Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Анализ свойств различных фракций макрофагов, выделенных с помощью нового адгезионного метода

РГ6 од

- 5 Д[][ШЖК^ЕРСТ£0 ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

НИКОЛАЕВА Елена Николаевна

АНАЛИЗ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫ! ФРАКЦИЙ МАКРОФАГОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ НОВОГО'АДГЕЗИОННОГО МЕТОДА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат, диссертации на соискание' ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Института шфйолоГйй Министерства здравоохранении Российской'Федерации

Нау;чныйруковоДЯ¥вДЫ член-корреспондент РАЕН, доктор ыедицинскйх a spit, профессор

В.М.ЗЕШШВ ¡Официальные оннойоа»ы$

• II - - ■

доктор |ыедшшк?кюс наук, профессор Р.Й.А^МШШЙ, доктор медицинских наук, профессор Д.В.СЙЙАНЕ

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиология ка.Н.Ф.Гамалаи РЛШ

' Защита диссертация состоится УофрЛ^.,.. 1993 г.

в; Л. час на заседании спецкадиэкрованного совета Д074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава РФ

w ' \

Адрес: Москва, II5478, Каширское шоссе, д.24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава РФ

Автореферат разослан ff/^Tih........ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

л.с.сшАвт

Актуальность проблемы. Проблема гетерогенности фагоцитарных клеток (макрофагов, Мф и др.), на которую замыкаются сегодня многие фундаментальные вопросы иммунологии и клеточной биологии, в отличие от лимфоцитов, оказалась наименее изученной. Стало очевидным, что анализ просто суммарного пула клеток не может полноценно отражать их роль в различных иммунологических и физиологических процессах. Популяция Мф разнообразна благодаря присутствию в крови моноцитов, дифференцирующихся в Щ при миграции в ткани, а • в тканях - Мф различной степени зрелости, из-за нахождения в ее составе разных классов органо- и тканеспецифических Мф, обусловленных, по-видимому, дифференцировкой и модуляцией клеток (Bursu-

!

ker I., Goldman R.,1983; Batler M.S. et al.,1983; Cben B.D. et el., 1988), которые в зависимости от них, в свою очередь, неоднозначно модифицируются модулирующими сигналами и активаторами (Dougherty G.J..McBride W.H.,1984; Mazzei G. et al.,1993; Yurochko A. 1990). Более того, гетерогенность Мф может объясняться,(хотя бы частично) их субпопуляцияии, произошедшими из разных костно-мозговых

/

предшественников (Bursuker I., Goldman R., 19S3).

Таким образом, окончательно вопрос о гетерогенности Мф сегодня, к сожалению, все еще не решен и это обосновывает осуществление различных поисков в этом направлений. Не менее важно и то, что многие методы анализа гетерогенности Мф имеют высокую сложность, не всегда воспроизводимы, не исключают определенную модификацию свойств, возникающую в процессе их изолирования.

Существенным тормозом изучения мононуклеарнык фагоцитов является отсутствие тонких и щадящих методов выделения их субпопуляций, основанных не только на чисто физических свойствах или наличии поверхностных маркеров, но и использующих функциональные различия клеток. Поэтому можно не сомневаться, что достаточно важным оказалось бы создание такого метода изоляции клеток или изу-

чения юс гетерогенности, который был бы основан одновременно на, хотя бы двух различных параметрах - выделении, основанном на чисто физических свойствах Мф, и на свойствах клеток, обусловленных состоянием их метаболизма и активного функционирования.

Б связи с этим наш исследования гетерогенности фагоцитарных клеток в первую очередь были направлены на разработку метода разделения Ыф, который бы основывался на их физических и функциональных свойствах, И последующее применение такого метода для непосредственного «¿учения их гетерогенности.

Цель работы. Цель работы состояла в разработке принципиально новых подходов Для изучения гетерогенности фагоцитарных клеток и исследовании функциональных свойств разных фракций ОД мышей, выделенных с помощью адгезии в градиенте температуры на полистирол с адсорбированным бычьим сывороточный альбумином.

. Задачи исслвдования. I. Апробировать новый метод анализа ге-терогённости резидентных и активированных Мф, основанный на их адгезии в градиенте температуры на полистирол, покрытый бычьим сывороточным альбумином, 2. Изучить метаболические, функционадь-ные и морфологические свойства фракций резидентных Мф, выделении новым методом в градиенте температуры, 3. Изучить метаболические и функциональные свойства фракций ОД, изолированных из животных, получивших иммуноыодуляторы. 4. Исследовать однородность ввделен ных фракций Мф с помощью гистограммного анализа и попытаться сеп рировать достаточно однородную фракцию клеток. 5. Выяснить возмо ясность индукции выделенными фракциями некоторых иммунологических реакций, б. Разработать математическую модель для анализа гетере генности популяции Мф без их фракционирования. Выяснить возможность перераспределения фракций Мф при введении животным иммуно-модуляторов.

Научная новизна. В представленной работе впервые:

1) всесторонне апробирован и исследован вариант метода для анализа гетерогенности фагоцитарных клеток, основанный на их адгезии в градиенте температуры на полистироле, покрытом бычьим сывороточным альбумином (БСА);

2) изучены свойства выделенных фракций резидентных и активированных Мф, показана выраженная гетерогенность их метаболических, функциональных и морфологических свойств, способности индуцировать иммунологические реакции (презентация антигена и индукция эффекторов локальной РГПХ); обнаружена микрогетерогенность выделенных

фракций; . • '■ ' _/

___!

3) на основе математического преобразования данных ристогра-мыного анализа разработан метод исследования гетерогенности суммарной популяции Мф без ее фракционирования; /

4) разработан новый метод выделения и исследования достаточ-

/

но однородной фракции Мф; из суммарного гула клеток' выделена и охарактеризована такая фракция, которая отличалась по ряду свойств от типичных Мф и составляла I - суммарной популяции;

5) впервые обнаружено явление перераспределения клеток при введении иыыуномодуляторов; /

6) предложена гипотеза возможной биологической роли выявленной гетерогенности резидентных Мф./ /

Научно-практическое значение работы. Выполненная работа является экспериментально-теоретической. Разработанные в диссертаций подходы для выделения субпопуляций и изучения их функций могут послужить основой для разработки новых методов выделения субпопуляций фагоцитарных клеток человека и их анализа при различных патологических состояниях. Метод исследования гетерогенности Мф, основанный на математическом преобразовании данных гистограммного анализа суммарной популяции Мф без ее фракционирования может быть использован в клинической иммунологии практически без какой-либо

адаптации и позволит получить новую информацию о роли гетерогенности клеток, ее модуляции в норме и патологии. Научные результаты данной работы, относящиеся к проблеме гетерогенности резидентных и активированных иммуномодуляторами субпопуляций Мф, получили дальнейшее развитие в других научных учреждениях страны, занимающихся изучением мононуклеарных фагоцитов.

Апробация. Материалы работы доложены на конференции молодых ученых Института иммунологии Минздрава СССР (19ь5), Заседании Проблемной комиссии "Обцая и прикладная иммунология" Научного совещания по иммунологии при Президиуме РАМН (Красноярск, 1988), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Дагомыс,1989), 10-й встрече

I

Европейской Федерации Иммунологических Обществ (Эдинбург, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Материалы диссертации защищены авторским сведетельством №1357756 от 08.08.1987.

'Збъем и структура диссертации. Диссертация построена по традиционному плану и состоит иэ введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований,. »

обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы д> сеертации изложены на 146 страницах малшнописного текста. Работа иллюстрирована' 24 рисунками и содержит 14 таблиц. Список литературы включает 38 отечественных и 213 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использовали мышей самцов (СВАхС57В1/б)Р1 или линии СБА массой 20 - 25 г, полученных из питомника "Столбовая" АМН РФ.

Для приготовления клеточных суспензий использовали среду 1£ с добавлением 20 ыМ НЕ РЕ Б - буфера и 2 мг/мл БСА, рН 7,2. Длд пс лучения фракций Мф клетки перитонеального экссудата ресуспендирс

ваяй в культуральной среде и наносили на полистироловые чахпки диаметром 40 мм, предварительно инкубированные, с той же средой в течение ночи при +4°С. После инкубации чашек в течение 30 мин при 4°С суспензию неприлипших клеток переносили в,другие чашки и ин-кубйровали их в течение 30 мин при 12°С. Далее используя описанную процедуру адгезии прилкпавдцих клеток и смыва неприлипших выделяли фракции клеток, адгезирущих при 20°С, 2В°С и 37°С. Во всех опытах создавали идентичные условия для всех разделяемых , фракций, инкубируя их при всех оставшихся температурах,"Веред инкубацией при 37°С во все фракции добавляли фетальную телячью сыворотку до 1($~ной концентрации, что способствовало удалению примеси лимфоцитов среди прилипших клеток. Во всех чашках ,йо данным морфологии и окраске на неспецифическуа эстеразу содержалось не более 5% типичных лимфоцитов. Суммарный пул получали, инкубируя исходную суспензию I час при 37°С. / .

Цитологический анализ фракций мононуклеаров проводили по окраске Романовского-Гимзы, на неспецифическую эстеразу и кислую фосфатазу, а такке с помощью прямого наблвденик морфологии клеточной поверхности в сканирующем электронном микроскопе. В цитохи-мичесюсс исследованиях использовали сканирующий иикроцитофотометр "ШК", соЕмеценный с микроскопом "ЛШШ'и-3" (длина волныА=580 им). Биохимический анализ активности аргиназы проводили по методу Кипе I. а1(1Э77);Ю1СлоЙ фосфатазы - по методу Тогг1ап1 А.

<1960). !

/ 1

Комплекс методов исследования связывающей и поглотительной > способности Мф включал в себя: реакцию ЕА-розеткообразования и | ЕА-фагоцитоз в монослое, согласноВаг-&1ат1Л Ъ. ot а1. (1979) > ПРИ получении ЕА использовали различную степень опсонизации эритроцитов специфическим выявление СЗМ - рецепторов в реакции ЕАС-розеткообразования, описанной СПХЛа ?.м. et а1. (1975) ; опреде-

- б -

ление неспецифических рецепторов на Мф с помощью эритроцитов барана, обработанных глютаровыы альдегидом (Ег-розеткообразование) по. Веао11в1 а.(1980)^остановку реакции розеткообразованкя фракций йф с сингенньши ткмоцнтаыи по методу ИоиЪу З.Е, е* а1. (1985); измерение пиноцитарной активности по поглощению перокси-дазы хрена ^е1тап л.«., 1976).

Для определения принадлежности выделяемых нами фракций к Тили В-лшфоцитам проводили лимфоцитотоксический тест, позволяющий выявлять; М$ЬА- или лв1А -антигены с помощью ыоноспецифичес-них сывороток, ¡полученных в лаборатории иммунологии Московского НИИЭЫ (НиловсЦй М.И-. и др., 1%3).

Для выяснения роли фракций Щ а презентировании антигена проводили адгезию Мф при 20°С и 3?°С на круглых полисТ1фоловых кружках диаметром 5 мм (вырезанных из чашек Петри), осуществляли фагоцитоз эритроцитов барана, обработанных еубагглютинирующей дозой рротивоэритроцитарной кроличьей антисыворотки, прилипшие эритроциты удаляли гипотоническим шоком и затем имплантировали кружи! в брюшную полость мышэй СБА по б - 6 штук. Через 14 дней животным внутрибрюшинно вводили 50-10^ эритроцитов барана, а через два дня после отого забирали кровь и определяли в сыворотке титр . антител (геыапглютинкнов) с помощью реакции геыагглютинации.

Взаимодействие Мф с тиыоцитаыи при индукции Т-клеток, вступающих в реакцию "трансплантат; против хозяина", исследовали, используя методику, описанную Анфаловой Т.В. и др. (1983). Еыде-■ ляли фракции резидентных перитонеальных Мф мышей(0ВАхС57В1/6)Р1, добавляли к ним интактныз сингенкые клетки тимуса в соотношении 1;5 и инкубировали 4 часа при ч-37°С в бессывороточной среде. Затем тимоциты отмывали центрифугированием и опытные тимоциты вводили подкожно по 2*10 клеток в 40 ыкл физиологического раствора в подушечку правой задней лапы мыши (СВАхС57В1/6)Р1> а в противо-

положную левую лапу - контрольные тимоциты ( не инкубированные с Щ), Интенсивность РТПХ оценивали на 7-й день после инъекции клеток по индексу увеличения лимфоузлов, который определяли, как отношение числа клеток в подколенных лимфоузлах правой и левой конечностей. ,

Статистическую обработку результатов проводили- по критерию Стьюдента. . 'ч

I. Исследование гетерогенности резидентных1 Мф перитонеальной

полости мышей ■ .

Предце всего была изучена температурная зависимость адгезии Мф на различных субстратах. Шло показано, что при >4°Сна стекло адгезировали 85£ Мф, на полистирол - Mfi, а на>ирли^тирол-, покрытый БСА (2 мг на мл добавляемого раствора) - только/ 5%'(рис.1). Шесте с тем, при адгезии Мф на чисгцй полистирол и йолистирол, покрытый БСА, при +37°С адгезировали практически 1Р0£ Мф. Также установлено, что в диапазоне концентраций 2 - 20 ¿кг на мл среды при +4°С начиналось снижение числа прилипающих кф по сравнению с адгезией на не обработанный субстрат вплоть ¿{^концентрации 2мг/мл (рис.2). Более низкое содержание альбуминане влияло на адгезию. Поэтому была выбрана концентрация БСА в с/еде, равная 2 мг/мл. Следует отметить, что, как видно из рис;2, количество клеток, ад-гезируюащх на полистирол, покрытый БСА, обратно пропорционально зависело от площади поверхности, пЪкрытой агрегатами белка, что■ позволяет предполагать адгезию-Йфименно на,участки полистирола» не занятые БСА. В этих экспериментах площадь поверхности, покрытой БСА, количественно оценивали на "Megiscan-2A"(Joyce-loebl, ! Англия) с электронногршм, полученных в сканирующем электронном 1 микроскопе"Carabridiie Stereo-Scan 250ЖЯ (Англия) и сканирующей приставке "Jeol EM-ASID-4D" (Япония), Подбор других значений температуры, используемых для разделения клеток, перитонеального экс-• судата, был проведен эмпирически, подобно методу Родионова C.B. и

100

50

100

50

J±L

-

Г5"] г5Е-|

|

,1 2 3 2 3

Ряс Д. Адгезия Щ на различные субстраты,

I

: Но оси.абсцисс - I - стекло, 2 - полистирол,

I

3 - полистирол о ишобилизированным EGA; ip оси ординат - число адгезировавлшх Мф: й - при t4°C, б - при +37°С, млн.

100 75

50

25

Г О®

(В

©

0,02 2,0

200

Ряс.2.Адгезия Щ на полистирол, покрытый различным количеством сывороточного альбумина, при +4°С. По оси абсцисс - концентрация БСА в добавляемом растворе, мкг/мл; по оси ординат - доля прикрепившихся Мф, %. В заштрихованных секторах - площадь поверхности, занятая иммобилизированным БСА, %.

>9-

др. (1965). \ , '

Применение данного подхода позволило выделить и охарактеризо-. вать 5 фракций резидентных перитонеальных Мф» адгазирующих при +4°С (1-ая.фракция), +12°С (2-ая фракция), Ц()ЬС (3-я,фракция), +28°С (4-ая фракция) и +3?°С (5-ая фракция). Они значительно различались по количественному составу: 5,70+1,32$, 30,70+1,56%, 25,46^1,90$, 2В,44+2,44$ и 29,70±2,3е$, соответственно. Шло показано, что адгезивность клеток 1-ой и 5-ой фракций зависела от сезона. Зимой и весной меньше всего прилипало клеток при +4°С, боль-те всего - при +37°С. Летом возрастало число клеток« прилипащих при +4°С, а осенью оно з два раза превышалохсредНий уровень адгезии во фракции, причем разница по сравнению с весной составляла 3,74 раза. Обратная тенденция наблвдалась в 5-ой фракции.-Таким образом, между числом клеток, адгезирующих при +4°С >/+37°С, существовала определенная зависимость. /

При исследовании выделяемых фракций в световом микроскопе' были выявлены различные варианты клеток, отличающееся по форме, размерам, содержанию органелл. Клетки 1-ой фракций имели наименьший средний диаметр (<10 мкм), 4-ой - наибольший (>15 мкм), причем различия клеток наблюдались как между фракциями, так и в пределах одной фракции (рис.3). / .

С помощью сканирующей электронной микроскопии были отмечены значительные различия рельефа клеточной поверхности на уровне фракций. Так, 1-ая фракция содержала до 90%' нетипичных для Мф клетбк, которые практически не распластывались, сохраняя почти сферическую форму, и прикреплялись я субстрату немногочисленными выростами. Их характерной чертой являлась сглаженность рельефа. Клетки 2-ой фракции имели менее сглаженную поверхность, более развитые ламеллярные образования, достаточно большое число клеток было способно распластываться на субстрате. Наиболее выраженными чертами

— из -

30г5, 15"

А. •

_С-» .", .1 ,

30 10 20 30 40

Г4. 1530

15

30

15

р

Р

"3. >

'Л

10 . 20 30 40

"Пть.гя.,

10 I 20 30 40

2.

4

т/

к ' & ■ 40*

I.

У

Зпк

10 20

30 40

Рис.3. Распределение клеток с различными диаметрами во фракциях. А: по оси абсцисс - диаметры клеток, мкм; по оси ординат

количество клеток, %\ 1.-5, - номера, фракций. Б: по оси абсцисс 1-5 - номера фракций, 6 - суммарный пул,'1 по оси ординат - диаметры клеток, мкм.

-II - ■

ф обладали клетки 3-ей фракции. Они хорошо распластывались, име-

и многочисленные раффлы, клапанообразные и Гребневидные отрост-я. Щ) 5-ой фракции отличались наиболее уплощенной формой, близ-:ой к полусферической. Пожалуй, эти клетки сгсзль же отличались от 1ф других фракций, как и клетки 1-ой фракции. ^Выявленная гетеро-'енность морфологии различных фракций Мф, которая явилась исход-Iда признаком клеток и даже сохраняла свои определенные особенно-:ти после их культивирования 1п т1*го , по-видимому, может свида-?ельствовать о реальности существования фракций'^, возможно, суб-кйуляцйй Ш>. ■ !,

При измерении активности неспецифической.эстераза"сУпомочью сканирующего микроцитофотокетра ее величина в суммарном/пуле.составляла 1,54+0,01 УЕ, в 1-ой фракции ~ 0,503+0,005 УН, в"5-ой

фракции 0,63+0,07 УЕ, тогда как в 3-ей - 3,52+0,32 Щ. При удли-

/

нении времени инкубация клеток до 24 часов интенсивность реакции в суммарном пуле практически не изменялась,'1 но возрастала в 5-ой фракции (1,24+0,01 УЕ и 1,04+0,08 УЕ). Активное^ лизосомального фермента кислой фосфатазы такке оказалась мак^шальной в 3-ей фракции (<3,47+0,10 УЕ) и минимальной в 1-ой фракции (0,051+0,02 УЕ), причем в 3-ей фракции она была выше в 2,2/раза, чем в суммарном , пуле и в 9,3 раза, чем в 1-ой фракции^Даким образом, выполненный; нами анализ активности ферментов отражал выраженную гетерогенность различных температурных фракций, йкк это было показано и в отношении других ферментов (Пангин В.И. и др., 1987). |

В настоящее время при йнализе таких функций Мф, как роэетко-образование, фагоцитоз.й других, в основном, используются усредненные характеристики клеток всей популяции. Подобный подход не позволяет выявлять функциональные показатели отдельных субпопуляций этих клеток с одной стороны, а также усложняет оценку, поскольку взаимодействие Щ с частицами является статистическим процессом,

- 12 - . ; •

что вносит дополнительные трудности в анализ гетерогенности Мф. Для того,, чтобы избежать эти недостатки, мы попытались разработат математическую модель для ¡анализа гетерогенности Щ по способно-

I

сти связывать и фагоцитировать эритроциты серезрс -рецепторы (Ще— рбухин В.В- и др., 1986). Модель основана на предположении, что гистограммы распределения М{), связавших или поглотивших различное число частиц, представляют собой сумму Пуассоновских распределений. Экспериментально наблвдаемые распределения М|> по гасфункцио-

: I "С-

нальной активности можно представить в виде суммы: А а с.й^(о)

I ° ±о1

где Ag - Теоретически расчитанные гистограммы распределения Mj? по количеству связанных'(поглощенных) ЕА, - доля клеток i- той субпопуляции Rj^íe) ■ exp(-Ei)Ei/3 - распределение Мф

по розеткообразукщей или фагоцитарной активности в 1 -той субпопуляции со средним количеством связанных (поглощенных) эритроцитов Таким/образом, образующие i-тое Пуассоновское распределение^ считались клетками одной субпопуляции и характеризовались средним числомэритроцитов, приходящихся на I Мф. Определялась

также доля i -той субпопуляции с> от суммарного пула клеток. Чис-» i

по Пуассоновских функций к , составляющих экспериментальное распре деление, определяли по наименьшему индексу и на основе визуального сравнения экспериментальных и наилучших в смысле метода наименьших квадратов теоретических гистограмм. Разработку алгоритма и расчеты, связанные с определением Aa,c1,Ei были выполнены с.н. канд. физ.-мат. наук В.ВДербухиным.

Математическая модель была использована для изучения гетерогенности резидентных Мф без их разделения на температурные фракции. При этом удалось выявить 3 типа клеток с существенно различающейся активностью связывания ЕА (от 0*3+0,1 до 6,0+0,7 ЕА/М$), что подтверждалось разложением гистограммы связывания на три 'Пуассоновских распределения и свидетельствовало о существовании в

]*ао.4.Розагкообразувдая способность резидентных Мф перитоноаль-

ной полости мышей.

По оси абсцисс - число эритроцитов барана, связанных одним Мф; по оси ординат - доля Мф, х - экспериментальные данные, • - теоретически рассчитанные; а.-гистограмма связывания Мф эритроцитов барана через Гс-рвцепторн, в.-через СЗа-рецепторы, д.-через неспа-цифические рецепторы; <5,г,в - математическое преобразование гистограмм связывания.

суммарном пуле ОД, по-крайней мере, трех различных фракций клеток, различающихся по экспрессии Гс-рецепторов (рис.4 а,б). Математический анализ гистограмм распределения ЕАС-РОК позволил выявить в суммарном пуле (по экспрессии сзы -рецепторов) два резко отличающихся пика связывания - 0,2 и 3,1 ЕАС/Мф (рис.4 в,г), которые в процентном отношении распределились примерно поровну. Изучение розеткообразования ОД через неспецифические рецепторы, показало, что в суммарном пуле также регистировапись два сильно различающихся типа клеток, связывающих в среднем 0,38 и 9,3 Е^Мф, доля которых составляла соответственно 40 и. 60& (рис.4 д,е). По интенсивности связывания сингенных тимоцитов (экспрессия специфических рецепторов к лимфоцитам) Мф суммарного пула разделились на три типа клеток: 16,8% Мф связывали в среднем 0,34, 70,2$6 Мф - 3,22 и 13$ Мф - 10,8 тимоцитов.

Таким образом, с помощью разработанной модели удается выявить выраженную гетерогенность ОД в их суммарном пуле по экспрессии различных специфических и неспецифических рецепторов. Важно отметить, что снижение или повышение опсонизации эритроцитов, усиление слабых адгезионных специфических взаимодействий после мягкой обработки розеток глютаровым альдегидом, в принципе, не меняло характера картины гетерогенности.

При изучении экспрессии Рс-рецепторов по средним показателям связывания ЕА/Мф наибольшей активностью обладали 3-я и 2-я фракции, отличаясь от наименьших 1-Й и 5-й в 2-3 раза. Однако, четко было видно, что в пределах каждой фракции или всего суммарного пула клеток прослеживались две основные субфракции клеток - активно и слабо связывающих ЕА, но их количественное соотношение в разных фракциях было неодинаковым (рис.5). Так, среди ОД 5-й фракции имелся 81% слабо связывающих ЕА клеток, а в 3-й фракции - только ЗОй. Во 2-й и 3-й фракциях обнаружился минорный компонент особен-

80

40

2

4

80

6.

Рис.5. Распределение (4$ по /Активности связывания эритроцитов барана, опсонизированнюс 150

Но оси абсцисс - количество ЕА, связанных одним Мф,

по оси ординат - доля Мф| %\ а,- вся популяция Мф,

б.-фракции Мф:[> 1-ая, Н - 2-ая,Щ -3-я,(Ш!-4-ая,а-5ая.

80

• 40

№

а.

80

40

аз!

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис,6. Распределение Мф по активности фагоцитоза эритроцитов барана, опсонизированннх

По оси абсцисс - количества ЕА, поглощенных одним Мф; по оси ординат - доля'Мф.Я; а. - вся популяция Мф, б.фракции Иф:0- 1-я, И - 2-я М- 3-я,Щ]-\4-я, 0 - 5-я.

8

б

но активных клеток, связывающих 9-10 ЕА, не. выявлявшихся ни в общей популяции, ни в других фракциях и составлявших всего от всей популяции. Возможно, что способность к активному связыванию ЕА характерна для зрелых Мф с активной латеральной подвижностью Fc-рецепторов в плазматической мембране. При удлинении времени инкубации in vi-tro в суммарном пуле, как и ранее, выявляли два типа клеток - активно и слабо связывающих ЕА, во фракциях - три,а в 3-й и 4-й - четыре типа клеток, различающихся по своей функционалы ной активности, то есть их гетерогенность не только не уменьшалась, а скорее, даже увеличивалась. Таким образом, эксперименты свидетельствовали, что гетерогенность Мф по экспрессии Fc-рецеп-торов является истинной и не обусловлена процедурой выделения клеток. Возрастание гетерогенности при культивировании связано, скорее всего, с созреванием/дифференцировкой Мф, не исключается и вклад в этот процесс адгезии клеток и их распластывание в культуре,

В случае связывания через неспецифические рецепторы наименьшим уровнем розеткообразования обладали клетки 1-й фракции, максимальным - 3-й и 4-й. Используя гистограммный анализ и его математическое преобразование можно было выявить три типа клеток во всех фракциях Мф как до культивирования, так и после него, то есть характер гетерогенности фагоцитов и их фракционный состав не изменился. Кроме абсолютных значений связывания определили экспрессию рецепторов на клетках различных фракций Мф в зависимости от средней площади клетки. Шло показано, что с увеличением площади клеток не происходило возрастания экспрессии Fc-рецепторов и неспецифических рецепторов.

Бри определении интенсивности фагоцитоза ЕА через Fc-рецепто-ры в суммарном пуле также выявили два типа высоко- и низкоактив- ; ных клеток, которые прослеживались во всех выделяемых фракциях, но в различных соотношениях (рис.6). Колебания средней фагоцитарной

активности во фракциях были пропорциональны их розеткообразующей способности: более активными были 2-я и 4-я фракции, а максимальная активность наблюдалась в 3-й фракции. Можно полагатьчто средняя 'фагоцитарная активность фракций варьировала за счет изменения относительного содержания слабо активных и активных Мф.

По способности к жидкому йиноцктозу клетки различных фракций также оказались гетерогенными/ Среди них в 1-й фракции выявляли в наибольшем количестве активно пиноцитирующие клетки (49?5 образцов обладали активностью от 0,9 да 1,75 УЕ, чего не выявляли ни з одной другой фракции), которые н1 были похожи на типичные так как давали слабую окраску на неспецифическую зстераэу и не обладали радом других свойств, характерных для фагоцитов. В остальных фракциях способность к ииноцитозу постепенно снижалась по мере возрастания значений температуры, при которых они были выделены, от незначительного превышения интенсивности пиноцитоза суммарного гула (0,010-0,287 У£) во 2-Й фракции, до статистически достоверного снижения в 5-й фракции.

2. Выделение и характеристика нсфагоцитирующей фракции

клеток перитонеального экссудата При изучении различных фракций четко прослеживалась обособленность клеток 1-й "холодовой" фракции. Основная масса их била

малоактивной и лишь минорный компоненг1 обладал более высокой акт-

р

вностьш. При почти двукратном снижении концентрации ионов +по сравнению с их содержанием в 199 среде до 0,31-0,36 мМ произошло уменьшение числа клеток этого минорного компонента активно связывающих ЕА. Остающиеся прилипающие в данных условиях клетки, составляющие 1-5$ от клеток общего пула, адгезнрукщкх при +37°С, состояли на 96-100$ из клеток 1-го пика, слабо связывающих ЕА (0,60+ 0,25 ЕД/М£). Усиление слабых специфических связей "лиганд-рэцеп-тор" с помощью мягкой обработки образующихся розеток глютнровым

альдегидом привело к возрастании связывания ЕА. в хояодовой фракции, но ее ло-прехнему представляли MJ>, составляющие практически один гомогенный пик.

Б отличие от клеток суммарного пула в холодовой фракции связывания черезСЗМ- рецепторы практически не было, а связывание через неспецифические рецепторы соответствовало исключительно слабому типу, причем обработка монослоя глютаровым альдегидом его не увеличивала. Аналогичные результаты были получены при изучении экспрессии рецепторов к сингенным тимоцитам.Способности к фагоцитозу как ЕА, так и частиц латекса у клеток холодовой фракции также не было отмечено, она обладала крайне низкой активностью кислой фосфатазы и несколько большей - неспецифической эстеразы.■ Такие данные не противоречат предположению о "гомогенности" клеток (безусловно, речь идет только о фагоцитах), гистограмма функциональной активности которых хорошо приближается одним распределением Пуассона. Клетки этой фракции не взаимодействовали с анти-M5LA сывороткой и комплементом, поэтому их нельзя отнести к Т-лиы-фоцитам. Экспрессия la- антигенов на мембране клеток холодовой фракции была в два раза выше, чем в суммарном пуле, а тимэктомия взрослых мышей приводила к возрастанию количества клеток холодовой фракции примерно в два раза, что весьма характерно для модификации содержания дендритных клеток. Исходя из того, что изоферме-нты неспецифической эстеразы Щ> чувствительны к действию фторида натрия, а у лимфоцитов - резистентны, применили этот тест. Обнаружено, что фторид натрия вызывал трехкратное снижение активности фермента в суммарного пула и клетках холодовой фракции и не влиял на нее в тимоцитах и спленоцитах, в которых активность фермента была низка. При культивировании in vitro через одни сутки клетки этой фракции отлипали от субстрата и морфологически не был похожи на типичные Щ. В тоже время эти клетки обладали способно-

стью к пиноцитозу пероксидазы хрена (эндогенной пероксидазы не обнаружено). Более того, отмечалось выраженное связывание с клетками холодовой фракци анти-ивьд сыворотки,.а также.антииммуноглобу-линовых антител. Поэтому в настрячее время отнесение их к Мф затруднительно, принадлежность ку^Г-лимфоцитам удалось исключить. Возможно, они являются субпопуляцией В-лимфоцитов или дендритных

клеток. Нельзя исключить принадлежность "холодовых" клеток к нз-

/

известной популяции. Ее "мабкированне" может быть обусловлено тем,

.что существующие методы не позволяли ранее выявить их в достаточ-

1

ном для анализа количестве. |

3. Влияние иммуномодуляторов на гетерогенность Мф Введение нуклеината натрия (НН) сопровождалось существенной активацией фагоцитов, причем при внутрибрюшинной инъекции размеры всех фракций клеток превышали размеры фракций резидентных Мф (при оральном применении НН оно отмечалось лишь в 20°-фракции); существенно повышалась активность аргиназы и кислой фосфатаэы в суммарных пулах клеток, причем в разных фракциях она оказалась очень гетерогенной, различаясь между некоторыми из них в 20-25 раз. Наряду с ферментами резко возрастала экспрессия рецепторов к синген-ным тимоцитам, отсутствующим у резидентных Мф (наиболее активными были 20°- и 3?°С фракции, наименее - 4°С фракция); Рс^-рецепторов: в суммарном пуле клеток и фракциях после парентерального введения НН в среднем в 2-9 раз, однако после орального применения она существенно уменьшалась, даже ниже значений резидентных клеток.

Изучение гистограммнаго распределения клеток по экспрессии Гей выявило в суммарном пуле наличие двух типов - слабо и умеренно ЕА-связыващих Мф, а после орального введения НН - появлялась третья чрезвычайно низкосвязывающая фракция, наряду с которой уже через II час начинали регистрироваться и высокосвязываюцие клетки, отсутствующие среди .резидентных Мф. Это (позволило высказать предо

"Э

положение о возможном перераспределении активированных и резидент-н'ас ОД после введения иммуномодуляторов. Это же подтверждалось при анализе FcB-опоередованного фагоцитоза, когда оральное введение НН вызывало исчезновение высокофагоцитирующей фракции ОД, имеющейся у интактных животных, относительный индекс фагоцитоза был у них также существенно ниже, составляя 0,21 при 0,47 в контроле (Индекс = X поглощенных ЕА/Мф X связанных ЕА/ОД), что свидетельствует о том, что не все FcB-несущие ОД фагоцитируют ЕА, связанные через FcR, По-видимому, некоторые субпопуляции ОД находятся в неактивном состоянии, но могут при определенных обстоятельствах активироваться, что подтверждает их культивирование in vitro. Таким образом, иммуномодуляторы, по-видимому, не только вызывают акти- ' вацию Мф, но и способствуют перераспределению в организме их высоко- и низкоактивных субпопуляций (?), Более того, возможно, в организме существует пул предактивированных ОД, выполняющих "сторожевые" функции, обеспечивающих быструю оперативную защиту, а также пул неактивных ОД, которые при необходимости могут быстро подвергаться активации и становиться фагоцитирующими; наряду с ними не исключено существование пула ОД, которые полностью проходят весь необходимый цикл клеточной активации.

4. Исследование роли фракций Щ> в индукции специфических

иммунологических реакций Исходя из того, что 3-я и 5-я фракции ОД наиболее резко различались по ряду свойств, изучили их возможную роль в презентации антигена. Для этого осуществляли ОД, адгезированными на кусочках полистирола, фагоцитоз ЕА, имплантировали эти кусочки реципиентам в брюшную полость, которых через две недели иммунизировали эритроцитами барана, и изучали у них титры гемагглютининов. Полученные данные свидетельствовали о 4-5-кратном повышении антигенпрезенти-рующей спосбности Мф 5-й фракции по сравнению с ОД 3-й фракции,

что подтверждает существенную функциональную гетерогенность различных фракций Мф.

Для выяснения роли фракций Мф в генерации Т-эффекторов, вступающих в реакцию "трансплантат против хозяина'ЧРСПХ), сингенные тимоциты ыышей инкубировали на монослоях этих фракций, выделенных из общего пула резидентных Щ.1Для неразделенного пула Мф индекс РТПХ был равен 2,32+0,35. Во фракциях он был соответственно равен:

1,21, 1,57 , 2,23, 1,71 и I /37, то есть Мф 3-й фракции обладали на/

ибольшей способностью индукции созревания тиыоцитов и последующей реализации ими локальной РТАХ у| реципиентов. Скорее всего вкладом именно этой фракции объясняется' активность Щ общего пула.

Опираясь на функциональную дискриминацию иымунокомпетентных клеток (Манько В.М., Хаитов Р.М., 19Ь7), можно предположить, что 3-я и 5-я фракции выполняют в организме разные функции и, возможно, представляют собой разные субпопуляции Ыф, Однако у нас нет абсолютных доказательств этого, так как в соответствии с общепринятым мнением, каждая из гипотетических субпопуляций клеток должна иметь своего предшественника, то есть, по существу, самостоятельную стволовую iweTiqr или коммитированного предшественника.

Таким образом, данные, полученные в наших опытах, можно рассматривать как определенное свидетельство в пользу широко распространенной точки зрения, что гетерогенность основной массы резидентных Мф обусловлена функциональным состоянием этих клеток и определяется их микроокружением, влиянием на клетки различных факторов и самих клеток, и является обратимой (Земсков В.М., 1969). Вместэ> с тем, нельзя исключить и существование среди них истинных субпопуляций Мф. В этой связи оказывается важным факт обнаружения нескольких, существенно различающихся типов активных и неактивных Мф в перитонеальном экссудате. Причем реальность их существования in vivo удалось продемонстрировать с помощью метода разделения по

адгезии в градиенте температуры. Очевидно, соотношение активных и неактивных Мф в каких-либо компартментах создает там микроокружение и таким образом влияет на физиологию целого организм?, и системы фагоцитов.

Вся совокупность полученных нами и литературных данных позволяет предполагать, что Иф 3-й и 4-й фракций являются типичными зрелыми клетками; клетки 2-й фракции, скорее всего, недавно мигрировали в перитонеальную полость из других компартментов организма и представляются незрелыми Мф; клетки 5-й фракции представляют собой зрелые Мф, выполняющие антигенпрезентирущую функцию; и, наконец, к клеткам 1-й "холодовой" фракции относится особая субпопуляция клеток, возможно, немакрофагальной природы.

ВЫВОДЫ'.

1. Разделение фагоцитарных клеток на фракции по адгезии в грат диенте температуры на полистироле, покрытом сывороточным альбумином, позволяет выявлять внутрипопуляционную гетерогенность резидентных и активированных ма1фофагов.

2. Адгезионное разделение макрофагов выявляет не только фракции клеток, но и микрогетерогенность последних.

3. Фракции резидентных и активированных макрофагов существенно различались по активности лизосомальных гидролаз, неспецифической эстеразы, аргиназы, экспрессии специфических и неспецифических рецепторов и рецепторов к сингенным тимоцитам. Из популяции резидентных макрофагов выделены оппозитные фракции по антигенпре-зентирующей способности и индукции эффекторов локальной Р1ПХ.

4. Фракции характеризовались четкими морфологическими отличиями, связанными с их функциональной гетерогенностью.

5. Разработана математическая модель, основанная на гистограм-мном анализе функций макрофагов, позволяющая изучать гетерогенность суммарного пула клеток без их фракционирования. Метод может быть использован в клинической иммунологии без дополнительного

адаптирования.

6.Этот метод позволяет выделить и оценить достаточно однородные фракции фагоцитарных клеток. С его помощью впервые выделена подобная фракция клеток, характеризующаяся сниженным количеством или отсутствием специфических ^ неспецифических рецепторов, ферментов и фагоцитозом, свойственным типичным макрофагам, выраженным пиноцитозом и ыорфологичёскими особенностями. Эти клетки не относятся к Т-лга^оцитам, положительно реагируют с антиглобулино-•вой и анти-kbia сывороткой, их неспецифическая эстераза подавляется фторидом натрия, они адгезируюг на полистирол, покрытый альбумином, при +4°С и, возможно, не являются макрофагами.

7.Новые подходы позволяют высказать предположение о возможности перераспределения фагоцитарных клегок и их фракций в организме животных в условиях введения иммуномодулягоров. Применение последних может сопровождаться появлением новых фракций клеток, отсутствующих в брюшной полости иятактных животных.

8.Исследование механизма адгезии макрофагов выявило, что параметры адгезивности и распластывания определяются температурой адгезии, составом среды инкубации, характером субстрата, интенсивностью клеточного метаболизма.

9.Характер адгезии макрофагов в градиенте температуры был подвержен сезонным колебаниям.

Ю.Предложена гипотеза возможной биологической роли выявленной гетерогенности резидентных макрофагов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации I.Щербухин D.B., Родионов C.B., Николаева E.H., Земсков В.М. Анализ гетерогенности макрофагов по их фагоцитарной активности //Цитология.-Г96б,-Г.ХХУШ .-№12.-1299-1306.

■ 2.3емсков В.М., Родионов C.B., Щербухин В.В., Николаева E.H. Способ выделения популяции незрелых макрофагов из мононуклеар-шх фагоцитов //Am. свидет.-W357756.-08.06.67.

3,RodionoT S.V.> Scherbukhln V.V., Nlkolseva E.N., Zemskov V.M. Redistribution of autpopulations oí peritoneal macrophagee with Pe - receptora under the eííect of an immunomodulator //J.Hygiene, Epidemiology, UicroMology and Immunology.-1988. - Vol.32, H1.-P.95-104.

4.3емсков B.M., Родионов С.В., Николаева Е.Н., Щербухин В.В., Хра-мцов А.В., Ларионов Е.В., Васин В.И. Новый подход для изучения гетерогенности макрофагов /Дез. докл. I Всесоюзн. иммунологического съезда.-ТЛ.-Москва, 19Ь9.-С.40.

5.Родионов С,В., Земсков В.М., Николаева Е.Н. Функциональная гетерогенность мононуклеарных фагоцитов /Дез. докл. Всесоюзн. симпозиума "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и патологии." - Новосибирск, I990.-C.II6.

6.Земсков В.М., Родионов С.В., Щербухин В.В., Николаева Е.Н., Ларионов Е.В., Васин В.И. Выделение и анализ нефагоцитирую-щих прилипающих клеток перитонеального экссудата мышей //Иммунология.-I 990.-^5 .-С.22-26.

7. Zemskov V.M., Rodiouov S.V., Nikolaeva E.N. , Schertiukhin V.V. ,

Khrajntzov A.V., Larionov E.V. , Vasin V. I. Nei» method oí macrophage heterogenelty //Materials of the 10th Meeting of .the European íederatioa of Immunological Societes. - Edinburg. -1990.-í. 14.

8. Земсков B.M., Пантин В.И., Родионов С.В., Николаева Е.Н., Лари-

онов Е.В., Васин В.И., Фрейвальд А.О. Исследование механизмов адгезии макрофагов на полистирол, покрытый разными белками //Иммунология.-1991.-№5.-С.35-38.

9.Земсков В.М., Родионов С.В., Николаева Е.Н., Храмцов А.В., Пантин В.И. Функциональная активность субпопуляций макрофагов, разделяемых в градиенте температуры на полистироле, покрытом сывороточным альбумином //Иммунология.-1991.-№6.-С. 31-34.