Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Выделение, изучение химического состава и некоторых видов фармакологической активности биологически активных ком-плексов из растений рода мелколепестник

На правах рукописи

Ботов Александр Юрьевич

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ РАСТЕНИЙ РОДА МЕЛКОЛЕПЕСТНИК

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

16 \Ш '¿013

Курск-2013

005058352

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Яцюк Валентина Яковлевна доктор медицинских наук Сипливый Геннадии Вячеславович

Официальные оппоненты:

Ермакова Валентина Алексеевна - доктор фармацевтических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии

Шорманов Владимир Камбулатович - доктор фармацевтических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. о£>

Защита диссертации состоится «У¥ » 2013 г. в /г- часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ул. К. Маркса 3, г. Курск, 305041).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан «1%"» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время урологические инфекционные заболевания занимают одно из ведущих мест в клинике инфекционных патологий (Лопаткин H.A., 1998; Переверзев A.C., 2000). Пиелонефрит составляет 14% всех болезней почек (Лоран О.Б., 2008). Рецидив заболевания в течение года отмечается в 30% случаев (Переверзев A.C., 2007). Основным методом лечения является адекватная антибактериальная терапия; считается достаточным курс лечения современными видами антибиотиков в течение 1014 дней (Naber K.G. et al., 2007). Лекарственные средства растительного происхождения широко применяются в составе комплексной терапии пиелонефрита. Поливалентное действие фитопрепаратов за счет содержания большого количества биологически активных веществ способствует более раннему выздоровлению и профилактике рецидивов заболевания (Кукес В.Г., 1999). Прием растительных средств повышает диурез, тонус мочеточника, что способствует активному оттоку из почки воспалительного экссудата, слизистого детрита, бактерий (Братчиков О.И. и др., 2009; Иванов В.В., 2010).

Известно, что применение качественных растительных препаратов повышает эффективность противорецидивной терапии, сокращает продолжительность использования антибактериальных средств и позволяет уменьшить частоту осложнений и нежелательных побочных эффектов (Синев Д.Н., 2004; Киселькова О.В., 2007). В этой связи расширение ассортимента лекарственных растений, имеющих разнообразный набор биологически активных веществ и видов фармакологической эффективности, соответствующих стратегии комплексного лечения пиелонефрита, является

актуальной проблемой.

Род Erigeron L. (мелколепестник) насчитывает около 200 видов, распространенных в странах Европы, Азии и Америки. Из них примерно 70 видов мелколепестника встречаются на территории Российской Федерации (РФ) и стран СНГ. По данным литературы, на территории ЦентральноЧерноземного региона произрастают и образуют значительные запасы мелколепестник канадский, мелколепестник едкий и мелколепестник однолетний (Губанов К.В. и др., 2004; Полуянов A.B., 2005; Маевский П.Ф., 2006).

В народной медицине мелколепестник канадский, мелколепестник едкий и мелколепестник однолетний применяются как тонизирующие, мочегонные, вяжущие и капилляроукрепляющие средства (Растительные ресурсы СССР,

1993; Charles W. Капе, 2006). В научной медицине РФ сырье изучаемых видов мелколепестника не находит применения.

Аналитический обзор данных литературы показал, что химический состав и фармакологическая активность мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего, произрастающих в Центральной России, изучены недостаточно, в связи с чем проведение фитохимического и фармакологического исследований данных объектов является актуальным, позволяющим расширить сырьевую базу лекарственного растительного сырья для создания на его основе новых отечественных фитопрепаратов.

Цель работы: провести фотохимический анализ растений рода Erigeron L. (мелколепестник канадский, мелколепестник едкий и мелколепестник однолетний), произрастающих в Центрально-Черноземных областях РФ, как потенциальных источников для создания фитопрепаратов. Установить некоторые виды фармакологической активности комплексов биологически активных веществ (БАВ) мелколепестника канадского при экспериментальном пиелонефрите.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

- провести аналитический обзор литературных данных о химическом составе, фармакологической активности и аспектах применения изучаемых растений рода мелколепестник;

- изучить качественный состав БАВ травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего;

- определить количественное содержание основных групп БАВ изучаемых растений;

- определить критерии оценки качества сырья (травы) мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего;

- установить оптимальные технологические параметры получения комплексов БАВ из травы мелколепестника канадского;

- исследовать некоторые виды фармакологической активности биологически активных комплексов из травы мелколепестника канадского на модели пиелонефрита.

Научная новизна. Проведен системный анализ растений рода мелколепестник: мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего, произрастающих в Центрально-Черноземных областях РФ. В ходе фитохимического исследования выявлено наличие веществ различной структуры как первичного (полисахариды, аминокислоты,

высшие жирные кислоты, спирты, алканы), так и вторичного обмена (терпеноиды, стерины, каротиноиды, хлорофиллы, производные 2-фенил-бензо-у-пирона и бензо-а-пирона, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, различные органические кислоты), а также минеральных элементов.

С помощью хромато-масс-спектрометрического метода анализа (ХМС) изучены компоненты липофильной фракции травы исследуемых видов мелколепестника. Впервые в составе липофильной фракции мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего установлено наличие 52, 31 и 37 веществ соответственно: высших жирных кислот, стеринов, спиртов, алканов, терпеноидов.

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в спирто-водных извлечениях травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего установлено наличие соответственно 22, 16 и 17 веществ полифенольной природы. Впервые идентифицированными для мелколепестника канадского являются: цикориевая, коричная, феруловая кислоты, гесперидин, гиперозид, дигидрокверцетин (таксифолин), эпигаллокатехин галлат, эпикатехин, катехин, дигидрокумарин; для мелколепестника едкого: цикориевая, феруловая кислоты, таксифолин, витексин, танин, кумарин, дигидрокумарин; для мелколепестника однолетнего: галловая, цикориевая, феруловая кислоты, рутин, таксифолин, витексин, танин, кумарин, дигидрокумарин, 3-метоксикумарин.

Впервые в водорастворимом полисахаридном комплексе (ВПСК) травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего, с помощью ХМС идентифицировано 27, 20 и 39 веществ соответственно: моносахаридов ациклической и циклической (пиранозной, фуранозной) структуры, уроновых, неорганических и органических кислот.

Определен макро- и микроэлементный состав, при этом впервые для изучаемых растений рода мелколепестник установлено наличие следующих элементов: Р, А1, Бь РЬ, Мо, Ва, Бг, В, Т\, V, 2г, ва, Ве.

Установлено количественное содержание в траве изучаемых видов мелколепестника пигментов (каротиноидов и хлорофиллов), флавоноидов, органических кислот, в том числе аминокислот, дубильных веществ, ВПСК и пектиновых веществ.

В результате фармакологических исследований установлено, что комплексы БАВ мелколепестника канадского проявляют выраженную анальгетическую и противовоспалительную активности. Впервые на модели пиелонефрита установлено, что изучаемые комплексы БАВ ускоряют

нормализацию выделительной функции почек, снижают интенсивность окислительных процессов, способствуют повышению гуморальной формы иммунного ответа (ГИО), что определяет возможность дальнейших исследований комплексов БАВ из травы мелколепестника канадского при лечении пиелонефрита.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют расширить сведения о химическом составе и фармакологической активности изучаемых растений рода мелколепестник. Определены критерии, нормирующие качество сырья. Подобраны оптимальные технологические условия процессов экстракции (вид экстрагента, измельченность сырья, число ступеней экстракции, временной режим экстракции, гидромодуль) комплексов биологически активных соединений.

Проведенные фотохимические исследования показали перспективность использования мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего в качестве лекарственного растительного сырья для получения новых фитопрепаратов. Обоснована целесообразность дальнейших фармакологических исследований по использованию комплексов БАВ мелколепестника канадского при комплексной терапии воспалительных заболеваний почек.

Результаты фитохимических и товароведческих исследований апробированы в ФГБУ ИМЦ ЭУАОСМП Росздравнадзора (Курский филиал); внедрены в учебный и научный процесс кафедр: фармакогнозии с курсом ботаники Рязанского государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова, фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета, фармакогнозии и фармацевтической технологии Ярославской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения, характеризующиеся научной новизной:

- результаты фитохимического исследования травы мелколепестника канадского, мелколепестника однолетнего и мелколепестника едкого;

- результаты по разработке критериев подлинности и показателей качества растительного сырья;

- результаты фармакологического исследования биологически активных комплексов травы мелколепестника канадского.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Международной научной конференции «Современные проблемы

экспериментальной и клинической медицины» (Бангкок, Паттайа (Таиланд), 2010 г.); Итоговой конференции сотрудников Курского государственного медицинского университета, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 76-летию КГМУ (2011 г.); 77 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», проводимой в рамках «Недели медицинской науки» КГМУ (2012 г.); II Международной научно-практической конференции «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012 г.); II Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (Москва, 2012 г.).

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 12 работ, в том числе 8 - в рецензируемых ВАК РФ изданиях, согласно п. 10 «Положения о порядке присуждения ученых степеней», в которых содержится необходимый объем информации по теме диссертации.

Личный вклад автора. Автор принимал участие в определении цели исследования и путей ее реализации, планировании и выполнении эксперимента. Автором проводились фитохимические и фармакологические виды исследования, анализ, статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Выполненная работа соответствует паспорту специальности 14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия (фармацевтические науки): пункт 5 -«Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье» и пункт 6 - Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на их основе.

Связь задач исследований с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 52 таблицами и

10 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), собственных исследований (главы 3-5), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 139 источников, из них 100 отечественных и 39 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Для изучения использовали растительное сырье - трава мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего. Сбор сырья (трава) был проведен в течение фазы вегетации: «конец цветения -начало плодоношения» на территории Курской и Белгородской областей (июль-август 2010-2011 гг.). Собранное сырье до воздушно-сухого состояния подвергали воздушной сушке в естественных условиях, без доступа прямых солнечных лучей.

Обнаружение биологически активных веществ проводили с помощью специфических качественных реакций, тонкослойной хроматографии (ТСХ), а также методами спектрофотометрии, ВЭЖХ и ХМС.

Спектрофотометрический метод применяли для качественной и количественной оценки каротиноидов и хлорофиллов, количественного определения суммы флавоноидов. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометрах СФ-2000 и СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм (Литвиненко В.И., 1997; Петриченко В.М., 2002; Барковский В.Ф., 1989).

Метод ВЭЖХ использовали для анализа качественного состава и количественного соотношения веществ полифенольной природы. Исследования проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "Gilston" (инжектор ручной, модель "Rheodyne" 7125 USA) с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром» для "Windows" (Онучак JI.A., 2004).

Качественный состав и количественное содержание аминокислот определяли с использованием метода ВЭЖХ на автоматическом аминокислотном анализаторе "Amino Acid Analyzer Т 339 М" (Лебедев A.B., 1999; Benson Y.R., 1975).

Атомно-эмиссионная спектроскопия использовалась в анализе макро- и микроэлементного состава изучаемых видов сырья. Исследования проводили на дифракционном спектрографе ДФС-8-1 (Гарифзянов А.Р., 2009).

Определение химического состава липофильной фракции и ВПСК проводили с помощью ХМС на хромато-масс-спектрометре АТ-5850/5973 Agilent Technologies (США) (Ткачев А.В., 2008).

В соответствии с требованиями к качеству сырья для каждого объекта определяли числовые показатели: влажность, содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлороводородной, измельченность и содержание примесей, содержание экстрактивных веществ (Государственная Фармакопея (ГФ) XI, вып. 1,1987).

Острую токсичность липофильного, спирто-водного экстракта и полисахаридного комплекса мелколепестника канадского определяли на здоровых животных по методике Б.М. Штабского (1980). С этой целью животные получали пятикратно per os извлечения в трех дозах: липофильное извлечение в дозах 3 мг/кг, 9 мг/кг, 15 мг/кг; спирто-водное извлечение в дозах 10 мг/кг, 30 мг/кг, 50 мг/кг; полисахаридный комплекс в дозах 50 мг/кг, 150 мг/кг, 250 мг/кг, растворенных в 0,1 мл соответствующего растворителя. Наблюдения за животными проводили в течение 24 часов. Липофильное извлечение растворяли в оливковом масле, ВПСК в воде, спирто-водное извлечение вводили в виде водной суспензии.

Исследование анальгетической активности выделенных растительных объектов проводили на мышах с использованием модели «уксусных корчей» и модели формалиновой болевой реакции (Гацура В.В., 1974; Тринус Ф.П., 1974; Winstein S., 1946). Растительные извлечения вводили перорапьно, пятикратно: липофильное извлечение в дозе 3 мг/кг, спирто-водное извлечение в дозе 10 мг/кг, полисахаридный комплекс в дозе 50 мг/кг, а в качестве препарата сравнения использовали анальгин в дозе 5 мг/кг.

Модель острого асептического воспаления воспроизводили по методике Н.А. Мохорт (1971). Результаты влияния полученных извлечений на выраженность воспалительного процесса оценивали через 24 часа после инъекции формалина, по разнице масс воспаленной и контрольной лапок по отношению к весу животного.

Модель необструктивного пиелонефрита создавали путем однократного внутрижелудочного введения ртути дихлорида в дозе 2 мг/кг и внутрибрюшинной инъекцией предварительно оттитрованных доз суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus, содержащих 1x10s микробных тел в 0,5 мл раствора (Есилевский Ю.М., 2007). Части животным с пиелонефритом внутримышечно, однократно в течение 5 дней вводили гентамицин в дозе 4 мг/кг (ампулы (80 мг - 2 мл), Индия Agio Pharmaceuticals Ltd.) и перорально

растительные экстракты в дозах: липофильный - 3 мг/кг, спирто-водный -10 мг/кг, ВПСК - 50 мг/кг. Иммунометаболические изменения у животных с пиелонефритом оценивали по интенсивности окислительных процессов и ГИО. Влияние экстрактов и ВПСК на иммунологическую реактивность животных оценивали по интенсивности ГИО на пятые сутки после иммунизации эритроцитами барана путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (АОК) (Мальберг К., Зигль Э., 1987).

Антиоксидантный статус эритроцитов характеризовали по активности супероксиддисмутазы (СОД) (Макаренко Е.В., 1988). Перекисное окисление липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) (Стальная И.Д., 1977). О состоянии выделительной функции почек судили по концентрации мочевины и креатинина в крови (Меньшиков В.В., 1986).

Статистическую обработку результатов проводили путем вычисления средних арифметических изучаемых показателей и их стандартных отклонений. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни при Р 1.0,05 (Гублер Е.В., 1978; Губ-лерЕ.В., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение качественного состава и количественного содержания биологически активных веществ некоторых растений рода мелколепестник

Для исследования химического состава биологически активных веществ проводили фракционирование природных соединений с помощью экстрагентов различной полярности (ацетон, 70% этанол, вода очищенная).

Методом ХМС в составе липофильной фракции травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего установлено наличие 52, 31 и 37 веществ соответственно, относящихся к различным классам органических соединений (табл. 1).

Таблица 1

Химический состав липофильной фракции травы изучаемых видов

мелколепестника

№ Время удерживания, мин Обнаруженные вещества Количественное соотношение, %

Erigeron canadensis L. Erigeron acer L. Erigeron annuus L.

1 6,619 лауриновая к-та - 0,43 0,79

2 6,775 метоксинафталин - 0,99 -

3 6,971 азелаиновая к-та - - 2,04

4 7,663 альдегид неидентифиц. - - 1,30

5 8,402 куркумен - 2,91 ■ -

6 9,460 миристиновая к-та 2,26 2,23 3,24

7 9,489 бензол-1 - [ 1,5 -ди метил-4-гексени л] -4-метил 2,09 - -

8 10,898 пентадекановая к-та 1,55 0,74 0,86

9 11,144 тетраметилгексадеценол 1,96 - -

10 11,252 тетраметилгексадеценол 1,40 - -

11 11,483 тетраметилгексадеценол 1,27 - -

12 11,557 терпен неидентифиц. 1,27 - -

13 14 11,719 тетраметилгексадеканол и разные фитанилы - 0,73 0,98

11,747 тетраметилгексадеценол 1,61 - ■ -

15 12,058 9-гексадеценовая к-та 1,78 - 2,39

16 12,356 гексадекановая к-та 7,72 14,67 12,05

17 12,690 изо-капроновый ангидрид 1,20 - -

18 13,029 капроновый ангидрид 1,76 - -

19 13,327 антеизо-гептадекановая к-та 0,29 - -

20 13,409 гептадеценовая к-та 0,27 - -

21 13,551 терпенол неидентифиц. 0,42 - -

22 13,686 гептадекановая к-та 1,23 1,03 1,03

23 13,890 терпенол неидентифиц. 1,65 - -

24 14,284 терпенол неидентифиц. 2,27 - -

25 14,696 линолевая к-та 8,17 23,36 11,17

26 14,710 олеиновая к-та 4,10 0,46 5,41

27 14,818 у-линоленовая к-та - 13,11 3,61

28 15,029 стеариновая к-та 4,12 4,33 6,02

29 15,742 6,10,14-тримети лпентадекан-2-ол 0,87 - -

30 15,836 октадекадиеновая к-та, коньюгированная - 1,28

31 16,264 р-линоленовая к-та 1,06 - -

32 17,031 октадекатриеновая к-та, коньюгированная 0,67 - -

33 17,078 октадекатриеновая к-та, коньюгированная 0,86 - -

34 17,240 эйкозеновая к-та - - 0,73

35 17,254 октадекатриеновая к-та, коньюгированная 0,53 - -

36 17,309 октадекатриеновая к-та, коньюгированная 0,37 - -

37 17,524 эйкозановая к-та 1,65 1,71 1,17

38 18,360 нонадиенил-окси-ноненовая к-та 0,46

39 18,705 генэйкозановая к-та 0,69 0,22 0,16

40 19,491 9,10-дигидроксиоктадекановая к-та - - 2,87

41 19,520 н-гексакозан 0,80 - -

42 19,600 докозатриеновая к-та - 0,47 0,37

43 19,756 2-гидроксиэйкозановая к-та - 0,09 0,14

44 19,857 докозановая к-та 2,02 1,73 1,49

45 20,956 трикозановая к-та 1,14 0,51 0,43

46 21,675 н-гептакозан - - 0,70

47 21,704 н-октакозан 0,87 - -

48 21,885 2-гидроксидокозановая к-та 1,42 0,88 0,51

49 22,028 тетракозановая к-та 2,07 1,42 1,20

50 22,896 2-гидрокситрикозановая к-та 1,06 0,85 0,18

51 23,059 пентакозановая к-та 0,40 0,20 -

52 23,106 сквален 0,62 0,44 -

53 23,140 неидентифиц. - - 4,82

54 23,710 н-нонакозан - - 0,83

55 23,759 н-триаконтан 2,03 - -

56 23,879 2-гидрокситетракозановая к-та 2,63 1,96 0,77

57 24,049 гексакозановая к-та 0,67 0,30 0,73

58 24,653 неидентифиц. - - 14,65

59 24,822 2-гидроксипентакозановая к-та 0,42 0,32 -

60 25,331 н-гентриаконтан 0,64 - 0,59

61 25,664 н-дотриаконтан 2,79 - -

62 25,751 2-гидроксигексакозановая к-та 0,32 0,19 -

63 25,976 октакозановая к-та 0,33 - -

64 26,322 моноглицерид 2,57 -

65 27,996 сгигмастерол 6,78 7,62 4,15

66 28,708 ситостерол - 7,31 2,70

67 28,735 сгигмастерол - - 2,86

68 28,771 сгигмастерол (изомер) 6,36 - -

69 28,966 амирин-1 3,33 3,35 1,35

70 29,441 амирин-2 5,18 5,43 4,47

сумма 100 100 100

В спирто-водных извлечениях из травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего методом ВЭЖХ идентифицировано соответственно 17, 11 и 12 компонентов полифенольной природы (табл. 2).

Таблица 2

Химический состав спирто-водной фракции травы изучаемых видов

мелколепестника

Время Количественное соотношение, %

№ удерживания, Обнаруженные вещества Erigeron Erigeron Erigeron

сек canadensis L. acer L. annuus L.

1 179,7 умбеллиферон 4,17 - -

2 185,8 танин - 23,45 21,03

3 189,7 галловая кислота 5,82 14,78 10,30

4 224,1 неидентифиц. 2,23 - -

5 237,0 эиигаллокатехин галлат 4,94 - -

6 299,1 цикориевая кислота 5,07 6,23 5,78

7 314,4 хлорогеновая кислота 5,89 18,13 17,63

8 385,0 кофейная кислота 2,63 - -

9 450,1 феруловая кислота 6,53 3,17 4,82

10 524,5 неидентифиц. - 5,19 4,19

11 548,9 дигидрокумарин 3,72 2,21 3,48

12 619,8 кумарин - 2,58 2,76

13 694,7 эпикатехин 4,88 - -

14 803,5 лютеолин-7-гликозид 4,24 6,65 9,69

15 872,2 гесперидин 9,70 - -

16 968,4 гиперозид 1,99 - -

17 992,4 3-метоксикумарин - - 0,85

18 1084,2 рутин 2,61 3,34 4,99

19 1100,0 таксифолин 16,03 3,12 3,52

20 1105,8 витексин - 10,23 9,91

21 1413,0 коричная кислота 0,71 - -

22 1636,0 неидентифиц. 5,80 0,22 0,37

23 1874,0 неидентифиц. 3,37 0,53 0,46

24 2133,0 неидентифиц. 1,95 0,11 0,21

25 2459,0 катехин 1,67 - -

26 2776,0 неидентифиц. 2,74 0,05 0,02

27 3516,0 кверцетин 3,30 - -

сумма 100 100 100

Методом ХМС в ВПСК травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего идентифицировано 27, 20 и 39 веществ соответственно: неорганических и органических кислот, моносахаридов (рибоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза, глюкоза, галактоза, манноза, альтроза, талоза) ациклической и циклической (пиранозной и фуранозной) структуры, уроновых кислот (глюкуроновая, галактуроновая). Полученные результаты показали присутствие значительных количеств фосфорной кислоты в гидролизате ВПСК мелколепестника канадского, что свидетельствует о высокой степени фосфорилирования моносахаридов. Наличие моносахаров в виде легко гидролизуемых эфиров фосфорной кислоты может объяснить ряд фармакологических свойств мелколепестника канадского.

С помощью ТСХ с последующим денситометрическим определением установлен качественный состав и количественное содержание моносахаридов пектиновых веществ (ПВ) травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего. Установлено, что комплексы ПВ травы изучаемых видов мелколепестника содержат галактуроновую кислоту (не менее 83%), глюкуроновую кислоту, а также нейтральные сахара: глюкозу, галактозу, ксилозу.

Методом ВЭЖХ установлено наличие во всех изучаемых видах мелколепестника 15 аминокислот (аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин), 9 из которых являются незаменимыми (треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин).

Полуколичественным спектральным методом анализа (испарения) на дифракционном спектрографе ДФС-8-1 в изучаемых видах сырья обнаружены макро- (К, Са, Р, Ыа, Мд) и микроэлементы (Ре, А1, 81, Си, Хп, РЬ, Ag, Мо, Ва, 8г, В, Мп, Т1, V, Сг, Ъх, Са, Ве), 10 из которых относятся к эссенциальным (К, Ыа, Са, Mg( Р, Ре, Си, Хп, Мо, Мп).

Количественное определение идентифицированных групп БАВ осуществляли по методикам ГФ XI, а также по заимствованным методикам, изложенным в доступной литературе, адаптированным к исследуемым видам сырья мелколепестника (табл. 3).

Таблица 3

Количественное содержание БАВ в траве изучаемых видов мелколепестника

Группа БАВ Количественное содержание

Трава Еп§егоп сапа(1еп818 Ь. Трава Еп§егоп асег Ь. Трава Нп§егоп аптшик 1

каротиноиды, мг/100 г 35,65±1,03 38,22±0,90 21,98±0,62

хлорофиллы, мг/100 г 43,21±0,82 53,78±1.67 39,06±0,66

флавоноиды, % 1,92±0,03 2,11 ±0,04 1,58±0,03

органические кислоты, % 3,47±0,П 3,13±0,08 4,26±0,11

аскорбиновая кислота, % 0,10±0,01 0,12±0,01 0,16±0,01

дубильные вещества, % 6,52±0,55 3,87±0,35 4,34±0,17

аминокислоты, % 4,15±0,29 3,90±0,18 3,74±0,22

полисахариды (водорастворимые), %, 4,91±0,15 4,99±0,23 6,98±0,29

пектиновые вещества, % 8,20±0,40 3,63±0,16 5,05±0,18

В соответствии с требованиями ГФ XI к качеству растительного сырья установлены числовые показатели (влажность, зольность, содержание примесей

и экстрактивных веществ) для всех исследуемых видов мелколепестника (табл. 4).

Таблица 4

Показатели, нормирующие качество сырья изучаемых растений рода

мелколепестник

Показатели качества сырья Трава Нг^егоп сапас!е1шз Ь. Трава Еп£егоп асег Ь. Трава Еп§егоп аппииз Ь.

Потеря в массе при высушивании сырья не более 11% не более 12% не более 13%

Зола общая не более 12%

Зола нерастворимая в 10% кислоте хлороводородной не более 2%

Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстием 7,0 мм не более 10%

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстием 0,5 мм не более 12%

Почерневших, побуревших и пожелтевших частей растений не более 3%

Органической примеси не более 2%

Минеральной примеси не более 1 %

Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этанолом не менее 13% не менее 11% не менее 8%

Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых ацетоном не менее 6% не менее 9% не менее 6%

Изучение фармакологической активности биологически активных комплексов мелколепестника канадского

В результате исследований установлено, что наиболее широкий набор БАВ содержит мелколепестник канадский, который, по данным литературы применяется в народной медицине, в основном как тонизирующее, капилляроукрепляющее и мочегонное средство. В связи с этим исследование перспективности его использования в комплексном лечении пиелонефрита и,

как следствие, расширение ассортимента отечественных лекарственных средств растительного происхождения, применяемых при воспалительных заболеваниях почек, является обоснованным.

Для исследования фармакологической активности были получены полисахаридный комплекс (экстрагент - вода очищенная), липофильный (экстрагент - ацетон) и спирто-водный (экстрагент - 70% этанол) экстракты из травы мелколепестника канадского. Для получения извлечений и полисахаридного комплекса с максимальным содержанием действующих веществ был проведен подбор оптимальных технологических параметров экстракции: степень измельчения — 1 мм, гидромодуль — 1:12, кратность экстракции - двукратная экстракция для извлечений и трехкратная для ВПСК. Для оптимизации дозирования полученные извлечения упаривали до густых экстрактов. Стандартизацию липофильного экстракта проводили по содержанию пигментов (каротиноидов, хлорофиллов), спирто-водного - по содержанию флавоноидов.

Определение фармакологической активности экстрактов и ВПСК, выделенных из травы мелколепестника канадского, показало, что они в изучаемых дозах не являются токсичными, проявляют анальгетическую и противовоспалительную активности.

Введение крысам с пиелонефритом, получавшим гентамицин и изучаемые экстракты, приводило к более ранней нормализации выделительной функции почек при использовании спирто-водного экстракта.

Оценка интенсивности окислительных процессов и выраженности ГИО у животных с пиелонефритом, получавших гентамицин, экстракты и ВПСК из мелколепестника канадского, показала их антиокислительную и иммуномодулирующую активность. Наиболее эффективное действие оказывал спирто-водный экстракт (рис. 1).

70 60 50 40 30 20 10 0

СОД, ЕД/мл эритроцитов

------------------------------------------------»7----------------------

.....1..... *1, +- *1,

; "Х щ

4-= 1 г—

1 2 3 4 5 —

МДА, мкмоль/л

70 60 50 40 30 20 10 0

4,2

»2 *Т,2

гН"

АОК, 10Э/ селезенка

Т *2

г 4

1 * 1,2 1 ♦1,2

Т Т

г§= I Г........

с------

--~ 1 2 3 4 5

Рис. 1. Интенсивность окислительных процессов и ГИО у животных с пиелонефритом, получавших гентамицин, экстракты и ВГ1СК из мелколепестника канадского.

Примечание:

1 - контроль (здоровые крысы); 2 - крысы с пиелонефритом + гентамицин; 3 - крысы с пиелонефритом + гентамицин + липофильный экстракт; 4 - крысы с пиелонефритом + гентамицин + спирто-водный экстракт; 5 - крысы с пиелонефритом + ген тамицин + ВПСК.

Полученные результаты обосновывают дальнейшее изучение эффективности использования извлечений из мелколепестника канадского при комплексном лечении пиелонефрита и сырья мелколепестника однолетнего и мелколепестника едкого с целью создания на их основе фитопрепаратов.

выводы

1. В изучаемых растениях рода Ег^егоп Ь., произрастающих в ЦентральноЧерноземном регионе РФ, обнаружены биологически активные вещества, относящиеся к различным классам: пигменты, высшие жирные кислоты, стерины, спирты, алканы, терпеноиды, производные у- и а-пиронов, фенолкарбоновые кислоты, свободные сахара, полисахариды, различные органические кислоты, в том числе аминокислоты, дубильные вещества; минеральные элементы. Наиболее широкий набор БАВ характерен для мелколепестника канадского.

2. В составе липофильной фракции травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего установлено наличие 52, 31 и 37 соединений соответственно, среди них жирные кислоты, стерины, спирты, алканы, терпеноиды. Содержание каротиноидов в траве мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего составило 35,65±1,03; 38,22±0,90 и 21,98±0,62 мг/100 г; содержание хлорофиллов - 43,21±0,82; 53,78±1,67 и 39,06±0,66 мг/100 г соответственно.

3. В спирто-водной фракции травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего установлено наличие полифенольных соединений: производных фенилбензо-у-пирона, бензо-а-пирона, а также фенолкарбоновых кислот. Новыми для изучаемых растений рода мелколепестник являются: галловая, цикориевая, коричная, феруловая кислоты, гесперидин, гиперозид, рутин, таксифолин, витексин, танин, катехин, эпигаллокатехин галлат, эпикатехин, кумарин, дигидрокумарин, 3-метоксикумарин.

4. Количественное содержание суммы флавоноидов в сырье в пересчете на рутин составило 1,92±0,03%; 2,11±0,04% и 1,58±0,03% для травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего соответственно. Валидация адаптированной методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в сырье мелколепестника доказала ее воспроизводимость, доступность и экспрессность.

5. ВПСК травы мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего содержит 27, 20 и 39 веществ соответственно: моносахаридов ациклической и циклической (пиранозной и фуранозной) структуры, уроновых, неорганических и органических кислот. Количественное содержание ВПСК в траве мелколепестника канадского,

мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего составляет: 4,91±0,15%; 4,99±0,23% и 6,98±0,29% соответственно. Содержание ПВ в траве мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего - 8,20±0,40%; 3,63±0,16% и 5,05±0,18% соответственно.

6. Установлены числовые показатели, нормирующие качество сырья мелколепестника канадского, мелколепестника едкого и мелколепестника однолетнего соответственно: влажность (не более 11%, 12% и 13%), золы общей (не более 12% для всей исследуемых видов), золы нерастворимой в 10% кислоте хлороводородной (не более 2% для всей исследуемых видов), экстрактивных веществ, извлекаемых 70% спиртом этиловым (не менее 13%, 11% и 8%) и ацетоном (не менее 6%, 9% и 6%).

7. Липофильный, спирто-водный экстракты и ВПСК из мелколепестника канадского, полученные по установленным оптимальным технологическим параметрам, при отсутствии токсичности обладают анальгетической и противовоспалительной активностями. Введение животным с пиелонефритом, получавшим антибактериальный препарат, спирто-водного экстракта, приводило к более ранней нормализации выделительной функции почек, окислительных процессов и ГИО.

Список публикаций по теме диссертации

1. Ботов, А.Ю. Изучение Erigeron canadensis L. как возможного источника получения каротиноидов и хлорофиллов / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, JI.E. Сипливая // Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы Междунар. науч. конф. (Бангкок, Паттайа (Таиланд), 20-30 дек. 2010 г.) // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - № 3. -С. 108-109.

2. Ботов, А.Ю. Фотохимическое исследование сырья мелколепестника канадского / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Л.Е. Сипливая // Традиции и инновации фармацевтической науки и практики : сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 45-летию фармацевт, фак. КГМУ (Курск, 27 окт. 2011 г.). - Курск, 2011. - С. 302-304.

3. Изучение возможности получения фитопрепаратов из травы мелколепестника канадского (Erigeron canadensis L.) / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Л.Е. Сипливая, В.И. Дейнека, Д.И. Писарев, О.О. Новиков // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. -№ 4(99), вып. 13/2. - С. 129-133.

4. Элементный состав некоторых растений семейства Asteraceae / А.Ю. Ботов, А.П. Северин, В.Я. Яцюк, Л.Е Сипливая // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. - № 22 (117), вып. 16/2. - С. 159-160.

5. Ботов, А.Ю. Мелколепестник канадский (Erigeron canadensis L.). Перспективы использования в медицине / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый // Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес : сб. материалов II Междунар. науч.-практ. конф. (Белгород, 26 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012. - С. 118-120.

6. Ботов, А.Ю. Определение содержания дубильных веществ в различных видах сырья мелколепестника канадского / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый // Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес : сб. материалов II Междунар. науч.-практ. конф. (Белгород, 26 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012. - С. 117-118.

7. Изучение химического состава липофильиой фракции некоторых растений рода Erigeron L. / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый, JT.E. Сипливая // Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации: материалы II Междунар. конгр. (Москва, 7-9 июня 2012 г.) // Традиционная медицина. - 2012. -№ 5. - С. 181-184.

8. Исследование фенольных соединений мелколепестника канадского (Erigeron canadensis L.) / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая // Традиционная медицина. — 2012. — № 3(30). -С. 48-53.

9. Изучение химического состава липофильиой фракции некоторых видов

семейства Asteraceae / А.П. Северин, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая, А.Ю. Ботов // Современные проблемы науки и образования [Электронный ресурс] : электрон, науч. журн. — 2012.-Л» 2.- URL: www.science-education.ru/102-5807.

10. Аминокислотный состав некоторых видов мелколепестника / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. — 2012. - № 22 (141), вып. 20/1.-С. 155-156.

11. Ботов, А.Ю. Перспективы использования мелколепестника канадского (Erigeron canadensis L.) при необструктивном пиелонефрите / А.Ю. Ботов, В.Я. Яцюк, Г.В. Сипливый // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. - №22 (141), вып. 20/1.-С. 187-190.

12. Исследование углеводного состава некоторых растений семейства Asteraceae / А.Ю. Ботов, А.П. Северин, В.Я. Яцюк, Л.Е. Сипливая // Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова. - 2012. - № 4. - С. 142-145.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 10.04.2013 г. Подписано в печать 11.04.2013 г. Формат 30х42'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 241 "А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.