Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Роль пуриновых нуклеозидов и оснований в регенерации тимуса, стимулируемой соматотропином и непептидным тимусным митогеном

КИЕВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭНДОКРИНОЛОГИИ И ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

ГОЙДАШ Михаил Михайлович

РОЛЬ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И ОСНОВАНИЙ В РЕГЕНЕРАЦИИ ТИМУСАГ СТИМУЛИРУЕМОЙ СОМАТОТРОПИНОМ И НЕПЕПТИДНЫМ ТИМУСНЫМ МИТОГЕНОМ

14.00.03 — эндокринология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев — 1992

Работа выполнена в Киевском научно-исследовательском институте эндокринологии и обмена веществ МЗ и АН Украины.

Научный руководитель: доктор мед, наук, профессор

И. А. БЕЗВЕРШЕНКО.

Официальные оппоненты: член-кор. АН Украины,

доктор мед. наук, профессор Э. В. ГЮЛЛИНГ.

доктор мед. наук Ф. П. МАРТЫНЕНКО.

Ведущая организация — Украинский НИИ фармакотерапии эндокринных заболеваний (г. Харьков).

Защита состоится « .тГ. » . 1992 г. в час.

на заседании специализированного совета Д 088.14.01 по эндокринологии при Киевском НИИ эндокринологии и обмена веществ МЗ и АН Украины (254114, Киев-114, ул. Вышгород-ская, 69).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Киевского научно-исследовательского института эндокринологии и обмена Ееществ МЗ и АН Украины.

Автореферат разослан «. » . . . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

И. Н. ШОСТАК-ПАСЕЧНИК

■• ' j ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

¡'¿ml

■ гДМтуадьность проблемы.Ьилочковая железа является органом, где ££рт:ций-{ .

сущеИтагяется синтез гормонов, контролирующих антигеннезависимую ифференцировку Т-лимфоцитов. Гормоны вилочковой железы избиратель-о контролируют дифференцировку различных популяций Т-лимфоцитов Bach, 1976í Ooldstein et al.,1971| Low et al.,1982). В этом орга-э происходит также интенсивная пролиферация гимоцитов, большинство оторых являются незрелыми Т-лимфоцитами. Регуляция пролиферативной ктивности тимоцитов осуществляется факторами, продуцируемыми адено-ипофизом - например, соматотропином (Pendían et al.,|1971jSaxena 1977; ' alwar 1979) факторами,' выделяемыми Т-лимфоцитами - например, интер-ейкином-2 (Lowenthal et al., 198б| Zttniga-Pfucher 1990) ростовым

У

ептидом (Stíder 1981) непептидным фактором тимуса (Безвершенко 197Ь) .

На пролиферативную активность Т-лимфоцитов влияют и другие фак-оры, ц частности, связанные с особенностями обмена пуринов в этих летках. Способность Т-лимфоцитов к пролиферации зависит от актив-исги пуриннуклеозидфосфорилазы, наследуемый дефект которой приводит накоплению дезоксигуаноэингрифосфата, угнетению активности-цити-инфосфатредуктазы и остановке синтеза ДНК в Т-лимфоцитах. По-види-ому, в нормальных тимоцитах существует относительный дефицит актив-ости пуриннуклеозидфосфорилазы, о чем свидетельствует, очень высо-ая их чувствительность к токсическому действию дезоксигуанозина Scharenberg et al.,1988). Ограничение пролиферации Т-лимфоцитов, ызванное дезоксигуанозином, может быть'отменено дезоксицитидином ли гипоксантином (Penit et al., 1986).

Остается не выясненным вопрос, являются ли объектом митогенно-о действия соматотропина и непептидного фактора одни и те же попу-яции тимоцитов, а также, одинаково ли действие указанных агентов

на обмен пуринов в субпопуляциях этик клеток.

Этот вопрос представляет существенный интерес, так как регенерация тимуса, наступающая после различных воздействий '(стероиды, облучение) происходит за счет пролиферации устойчивых к гидрокортизону популяций тимоцитов (Кои^о1<1 et в1*|1981| 0егес118 вt в1.,1982 Соматотропин в свою очередь, стимулирует пролиферацию кортизончув-ствительных популяций.тимоцитов (Та1тгах 19В2).

.Таким образом, регенерация гимуса контролируется не единствен-,ным фактором. Изучение этих.факторов и механизма их действия способствует выбору оптимальных методов восстановления количества и состава Т-лимфоцитов при гиперкортицизме или другой эндокринной патологии.

м9ль работы -заключалась в изучении действия соматотропина и непептидного митогенного фактора тимуса на регенерацию тимоцитов и на катаболизм адениловой кислоты в кортизонрезистентных и кортизон-чувствительных тимоцитах, а также в .выяснении роли пуриновых метаболитов в пролиферативной активности кортизонрезистентньк и корти-зончувствительных тимоцитах. . '

Основные задачи исследования:

1. Выделение и очистка непептидного митогенного фактора тимуса, уточнение данных о его химической природе.

2. Изучение особенностей-кагаболизма адениловой кислоты в кор-тизонрезистентной популяции тимоцитов' по сравнению с суммарной популяцией.

3. "Сравнительное изучение катаболизма адениловой кислоты в тимоцитах при воздействии соматотропина и непептидного митогенного . фактора тимуса.

/¡зучение этих вопросов было необходимо для разработки оптималЬ' ных методов стимуляции пролиферативной активности Т-лимфоцитов при

- г -

Т-клеточных дефицитах различного происхождения.

Научная новизна исследований.

В работе впервые показано, что соматотропин и непептидный ми-тогенный фактор тимуса стимулируют пролиферацию разных популяций тимоцитов.

Вскрыт механизм митогенного-действия непептидного фактора тимуса на кортизонрезистентную популяцию тимоцитов. Он.связан с накоплением внутри- и внеклеточного гипоксантина, играющего определяющую "роль в пролиферации кортизонрезистентных клеток.

Соматотропин не изменяет пул гипоксантина ни в кортизончувст-вительной, ни в кортизонрезистентной популяциях тимоцитов.

Теоретическое и практическое значение полученных результатов ' заключается в установлении независимых- механизмов регуляции проли-феративной активности кортизонрезистентных и кортизончувствитель-ных тимоцитов при помощи гормональных( соматотропин) и негормональных (нзпептидный митогенный фактор тимуса) факторов.

Практическая ценность работы состоит в.установлении возможности избирательной стимуляции восстановления количества Т-лимфоцитов ■ в организме с помощью соматотропина и непептидного фактора, выделенного из вилочковой железы.

Представленная в работе информация о структуре непептидного митогенного фактора тимуса важна для определения формулы и последующей разработки метода его химического синтеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Непептидный митогенный фактор ускоряет пролиферацию кортизонрезистентной популяции тимоцитов.

2. Непептидный митогенный фактор тимуса усиливает продукцию антител в ответ на иммунизацию мышей эритроцитами барана.

3. СоматотропнЫЙ.гормон усиливает пролиферацию кортикальных

2-2^23 - 3 -

тимоцитов и не влияет на кортизонрезистентную медуллярную популяцию тимоцитов.

. 4. Действие непептидного митогенного фактора тимуса связано* с внутри- и внеклеточным накоплением гипоксантина кортизонрезис-тентными тимоцитами, который снимает ограничение пролиферации, зависящее от относительного дефицита активности пуриннуклеозидфосфо-рилазы.

Активация пролиферативной активности кортикальных кортизон-чувствительных тимоцитов соматотропином не связана с накоплением гипоксантина или других катаболитов ацениловоП кислоты.

Реализация результатов исследования.

Материалы диссертации отражены в 10 публикациях.

На основе диссертационной работы разработан метод определения активности Т-клеточных митогенов в том числе выпускаемых фар-макологичёской промышленностью, например, вилозена. .

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на III сьезде эндокринологов УССР / Киев, 19ь2 /, III всесоюзном симпозиуме, "Регуляция иммунного гомеостаза" / JI.,I9o2 /, конференции "Механизмы иммуностимуляции" / Киев, 19о5 /, У Украинском биохимическом сьезде / Ивано-Франковск, 19о7 /, 1У сьезде эндокринологов /Львов, I9b7 /, международном, симпозиуме ЮНЕСКО "Вирусология, иммунология и общество" / Киев, 1991 /.. диссертация апробирована на заседании профильных лабораторий по экспериментальной эндокринологии Киевского НИИ эндокринологии и обмена веществ.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, прак-- 4 -

тических рекомендаций и указателя литературы, содержащёго наименования 22-х источников отечественных и I29 зарубежных авторов. Рабата иллюстрирована 12-тью таблицами и ?-ью рисунками.

■латериацы и методы исследования. Основная часть опытов проведена на мышах линии СВА и крысах линии Вистар, выращенных в виварии Киевского. НИЛ эндокринологии и обмена веществ. Всего использовано около IÍÜU мышей, а также 170 крыс.

Непептидный митогенный фактор получали из вилозена как описано ранее / /i.A. Безвершенко', ul.Г. Бойко и соавт. 197ь,1979 /. Из раствора вилозена непептидный митогенный фактор выделяли последовательным осажцением баластных веществ (нуклеотидов) ионами ртути при pH 3 иосаждеиие активного препарата ионами ртути при pH 6. После удаления ртути препарат лиофилизировали. Лиофилизированную массу экстрагировали диметилсульфоксицом и осаждали этилацетатом.

Разделение компонентов вилозена и непептидного митогенного фактора проводили на жидкостном хроматографе фирмы " Beckman " системы " Gold ". Линейный градиент: раствор А - 25 мгЛ КН^РО^

pH 5,5; раствор ß - СНдОН; доля раствора В возрастала от 0 до 4U/o за мин. Скорость элюции - I мл/мин.

Инфракрасные спектры снимали на спектрофотометре Specord IR-75 ( Carl Zeis, lena) в интервалах 700-1ь00см~* и 1600-3000 см-1, для определения пептидных связей препараты дейтировали.

Определение включения' 2-^-тимидина в ДНК тимоцитов выполняли общепринятым методом. К суспензии клеток IUb добавляли 2-^-тимидин в количестве 0,5 мкКи и инкубировали при 37ÓC в течение 3 ч в иммунологических планшетах.' По окончании инкубации ти-моцигы осаждали на фильтрах, предварительно пропитанных 10% ГХУ, ■ промывали холодным раствором 1'ХУ, затем спиртом и высушивали, л'.-.-и,-тры переносили во ¿¡я£ионы, содержащие сцинтиляционную жидкость 2* - 5

ЖС-ti, и радиоактивность проб определяли при помощи бета-спектромет- . ра "Марк-3".

Изучение"влияния гипоксантина или соматотропина на включение й-^-тимидина в ДНК тимоцитов in vitro проводили в иммунологи-

с

ческих планшетах. 10 тимоцитов кортизонрезистентных или суммарных инкубировали с 0,5 мкКи 2- 14С -тимидина с различными■концентрациями гипоксантина ; (0,005-50 мкг/пробг)) или соматотропина( 10-60 мкг/про-ба). Остальные процедуры выполнялись так же, как описано выше.

Определение продукции антител, оцениваемой по гемолизу эритроцитов барана, проводили по Simpson et al.,( I97b).

Количество ig Е-антител в экстрактах органов определяли по дегрануляции мастоцитов в присутствии исследуемого экстракта и аллергена noovari в модификации Я.А. Дюговской / 1973 /.

При изучении превращения пуриновых метаболитов были использованы тимоциты мышей лиши СВА и крыс линии Вистар. Опыты выполнены на суммарных и кортизонрезистентных тимоцитах. Отмытые тимоциты-4 х 10^ инкубировали в 4 мл среды Хенкса, содержаний 0,175 мМ адениловой кислоты в течение 45 мин при 37°С в присутствии 50 мкг непептидного митогенного. фактора или 250 мкг соматотропина. Контрольные тимоциты не содержали этих препаратов. После этого клетки отмывали, добавляли новую порцию среды, содержащую ту же концентрацию непептидного митогенного фактора или CTF. Через' 20, 40 и 60 мин инкубации отбирали по I мл суспензии,' клетки отделяли центрифугированием. Надосацочную жидкость и осадок клеток обрабатывали раствором хлорной кислоты и нейтрализовали КОН. 50 мкл нейтрализованного экстракта клеток наносили на хроматографическую бумагу гн -2 и разделяли методом восходящей хроматографии в присутствии свидетелей: АГАР, аденозина, инозина, гипоксантина и гуанозина. Расположение свидетелей на хроматограмме определяли с помощью.ультрахемископа.

- 6 - " - " •

адиоактивность вырезанных "пятен" определяли в сцинтилляционной идкости ЖС-Ь при помощи бета-спектрометра "Марк-3".

Все цифровые данные обрабатывали статистически общепринятыми етодами.

Результаты и их обсуждение.

Сравнительное хроматографическое исследование исходного мате-иала ( вилозен) и очищенного непептидного митогенного фактора пока-ывает, что в составе этого.фактбра отсутствуют нуклеотиды, содер-атся нуклеозиды и мочевая кислота. Никаких новых .соединений, ко-орые могли бы появиться в результате обработки экстракта, не об-аружено. Исследование выполнено с помощью высокоразрешающей жид-остной хроматографии высокого давления в гидрофобной обратнофаз-ой хроматографической системе.

Биологические свойства непептидного фактора тимуса во многом ходны со свойствами вилозена, в частности, один из главных его ффектов - увеличение массы' тимуса при парантеральном введении пре-арата. Повторное введение непептидкого фактора приводит к увели-ению массы вилочковой железы (рис.1) . Установлено, что среднее оличество тимоцитов в вилочковой железе контрольной группы мышей а 12-й день, после 3-й инъекции физраствора составляло 2,24 + 0,15 а 10 . У животных, получавших внутрибрюшинно непептидный митоген-ый фактор, среднее количество тимоцитов в тимусе составляло- за .

п

тот же период наблюдения 3,56 + 0,13 на 10 . Среднее исходное ко-ичество тимоцитов на 2-е сутки после введения гидрокортизона сос-

п

авляло 1,35 на 10 .

Таким образом, а контрольной группе, мышей линии СБА количес-во тимоцитов через 12 дней после последнего введения физраствора величилось в 1,6 раза. В результате же введения митогенного фак-ора количество тимоцитов.за этот же период возрастало после пос-едней иньекции в 2,6 раза.

3-2-^723 ~ 7 -

а 20

а . т а> ч

<и «

а)

о Ю о)

ДГ-—'

и о

к о н ш

о т и а Ф

э1

к §

0

12 Дни

Рис.1. Влияние непептидного фактора на изменение массы

вилочковой железы ( 1,2 ) и количества тимоцитов' (А,В ) у мышей линии СБА после введения гидрокортизона.

Примечание. I;А - контрольные животные; 2;Б - животные стимулированные непёптидным фактором..

Масса вилочковой .железы-изменялась-паралельно увеличению количества тимоцитов ( рис. I) .

На основании данных этих опытов можно утверждать, что под влиянием непептидного фактора происходит или ускорение пролиферации одной из кортизонрезистентных популяций тимоцитов, или ускорение миграции в вилочковую железу костномозговых предшественников тимоцитов. При этом может происходить размножение как резидентных, устойчивых к гидрокортизону тимоцитов, так и мигрантов из костного мозга.

-Мы попытались выяснить, играет ли в этом восстановлении какую-либо роль пролиферация кортизонрезистентных клеток тимуса и ускоряется ли она под влиянием непептидного фактора. С этой целью изучена скорость включения 2-*4с~тимидина в ДНК тимоцитов мышей, стимулированных непептидным фактором, после предварительного введения гидрокортизона.

Отличие между уровнем включения 2- -тимидина в ДНК тимоцитов, выраженного в имп/мин на. 10^ клеток, у контрольных и подопытных мышей становится статистически существенным через 7 ( 2367 +260

- контроль, 4222 ± 440 - опыт ) и 12 сут.( 2251 ± 101 - контроль, 3933 £ 537 - опыт ) после введения непептидного митогенного фактора.

Поскольку воздействие фактора осуществлялось m vivo , можно предположить, что введение его мышам не оказывает непосредственного митогенного действия на кортизонрезистентные тимоциты и злужит лишь для подготовки этих клеток к последующему воздействию зоматотропного гормона гипофиза. В частности, в пользу такой воз-иожности говорит то обстоятельство, что включение 2-*4С-тимидина в ДНК тимоцитов под влиянием непептидного митогенного фактора наблюдается на 7 и 12-е сут. и не заметно непосредственно после введения препарата т.е. на 2-е сутки ( 20Ib ± 158 - контроль, 2154 + 124

- опыт ) после проведения последней инъекции фактора.

Как будет видно из последующего изложения, в действительности чепептидный фактор обладает прямым митогенным действием на корти-эонрезистентную популяцию тимоцитов. Мишенью соматотропного гормона являются кортизончувствительные популяции тимоцитов.

Под влиянием соматотропина in vitro . происходит ускорение включения 2-^^С-тимидина в суммарную популяцию тимоцитов (рис.2) . /скорение включения статистически существенно и мало отличается от данных, представленных1ранее в работе Talwar /1979/.

J* ' i - У -■

д ivl имп/мин 2200

1600 1400 1000

600 .

200

10 20 40 80 СТГ

Рис.2. Влияние СТГ мкг/Юйклеток на включение 2-*'*С-тимиди-на в ДНК суммарной (А) и кортизонрезистентной популя-ции( Б )гимоцитов крыс in vitro, д М - разница между уровнем включения метки в опыте и кон троле. it - р<:0,05; км р<0,01.

Аналогичный опыт, выполненный не на суммарной, а на кортизон-резистентной популяции тимоцитов, дает другой результат. В тех же условиях сколько-нибудь заметной активации включения 2-^^С-тимиди-на не наблюдается (рис.2):

На этом основании можно заключить, что объектом действия со-матотропина и непептидного фактора являются различные тимоциты. Этот результат согласуется с данными Talwar /1979/, который пока-

•' - 10 -

зал, что кортизонреэистентные тимоциты не имеют рецепторов для со- . матотропного гормона. В дальнейшем будет показано, что и механизм митогенного действия соматотропина на кортизончувствительные и кортизонреэистентные клетки отличается от действия непептидного фактора на- эти популяции Г-лимфоцитов.

Увеличение массы тимуса и количества тимоцитов в нем позволяют предполагать, что вилозен может регулировать силу иммунного ответа В-лимфоцитов на антиген, воздействуя на хелперную и супрессор-ную функцию Т-лимфоцитов. Действительно, предварительное (до иммунизации )введение вилозена усиливает ответ спленоцитов примирован-ных животных на 64й. Вилозен вводили по 100 мкг в течение 5 дней. Несколько меньшее усиление иммунного ответа (на 36%) наблюдается после трехкратного введения 3,3 мкг (т.е. в 50 раз меньшей дозы ) непептидного митогенного фактора.

Очищенный непептидный фактор сохраняет также очень важное свойство вилозена - способность подавлять продукцию 1вЕ-антител у крыс, сенсибилизированных экстрактом пыльцы амброзии. Перораль-ное введение непептидного митогенного фактора с концентрацией 100 мкг/мл приводит к статистически существенному снижению способности экстрактов слизистой носа, трахеи и бронхов этих животных дё-гранулировать тканевые базофилы. Для достижения такого же эффекта необходима в 10 раз большая доза вилозена. Введение очищенного непептидного фактора приводило к 5 кратному снижению процента дегра-нулированных тимоцитов.

Изучение действия соматотропина и непептидного фактора тимуса ■ на катаболизм адениловой кислоты и значение ее катаболитов для про- -лиферации тимоцитов необходимо в связи с ролью особенностей пури-нового и пиримидинового метаболизма в пролиферативной активности тимоцитов. В частности, отношение пуриннуклеозидфосфорилазы и аде- II -

нозинкиназы играет важную роль в ограничении пролиферативной активности, зависящем от накопления дезоксигуанозинтрифосфата и торможения нуклеозидцифосфатредуктазы. Преобладание киназной' реакции и относительный дефицит пуриннуклеозидфосфорилазы приводит к сдвигу метаболического потока в сторону фосфорилирования дезоксигуанозина, накопления дезоксигуанозинтрифосфата (ингибитор редуктазы нуклео-эидцифосфагов) и торможения образования дезоксицитидинтрифосфата и других нуклеотидов, что, в свою очередь, ведет к торможению клеточного цикла ( и^шап et а1/1979/, К^гак! е! а1./19оЗ/, ЗЬагет-Ьегк et аХ./19ЬЬ/.).

Кортизонрезистентные тимоциты включают метку преиму-

щественно в состав гипоксантина и в меньшей степени в состав инозина (табл.1,2). Преобладающая часть метки, включенной как в гипо-ксантин, так и в инозин,'обнаруживается во внеклеточной среде.

Тотальная популяция тимоцитов интактных ыьшей включает в 2-3 раза меньше метки в гипоксантин и в 2-3 раза меньше в инозин, чем чем кортизонрезистентная популяция.

Инкубация кортизонрезистентных тимоцитов в Присутствии непептидного митогенного фактора приводит-к увеличению включения метки !

как во внеклеточный, так и во внутриклеточный гипоксантин. Отличия во всех временных точкак' статистически существенны. Показано, что вклад метки гуанозина составляет менее 1<Ж от метки гипоксантина,

.т.е. пренебрежимо мал и существенно не влияет на величину накопле-

1

ния метки в гипоксантине. Уровень метки аденозина и инозина почти на порядок ниже чем гипоксантина. Под влиянием непелтидного фактора наблюдается небольшор накопление инозина (табл.1,2 ).

Таким образом, наиболее выраженным эффектом непептидного митогенного фактора является стимуляция накопления внутри- и внеклеточного гипоксантина кортизонрезистентньми тимоцитами.

' Таблица I

Включение е-^^С-АМР во внеклеточные нуклеозиды кортизонрезистентных тимоцитов мышей линии СБА, стимулированных и не стимулированных митогенным фактором m vitro (имп/мин,).

! Время'Стат. инку-5 пока- Гипоксантин Инозин Г I Аденозин ! ГУанозин

бации'зате-'ли • t х|0пыт роль"|^ПЫТ| Конт-j роль j Опыт

20 мин 2179 3927 ЬбЬ 1492 191 273 НО III

дМ+т 1740+549 624+20b о2+46

Р- <0,02 <0,05 >0,1

40 мин 3113 453Ь 724 1037 135 153 135 167,

дМ+т 1425+377 313+128 I&+20

Р <0,01 0,05 >0,5

60 мин 3220 4637 436- 659 о5 106 190 213

йМ+т 1416+Зо9 223+49 21+22

Р ' <0,02 <0,01 >0,5 -

Возникает естественный вопрос о том, каково значение этого эффекта? Каков биологический смысл накопления гипоксантина и к каким клеткам вилочковой железы это накопление имеет непосредственное отношение? Оказалось, что кортизонрезистентные тимоциты, инкубируемые с различными концентрациями гипоксантина, быстрее включают

-тимидин , чем контрольные тимоцитыС рис.3 ). Концентрация ги-

с

поксантина 5 мкг/10 тимоцитов оказалась оптимальной. Дальнейшее увеличение концентрации гипоксантина на порядок приводит к снижению

Таблица 2

Включение Ь-*"*С-АМР во внутриклеточные нуклеозиды кортизонрезистентных тимоцитов мышей линии СВА, стимулированных и ие.стимулированных митогенным фактором 1п у!1;го (имп/мин ).

" ! ...... ! Бремя! Стат.I инку-! пока-! Гипоксантин Инозин 1 ! |Аденозин | Гуанозин

бации! з&те-! ! "ли ! ! ! Конт-',Опыт роль |' Конт-|Опыт¡Конт-1Опыт [ роль | ¡роль | | Конт-{Опыт роль |

20 мин 71Ь 1167 199 370 76 125 57- ЬЗ

дМ+ш 449+46 170+95 49+36

Р ¿0,001' >0,25 >0,2

40 мин ¿15 1137 150 311 '5Ь 10Ь 66 92

дМ+т 322+125 ' 161+101 50+29

Р "С 0,05 >0,25 >0,1

60 мин 640 Ьб4 27о 400 Ы .96 75 125

дМ+я 224+50 123+43 15+16'

Р 40,01 <0,05 ' >0,1

включения й-'^-тимидина в ДНК кортизонрезистентных тимоцитов, однако разница по сравнению с контролем остается статистически существенной (рис.3 ). Причина снижения, включения 2-

14с

-тимидина в

■ДНК тимоцитов при увеличении концентрации гипоксантина остается неясной.

Рис.3. Влияние гипоксантина мкг/10® клеток на включение 2-*^С-тимидина в ДНК кортизонрезистентных тимоцитов мышей 1п vitгo. дМ - разница меаду.уровнем включения метки в опыте и . контроле.

к - р<0,01; хх - р<0,05; юо{-р<0,02.

Изучение распределения метки з-^^-МР среди ее катаболитов предпринято нами также и на тимоцитах крысы в связи с тем, что крыса является единственным видом-млекопитающих, который реагирует на ксеногенный соматотропин (например, быка ). Поэтому на тимоцитах крысы допустимо сопоставление'действия непептидного фактора и сома-тотропина на метаболизм пуринов и пролиферативную активность этих -клеток. Под влиянием непептцдного митогенного фактора хорошо воспроизводится статистически существенное накопление как внутрикле-

точного, так и внеклеточного гипоксантина в кортизонрезистентных тимоцитах крыс линии Вистар. Накопление внеклеточного инозина также статистически существенно отличается от контроля во всех временных точках.

Таким образом, под воздействием непептидного фактора происходит как ускорение включения 2-*^-тимидина в ДНК кортизонрезистентных тимоцитов, так и накопление' внутри- и внеклеточного гипоксантина. По-видимому, накопление гипоксантина является причиной ускорения включения 2-*^С-тимидина, как это и доказано экспериментально (рис.3). Является ли гипоксантин соединением, непосредственно ускоряющим включение 2-^^С-тимидина в' ДНК тимоцитов, или он превращается в другое биологически активное соединение, не ясно.

Катаболизм Ь-^^С-адениловой кислоты суммарной популяции тимоцитов, чувствительных к действию соматотропина, ускоряющего включение 2-^^С-тимидина в ДНК тимоцитов, был изучен в тех же условиях, что и действие митогенного непептидного фактора на кортизонрезис-тентные тимоциты крыс. Однако оказалось, что несмотря на совершенно очевидное ускорение включения 2-^^С-тимидина в ДНК тимоцитов под влиянием соматотропина, ни внеклеточного, ни внутриклеточного накопления метаболитов адениловой кислоты (Гипоксантина или инозина) не наблюдается. Становится очевидным, что соматотропин- и не-пептид'ный ыитогенный фактор не только имеют различные объекты воздействия, но и осуществляют свое митогенное действие посредством совершенно различных механизмов. 1

Как известно, гипоксантин отменяет тормозящее действие дезок-сигуанозина на активированные зрелые Т-лимфоциты фенотипа СВ4+,СШ" (1у-2~ьзт4+) или СИ4-IСБ8* (1у-2+ЬЗТ4"), но не на субкапсулярные бластные тимоциты фенотипа СП4 ,СБ8"",СБЗ" (1у-2~1,ЗТ4~)т.к. у этих клеток гипоксантин не отменяет токсическое действие дезоксигуано-

зина ( ЗоЬагвпЬвге et а1. ,1968). Действие митогенного непептидного фактора, тимуса по-видимому направлено на активацию медуллярных кортизонрезистентных тимоцитов зрелого фенотипа. Можно также утверждать, что медуллярные тимоциты зрелого фенотипа могут принимать участие в регенерации тимуса после воздействия гидрокортизона. Соматотропин действует на другие клетки тимуса с помощью другого механизма.

вывода

1. Непептидный митогенный фактор ускоряет восстановление массы и количества тимоцитов вилочковой железы, сниженных в результате введения гидрокортизона.

2. Непептидный фактор тимуса увеличивает накопление внутри-и внеклеточного гипоксантина в железе, что оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию кортизонрезистентных тимоцитов.

3. Соматотропный гормон не оказывает влияния на кортизонреэистентные тимоциты, чувствительные к непептидному фактору.

4. Вызванное соматотропином ускорение синтеза ДНК в кортикальных тимоцитах не связано с изменением концентрации внутри- и внеклеточного гипоксантина.

Ь. Активируемая непелтидным фактором популяция тимоцитов, чувствительных к гипоксантину, представлена кортиэонрезистентными медуллярными тимоцитами, но не субкапсулярными незрелыми клетками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Непептидный митогенный фактор и. соматотропин ускоряют восстановление массы и количества клеток тимуса после введения гидрокортизона, воздействуя на различные популяции Г-лимфоцитов. На основании данных диссертации для восстановления Т-клеточной системы - 17 -

иммунитета при гиперкортицизме можно рекомендовать сечетанное применение соматотропина и непептидного митогенного фактора в молодом возрасте,' а также гормонов тимуса, митогенного фактора и соматотропина в пожилом возрасте.

' 2. Учитывая, что накопление гипоксантина в кортизонрезистен-тных тимоцитах под влиянием Т-клеточного митогена происходит в течение очень короткого времени и не требует Специальных условий культивирования клеток рекомендуется по этой реакции осуществлять скрининг Т-клегочных митогенов.

С1МС0К РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ 110 *Ш2 ДИССЕРТАЦИИ

1. Химические свойства непептидного лимфоцитотропного фактора тимуса // Докл. на 3 съезде эндокринологов УССР.К.,19о2,-С.15-16 (соавт.И.А.Безвершенко) .

2. Некоторые свойства непептидного лимфоцитотропного фактора тимуса // I Всесоюзный симпозиум:"Молекулярные механизмы системно-антисистемной регуляции в норме и патологии" К.,-С.ьЗ-ь4 С соавт. Л.А.Дюговская, И.А.Безвершенко ) .

3. ¿Ьмуномодулируицее и гепатогропное действие небелковых факторов лимфоидной ткани // Тез.сообщ.конф."Механизмы иммуностимуляции", К, ,19ь5,-С. 176-17о ( соавт.Б.В.Олейник,И.А.Безвершенко ) . ,

4. Усиление антителопродукции у мышей СБА при воздействии' небелкового низкомолекулярного фактора, выделенного из вилочковой железы // В кн.Механизмы иммуностимуляции.-Тез.Респ.конф.,К.,19о5,-С. Ьб-Ьа С соавт.и.А.Безвершенко,|11.Г.Бойко ) .

5. Регуляция пролиферативной активности" тимоцитов. небелковыми факторами //Укр.биохим.сьезд г.Ивано-Франковск, 19Ь7,-С. 11-12 Г соавг. И.А.Безвершенко) . '

6. Роль непептидных факторов в регуляции пролиферативной активности тимоцитов // Современные проблемы экспериментальной и клинической

эндокринологии: Тез.докл. 1У съезда эндокринологов УССР. Львов, 19ь7. -Киев:Б. H.-I9ü7,-C.2ü-29 ( соавт.и.А.Безвершенко,В.Х.Премыслов, 1,1.Г.БоГ'ко ) . .

7. Вилозен и его иммунобиологическая активность // В кн.Иммунобиология гормонов тимуса.-Киев."Здоров'я",19о7.-С.97-103 ( соавт.Без-вершенко П.А. ,Ъийко М.Г.'.Премыслов В.Х. ) .

ü. Катаболизм ацениловой кислоты в тимоцитах регенерирующей вилочко-вой железы // Укр.биохим.журнал -19о9.-61,И.~С.Ь2-Ь7 Ссоавт.

' 1Ч.А.Безвершенко,В-Х.Премыслов ) .

9. Значения катабол{г:в аден1лово'1 кислоти для регенерацП тимусу миш! •// Укр.б{ох}м.журнал -1992.-64,№1. -С155-59 ( соавт.И.А.Без-вершенко.М.Г.Бойко ) .

10. Purine Detabolitm and T-oell immune system // Internat, sjap» "Virology, Immunology and Society". - Kiev, April 15-18, 1991.-P. 187-199. (соав'цИ.А.Безвершенко) .