮХ включено 18/46 больных (схема 1). К сентябрю 2013 г. медиана наблюдения составила 26 месяцев (от 3 до 65 месяцев).

Схема 2. Распределение больных.

46 больных первый курс R-EPOCH

М/Ж : 7б%/24% Возраст 29-64 года (медиана 55 лет) М1Р1„: 28% низкого, 33% промежуточного и

39% высокого риска / 4

Высояодоэная ветвь R'EPOCH/R-HD-Met-AraC Средиедозная ветвь Я ЕР0СН/Н-С1Р10Х

28 больных: М/Ж: 89,3%/Ю,7% Возраст 29-64 года (медиана 51 год) М1Р1Ь: 35,7% низкого, 28,6% промежуточного и 35,7% высокого риска 18 больных: М/Ж: 55,б%/44,4% Возраст 41-63 года (медиана 60 лет) М1Р1Ь: 16,7% низкого, 38,9% промежуточного и 44,4% высокого риска

К сентябрю 2013 г. аутоТСКК выполнена 39 больным: 25/28 из группы R-HD-Met-AraC и 14/18 из группы R-GIDIOX.

Источником стволовых кроветворных клеток в 34/39 случаях (87,2%) была периферическая кровь, в 5/39 случаях (12,8%) неудачной мобилизации выполнены

эксфузии костного мозга: 2/25 пациентам из группы R-HD-Met-AraC и 3/14 больным из группы R-GIDIOX. Плериксафор в нашем исследовании не использовался.

У 23/25 больных из группы R-HD-Met-AraC медиана количества сеансов лейкоцитафереза составила 2 (1-6), медиана собранных CD34+ клеток-предшественниц составила 3,14*106/кг (2,0-9,2* 10 /кг).

У 11/14 пациентов из группы R-GIDIOX медиана количества сеансов лейкоцитафереза составила 2 (1-6), медиана полученных CD34+ клеток-предшественниц составила 3,7*10б/кг (2,0-18,0* 106/кг; см. приложение).

Целью эксфузии костного мозга было получение 2-3*108/кг ядросодержащих клеток в независимости от количества полученных ранее стволовых кроветворных клеток периферической крови.

3-х летняя поддерживающая терапия ритуксимабом завершена у 11/39 больных (у 4/25 из группы R-HD-Met-AraC и у 7/14 из группы R-GIDIOX). 2/14 из группы R-GIDIOX поддерживающая терапия ритуксимабом прекращена досрочно из-за развития тяжелых инфекционных осложнений III-IV ст. 26/39 больных (21/25 из группы R-HD-Met-AraC и у 5/14 из группы R-GIDIOX) поддерживающая терапия продолжается.

У 1/18 больного с бластоидным вариантом заболевания из группы R-GIDIOX констатирована прогрессия заболевания до аутоТСКК; 1/28 больной скончался после первого курса по схеме R-HD-Met-AraC в результате септического шока.

5/46 пациентам (2/28 из группы R-HD-Met-AraC и 3/18 из группы R-GIDIOX) проводится индукционная ПХТ.

Токсичность.

Проанализирована токсичность 142 курсов R-EPOCH (42/46 больных), 100 курсов R-HD-Met-AraC (28/28 больных) и 58 (17/18 больных) курсов R-GIDIOX, что составило 93,8% от всех проведенных курсов ПХТ.

После проведения курсов R-EPOCH лейкопения IV ст. развилась в 19,7% случаев, тромбоцитопения III и IV ст. — по 3,5%, анемия III и IV ст. - в 21,1% и в 6,3% случаев соответственно. Медиана длительности лейкопении IV ст. составила 2,5 суток (от 1 до 6 суток), при развитии тромбоцитопении IV ст. потребность в трансфузиях тромбоконцентрата составляла 8 доз на эпизод. При развитии анемии IV ст. средняя потребность в трансфузиях эритроцитной массы составляла 1,5 дозы на эпизод. В 2/3 случаев гематологическая токсичность III-IV ст. после курса R-EPOCH развивалась у пациентов старше 55 лет. Увеличение доз вепезида, доксорубицина и циклофосфамида на 20-25% выполнено в 34,7% (49/142) случаев: у 20/28 больных из группы R-HD-Met-AraC и у 3/18 больных из группы R-GIDIOX. Снижение доз вепезида, доксорубицина и циклофосфамида на 50% потребовалось в 1/142 случае (1/18 больной из группы R-GIDIOX).

Гематологическая токсичность III-IV ст. развилась у всех пациентов после курсов ПХТ по схеме R-HD-Met-AraC. Лейкопения IV ст. зарегистрирована в 97% случаев, с медианой длительности 6 суток (от 1 до 14 суток). Тромбоцитопения IV ст. — в 95% случаев, анемия III и IV ст. — в 29% и 14% случаев соответственно. Средняя потребность в трансфузиях компонентов крови составила: 7,3 дозы

тромбоконцентрата на эпизод при развитии тромбоцитопении III ст., и 11,7 дозы при тромбоцитопении IV ст., при развитии анемии IV ст. - 2,15 дозы эритроцитной массы на эпизод. Дозы цитарабина уменьшали на 25-50% в 12% случаев (12/100 курсов, 5/28 больных), метотрексата на 30-40% - в 3% (3/100 курсов, 3/28 больных).

Гематологическая токсичность при проведении лечения по схеме R-GIDIOX была следующей: лейкопения IV ст. развивалась в 74,1% случаев, с медианой длительности 4,5 суток (от 1 до 13 суток). Тромбоцитопения IV ст. развилась в 39,7% случаев со средней потребностью в трансфузиях 10 доз тромбоконцентрата на эпизод. Анемия IV ст. — в 24,1% случаев со средней потребностью в трансфузии 1,7 дозы эритроцитной массы на эпизод. Снижение доз химиопрепаратов на 25-50% потребовалось в 6,9% (4/58) случаев, у 3/18 больных.

Инфекционные осложнения после курсов R-HD-Met-AraC развивались в 69% случаев против 46,6% после курсов R-GIDIOX. Сепсис диагностирован в 5,2-6%. Развитие почечной недостаточности I-II ст. констатировано после 8% (8/100) курсов R-HD-Met-AraC у 4/28 больных, IV ст. с развитием анурии - в 1% (1/100) случаев (1/28 больной).

Таблица 4. Негематологическая токсичность.

Параметр Степень R-EPOCH R-HD-Met-AraC R-GIDIOX

токсичности (142 курса; 42/46 больных) (100 курсов; 28/28 больных) (58 курсов; 17/18 больных)

Стоматит I-II 13,4% 45% 27,6%

III-IV 0,7% 2% 6,9%

Диарея I-II 3,5% 8% 20,7%

(энтеропатия) III-IV 1,4% 1% 19,0%

Пневмония 1,4% 11% 3,4%

I 9,9% 15% 19,0%

Лихорадка II 9,9% 50% 25,9%

III-IV 0% 4% 1,7%

Сепсис 1,4% 6% 5,2%

Тошнота/рвота (с антиэм етиками) I 39,4% 15% 1,7%

II 11,3% 2% 3,4%

III-IV 0% 2% 0%

Повышение актив- I-II 12,0% 18% 65,5%

ности АЛТ и ACT III-IV 0,7% 5% 6,9%

Повышение уровня I-II 1,4% 8% 10,3%

креатинина III-IV 0% 1% 0%

Из неинфекционных осложнений, связанных с курсом R-GIDIOX отмечено развитие печеночной недостаточности: транзиторное повышение активности аминотрансфераз до I-II и III-IV ст. в 65,5% (38/58) и 6,9% (4/58) случаев соответственно, но без клинических проявлений и нарушения белково-синтетической функции печени. Уровни АЛТ и ACT нормализовались в течение 7-10 суток после курса, без дополнительной терапии.

Повышение активности АЛТ и ACT при проведении курсов R-EPOCH и R-HD-Met-AraC происходило, как правило, после первых курсов ПХТ, и, по всей видимости, было связано с лизисом опухоли в печени.

Была отмечена высокая частота эпизодов тошноты I-II ст. (50,7%) во время проведения курсов R-EPOCH, несмотря на плановое применение ондансетрона или его аналогов.

За исключением пациента (1/26), погибшего после первого курса HD-Met-АгаС, всем больным (25/26) проведено запланированное количество курсов терапии.

Токсичность схемы R-GIDIOX оказалась промежуточной между токсичностью курсов R-EPOCH и R-HD-Met-AraC.

В работе не использовалась селекция больных, связанная с гематологической и негематологической токсичностью. Единственным критерием, определявшим количество курсов терапии, было время достижения полной ремиссии ЛКМ. Неудача в мобилизации и сборе аутоСКК из периферической крови в нашем исследовании не являлась причиной отказа от аутоТСКК — в 5/39 случаев выполнена эксфузия костного мозга.

В группе R-HD-Met-AraC восстановление количества лейкоцитов после высокодозной консолидации по схеме BEAM-R и трансплантации аутоСКК периферической крови составила 11 дней, в группе R-GIDIOX — 10 дней.

5/39 больных (2/25 из группы R-HD-Met-AraC и 3/14 из группы R-GIDIOX) из-за неудачной мобилизации и сбора аутоСКК в качестве трансплантата после высокодозной консолидации по схеме BEAM-R использованы ядросодержащие клетки костного мозга. Медиана восстановления количества лейкоцитов более 1,0*109/л после аутоТСКК составила 17 суток (14-28). Медиана потребности в трансфузиях тромбоконцентратов составила 41 дозу (16-105), эритроцитов — 4 дозы (0-5), что существенно выше, чем после трансплантации аутоСКК периферической крови.

К сентябрю 2013 г. 3-летняя поддерживающая терапия ритуксимабом в дозе 375 мг/м2 1 раз в 3 месяца начата у всех 39 больных, кому выполнена аутоТСКК. Завершена поддерживающая терапия у 11/39 больных: у 4/25 из группы R-HD-Met-АгаС и у 7/14 из группы R-GIDIOX.

Поддерживающая терапия ритуксимабом сопровождалась развитием рецидивирующих инфекционных осложнений I и II ст. у 11/25 (44%) больных из группы R-HD-Met-AraC, III-IV ст. — 0%. Увеличения 3-месячных интервалов между введениями ритуксимаба более чем на 1 месяц не потребовалось.

В группе R-GIDIOX, поддерживающая терапия ритуксимабом после аутоТСКК (14/18 больных) сопровождалась инфекционными осложнениями I-II ст. у 7/14 (50%; рис. 15) пациентов и III-IV ст. - у 2/14 (14%) больных. У 6/14 (43%) пациентов из группы GIDIOX, из-за развития рецидивирующих инфекционных осложнений поддерживающая терапия ритуксимабом прерывалась на 3 и более месяца.

Эффективность.

Оценка эффективности терапии проводилась с учетом международных стандартизованных критериев ответа на лечение при неходжкинских лимфомах (Cheson 2009).

При достижении ПР после 4 курсов терапии, больным суммарно проводилось 6 курсов индукционной терапии. В случае достижения ПР на более позднем этапе всем больным проводилось 8 курсов индукционной терапии.

К сентябрю 2013 г. в группу R-HD-Met-AraC включено 28 больных. 25/28 выполнена индукционная терапия и аутоТСКК, 1/28 больной скончался в результате септического шока после курса ПХТ по схеме HD-Met-AraC, у 2/28 больных продолжается индукционная ПХТ. У 25/26 больных из группы R-HD-Met-AraC, получивших индукционную терапию в полном объеме, ПР достигнуты в 100% случаев до выполнения аутоТСКК. В зависимости от времени достижения ПР 19/25 (76%) пациентам потребовалось проведение 8 курсов индукционной ПХТ, 6/25 (24%) - 6 курсов.

У 4/25 больных после 8 курсов индукционной терапии по схеме R-EPOCH/R-HD-Met-AraC и аутоТСКК сохранялись остаточные образования. Во всех случаях повышенного накопления радиофармпрепарата при ПЭТ исследовании не выявлено, а при дальнейшем наблюдении у всех больных констатировано исчезновение остаточных образований.

В группу R-GIDIOX включено 18 больных, у 3/18 продолжается индукционная терапия. Противоопухолевый ответ на терапию получен в 14 из 15 случаев (93,3%): ПР достигнуты у 11 пациентов (73,3%), ЧР - у 3 (20%). У 1 больного с бластоидным вариантом заболевания после 5 курсов индукционной терапии констатирована прогрессия заболевания. АутоТСКК выполнена у всех больных с ЧР и ПР (14/15), причем все ПР были достигнуты до аутоТСКК, а ЧР не были конвертированы в ПР в результате трансплантации.

3 больным с ЧР заболевания, после аутоТСКК проведена лучевая терапия на область остаточных образований в дозе 36 Гр. ПР достигнута в одном случае; во втором — сохранение ЧР, чья продолжительность к сентябрю 2013 г. составила 37 месяцев после аутоТСКК; в третьем — прогрессия заболевания через 3 месяца после завершения лучевой терапии. Из 14 больных, у кого достигнуты ПР или ЧР, 10/14 (71%) проведено 8 курсов индукционной ПХТ, 4/14 (29%) пациентам - 6 курсов.

100% -5

Ь

80% -

>

ш

ш 60% -

X

ш 40% -

и.

=г

«о 20% -

и

[Ч-ЬЮ-МеиАга

100% -

80% -

ф

со 60% -

*

40% -

IX

СО

ю 20% -

О

0% -

48

24 36

Время (мес.

О 12 24 36

Время (мес.

Рисунок 1. Общая выживаемость пациентов ЛКМ кому проводилась ПХТ по схемам

Я-Нй-Ме1-А гаС и Я-вЮЮХ.

3-летняя ОВ в группах больных, кому проводилась терапия по программам Я-ЕРОСН/Я-НО-Ме^АгаС (п=28) и Я-ЕРОСН/Я-ОГОЮХ (п=18) равна 80%±11% и 93%±6% соответственно.

24 36 48 60 Время (мес.

Рисунок 2. Бессобытийная выживаемость пациентов ЛКМ кому проводилась ПХТ по схемам Я-НО-Ма-АгаС и Я-вЮЮХ.

3-летняя БСВ в группах больных, кому проводилась терапия по программам Я-НО-Ме1:-АгаС (п=28) и Я-вЮЮХ (п=18) равна 78%±10% (среднее время до события -21 месяц) и 79%±11% (среднее время до события - 34 месяца) соответственно. Медиана наблюдения - 26 месяцев (максимальное - 62 месяца).

Многофакторный анализ.

С целью нахождения предикторов летального исхода выполнен многофакторный анализ. Определены статистически значимо ассоциированные с летальным исходом факторы прогноза: количество лейкоцитов (средняя ± стандартное отклонение: в группе умерших — 68,2±39,8*109/л; в группе живых — 10,1±8,6*109/л), концентрация ЛДГ (медиана: в группе умерших - 621; в группе живых — 447 Ед/л), а также наличие рецидива, вовлечение костного мозга, высокий риск М1Р1Ь и мужской пол.

Таблица 5. Результаты многофакторного анализа 46 пациентов (связь с _летальным исходом),_

Переменная Точки раздела Уровень значимости, р Отношение шансов (ОШ) ОШ 95% ДИ

Рецидив да нет 0,05 2,2 1,2-5,4

М1Р1Ь: высокий риск да нет 0,07 1,5 0,7-4,7

Вовлечение костного мозга: да нет 0,07 1,5 0,7-4,1

Лейкоциты (*109/л): >50 <50 0,07 1,3 0,4-3,6

ЛДГ (Ед/л): >700 <700 0,09 1,2 0,3-2,9

Пол (мужчины) 0,08 1,3 1,1-3,5

Возраст (лет): >60 <60 0,23 1,2 0,2-3,3

ДИ — доверительный интервал.

Ранние рецидивы развились у 3 больных в группе R-HD-Met-AraC и у 1 пациента в группе R-GIDIOX. У 2 больных из группы R-GIDIOX констатированы прогрессии заболевания: у первого пациента во время проведения индукционной терапии, у второго - непосредственно после аутоТСКК и лучевой терапии. 5 из 6 больных были включены в группу высокого риска, оцениваемого по шкале MlPIt,. У одного пациента из группы R-GIDIOX с промежуточным риском по шкале М1Р1ь развился поздний локальный рецидив в области левой орбиты. Проведена лучевая терапия, достигнута вторая ПР.

У двоих больных ранние рецидивы были представлены изолированным вовлечением центральной нервной системы и нейролейкемией. Это послужило поводом к включению профилактики нейролейкемии в протокол терапии всех первичных больных с J1KM в ноябре 2011 г.

Определение t(ll;14)(ql3;q32) в различных популяциях клеток.

Аспираты костного мозга получены у 12 больных J1KM до начала терапии. При помощи флюоресцентно-активированного клеточного сортера выделено 75 популяций клеток костного мозга: 12 популяций гранулоцитов, 12 - моноциты, 12 — Т-лимфоциты, 4 - нормальные В-лимфоциты, 12 - клетки JIKM (в 1 случае 2 популяции от одного больного), 12 - эритрокариоциты и 11 - CD34+ клетки предшественницы. Во всех 75 случаях выполнена флуоресцентная гибридизация in situ.

Степень чистоты полученных популяций зависела как от исследуемой линии кроветворения, так и от количества клеток, и составляла в среднем 95,42% (от 76,5 до 99,8%; медиана 97,35%). Наиболее низкий процент чистоты популяции был при выделении эритрокариоцитов (CD45-CD235(GlyA)+) - в среднем 87,17% (от 76,5 до 99,35%, медиана 84%). Во всех остальных популяциях чистота зависела от

клеточноети. При объеме фракции свыше 50 тысяч клеток чистота была не менее 92,5%, при количестве клеток во фракции менее 20 тысяч чистота снижалась до 80%.

В 1/12 случае, у больного с изолированным вовлечением толстой кишки, клеток коэкспрессирующих CD5 и CD 19 в костном мозге не было выявлено.

Клетки-предшественницы, коэкспрессирующие CD34 и CD45dim, были выделены, нанесены на предметные стекла и оценены в 11 из 12 случаев. Неопухолевые B-клетки были выделены и нанесены на предметные стекла только в 4/12 случаях, т.к. в 8/14 случаях они не определялись в костном мозге. Это может объясняться полным подавлением нормального B-клеточного лимфопоэза.

Таблица 6. Результаты определения t(l 1 ;14)(ql3;q32) в различных популяциях клеток костного мозга методом FISH, выделенных флюоресцентно-активированным клеточным сортером у первичных больных JIKM.

Клетки ЛКМ [¡-клетки Моноциты Т-клстки Эритро-карпоц. Клетки предюест-вепннцы Грануло-циты

Результаты сортинга, средний п роцент чистоты популяции

21.703- 1.910- 51.231- 100.093 - 33.525- 4.667 - 164.126-

10.003.443 16.402 184.873 311.629 170.000 40.003 1.413.919

98,2% 96,9% 98,6% 91.5% 92,3% 97,8%

FISH: процент клеток с t(ll;14)(ql3;q32)

ш. 99,5% Нет клеток 0% 0% 0% Нет ядер 0%

д 99,0% Нет клеток 0% 0% 0% 0% (5 ядер) 0%

к. 100% (5 ядер) 0% (15 яд.) 0% 0% 0% 0% (30 ядер) 0%

А. 84% 0% (5 яд.) 0% 0% 0% (50 ядер) 0% (100 яд.) 0%

М. 92% Нет клеток 0% 0% 0% 0% (100 яд.) 0%

У. 95% Нет клеток 0% (100 яд.) 0% 0% (40 ядер) 1% (100 яд.) 0%

ф. 100% Нет клеток 0% (20 яд.) 0% 0% (20 ядер) 0% (20 ядер) 0%

Б. 100% Нет клеток 0%(100 яд.) 0% 0% (20 ядер) 0% (20 ядер) 0%

Ч. 100% (10 ядер) Нет клеток 0% 0% 0% 0% (5 ядер) 0%

X. 100% Нет клеток 0% 0% 0% 0% (50 ядер) 0%

м. Нет клеток 0% 0% 0% 0% 0% 0%

ю. 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

В выделенных клетках J1KM (CD5+CD19+KA.+) количество ядер с t(ll;14)(ql3;q32) составляло в среднем 97,2% (84-100%, медиана 97,25%), в то время, как в других клеточных линиях, включая, клетки-предшественницы CD34+CD45dim, t(ll;14)(ql3;q32) не выявлялась. В одном случае в популяции CD34+CD45dim количество клеток с t(lI;14)(ql3;q32) составило 1%, но это было ниже уровня отсечения равной 3%, т.к. чистота клеточной линии в данном случае составила 97%.

У 8 из 11 пациентов с вовлечением костного мозга отмечено полное вытеснение нормального В-клеточного лимфопоэза (отсутствие неопухолевых В-клеток в костном мозге). При анализе минимальной резидуальной болезни, после проведенной ПХТ, у этих больных отмечено восстановление неопухолевого В-клеточного лимфопоэза.

Таким образом, в нашем исследовании транслокация t(l I;14)(ql3;q32) выявлена только в CD5+/CD19+/K/A. клетках JIKM. Это свидетельствует об отсутствии данного генетического нарушения на стадии стволовой кроветворной клетки, способной к мультилинейной дифференцировке. В связи с идентичностью результатов мы ограничились выборкой из 12 больных.

Совместное использование клеточного сортера и метода FISH позволило увеличить чувствительность последнего в 100-1000 раз. В случаях, когда исследуемая популяция клеток составляет менее 0,001% от общего количества (например, менее 20 тысяч отсортированных клеток из 20 миллионов), нами отмечено снижение чистоты выборки получаемых клеток вплоть до 76%. Таким образом, минимально допустимыми для сортировки являются популяции клеток численностью от 0,01 до 0,05%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Одной из отличительных особенностей B-лимфоцитов является большое количество соматических перестроек ДНК в процессе их созревания, что создает основу для онкогенных нарушений. На сегодняшний день считается, что мутации с вовлечением локуса тяжелых цепей иммуноглобулинов (14q23) происходят во время соматической гипермутации, когда данный участок ДНК оказывается вовлеченным в процесс реарранжировки генов. Эти онкогенные нарушения происходят постоянно, поскольку хромосомные транслокации с участием локусов генов иммуноглобулинов с некоторой частотой выявляются в лимфоцитах здоровых людей. Лимфоциты с транслокацией t(8;14)(q24;q32) выявляются у 2% здоровых лиц, а с транслокацией t(14;18)(q32;q21) - у 50-60% здоровых лиц, причем частота встречаемости данных нарушений с возрастом увеличивается. Транслокация t(l I;14)(ql3;q32), напротив, не выявляется в лимфоцитах здоровых доноров, даже при использовании высокочувствительных методов диагностики, таких как ПЦР. Это может свидетельствовать об исключительной роли данного генетического нарушения в патогенезе ЛКМ.

В нашей работе, при анализе различных популяций клеток, включая CD34+ клетки-предшественницы, транслокация t(ll;14)(ql3;q32) выявлена только в опухолевых клетках. Это свидетельствует об отсутствии данного генетического нарушения на стадии стволовой кроветворной клетки, способной к мультилинейной дифференцировке.

Отсутствие транслокации в стволовых клетках позволяет надеяться на возможность излечения ЛКМ, о чем свидетельствуют данные нескольких исследований, в которых использовалась максимально интенсивная индукционная терапия высокими дозами цитарабина, антиС020 антитела и аутологичная трансплантация стволовых кроветворных клеток. Благодаря такому подходу появились группы пациентов с бессобытийной выживаемостью более 10 лет, что может свидетельствовать об излечении.

При первичном обследовании больного ЛКМ, помимо стандартных процедур необходимо использование высокочувствительных методов диагностики вовлечения

костного мозга, выполнение эзофагогастродуоденоскопии и фиброколоноскопии. В нашем исследовании у 96% больных установлена IV стадия заболевания, вовлечение ЖКТ выявлено у 74% больных: в 59% - визуально, в 15% случаев только на основании иммуногистохимических исследований слепых биоптатов визуально неизмененной слизистой. Причем сохранение остаточных образований в толстой кишке в 3 случаях потребовало проведение 8, а не 6 курсов индукционной ПХТ.

При использовании высокочувствительных методов диагностики вовлечение костного мозга выявлено в 91,3% случаев, тогда как при использовании только гистологического и иммуногистохимического исследований поражение костного мозга определяется в 70-75% случаев.

Основной задачей нашего исследования явилось соединение интенсивной индукционной терапии, трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток и поддерживающей терапии ритуксимабом в первой линии терапии у больных с лимфомой из клеток мантийной зоны моложе 65 лет.

Отличительной чертой нашей выборки явился относительно небольшой процент больных из группы низкого риска по шкале М1Р1ь (28%), что совпадает с выборками больных Nordic Lymphoma Group и M.D. Andersen Cancer Center. Авторы делают ставку на интенсивную индукционную терапию с использованием высоких доз цитарабина (12 г/м2 на курс, 3-4 курса) и аутоТСКК, отмечая, что в трети случаев дозы химиопрепаратов необходимо редуцировать.

При анализе ряда европейских исследований (GELA, LYMA, European MCL Network), посвященных эффективности средних доз цитарабина (4 г/м2 на курс, 3-4 курса), обращает на себя внимание, что в группу низкого риска (MIPI) включено до 60% больных. С одной стороны, это можно объяснить более ранней диагностикой лимфопролиферативных заболеваний в Европейских странах, с другой стороны, одним из критериев включения в исследование служит удовлетворительный соматический статус (ECOG<2). Кроме того, финальный анализ общей и бессобытийной выживаемости включает только тех больных, у которых достигнута 4P или ПР заболевания, а ПХТ выполнена в полном объеме. Из окончательного анализа выводится до 20-30% больных из группы с крайне неблагоприятным прогнозом. В результате, после проведения индукционной ПХТ с использованием среднедозных схем терапии DHAP и выполнения аутоТСКК ПР достигаются у 92% больных, а медиана бессобытийной выживаемости достигает 83 месяцев. Многообещающие результаты таких исследований создают ошибочное представление о возможности использования средних доз цитарабина в терапии больных из группы высокого риска, которая в нашем исследовании составила 39%.

Использование высоких доз метотрексата и цитарабина является высокотоксичным и их использование возможно только у 2/3 пациентов моложе 65 лет. Схема R-GIDIOX менее токсична, чем R-HD-Met-AraC, но её эффективность сравнима по частоте достижения общих ответов (93% против 96%), 3-х летней бессобытийной выживаемости (79% против 78%) и мобилизации необходимого количества аутологичных стволовых кроветворных клеток (79% против 92%). Это позволяет рекомендовать использование гемцитабин и оксапиплатин содержащих

режимов в тех случаях, когда использование высоких доз метотрексата и цитарабина сопряжено с высоким риском развития жизнеугрожающих осложнений.

Предложенный нами протокол лечения больных с лимфомой из клеток мантии моложе 65 лет позволяет минимизировать риск летальных исходов, связанных с недооценкой статуса и высоким риском осложнений после применения высоких доз цитарабина и метотрексата. В нашем исследовании летальность, связанная с лечением во всей группе больных составила 2,2%.

При использовании максимально интенсивной индукционной ПХТ по схеме Я-ЕРОСН/Я-НО-Ме1-АгаС, ПР достигнуты в 96,2% случаев, 3-летняя БСВ составила 78%, 3-летняя ОВ — 80%, гематологическая токсичность IV ст. развивалась в 100% случаев, летальность составила 3,8%.

В группе больных, которым индукционная ПХТ проводилась по схеме Я-ЕРОСН/Я-ОШЮХ, общий ответ составил 93,3%, ПР достигнуты в 80% случаев; 3-летняя БСВ составила 79%, 3-летняя общая выживаемость - 93%, гематологическая токсичность IV ст. развивалась в 74,1% случаев, летальность составила 0%.

В нашем исследовании достижение полной ремиссии после 4-5 курсов индукционной терапии констатировано только в 24-29% случаев. С одной стороны, это подтверждает данные крупных международных исследований и соотносится с биологией самой опухоли (не менее чем у половины больных индекс пролиферативной активности менее 30%). С другой - диктует необходимость в разумной интенсификации, т.к. в большинстве случаев необходимо проведение 8 курсов терапии. Альтернирование с СНОР-подобными курсами позволяет, сохраняя противоопухолевый эффект и необходимые межкурсовые временные интервалы, восстановиться больному к началу очередного интенсивного курса терапии.

Частота тяжелых инфекционных осложнений во время поддерживающей терапии ритуксимабом в группе Я-СТОЮХ оказалась выше. По всей видимости, это в большей степени связано с медианой возраста больных (51 против 60 лет), наличием гипоплазии костномозгового кроветворения и сопутствующей патологии уже на момент начала терапии, чем с интенсивностью самой индукционной терапии.

Несмотря на максимальную интенсификацию индукционной терапии, существует группа больных, у которых развиваются ранние рецидивы заболевания. Срок жизни таких больных после рецидива редко превышает 1 год, заболевание характеризуется крайне агрессивным и плохо контролируемым течением, частым вовлечением центральной нервной системы. Главными предикторами ранних рецидивов и неудач терапии являются бластоидный вариант заболевания, пролиферативный индекс клеток опухоли Кл-67 более 40%, наличие гиперлейкоцитоза и выраженных В-симптомов, соматический статус больного по шкале ЕССЮ более 2. Эти признаки помогают выделить группу больных с неблагоприятным прогнозом, единственным вариантом для которых, на сегодняшний день, является максимально ранее выполнение трансплантации аллогенных стволовых кроветворных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный риск-адаптированный протокол высокодозной химиотерапии больных с лимфомой из клеток мантии в возрасте до 65 лет, основанный на использовании альтернирующих курсов R-EPOCH/R-HD-Met-AraC либо курсов пониженной интенсивности R-EPOCH/R-GIDIOX, трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток (BEAM-R) и поддерживающей терапии ритуксимабом. Применение у трети больных курсов пониженной интенсивности не привело к ухудшению долгосрочных результатов лечения (сопоставимо по эффективности с высокодозной программой): общий ответ составил 93,3% и 96,2%, 3-летняя бессобытийная выживаемость - 79% и 78%, 3-летняя общая выживаемость — 93% и 80%, соответственно.

2. Установлено, что стратификация больных после первого курса R-EPOCH на основе простых критериев оценки токсичности (лейкопения IV ст. или III ст. более 3 суток, инфекционные осложнения III-IV ст., наличие почечной недостаточности) позволила выполнить запланированную терапию в обеих группах в полном объеме у 97,8% больных при сопоставимой частоте развития инфекционных и токсических осложнений. Летальность, связанная с лечением, составила 2,2%.

3. Показано, что для достижения полного ответа у больных с лимфомой из клеток мантии требуется длительный период времени: полная ремиссия достигнута после 4-х курсов лишь у 24% пациентов при использовании интенсивной ветви протокола и у 29% в ветви пониженной интенсивности; и только после проведения 8 курсов химиотерапии удалось получить полные ремиссии у 80% в группе R-GIDIOX и у 96,2% при использовании R-HD-Met-AraC.

4. Доказано, что применение обеих схем R-HD-Met-AraC и R-GIDIOX позволяет выполнить адекватную мобилизацию аутологичных стволовых кроветворных клеток периферической крови в 92% и 79% случаев, соответственно. Дополнительная эксфузия костного мозга у 12,8% больных позволила реализовать трансплантацию аутологичных стволовых кроветворных клеток у всех пациентов.

5. Выявлено, что поддерживающая терапия ритуксимабом сопровождалась высокой частотой инфекционных осложнений: в группе R-HD-Met-AraC осложнения I-II ст. констатированы в 44% случаев, III-IV ст. — в 0%, в группе R-GIDIOX осложнения I-II ст. развились в 50% случаев, III-IV ст. — в 14%.

6. Разработан алгоритм обследования больных с лимфомой из клеток мантии, позволивший у 96% больных установить IV стадию заболевания, выявить вовлечение желудочно-кишечного тракта в 74% случаев и костного мозга в 91,3% случаев.

7. Транслокация t(l I;14)(ql3;q32) при лимфоме из клеток мантии встречается только в опухолевых В-лимфоцитах (коэкспрессирущих CD5 и CD 19) и не выявляется в других линиях кроветворения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лорие Ю.Ю., Воробьев В.И. Индукционная терапия лимфомы из клеток зоны мантии. Клиническая онкогематология. 2011. Том 4, № 1. С. 10-19.

2. Воробьев В.И., Лорие Ю.Ю., Мангасарова Я.К., Кравченко С.К., Кременецкая A.M. Возможности терапии рецидивов и резистентного течения лимфомы из клеток мантийной зоны. Гематология и трансфузиология. 2011 №1: 3437.

3. Илюшкина Е.А., Ковригина A.M., Кравченко С.К., Обухова Т.Н., Воробьев В.И., Звонков Е.Е., Романова М.Н., Лапин В.А., Лорие Ю.Ю. Лимфома из клеток мантийной зоны с первичным вовлечением кожи: клиническое наблюдение. Клиническая онкогематология. 2012. Том 5, № 2. С. 129-134.

4. Воробьев В.И., Кравченко С.К., Гемджян Э.Г., Лорие Ю.Ю., Магомедова А.У., Меликян А.Л., Мангасарова Я.К., Марьин Д.С., Дубровин Е.И., Обухова Т.Н., Махиня С.А., Жеребцова В.А., Вернюк М.А., Тюрина Н.Г., Савченко В.Г. Программное лечение первичных больных мантийноклеточной лимфомой в возрасте до 65 лет. Клиническая онкогематология. 2013. Том 6, № 3. С. 274-281.

5. Воробьев В.И., Лорие Ю.Ю., Кравченко С.К. Под ред. Савченко В.Г. Программное лечение заболеваний системы крови: Сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови. Протокол терапии лимфомы из клеток мантийной зоны у пациентов моложе 65 лет. - М.: Практика, 2012: 397—416.

6. Воробьев В.И., Лорие Ю.Ю. Под редакцией Гриншпун Л.Д., Пивника А.В. Лимфома из клеток мантийной зоны: клиника, диагностика и возможности терапии у лиц пожилого возраста. Гериатрическая гематология. Заболевания системы крови в старших возрастных группах. Том 2 М., «Медиум», 2012: 188-195

7. Vorobyev V., Obukhova Т., Gretsov Е., et al. Toxicity Adapted High-Dose Therapy in Mantle Cell Lymphoma Patients, Using Schemes EPOCH, HMA and GIDIOX, Autologous Stem Cell Transplantation and Rituximab. Hematologica. 2011. Vol. 96 (suppl. 2): Poster presentation, Abstr. 0954.

8. Vorobyev V., Gretsov E., Obukhova Т., et al. T(11;14)(ql3;q32) in Mantle Cell Lymphoma Patients Is Present Only on Mature Malignant Cells. Fluorescence-Activated Cell Sorting and Fluorescence in Situ Hybridization Analysis. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts). 2011 Vol. 118; Issue 121: Abstract 4405.

9. Vorobyev V., Lorie Yu., Zvonkov E., et al. Intensive Induction, Autologous Stem Cell Transplantation and Rituximab Maintenance Has Changed Event Free Survival and Overall Survival in Mantle Cell Lymphoma Patients. Using Gemcitabine and Oxaliplatin in First Line Therapy. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts). 2012 Vol. 120, Issue 121: Poster presentation, Abstract 2034.

10. Vorobyev V., Kravchenko S., Gemdjian E. High Rate of Durable Remissions after Toxicity-Adapted Intensive Induction, Autologous Stem Cell Transplantation and Rituximab Maintenance in Mantle Cell Lymphoma Patients. Hematologica. 2013. Vol. 98 (suppl. 1). Poster presentation, Abstr. P329.

Подписано в печать: 06.03.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1093 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru