Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Возрастные особенности взаимодействия стромальных и кроветворных клеток костного мозга мышей линии СВА

% **

1нститут геронтологи АМН Украши

На правах рукопису

Максюк Тегяна Володимир1вна

BIR0BI 0С0ЕЛИВ0СТ1 ВЗАСМОДП СТРОМАЛЬНИХ I КРОВОУГВОИЯОЧИХ КЛ1ГШ К1СТКОВОГО МОЗКУ

14.00.17 - Нормальна <Ji3icuioriH

Автореферат дисертацП на здобутгя наукового ступени кандидата 61олог1чних наук

Кшв - 1995

Дисертахцею е рукопис.

Робота виконана в ¡.нстигуп геронтологи АМН У крайни Науковий Kspiвник: академХк АМН Украйни, член-кореспондент

Офнцши опоненти: доктор б1алог1чних наук, професор

Провгдна орган!задin: Науковий центр рад1ац!йно1 медицини

АМН Укра!ни

на зас1данн1 слевда/пзовано! вчено'1 ради Д 001.28.01 при 1нститут1 геронтологи АМН Украши ( Ки1В-114, вул. Вишго-родська. 67).

3 дисертащею можна ознайомитися у б1бД1отец1 1нституту геронтологи АМН Укра1ни.

HAH Укра "i ни та АМН Pocii, доктор медичних наук, професор Г.М.Бутенко

I.M.Алексеева

доктор медичних наук З.Д. Савцова

Автореферат

Вчений секрегар спеадайзовано! вчено! ради

Р. I.Потапенко

Актуальмсть проблеми. Система кровоутворення i 1муноге-яезу е кжчовою в життезабезпеченн! i збереженн! цШсност! организму i виду. Диференщйован! ефекторн1 клхтини з р!зних кровоутворюючих ростков та молекули, як! вони виробляють, приймають участь в транспортi дихальних газ!в i тканинному га-sooöMiHi (еритроцити), зд1йсгаоють !мунний нагляд (клхтини л!м-фо!дного, макрофагалъного, гранулоцитарного ростк!в), беруть участь в репараци тканинних пошкоджень (макрофаги, тромбоцита).

Лорушення нормального функщювання euerem кровоутворення i !муногенезу вШграе важдиву роль у патогенез! ряду захворю-вань, як! розвиваються при стархнн! i е ведучими чинниками смерт! ( атеросклероз та його ускладнення, злояк!снз. пухлини, !нфекц!1, 1мунопатолог!я та irani) (Д.Ф.Чеботарьов, В.В. Фроль-Kic, та !н., 1990).

Псгогенез кровоутворюючох i !мунно! систем ссавщв - це е процес диференцшвання родових кровоутворюючих клхтин к!ст-кового мозку В1Д сгадП штпотентних попередникгв до стад!1 диференщйованих елемент!в кров! i системи !муттету.

В процес! розвитку орган!зму система !мун1тету зазнае дуже значних в!кових зм!н. як! приводить до зниження ефектив-HOCTi !мунних реакщй при CTapiHHi больше, hia на порядок (Г.М. Бутенко та iH., 1985, М.Е. Weksler, 1990).

Механ!зми таких зрушень залишаються нез'ясованими до ць-ого часу. Ч!тко продемонстрован! в!ков! зм!ни лише в одному первинному opraHi !мун1тету - тимусi. В!дносно в!кових зм!н у Kai тинах юстшвого мозку даних небагато i вони суперечлив!. Потребуе уточнения "локал!защя" дефекту в систем! гемо-, 1му-нопоезу: чи зм!ни виникають в уже диференц!йованих кл!ти-нах-ефекторах чи з'являються на бальш раннгх ступенях розвитку

цих кд1тин. Ще менш вивченим е питания про BiKOBi ам!ни стро-ыальних кл!тин к1сткового мозку, котр! е складовою частино» мшрооточення кровоутворюючо! тканини. Mi* тим Ыдомо, що фун-кщювання цих юйтин вшграе важливу роль в прсшферацп i диференцшваин1 гемолоетичних шйтин. I остание, потребуе детально! розробки питания про те, чи пов'язан1 зм1ни в системах кровоутворення i 1мун1тету з "ix генетично обуыовденою програ-мою стар!ння кохно! кл1тини, чи вони виникають як реакщя на зм1ни (старишя) иакро- i м1крооточення. б докази того, що is фактор1в макрооточення - нейроендокринна система як регулятор i координатор багатьох ф1з!олог1чних npoueciB гкхлдае цеит-рапьис Miotif- ог-рг-д в пли вiв. як! Бдасгмшйтъ Bir.OBi поручения функций систем гемо-» 1мунопоезу (L.Piantanelli et al., 1980). 3 друго боку, сгромальне макрооточення кровоутворюючих i л1м-фо!дних органiв створюе умови, до дозеоляють чи не дозволяюгь родовим гемопоетичним oi тинам реалiayкати певн1 можливост1, котр! закладено в 1хньоыу генетичному anapaTi (0.0. Лур1я, О.Я. Фргденштейн, 1981).

Мета та задач1 досапдлсення. Виходячи з вицезгаданого, основною метою робота було з'ясування BiKOBix особливостей про-л1ферацП, диференц!ювання 1 взаемод!i кровоутворюючия та стромаяьних kjuthh к1сткового мозку, а такаж ощнка внеску макрооточення в зм1ни цих npoueciB при CTapiHHi.

В1дпов1дно поставлена мет1 будо сформульовано так! зада-4i: 1) вивчити абссшотний i вхдносний вм1ст, а також лролафе-ративну активность родових кл!т1н, так званих колонleyтворюю-ч1х кл1тин селез1нки (КУК-С) та ком1тованих колон ley творшчих клгтин, гранулоцитарно-макрофагальних попереднишв (КУК-Ш), в к1стковому мозку мододих i старих тварин; 2) охарактеризува-ти у тварин рХзного BiKy bmIct i прод!феративну активнЛсть

стромальних юптин клсткозого мозку. як1 здатHi формувзги ко-лонП ф16робласт!в in vitro (КУК-Ф): 3) досл!дити BiKOBi особ-ливостч функщювання i взземодп кровоутворюючих i стромальних кл1тин в iнтактному гастковому мозку та в стат репарацП; 4) ощнити В1Дносний внесок внутршнього середовища цШсного ор-

ган13му i MiКрООТОЧеННЯ К1СТКОВОГО мозку В BiKOBi ОСОбЛИВОСГ!

функцшвання кровоутворюючих i стромальних клггин.

Наукова новизна. Отримаш hobi дан! про ргзну ступень в!~ кових зшн у К1лыюст1 та щюд!феративнШ активноеTi кровоут-вордачих i стромальних гсгйтин-пояередншав юсткового мозку.

Використання експериментальних моделей з гетерохровним вмлстом кл1тинних елемент!в дозволило виявити ряд нових BiKO-во-специфгчних рис в фунгацюванн! кровоутворюючо"! системи кхсткового мозку. Вперше показано пригноблшчу дш гемопоетич-них rairiH к1сткового мозку старого донора на стромальн! шй-тини-попередники ф1бробласт1в у молодого опроманеного peyini-ента; вперше показано, що стромальна тканина к1сткового мозку старо! тварини теля пошкодження не вдаовлювала сво! функцП Miкрооточення. Виявлено, що вплив внутр!шнього середовища старого орган1зму на кровбутворгочу систему опосередковуеться через Miкрооточення кровоутворюючих opraHiB.

Отриман! нов! дан1 про вплив на кровоутворюючу систему старих тварин з боку молодих партнер1в по параб1озу.

Теоретична та практична ц1ншсть. Отримаш результата важлив1 для пояснения механ1зм!в в1кових зм1н систем гемо- та хмунопоезу. Результата досл1Джень св!дчать про те, що джерелом сигнал1в, специфично модулюючих функцП систем кровоутворення i 1мунитету при CTapiHHi, е внутрХшне середовище щл!сного ор-ган!зму. Показано, що вплив таких сигналов опосередковуеться, зокрема, через стромальну тканину Miкрооточення кл сткового

мозку, де в1дбуваеться прод1ферацгя i ком1тування кровоутворю-ючих кгйтин, в тому числ1 май0утн1х ефекторхв 1иун1тету. Таким " чином, детерм1нац!я bíkobhx особливостей iMyHHol системи в!д-буваеться вже на ранн!х етапах гемо- i 1иунопоеза. Встановлен-ня цього факту мохе бути важливим в спрямованому пошуку шляхiв корекцп bíkobhx 3míh в систем! 1мун1тету, щр е необх1дним для успшного л1кування та профилактики деяких захворювань людей похилого BiKy.

Розроблен! експериментальш модели, hkí дозволяють ouiнити in vivo вплив внутршньго середовшца орган1зму на функцш-вання кровоутворюючих i стромальних клгтин (йсткового мозку. Дат модел1 мохуть бути використаш як в експериментальних досл!дженнях в галуз! юптшшо) бюлогП, так i в клШчн1й гематологií i 1мунологп, а також в практивд лаборатор1й, hkí досл1джують вплив пшдливих фактор!в довк!лля, зокрема, гемо-i iMyHOTOKcmiHHX.

Основа! положения, що виносяться на захист, базуються на результатах, одерканих особисто пошукувачем.

1. Зм1ни BMicry кровоутворюючих кл1тин-попередник!в к!сткового мозку при стар1нн1 в1др!зняються в окремих субпопуля1иях (ИУК-С i КУК-ГМ). Ствыдношення mía гемопоетичними пролхферу-ючями клiтинами i клiтинами в стан! спокою, з bíkom майже не зм!нюеться.

2. Bmíct стромальних юптин-попередник1в (КУК-Ф) KiCTKOBoro мозку вб1дьшуеться з bíkom тварин. Прсипферативний потенщал цих кд!тин при цьому не зм1нювться.

3. Bíkobí smíhh у функц1ювашй i взаемодП стромальних i кровоутворюючих шйгин, ч!тко проявляються лише при регенерацП кро-воутворення в к!стковому мозку п1сля жорстких повкодхуючих д!й.

4. Smíhh окремих характеристик кровоутворюючо! 1 стромадьно!

~ г -

тканши кюгкового мозку в систем! гетерохромного парабиозу спостертгаються у обок партнеров. Вплив старого i молодого орган! smv на партнер!в протилежного Biicv мае рхзноспрямований характер.

Апробад1я роботи. Результата досл!дження буди пов1домлен1 та обговорен! на Всесоюзен шк£ш-сем!нар! молодих вчених i cneuianiCTiB " CTapiння i патолог1я" (Тернотль, 1989), на заседали! лаборатор!! хмунологи 1нстнтуту геронтолог!I при ме~ дицинському Ушверситет! !м. Земмельвейса (Будапешт, 1990), на заседаниях Украшсько- 1зра1льського симпозиуму "Мехазпзми ста-р1ння" (Ки1в, 1993), на конференni'i в Марбургському университет! (Марбург, 1993), на II конгресс геронтологов та repia'rpiB Укра1ни (Кшв, 1995), на наукових конференщях !нституту геронтологи АМН Укра!ни.

Дубл!кацП. По материалам дисертац! i опубл!ковано 8 роб1т.

Обсяг та структура дисергацП. Робота викладена на 166 сторонках (враховуючи 13 машонк1в та 22 таблиц!). Дисертац!я складаеться !з введения, огляду Л1тератури, розд!лу "Матер1ал та методи", 4-х глав власних доооджень, заключения, висновгав та перел!ку цитовано! л!тератури.

МАГЕР1АЛ ТА МЕТОДИ ДОСШДЖЕНЬ

Робота виконана на 306-ти мшах-самках л1нН CBA/Ca,Sto дbox BiKOBHX труп: молодих (3-4 Mic) га старих (23-25 м!с).

Мехашчне пошкодження к1сткового мозку стегново! гастки in situ (кюретаж) проводили за 3 Mic до доопдження. Тваринам двох в!кових труп щпзь кол!нний суглоб з подальшм проникнен-ням в кютково-мозковий канал стегново! ¡пстки вводили зубол!-кувальний буравчик. HoTiM 1нтенсивно вшивали к1стковий мозок ф!з10Л0г1чним розчином. В друПй постанови! досл!ду, молодих

мишей nie ля кзоретаку одте! стегново! кастки в цей же день оп-ромхнювали апаратом РУМ-17 в доз! 8,5 Гр та вводили внутршнь-овенно клггини кхсткового мозку В1Д молодих чи в1д старих син-генних тварин.

Гегеротопну трансплантащю стегнових к1сток в1д молодих i старих донор!в зд1йснювали п1д ¡¡тару боково! поверхн! т1ла з кожного боку молодим мишам-реципиентам. В друг!й rpyni тварин перед хмплантавдею стегново! к1стки було проведено Г! кюретаж. 1мплантаги виймали i досл1дасували через 2,5 Mic п1сля onepauil.

ОперацП по утворенню параб1отичних пар проводились за 2,5 Mic до досладкення за методикою E.Bunster, R.Meyer (1933).

Bei xipypri4Hi ман1пуляцП проводились тд загальною анестез1ею (1-1.5 мг кетатну на 10 г маси т1ла).

Для оц1нки KiJibKocTi кл!тин в KiCTKOBOMy мозку використо-вували гакий показник, як "гаптинн1сть" С абсолютна к1льк1сть ядровмхщуючих кл1тин в однМ стегнов!й Kicryi).

Для характеристики початкових eTaniB г1стогенезу кровоут-ворюючих кл!тин KicTKOBoro мозку був застосований метод peric-трац!] родових кровоутворюючих (КУК-С) i ком1тованих (КУК-ГМ) кдхтин-попередншав. Для визначення КУК-С рецшпентам, onpoui-неним у доз! 8,5 Гр, через 2 години внутршньовенно вводили 0,75 хЮ5 шйтин KicTKOBoro мозку в1д молодих або старих доно-piB. На 8-й день селезхнки вилучали з подальшим п!драхунком в них числа макроскоп1чних кровотворних колон!й (J. Till, Е. Мс-Culloch, 1961). ¡Штини-попередники для гранулоцитарно-макро-фагальних колонiü (КУК-ГМ) визначали в агарових культурах, для чого експлантували гаитини к1сткового мозку (1х105) у пластма-сов1 чашки в 1 мл живлячого середовища McCoy 5А з добавкою 15 X колон!естимулшчого фактору i 0,3 Z розплавленого агару. Культури !нкубували 10 дн1в при 37°С в волоПй газов1й cyMimi,

яка складалась з 10 % СО2 i 90 Z повхтря. Кожнш експеримент складався не менше, н!ж з 3-4 культур. В Kimji строку хнкуба-цП лад iнвертованим м1кроскопом шдраховували число кровоут-ворюючих колон1й, як! вмщуваяи не менш 50 teilтин ( J.K. Bradley, D. Metealf, 1966., J.У. Parker, D. Metealf, 1974).

3 компонент!в стромального мгкрооточення к1сткового мозку були дослужен! шитини, здатн! утворювати колони (КУК-Ф) та кластери ( КлУК-Ф) ф1бробласт2в in vitro, ix визначали методом культивування юсткового мозку в моношарових культурах. 3 метою CTiHKoro колонleyтворения в культури додавали опромгнен! в доз! 45 Гр клхтини к!сткового мозку морсько! свинки, як! слу-гували в HKocTi ксеногенного ф!дера. Через 12 д!б культури були заф!ксован! 96 Z. етанолом i пофарбоваш азур-еозином. Результата оц!нювались по двом категориям: 1) колон!!, в яких було б1льше 50 клятин (КУК-Ф), 2) кластери, як! вм!шували менше 50 юптин (КлУК-Ф). В колон!ях i кластерах тдраховувалась KiJibKicTb клгтин ( A.J. Friedenstein , et al., 1974).

Одлнку прол!ферагивно1" здатноста КУК-С ! КУК-Ф гасткового мозку мишей проводили через 18 годин теля внутр!шньочеревного введения оксисечовини.(ОС) в доз1 1 мг на 1 г маси т!ла дв!ч1 з !нтервалом 7 годин.

Статистичну обробку результапв га побудування графШв проводили на персональному компьютер! IBM PC/XT, за допомогою програм "Statgraphics" та "Storyboard Plus". Дан! були проана-льзован! за допомогою метод!в параметрично! статистики.

РЕЗУЛЬТАТ» ДОСЛ1ДЖЕННЯ ТА ÏX ОБГОВОРИЛИ

Завданням першого етапу роботи було: пор1вняння в KicTKo-вому мозку у молодих та старих мишей числа ядровм!шуючих кл!-тин i кровоутворкяочих кл1тин-попередник1в, к!лькост! стромаль-

них шйтин-попередниив, та отримання ix л рол !фе ратив них характеристик. Було всгавовлено, що у старих мишей в пор1внянн! з молодими в KicTKOBOMy мозку стегново! к1стки суттево збхль-шуеться к1льглсгь ядровм!щуючих гаiтин ( Р< 0,05). Цей факт шдтвердасуеться роботами хнших досл1дник!в (D.Popp, R.Popp, 1979; O.B. Сидоренко, 1983; Г.М. Бутенко, Л.Ф. Андр1анова, 1986).

За рахунок зб1льшення кл1тинност1 к!сткового мозку зрос-тае з BiKOM i абсолютна к1льк!сть родових кровоутворюючих кл1-тин-попередник1в (КУК-С). Однак дан! про зростання абсолютного BMicry КУК-С не мозша однозначно пояснити т!льки за рахунок збальшення пулу родових кровоутворюючих кл1тин (РКК), тому щр цей в1дд1л гетерогенний i представлений каскадом попередник1в, HKi мають р!зний потенщал самооновлення, прсшферативн1 i ди-ференцировочн! характеристики ( R. Schofield, 1978; L. Botnik et al., 1979; M. Rosendaal et al., 1979). Припущенню про 1н-такттсть чи збзлыпення з в1ком пула РКК суперечить також зни-ження у старих тварин концентрацП КУК-С в загальн1й кхлькост1 кл!тин. В процес1 !ндив1дуального розвитку, можливо, в!дбува-ються зм!ни популяцП в б1к зб1льшення числа кл!тин, що знахо-■дяться в стан1 спокою С L. Botnick et al., 1982), KOTpi при стандартному метод! тестування КУК-С не вдаеться виявиги. Однак при введеню п1ддосл1дним тваринам ОС, яка селективно ел1-MiHye кл!гини в S-фазх кл1тинного циклу ( G. Hodson et al., 1975), виявилась в^дсутнхсть змхни концентрацП КУК-С i у мо-лодих, i у старих мишей при бхльш, н!х вдвгч! знижетй кл!тин-HocTi KicTKOBoro мозку.

In vitro були досл!джен! б1льш просунув, ком1тован! кро-воутворюкт кл!гини-попередники, у вигляд1 гранулоцитарно-мак-рофагальних кшон1й. Було встановлено, що концентрация грану-

лоцитарно-макрофаг адьних кл!тин-попоредников к1сткового мозку старих тварин суттево не в!др1зняеться в1д в1дповхдного показ-ника молодих. Не сутгевим був також npnpicx абсолютного вм!сту попередншйв uieï категорП у старих тварин. Ц1 дан! погоджу-ються з результатами нечисленних пов1домлень шших автор1в (М. Туап, 1982; L. Williams et al., 1983; R. Schofield, 1986) i св1дчать, щр ця популяцхя шитин в ходх 1ндив1дуального роз-витку, включаючи стар1ння, в ai лому зканюеться мало. Висказане припущення п1дтверджувться результатами дослШв на гетерох-ронних рад1охимерах крово^ творюючох i л!мфо!джЯ тканини (D. Harrison et al., 1975, 198Ы).

В1домо, щр BiKi зм!ни гемо- та 1мунопоезу модут бути обу-мовлеш г1стогенетично незалелсними кл1тинами строми гасткового мозку, серед яких ф^бробласти е одним 1з головних структур-но-функдiональних компонентов.(A. Piersma et al., 1985; 6. Gu-lati et al., 1988). Зпдно з нашими даними, при CTapiHHi суттево зб1льшуеться як кониецтрФцдя, так i абсолютний BMiCT КУК-Ф в KicTKOBOMy мозку CT-e'f'OBoI к1стки милей. Не можна вик-лючити можливост1 того, цо ipvîpicT числа колонin ф1бробласт1в, отриманих i3 KicTKOBoro мозку старих мишей, 1де не лише за ра~ хунок зм1ни BMicry сгромальных родових кл1тин, а й за рахунок зм1ни npoueciB прол1ферацп. Гаке припущення було перев1рене при пор1внянн1 середньо! кл1тинностх колон1й ф1бробласт!в в культурах кхсткового мозку вхд мишей рхзного BiKy. Було вста-новлено, що за показником середньо! кл!тинност1 колонil в1д молодих i старих донорiв м!ж собою суттево не в1др1зняються. Зроблен1 на п1дстав! цих даних розрахунки св1дчать, що б1хь-и1сть колон1й утворюеться в результат! 8-10 подШв КУК-Ф < 65 % вс!х колон1й в культурах к!сткового мозку в1д молодих мишей i 70 Z в культурах в1д старих тварин). Однак, КУК-Ф мо-

лодих i старик мишей в!др1знялись по чутливостх до введенно! in vivo оксисечовини. тобго знаходились в píshhx стадгях mii-тинного циклу. В результат! fli'i ОС зб1лышлась концентрац1я kíстковомозгових КУК-Ф i у молодих (в 1,7 рази) i у старих (в 1,2), в nopíBHHHHi з контрольном культурами того ж в!ку. Така р1знидя в реакцп на введения циклоспециф!чно1 речовини у молодих i у старих тварин може свхдчити про те, що у старих KiJibKicTb КУК-Ф, як! знаходяться в S-фаза клiтинного циклу бШша, Hi* у молодих. Таким чином, з отриманих даних вишш-вае, що КУК-Ф В1Д старих донор1в бгльш активт в пролиферацП in vitro , а така* б!льша "ix к!льк1сть знаходиться в синтетична фаз! м!тотичного циклу in situ.

Щкаво вхдзначити р1знихдо в повед^щ КУК-Ф i КУК-С теля введения ОС. Ця р1знидя була обумовлена тим, що концентрация kíстковомозкових КУК-Ф зростала, а КУК-С - не змшювалась при одночасному зниженн! загально! юйтинност! KicTKosoro мозку (таблиця).

Таблица.

Вплив оксисечовини (ОС), введено! in vivo, на к1лък:1сть ядро-вм!щуючих кл i тин, КУК-С та КУК-Ф в KicTKOBOMy мозку стегна мишей pisHoro в1ку

В!к мишей, Mic Введ ОС Юпткн- HÍCTb 1 стес-на,10й Концен-трац1я КУК-С к /1~105 Загадьна К1ЛЬК1СТЬ КУК-С в 1 стегн! Концентра-щя КУК-Ф /110б Загальна к1льк1сть КУК-Ф в 1 CTerHi

3-4 3-4 + 119+ 13 47+ 9 17+ 1,4 16+ 1,6 1615 + 356 735 + 128 2,3+ 0,2 ~~ л 3,9+ 0,4 309 + 29 * 152 +13

24-25 24-25 + 205+ б * 94+ б 13+ 1,0 13+ 4,7 2564 + 167 1146 + 429 3,9+ 0,2 4,7+ 0,2 775 + 25 * 389+ 24

Пояснения. Pi3HMixñ mííc в1длов1дними показниками контрольних та досл!дних тварин (введения оксисечовини) одного BiKy: Р<0,01(*).

Це може означати, що зниження кл1тинност! кхсткового мозку в1дбуваеться биьше за рахунок пошкодждення пулу прол1феру-ючих гемопоетичних ¡ел 1 тин.

Отриманх результата св1дчать про змйш регуляторних пронес! в в систем! гемопоезу при стар1кн1 орган!зму. Можна припустите, що Ц1 процеси включають або м1жкл1тинн1 взаемодп, або змпш фунюцоняльних властивостей стромальних клхтин, або регуляторний вплив шл!сного орган!зму.

Для перев!рки даних припущень другий етап наших досл!д-жень передбачав використання експериментальних моделей з пош-кодженням системи, або з конструюванням х1мер, як! складалися з елементхв р!зного гтоходження.

При механичному пошкодженн! одн1е! стегново! тетки ос-новним джерелом для в!дновлення цитоарх1тектон1ки юсткового мозку е м1сцев!, родов! елементи строми а паренх!ми, як! збе-реглися пхеля операцП, а також т! кровоутворююч! кл!тини, якх прибули з хнших джерел. Через 3-4 м!сяц! п1сля такого пот-кодхення вхдбуваеться повне вхдновлення функщй м1крооточення стромажьно'1 тканини к!сткового мозку, що проявляегься в в1д-новленн! кл!тинност! к!сгкового мозку ! к!лькост1 родових кровоутворюючих кл!тин-попередник1в. Не було виявлено розниц! в регенераторних зд!бностях стромальних попередник!в кхсткового мозку старих мишей в пор!внянн! з молодими. В той же час в контрлатеральному стегн1 молодих мишей було виявлено зб!лыпе-ний вмхет КУК-Ф, зб!льшений вм!ст родових кровоутворюючих та кхялтованих кл!тин-попередник!в в порхвняшп з контрольною групою тварин- У старих мишей под!бний ефект спостер!гався т!льки в вхддШ кровоутворюючих клхтин-попередикхв. Тобто, вилучення к1стковомозгових кл!тин з одного стегна привело до посилено! пролхферацП !х в другому, що може бути пов'язано з

пад1нням концентращ! 1нг1битор1в пролгферащ1 ( кейлотв).

3 метою пор1вняння функщонально! спроможност1 молодого та старого гасткового мозку, було використовано модель рад!а-щйних xiMep з застосуванням кюретажу стегново! к!стки у молодих тварин. В так1й моделх опромхнена строма належить молодому "рецишенту, а гемопоегичн! кл1тини - молодим або старим донорам. У радхащйних xiMep Bcix експериментальних груп повне вхдновлення шйтинностх к1сткового мозку в!дбувалося через 3-4 Mic, щр св1дчить про задов1льну регенеращю к1сткового мозку незалелшо в1д в1ку введения гемопоетичних клхтин ( мал. 1, А). Але спостер1галось значне зменшення як концентрацп, гак i загадь но! к1лькост1 КУК-Ф: i в иоретованому i в контрлатеральному crerHi, в nopiBHHHHi з анадог1чними трупами 1нгактних мишей. Неспод1вано у радюххмер, котрим було введено старий кхстковий мозок, кондентрац1я га загальний BMiCT КУК-Ф були ще нижчими н!ж у тих кому вводили молодий KicTKOBHH кззок (мал. 1, Б). Цей факт може означати, щр гемопоетичнх кл!гиы: старо! тварини мають пригн1чуючу дш на строму молодого о.:ротненого реципиента. В лхтератур! шуЦбний феномен ще не буз описаний.

3 метою вивчення стромально! тканини к1сткового мозку, яка е складовою частиною м!крооточення для м1ело1дних кл!тин, нами був використаний мегод комб1нацп кюретагку з наступнсмо гетеротопною трансплаятащею стегновох метки Шд EiKipy. В та-к1й модел1 стромальна тканина мае донорське гоходження, а власне кровоутворшча - рецшйенське (Т. Hotta et al., 1983, Н. Patt et al., 1982). Через 2,5 Mic п1сля onepaui'i 1мплантаги в1д молодих та старик донорiв вилучували та досийджували. Було виявлено, щр iHTaKTHi ¿.мплантати в!д молодих га старих донорхв м1ж собою суттево не в!дразнились Hi за числом ядровм1щуючих кл1тин, Hi за кхльк1стю кровоутворшчих кл1тин-попередник1в

KiSbKiCTb

ядровм!щуючих

юптин

25 г х10-6 20

15 18

X

Мо

1

i'

I

1

Л

Щ

й

м

ьнтаиш

1

й Щ

й -ш

М

KijIbKiCTb

КУК-Ф

x

-J-г-

¡Д

,1 й

'ii

У,/Л

f ''.'

щ

it

т

ш.

Мал. 1

Mo М Мм

МИШ ш КЮРЕТОВАНЕ СТЕГНО SS КОНТРЛАТЕРАЛЬНЕ СТЕГНО

К1дьк1сть ядровм!щуючих кл1тин (А) та число КУК-Ф (Б) в к1стковому мозку радюхамер з гаореталсем стегна in situ: Mo - 1нтактн1 миш; M - мит з кюретажем одного стегна; »to - рад1ох1мери, п1сля введения к1сткового мозку молодих донор1в; Мс - рад1ох1мери, п1сля введения Лоткового мозку старих донор1в. •* Рмс- м<0,05.

Ж ж

л

я

т

н

Мс

(КУК-ГМ). Числове сп1вв1дношення КУК-Ф к!сткового мозку моло-дих та старих 1мплангат1в зберггалось приблизно на тому ж piB-н1, щр i в вих!дному матер1ал1, а саме: спостерхгали зб1льшен-ня к!лькост1 КУК-Ф та КлУК-Ф без зм!ни прол!феративного потен-вдалу при cTapiHHi.

Кюретаж порожнини стегново! Kicrrai перед II пересадкою драматично знижував поновлення кровоутворенння в 1мплантатах в1д старих донор!в як в пор1внянн! з штактними 1мплантатами В1Д тварин того ж в!ку (Р < 0,001), так 1 з 1шлантатами в1д молодих донор1в (1нтактними та кюретованими, Р < 0,001). При цьому у молодих донор!в в1дбувалася суттева прол1ферац!я стро-мальних елементгв, про яку д1знавалися по зб!льшенню як выносного, так i загального числа КУК-Ф та КлУК-Ф. BiAMi чаюсь також збхльшення кл!тинностх кластеров. В "старих" кюретованих 1мплантатах Bei перелеченi показники були зниженими.

Таким чином, використання експериментальних систем з ге-терохронним сполученням элемент!в дозволило виявити особливос-Ti функщювання i взаемодП юптин к!сткового мозку. В першу чергу втрата фунгац! мз.крооточення, зниження регенераторного потенц1алу та прол1феративних мсшшвостей стромальних клхтин KicTKOBoro мозку. Bei щ особливост! були виявлен! лише nie ля використання додаткових, екстраординарних навантажень на систему. з хншого боку, був також показаний супресорний вплив кровоугворюючих клхтин KicTKOBoro мозку в!д старих доноров на юатини стромально! тканини касткового мозку молодих опром!не-них рецшпент1в.

Для досл1даення рол! "макрооточення" стар!ючого оргатзму використовувалась модель гетерохроннного napa6io3y. PaHime у досупдах на гегерохронних napaöiOHTax було показано, що трива-licrb життя старого партнера неможливо зб!льшити з допомогою

1пдтивання до нього молодого ( Ф. Лудург, Р. Елатофф, 1972; С. Astle, D. Harrison, 1984 ). В1лыие того, в opraHiSMi молодого парабшнта, з'еднаного 3i старим, спостер1гали ознаки прискореного стар1ння системи 1муйтету (Г.М.Бутенко, ЬВ.Губ-piit, 1980), печ1нки (Н. Tauchi et al., 1980), колагену (Z. De-yl, Q.M. Butenko et al., 1990). В наши робот1 вивчався вплив довгогривалого перебування в став! гетерохронного парабиозу на функщональний стан кровоутворюючо! тканини у молодих та ста-рих мишей.

Результата показали, що у молодо! гварини, що прожила 2,5 Mic в napa61o3i 3i старою, число тстковомозкових ядровм1щую-чих кл1тин значно знижувалось в nopiBHAHHi з тваринами того ж BiKy, як1 перебували в стан1 гомохронного парабгозу, або з 1н-тактними мишами ( р < 0,05).

При визначенн1 КУК-С в к!стковому мозку молодих мишей, з'еднаних 3i старими, cnocrepirara виразне зниження i вгднос-ного i абсолютного 1х числа як в порхвнянн! з 1нтактними тваринами, так i зштими в гомохронну пару. У старих napTHepiB по параб!озу з молодими в!дносна кíлькicть КУК-С значно зростала i могла пор1внюватись.з показниками молодих контрольних тва-рин, або з'еднаних в гомохронну параб!отичну пару. Зростав та-кож i абсолютний BMicT КУК-С (мал. 2).

При визначент числа ком!тованих кровоутворюючих поперед-ник1в були отриман! noflifiHi результата: р1зке зниження кон-центрацп й абсолютного вм!сту КУК-ГМ у молодих napTHepiB та наростання (хоча i менше, Н1Ж КУК-С) к!лькосп цих попередни-к!в у старих партнер1в в nopiBHHHi з контрольними тваринами того ж BiKy.

Перебування мишей в гетерохронному парабиоз! впливало такса на в1дносний га абсолютний BMicT КУК-Ф в гастковому мозку.

В1ДН0СНА К1ЛЬК1СТЬ КУК-с

АБСОЛЮТНА К1ЛЬК1СТЬ КУК-С

20Р

40000

- 30000

- 20000

10000

• * * *

* *

**

М С МмМс См

М С Мм Мс См

1

со

Мал. 2. В1дносна (в роврахунку на 105 юцтин) та абсолютна к!льк1сть КУК-С в к1с.тковому мозку стегна параб!онт1в. М - 1нтакткий молодий контроль; С - 1нтактний старий контроль; Мм - молодий партнер по гомохронному парабиозу; Мс- молодий партнер, См -старий партнер по гетерохронному параб1озу. * Рм-с<0,05; **Рм-мс<0,01; ***Рмм-мс<0,01; **** Рмс-см<0,01, ! Р<0,01 у пор!внянн1 з ус!ма 1ншими трупами.

Спостер1галось р1зке зменшення к1лькост! ц1е! категорП кл!тин У молодих лартнер!в, зшитих з1 старики. У старих партнер1в вм1ст КУК-Ф суттево не зм1нювався.

Таким чином, э'еднання молодих та старих тварин в гете-рохронн1 пари, що супроводжувалось взаемообм1ном кл1тинами та гуморальними факторами, привело до суттевого пригн1чення кро-воутворюючого ростка у молодих партнеров. В той же час необ-х1дно зазначити, що у старого партнера по параб!озу спостер!-галось падвищеньл вм1сту кровоутворюючих кл1тин-попередник1в истцового мозку.

Таким чином, на п!дстав! отриманих в наш!й робот! фактов сл1д вважати, що В1К0В1 зм1ни системи 1мун1тету охоплюють вс! р1вн1 гистогенезу ще! системи, починаючи з ранн1х еташв ге-мога ¿мунопоезу. При цьому власне кровоутворююча тканина к1ст-кового мозку (в усякому раз1 та види попередник1в, що вивчали-ся нами) зм1нюеться не так як стромальна. Схоже що, зм1ни ге-мопоетичних попередншив при стар1шй обумовлеш, Головины чином, змхнаш регуляторних сигнал1в, а валив макрооточення опо-середковуеться також через стромальну тканину м1крооточення к!сткового мозку.

Разом з тим, юйтини кгсткового мозку функщонують в ста-р1ючому орг£ийзм1 досить стабыьно. Недостатшсть стромально! регуляцП та/або зм1ни чутливост1 гемопоетичних клхтин до ре-гулюючих сигнал1 в ч1тко проявляются лише в умовах коротких вплив!в, що пошкоджують к1стковий мозок.

ВИСНОВКИ

1. При стархшп у мишей л!н13 СВА зб1льшуеться к1льк!сть ядровм1щуючих кл1тин в к1стковому мозку стегна.

2. В1ков1 змхни кровоутворюючих кл!тин к1сткового мозку

залежать в1д стадП !х диференщювання.- концентравдя родовпх кровоугворюючих шптин-попердтшв (КУК-С) знижуеться, а абсолютна ЮЛЬКХСТЬ ЦИХ КЛХГИН Зб1Л£ШуеГЬСЯ 3 В2КОМ; В1Дносне 1 абсолютна число комхтованих попередктив (КУК-ГМ) при цьому не зм1нюеться.

3. Вшст ( в1дноснт та абсашгний) стромальних кл1-тин-попередник!в (КУК-Ф) в к1стковому мозку старих мишей зб1льшуеться.

4. Влдносна к1лыасть рашпх кровоутворшчих попередни-к1в, як1 знаходяться в хнтактному кхстковому мозку в 5-фаз1 кл1тинного циклу, з в1ком практично не змпюеться; концентра-ц1я стромальних попередник1в - зростае.

5. Вперие виявлена можливасть "зворотн!х" регуляторних взаемод1й пареюами 1 строми к1сткового мозку : гемопоетичн1 кл1тини старого донора пригтчували стромальн! клхтини-попе-редники ф!бробласт1в молодого опром!некого рещпхенга.

6. Регенераторна 1 регуляторна активност! стромально! тканини сткового мозку досить стаб!льн1; 1х зниження з в!ком проявляеться лише в умовах жорстких шшкоджуючих вплив1в.

7. В систем! гетерохронного параб1озу виявлено пригнхчен-ня кровоугворюючих (КУК-С та КУК-ГМ) 1 стромальних юптин-по-передншйв ( КУК-Ф) у молодого партнера 1 зб!льшення вм1сту обох тшив гемопоетичних попередник1в у старого параб!онта.

8. В ц!лому кровоутворююча система старих мишей характеризуемся високим р!внем ст!Йкост1, 1 тхльки додагков! жорстк! дИ виявляюгь залежну в1д ваку неспроможшсть и кл1тин в!д-новлювати сво! функцП т.сля пошкодження.

ПЕРЕД IК РОБIТ,ОПУВЛIКОВАНИХ ЗА МАТЕР1АЛАШ ДИСЕРТАД1I:

1. Sidorenko A.V., Gubril I.В., Andrianova L.F., Macsijuk Г.V, Butenko G.M. Functional rearrangement of lymphohemopoietic system in heterochronically parabiosed mice J/ Mech. Ageing Dev. - 1986. - Vol.36 , N 1. - P.41-56.

2. Сидоренко А.В., Максюк Т.В. Особенности восстановления кроветворения в подкожных имплантатах кости у мышей при старении // Бюлл. экспер. биол. мед.,1987,- Т.103 N 4,-С.468-470.

3. Андрианова Л.Ф.,Сидоренко А.В..Максюк Т.В. Содержание кроветворных и стромальпых ::лстсгс- предшественников в ¡состном мозге молодых и старых мышей линии СВА // Тез.докладов 1 Всесоюзн. съезда имиvкол., Сочи-Дагомыс, 1989.- С.385.

4. Sidorenko А. V., Andrianova L.F., Macsyuk T.V., Butenko G.M. Stromal hemopoietic microenvironment in aging // Mech. Ageing Dev.- 1990.- V.54, N 2.- P.131-142.

5. Максюк Т.В., Драгунова В.А. Влияние гаоретажа бедренной кости на содержание кроветворных клеток-предшественников у молодых и старых животных // В кн.: Механизмы старения и долголетия. Материалы конференции. Сухуми, 19-21 июня 1991 г., с.231.

6. Бутенко Г.М., Максюк Т.В., Сидоренко А. В. Пролиферативная и поддерживающая гемопоэз несостоятельность стромальных элементов костного мозга старых мышей, выявляемая при повреждающем воздействии // Проблемы старения и долголетия. -1991. - T.l, N.1. - с.18-22.

7. Butenko G.M., Andrianova L.F., Kharazi A.1., Pishel I.N., Maksyuk T.V., Kudinov Yu. G. Interrelations between central and peripheral lymphoid organs in aging // The 4th

Asia/Oceania Regional Congress of Gerontology. Yokohama, Oct.31-Nov.3, 1991» Abstracts. - P.385. 8. Butenko G.M., Labunetz I.F. . Macsyuk T.V., Pishel I.N., Kudinov Y.G.. Age-dependent changes in intra- and extrasystemic immunoregulation // Abstracts of XVth Congress of the International association of Gerontology. Budapest,Hungary, 1993.- P. 97.

Максюк Т.В. " Возрастные особенности взаимодействия стромаль-ных и кроветворных клеток костного мозга мышей линии СБА". Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.00.17 - Нормальная физиология, ин-г геронтологии АМН Украины, Киев, 1995. Защищается 8 научных работ, которые содержат экспериментальные исследования особенностей функционирования клеток костного мозга при старении организма. Установлено, что, в целом, кроветворная система старых мышей характеризуется высокой степенью устойчивости, и только дополнительные жесткие меры воздейстия обнаруживают возраст-зависимую неспособность ее клеток восстановить свои функции после повреждения.

Maksyuk Т.У. " Interaction of hemopoietic and stromal cells of bone marrow in CBA mice in aging Thesis for a degree of Candidate of biological sciences, specialization 14.00.17 -Normal Physiology, Institute of Gerontology Academy of Medical Sciences, Kiev, Ukraine, 1995. The results published in 8 articles are presented for scientific discussion. The hemopoietic > system of bone marrow in mice has been shown to maintain