Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Кроветворные и стромальные клетки-предшественники в длительной культуре костного мозга

7

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР /ІУ2^

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ЯШімЛ/ий К-& ЛиХ&с-

' ДзХзЭг.

ДІЧ13Е Нина Поснфошш

(¡12.11!)

КРОВЕТВОРНЫЕ II СТРОМАЛЫ1ЫЕ КЛЕТКИ — ПРЕДШЕСТВЕННИКИ В ДЛИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ КОСТНОГО МОЗГА

(14.00.29 — гематология и перелппанпе кропи)

А и т о р к «і» і: р а т

'диссертации на соискание ученоіі степени докто])а биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре Министерства здравоохранения СССР.

О ф н ц и а .и ъ н ы с о и лопопт ы: доктор биологических наук, ст. науч. сотр. Р. В. ЛЕНСКАЯ доктор моднцннскнх паук, профессор 10. М. ВАСИЛЬЕВ доктор медицинских паук, профессор Г. П. ГРУЗДЕВ

Ведущая организации — Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР.

Защита состоится «......» ............ 1990 г. і! .... час.,

па заседании специализированного совета Д 074.08.01 при Всесоюзнім ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре Министерства здравоохранения СССР (1251(17, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного гематологического научного центра.

Автореферат разослан «......» ................ 1990 г.

Ученьш секретарі» специализированного совета,

доктор медицинских наук Л. А. ЖКРЕ1ЩОВ

ОЫЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Существенным 'достижением гематологии последних лет явилось экспериментальное доказательство существования стволовых кроветворных клеток (СКК) ( H.B.,ucOuliooh Е.н. t 1961). Выявление механизмов регуляции кроветворения связано с изучением пролиферации и дифференцировки СКК. В СКК должны быть совмещены два очень важных свойства: чувствительность к запросу, с одной стороны, и неистощаемость популяции - с другой.

Как СКК обеспечивают неистощаемость кроветворения? Оказалось, что тлеется два уровня регуляции гемопоэза. Количественная регуляция кроветворения, т.е. удовлетворение запроса на зрелые клетки осуществляется на уровне коымитированных клеток-предшесгвенников соответствующих рядов кроветворения, уже потерявших спосбность к длительному самоподцержанию и полипотентность. Такая регуляция основана на функционировании системы специальных гормонов - ростковых факторов (Sieff G.A. > 1987; uetoalf D. . 1989). Ростовые факторы являются специализированными для каждого данного вида клеток, причем они могут меняться по мере дифференцировки клетки-предшественника. Выделение гормона вызывается запросом, т.е. обусловливается прямой или косвенной потребностью в клетках соответствующего ряда. Такая регуляция является дальнодействующей и может захватывать многие кроветворные территории. .

СКК регулируются принципиально иначе. Их регуляция носит локальный характер и связана с функционированием стромы гемопоэти--ческях органов или, иначе говоря, кроветворным микроокружением (Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984). СКК не чувствительны к запросу со стороны кроветворной системы в целом. Локальная регуляция обеспечивает их поддержание на определенном уровне. Таким образом, дифференцировки в кроветворной системе сопрововдаются сменой типа регуляции, принцип регуляции является одной из основных характеристик класса кроветворных клеток-предшественников.

В последние года были получены принципиально ноше данные о механизмах гемопоэза, о роли стромального микроокружения в качестве кооперирующей клеточной системы, поддерживающей и регулирующей кроветворение, а также о клеточных предшественниках строш костного мозга и их функционировании в условиях трансплантации.

Была выявлена иерархия цредшественников в отделе стволовых кроветворных клеток, охарактеризованы примитивные СКК, получены новые

данные о клональности кроветворения. Все перечисленные исследования были проведены благодаря созданию метода культивирования кроветворных клеток, обеспечивающих поддержание кроветворения в течение многих недель за счет сосуществования в культуре строма-льных и кроветворных клеток т.ы. et all. ( 1977). в

длительных культурах костного мозга осуществляется близкое к нормальному кроветворение с поддержанием всех основных линий диффе-ренцировки кроветворных клеток, всех классов предшественников, включая и стволовые клетки. Функции поддерживающего стромального микроокружения в таких культурах осуществляет слой прилипающих клеток, имитирующий кроветворную строму в организме. За образование слоя прилипающих клеток ответственны те же элементы, которые строят кроветворное микроокружение в организме.

Длительная культура костного мозга является адекватной и очень удобной моделью для изучения физиологии гемопоэтической системы.

Цель исследования.

Цель исследования - изучение нормальной физиологии кроветворной ткани: структуры и функций гемопоэтического микроокружения и отдела стволовых кроветворных клеток.

Задачи исследования.

1. Изучить структуру гемопоэтического микроокружения, дать характеристику родоначальных клеток кроветворной стромы.

2. Исследовать взаимодействие стромальных и кроветворных клеток, их взаимное влияние.

3. Определить происхождение клеток кроветворной стромы у химер.

4. Изучить иерархию ранних кроветворных клеток-предшествен-ников, пролиферацию и пролиферативный потенциал стволовых кроветворных клеток (КОЕс).

5. Дать характеристики примитивных стволовых кроветворных клеток.

6. Исследовать проблему клональности кроветворения-и последовательной смены гемопоэтических клонов.

Научная новизна. • _

В результате применения метода длительного культивирования костного мозга исследована структура кроветворного микроокружения, показано наличие ранних стромальных предшественников "кро-

ветворное микроокружение переносящих единиц" и более зрелых "ин-дуцибельных предшественников кроветворной стромы", изучена их способность к пролиферации, радиочувствительность, способность к реимплантации в организм. Исследован феномен гибридной резистентности в культуре.

Исследовано происхождение клеток кроветворной отромы у химер, показана неспособность стромальных клеток переносить кроветворное микроокружение при внутривенно!,! введении. .

Получены ноше данные об иерархии ранних кроветворных предшественников. Выявлены примитивные стволовые кроветворные клетки, определено их количество в бедре мыши и некоторые характеристики: нечувствительность к стадиоспецифическим цитостатикам и неспособность к регенерации после облучения. Описаны их ранние потомки -пре-КОЕс клетки. .

Представлены косвенные и прямые доказательства клональности кроветворения в культуре. Показана последовательная смена клонов кроветворных клеток.

Практическая ценность.

Полученные результаты существенно углубляют, а во многом и ■изменяют существующие представления об организации кроветворной системы. Получены новые,данные о стромалышх предшественниках кроветворного микроокружения. Установлена иерархия стволовых кроветворных клеток. Особое значение представляют данные о клональ-' ном характере кроветворения и последовательной сменэ клонов кро-’ ветворных клеток. ■

. Данные о нечувствительности примитивных стволовых кроветворных клеток к действию стадиоспецифических цитостатиков тлеют большое практическое значение при химиотерапии различных гемопатий.

Исследования происхождения кроветворной стромы у химер и доказательства нетрансплангабелытсги клеток гемопоэтического микроокружения при введении внутривенно имеют большое значение для трансплантации костного мозга.

Внедрение в практику.

Основные результаты работы внедрены в экспериментальную и клиническую гематологию в виде лекций для практических врачей и научных сотрудников во Всесоюзном гематологическом научном цект-. ре. Итоги диссертационной работы доложены па конференциях,- сесси-

ях, всесоюзных съездах, всемирном конгрессе по экспериментальной и клинической гематологии в Будапеште. Проведено обучение научных сотрудников из различных гематологических учреждений страны.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 259 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, заключения, выводов. Работа иллюстрирована 29 таблицами п 30 рисунками. Список литературы содержит 20 отечественных и 421 зарубежных источников.

Основные положения работы, вынесенные на защиту.

Использование метода длительного культивирования костного мозга позволило получить некоторые принципиально новые данные, которые и выносятся на защиту: '

- выявлены две категории стромальных предшественников, отвечающих за построение кроветворного микроокружения в культуре, показана их способность к обратной трансплантации в организм; получены их основные характеристики: способность к пролиферации, са-моподцержанию, их радиочувствительность, кинетика в культуре;

- на основании экспериментальных данных показано, что строма кроветворных органов нетрансплантабельна при внутривенном введении в организм, и стромальные и кроветворные стволовые клетки имеют независимого предшественника;

- обнаружена иерархия в отделе ранних кроветворных предшественников в культуре* охарактеризованы примитивные стволовые кроветворные клетки, показано, что они, а не КОЕс способны длительно поддерживать кроветворение в культуре и не обладают способностью к регенерации после облучения, подсчитано приблизительное их количество на бедро;

- приведены доказательства клонального кроветворения в культуре, подтверждающие гипотезу о том, что заложенные в онтогенезе стволовые кроветворные клетки расходуются последовательно, . продуцируя клоны дифференцированных гемопоэтических клеток. ■

В. цблом разработка данного экспериментального направления дала возможность изучить принципиальные вопросы, связанные о физиологией кроветворения и открывает дальнейшие возможности для . использования метода длительного культивирования клеток костного мозга при лечении гемопатий и применения современных методов генной терапии.

Материалы и методы исследования.

Работа проведена на шшах-самках и самцах - в возрасте 2-6 ыес., а иногда I год, линий С57ВІ/6, СМ, СВАТ6Т6, (СВА х С57М/6) (СВР]-), (СВА1'6Т6хС5731/6)Р1 (СЗР^-Тб), (ДВЛ/2хС57В1/6)

Р-,- (ДДРд-), (МО/бп СЗИ/Незп , (ВАГВ/с, ЗАІВ/с X ВІО/сда )ЇІ.

і.ішеії облучали на установке ИНК (137св ) в дозах 10,5 Гр для линии С57ВІ/6 и 12-12,5 Гр для гибридов Р^ при мощности дозы от 0,15 до 0,25 Гр/мин. .

Длительные культуры костного мозга облучали на той же установке в дозах 2-30 Гр при мощности дозы 3,8-5 Гр/мин.

Для получения химер летально облученным мышам (10,5-12,5 Гр), внутривенно вводили сингенннй костный мозг (1/3 бедренного эквивалента). В некоторых экспериментах облученных мышей восстанавливали различными дозами костного мозга от 0,35x10® до 35x10® клеток.

Были получены следующие виды химер: стандартные - 1/3 бедренного эквивалента; однопассажные - облученных химер восстанавливали костным мозгом стандартных химер (полученным не ренее, чем через 2 мес. после создания химеры);

двухпассажные - облученных мышей восстанавливали костным мозгом пассажных химер;

двойные - стандартных химер облучали повторно в той же легальной дозе и восстанавливали костным мозгом нормальных доноров.'

5а полным или частичным сохранением химер следили кариологи-чески. ,

. Для определения колониеобразующих единиц в селезенке КОЕс был использован метод цц и мсСиїїоск (1961). Мышей облучали максимально переносимой дозой, при которой число эндогенных колоний не превышало 0,2 на селезенку. Такая доза составляла 11-13

гр. ■

Метод экзогенных селезеночных колоний определяет только ту часть популяции СКК, которая при внутривенном введении попадает в селезенку (КОЕс). Эта часть может меняться в зависимости от вводимых клеток и в результате различных воздействий на них. В работе использовали метод определения фактора распределения стволовых кроветворных клеток ДЛЯ Пре-КОЕС, предложенный Slml.noTi.toh с соавторами в 1363 г. для КОЕс.

Пролиферативный потенциал КОЕс изучали по числу дочерних

КОЕс в индивидуальных селезеночных колониях. Мышей легально облучали и вводили кроветворные клетки с таким расчетом, чтобы число колоний в селезенке не превышало 4-6. Через II сут., когда в селезенке остаются колонии, продуцированные только фракцией СКК. Клетки каждой колонии вводили двум или трем облученным мышам и через 7-8 сут. подсчитывали число колоний.

Пролиферацию клеток предшественников определяли при помощи метода клеточного "самоубийства", основанного на избирательной гибели пролифериружщих клеток при введении цикло- и фазоспецифи-^е^ких цитостатиков. Оксимочевина (ОМ) поражает, главным образом, рахидмциеся в фазе синтеза ДНК. В условиях культуры кроветворные клетки (не более 2х107 в I мл) или стромальные клетки инкубировали в питательной среде с 2 % сыворотки в течение 2 часов при 37°С (для стромалышх клеток в некоторых экспериментах - 7 суток, с ОМ в концентрации 13 Щ (I мг/мл). Затем клетки отмывали. Величину

клеточного самоубийства (,, ) вычисляли по формуле :н = §Lz_¿— х

а

х 100, где а -.число колоний или размер очага эктопического кроветворения, продуцированных когрольными клетками, а в - клетками, инкубированными с ОМ.

Для уничтожения пролиферирующих клеток-предшественников мы-шам-донорам костного мозга вводили внутрибрюшшшо 01.1 в дозе 9001000 мг/кг 6 раз с интервалом 6 часов; 5-фгорурацил вводили внутривенно в дозе 150 мг/кг за 2 и 4 суток до проведения эксперимента.

Для работы методом конкурентной репопуляции проводили кондиционирование реципиентов. Ыышей-реципиентов генотипов CBP-j- И ВДР-j-иммунизировали внутрибрюшинно перекрестно путем двукратного с интервалом 2 недели введения 2 х 10^ спленоцитов противоположного генотипа. Иммунных реципиентов облучали не ранее, чем через 2 недели после второй иммунизации.

Для определения эритрорепопулирующей активности кроветворные клетки вводили облученным мышам. Через 8 сут. вводили внутрибрюшинно 59^8 в виде аскорбата железа в дозе 37 КБк ( mkCu ) на мышь. Еще через 2 сут. определяли включение железа в эритроциты периферической крови, принимая ее маосу за 5,8 % массы шши. Одновременно подсчитывали число колоний в селезенке. Эритрорепопу-лирующую активность рассчитывали как процент введенной дозы железа на одну КОЕс.

Кюретаж проводили по методу Brecher с соавт. Ыышеи нарко-

зи,

и?ровали внутрибрюшинным введением I % раствора гвксвнала в дозе

0,15 мл на 10 г массы мнши.

Очаги эктопического кроветворения получали путем гетеротоп-ной имплантации костного мозга или подслоя длительных культур костного мозга, в которых находятся стромальные клетки-предшественники. Имплантацию осуществляли под капсулу почки, как описано (Чертков И.Л., Гуревич О.А., 1984).

Размер образовавшегося очага оценивали через 1-1,5 мес. поо-ле имплантации по числу содержащихся в нем кроветворных клеток и (или) КОЕс.

В качестве пре-КОЕс клеток рассматривали клетки, дававшие в селезенке за 22 сут. .(с промежуточным пассажем через II сут.) колонии, содержащие дочерних КОЕс, в которых было по меньшей мере в 2 раза большим, чем в среднем в данном опыте. Для определения числа пре-КОЕс использовали метод лимитирующего разведения ( Bravi R.iï. I 1971).

Учитывая долю селезенок, не содержащих пре-КОЕс (фракция непоявления Ро), рассчитывали число пре-КОЕс' (п) по формуле: п = -L пРо.

Сыворотку анемичных мышей получали по методу. Tambourin о соавт., IS73.

Для стимуляции роста гранулоцитарно-макрофагальных колоний в агаре использовали сыворотку мышей, получавших эндотоксин, , внутривенно по 2,5 МВД (минимальная пирогенная доза) на мышь.

Длительные культуры костного мозга мышей вели по методу Dextar с соавт.,(1977). Костный мозг I бедра мыши в виде фрагментов вымывали 10 мл среды в пластиковый матрас с площадью дна 25 см^ (Flow ,Lux )• Использовали среду Фишера, обогащенную -глютамином, гидрокортизоном в концентрации 10-10“® М и 20 % смеси (1/3 эмбриональной телячьей сыворотки и 2/3 лошадиной сыворотки). В полную питательную среду добавляли антибиотики - IQO ед./ мл пенициллина и 50 мкг/мл стептомицина. Культуру вели при 33°С с еженедельной сменой 1/2 среды без возвращения удаляемых со средой клеток. Иногда производили вторую посадку клеточной взвеси на облученный подслой трехнеделышх культур. Для этого культуру облучали в дозе 10 Гр и не ранее чем через 2 часа производили трансплантацию клеточной взвеси со сменой всей питательной среда.

Для изучения феномена гибридной резистентности' в культуре трехдадельше культуры облучали в дозе 10-Гр, после чего произ-

водшш вторую посадку взвеси сишчлпьи семисингенных клеток костного мозга. Способность прилипающих клеток культур к осуществлению феномена гибридной резистентности в организме изучали путем имплантации подолоя под капсулу почки. Культуры генотипа С57В1/6 имплантировали к сингенным и СВР^ реципиентам. 01®- гибридам под капсулу второй почки имплантировали культуру генотипа СВР-]-. Через 1-2 мес. мышей-реципиентов облучали и вводили им внутривенно 2 х М6 клеток костного мозга генотипа С57В1/6. Через 7 или 10 дней изучали содержание КОЕс в вктопических очагах кроветворения при помощи метода селезеночных колоний. Для определения числа примитивных стволовых кроветворных клеток в длительных культурах костного мозга трвхнедельные культуры облучали в дозе 10 Гр и на подслой эксплантировали кроветворные клетки. Культуры вели 5-7 недель, снимали подслои резиновым "полисменом", разбивали его повторным пипетированием, и клетки каждого матраса вводили двум облученным реципиентам для определения присутствия КОЕс.

1М-К0Е культивировали в 0,3 ^ агаре. В качестве колошестимулирующего фактора использовали сыворотку мышей, получавших пи-рогенал, которую разводили 1:3 и добавляли в количестве 10 % к среде культивирования. .

Полипотентные клетки-предшественники (КОЕсм) клонировали в

0,8 % метилцеллулозе. .

Для определения пролиферативного потенциала КОЕс, содержащихся в КОЕсм, полученных из клеток длительных культур.костного мозга, клетки колоний извлекали из метилцеллулозной среды автоматической пипеткой на 25 мкл, взвешивали в 0,2 мл среды 199 с

2 % гепес,'буфера и вводили внутривенно легально облученным мышам в дозе 1-2 колоний на мышь. Через II дней определяли число дочерних КОЕс в селезеночных колониях. Проводили статистическую обработку результатов (Урбах В.Ю., 1984).

В работе использованы данные, полученные автором совместно с другими специалистами.

1. Изучение кроветворных и стромальных клеток-предшествен-ников в длительных культурах костного мозга и их характеристики осуществлено совместно с зав. лабораторией физиологии кроветворения, профессором И.Л.Чертковым. .

2. Карио л отческий анализ кроветворных клеток проведен совместно со старшим научным сотрудником лаборатории физиологии

кроветворения, канд. мед. наук Г.А.Удаловым.

3. Изучение и характеристики стромалышх предшественников в длительных культурах костного мозга проведено совместно со старшим научным сотрудником лаборатории физиологии кроветворения, д-ром биол. наук О.А.Гуревич.

4. Изучение клоналъности кроветворения и определения числа П-СКК в длительных культурах костного мозга проведено совместно со старшим научным сотрудником лаборатории физиологии кроветворения , канд. биол, наук Е.И.Дерюгиной.

5'. Получение межлинейных антисыворогок проведено совместно со старшим научны»,1 сотрудником лаборатории клеточной иммунологии, канд. биол, наук Р.С.Самойловой.

_ 6. Определение П-СКК у мышей методом лимитирующих разведе-

ний проведено совместно с младшим научным сотрудником лаборатории физиологии кроветворения, канд. биол. наук Е.Ю.Садовниковой.

Результаты исследований и их обогащение.

А. Родоначальные клетки кроветворной стромы

I. Кроветворное микроокружение переновящие единицы и индуцибельные предшественники кроветворного микроокружения

Для длительных культур костного мозга характерно образование подслоя прилипающих клеток, тлеющего сложное строение и выполняю-^ щего роль кроветворного микроокружения. Такой подслой поддерживает пролиферацию и дифференцировку всех категорий кроветворных кле-,ток. Подслой формируется в течение 2-3 недель после эксплантации костного мозга в культуру и состоит из гистиоцитов макрофагов; фибробластов, эндотелиальных и, вероятно, гладкомышвчных клеток, а также белков внеклеточного матрикса.

Для изучения стромалышх предшественников в культуре использовался функциональный подход. Возникает вопрос, строится ли микроокружение в культуре теми же категориями предшественников, что и в организме. Вопрос этот принципиален, так как в случае положительного ответа появляется возможность прямого изучения гистогенеза кроветворного микроокружения в хорошо контролируемых условиях культуры.

При обратной трансплантации подслоя прилипающих клеток из культур под капсулу почки сингенных мышей продуцируется очаг эк-

топического кроветворения. Процесс 11СС?рг)ошш микроокружения в очаге очень эффективен. Если трансплантировать подслой трех-че-тырех недельных культур в перше же дни образуется кость, на которую репопулирую/кроветворные клетки, обеспечивающие возникновение очага полиморфного кроветворения. При трансплантации культур после 6-8 недель культивирования в очагах эктопического кроветворения' отсутствует кость, у облученных сингенных реципиентов такие очаги могут достигать значительных размеров - до 30-50x10® гемо-поэтичёских клеток. Кроветворение в очагах вполне стабильно, в них легко идентифицируются клетки всех ростков кроветворения.

Кроветворные клетки эктопических очагов целиком принадлежат рецппиенту; "мозаики", г.е. очаги, в Которых кроветворные клетки принадлежат и донору, и реципиенту.обнаружены не были, Действительно, через месяц после имплантации подслоя культур самок С57В1/6 сингенным самцам ни в одном из 5 исследованных очагов не было выявлено ни одной метафазы самки (исследовано по 25 метафаз на очаг). Тот же результат был получен при имплантации подслоев СВАТ6Т6 к реципиентам СВА - в 3 эктопических очагах (75 метафаз) не определялось ни одного митоза донора подслоя. В то же время после имплантации свежего костного мозга образующиеся эктопические очаги, как правило, мозаичны и содержат 15-30 % кроветворных клеток донора (Удалов Г.А. и соавт., 1977). И все же отсутствие донорских метафаз в очагах, построенных подслоем, не обязательно свидетельствует о какой-то дефектности клеток-предшест-вешшков стромы из культур. Возможно, результаты объясняются тем, что содержание стволовых клеток в подслое в несколько десятков раз меньше, чем в костном мозге.

Очаг эктопического кроветворения, образующийся после имплантации слоя прилипающих клеток (СПК), строится стромальными предшественниками донора и не является результатом индукции. Это доказывается тем, что у аллогенних реципиентов СПК не способен вызывать очага гетеротопного кроветворения, т.е. СПК формирует, а не индуцирует очаг. Следовательно, в длительной культуре костного мозга поддерживаются клетки, способные к переносу нормального микроокружения. Идентичны ли эти клетки кроветворное микроокружение переносящим • •' единицам (КМПЕ)? Показательно,

что КМПЕ строят очаг эктопического кроветворения таким образом,, что размер сформированного микроокружения линейно связан с величиной имплантанта.

Эта же характеристика свойственна и стромальнш предшественникам из -культуры при построении ими эктопического очага под капсулой почки.

При трансплантации 1/2 части подслоя размер очага эктопического кроветворения составляет (3,56 + 0.8) х 10 клеток, а подслоя с целого гатраса (5,81 + 0,9) х 10 клетш.КМПЕ при имплантации некультивированного костного мозга строят эктопическую строму, поддерживающую кроветворение, по всем параметрам соответствующее нормальному.

Изучали пролиферативный потенциал стволовых кроветворных клеток из очагов эктопического кроветворения, сформированных клетками подслоя в необлученных реципиентах или химерах, в сравнении с клетками из костного мозга тех же реципиентов. Через месяц после импрангации подслоя, т.е. после формирования эктопических очагов, мышей облучали в летальных дозах и состав кроветворной ткани у них восстанавливали введением свежих костномозговых клеток. Еще через 2-3 мес., когда вся кроветворная ткань реципиентов, в том числе и эктопическая, была заселена потомка!,ш одних и тех же донорских клеток, сравнивали пролиферативный потенциал КОЕс, обитавших эго время в нормальном костном мозге и в образованных клетками культур эктопических очагах (табл. I). Оказалось, что сгрома в эктопических очагах полноценна и достаточно хорошо, хотя и несколько меньше, чем в нормальных крове- , творных территориях, поддерживает пролиферативный потенциал . КОЕс.

Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что •стромальные предшественники кроветворной стромы строят в культуре упрощенное микроокружение, способное длительно поддерживать пролиферацию и дифференцировку КОЕс. '

С другой стороны, в культуре сохранены предшественники кро-

■ ветворной стромы, способные при ретрансплантации в организм переносить новое, нормальное по всем параметрам кроветворное микроокружение. Между тем, в большинстве эктопических очагов отсутствует кость. До сих пор стабильные очаги эктопического кроветворения удавалось наблюдать лишь в случае наличия в очаге кости. Это впервые доказывает, что естественный сосед кроветворения во взрослом организме - кость - не- является обязательным компонентом крупной и стабильной кроветворной территории, т.е. ин-

Таблица 1

Самоподдержание КОЕс (число дочерни:: КОЕс в 11-дневных селезеночным колония:; из костного мозга и очагов эктопического кроветворения, продуцировании:: клетками подслоя длительны:: культур костного мозга

!Опыт!Линин!Реципиент!Самоподдержание!

! I ! 1 КОЕс

1 !МНШЄЙІ !КОСТНЫЙ!эктопи-!

! I 1 ! мозг ¡ческия !

1 ! ! 1 ! очаг !

1 1 ІС 57 Жеоблучен ¡65 + 16 !3 9 + 13 !

! ! В1/6 !нып ! ! !

! 2 ! СВР. і _ " - ¡139+23 ¡91+ 19 I

1 3 1 СВР, ! !165+26 ¡159+25 !

1 4 ІСВР, 1 Химера !141+22 ¡112+23 1

! 5 ¡СВР* ! ¡223+31 ¡108+20 !

тегральной частью кроветворного микроокружения.

При имплантации свежего костного мозга под капсулу почки интактных и облученных мышей размер очага в облученном реципиенте обычно в 1,5-3 раза больше, чем в нэоблученном. В культуре эти различия существенно больше. Очаги в облученных реципиентах в 6-7 раз больше, чем в интактных. Важно, что в ряде случаев клетки подслоя вообще не способны к построению очага в не-облученном реципиенте, тогда как у химер строится таким же подслоем кроветворная территория огромного размера. Эти данные по-, зволяют предполагать наличие гетерогенности в отделе стромаль-ных предшественников. Кажется вероятным, что этот отдел иерархи-чэн по степени дифференвдровки образующих его элементов. Наряду со стволовыми клетками 1фоветворной стромы (КМПЕ) там могут присутствовать и болое зрелые предшественники, чувствительные к запросу и потому строящие очаг большего размера в облученном, реципиенте. Эти предполагаемые клетки мы будем называть далее индувдбельными предшественниками кроветворного микроокружения СИПКГЛ). Можно предполагать, что в некоторых более старых культурах присутствуют только ИПКМ, в связи с чем подслои из таких

культур не образуют эктопических очагов у необлучешшх реципиентов. . '

При ретрансплантации очага эктопического кроветворения от необлученного реципиента, построенного, по определению КИПЕ и в 2-3 раза большего очага от химеры, построенного как КМПЕ, так и ИПКМ, размеры вторичного очага оказываются одинаковыми. Указанные различия в поведении свежих и культивированных стромальных предшественников послу шиш основанием для проведения следующего эксперимента. В культуру эксплантировали разное количество стро-мальных предшественников - 1/2, I и 2 эквивалента костного мозга бедра на I матрас. Через 4-6 нед., когда во всех случаях подслой прилипающих клеток, равно как и интенсивность кроветворения, были примерно одинаковыми, клетки подслоя имплантировали под капсулу почки необлученных рецишшнтов и химер (табл. 2).

Таблица 2

Размер эктопическим очагов, образованных клетками полслон, в зависимости от величины запланированного в культуру фрагмента костного мозга {среднее из 3 опытов)

I Эксплантант ! Размер очага (число кровотворних клеток,*1 о"6 ) |

I (эквивалент I---------------------------------------------------------1

■ I бедра) ! интактнып реципиент I облученный реципиент I

I 1/2 1 1,7 1 37,1 I

І 1 I 4,0 I 42,7 . I

I 2 ! 8,3 I 30,3 I

Результаты подтвердили гипотезу о наличии 2 последовательных стадий дифференцировки стромальных предшественников. Действительно, размер очага в необлученном реципиенте, как следовало ожидать, оказался пропорционален количеству эксплантировапного костного мозга, т.е. количеству КМПЕ. В то же время в облученных

реципиентах очаги оказались одинаковыми. Отсюда можно сделать вывод, что во ёсох культурах подслой прилипающих клеток, размер которого определяется только площадью дна матраса, построен в основном индуцибельными стромалышми предшественниками - 1ШКМ, способными к построению кроветворного микроокружения только в облученном реципиенте. Следовательно, предшественники стромы из культур отличаются относительно более высоким содержанием отвечающих на запрос клеток - ИПКМ. Поэтому можно думать, что пролиферативный потенциал стромальных предшественников в очагах из культур должен быть существенно меньше, чем в очагах, образованных свежим костным мозгом. Последние обладают очень высоким пролиферативным потенциалом - очаги можно пассировать повторно, до 9 раз, без уменьшения размеров формируемых кроветворных территорий. Совершенно по-другому обстоит дело с эктопическими очагами, продуцированными клетками из культур. При первом же пассаже теряется 05-90 % стромальных предшественников, что свидетельствует об их низком пролиферативном потенциале и подтвервдает тем самым гипотезу о наличии иерархии стромальных предшественников, более зрелые из которых (ИПКМ) отвечают на запрос и имеют низкую способность к пролиферации. Кроме того, ИПКМ способны к однократному строительству эктопического микроокружения не только в условиях стимуляции (у облученного реципиента), но и без нее (у интактной мыши). КМПЕ составляют в культуре меньшую долю предшественников, чем в нормальном костном мозге.

Имеющиеся экспериментальные данные говорят о наличии иерархии предшественников кроветворного микроокружения в длительной культуре, среди которых выявляются как стволовые клетки стромы (КМПЕ), так и более зрелые, имеющие ограниченный пролиферативный потенциал и отвечающие на зацрос их потомки.

2. Кинетика стромальных предшественников в культуре

Было выявлено 2 популяции стромальных предшественников, представленных в разном соотношении. Представляется важным изучить их гистогенез в условиях построения СПК в культурах. Изучали кинетику КМПЕ и ИПКМ в процессе построения кроветворного микроокружения, в культуре.

В течение 1-Й недели после эксплантации костного мозга стро-

малыше предшественники в культуре не выявляшгся. Вероятно, эго связано <? потерей шли трансплантабелышсти, в связи с разобщением в процесса миграции б культуре. Аналогично ведут себя КШЕ в организме в течоние I-й недели после облучения, когда костный мозг теряет организованную структуру и перенести его не удается. Со 2-й по 4-га нед. культивирования размеры очагов примерно одинаковы (рис. I). В связи с тем, что размеры очагов стабильны со 2-й по 4-5-ю нед., можно считать, что к концу 2-й нед. культивирования формирование подслоя заканчивается, содержат« КШЕ в подслоях не меняется. Однако структура популяции стромальных предшественников претерпевает существенные изменения. До 4 недель культивирования в СПК происходит остеогенез и в очаго эктопического кроветворения образуется кость независимо от того, где формируется очаг - в облученном или стандартном реципиенте. Поело 5-6 нед. культивирования остеогенеза не происходит, образующиеся очаги обычно не содержат кости в интактном реципиенто, но в облученном реципиенте способность культур к остеогенезу выявляется еще в течение 1-2 нед. культивирования. После 5 нед. культивирования размер очага в стандартном реципиенте снижается быстрее, чем в облученном. Из приведенных дашшх ясно, что КМПЕ..И ШШ имеют различную кинетику в культуре в процессе формирования и функционирования кроветворного микроокружения.

3. Радиочувствительность огроыалымх предшественников

Существенной характеристикой стромальных предшественников, .принципиально отличающей их ог кроветворных клеток, является их высокая радиорезистентность. В длительных культурах костного мозга можно непосредственно изучать радиочувствительность стромаль-ных предшественников и зрелых клеток кроветворной стромы в упрощенных условиях, исключающих посутствующие факторы, свойственные системам in vivo .

Радиочувствительность стромальных предшественников была изучена в семи опытах на мышах трех генотипов. Результаты оказались близкими (рис. 2).

Клеточность очагов, х!0'

Время культивирования, недели

Рис.4.2.1. Кинетика стромальных предшественников в культуре костного мозга. Подслой из культур имплантирован стандартным реципиентам (I) или радиационным химерам (П\ Нижняя заштрихованная область - клеточность очагов, продуцированных у стандартных реципиентов некультивированным костным мозгом одной бедренной кости, верхняя заштрихованная область - то же у радиационных химер. ‘

’ Цифры в скобках - число имплантированных культур.

Рис.4.3.1. Радиочувствительность клеток-предшественников кроветворной стромы из длительной культуры костного мозга мыши.

По оси абсцисс - доза облучения, Гр

По оси ординат - доля выжившей фракции

1,2 - мыши С57В1/о .

3-6 - мши СВР I 7 - мши ВДР7 /

Уравнение линейной регрессии:

и^Уа -0,144х + 0,194 .

Необлученные культуры продуцировали очаги эктопического кроветворения, клегочносгь которых составляла 3-6x10®; большая часть культур продуцировала очаги, содержащие не только кроветворную, но и костную ткань. При облучении даже в самой низкой из использованных доз (2Гр) остеогенез в очагах никогда не наблюдался,

До = 3,02+0,7 Гр, а экстраполяционное число составляло 1,56.

Таким образом, по радиочувствительности КПМЁ, строящие Микроокружение в культуре, существенно не отличаются от содержацих-ся в некультивированном костном мозге. В то же время радиочувствительность стволовых кроветворных меток существенно ниже. Величина До для них составляет I 1£. Эи: данные являются, следовательно, еще одним серьезным доказательством гистогенетической независимости стволовых кроветворных клеток от предшественников сгромы костного ыозга.

Радиорезистентность зрелых клеток кроветворного микроокружения в культуре оказалась высокой. Облучение в дозах от 20 до ВО Гр практически не влияло на способность СПК поддерживать кроветворение, Во всех группах независимо от дозы облучения общая кле-точность культур и содержание в них КОЕк значимо не различались. То же относится и к числу КОЕс в культуре, которое было изучено через 3 и 7 нед. после облучения и колебалось от 130 до 216 колоний на матрас (3 нед.) и от 3 до 13 (7 нед.) независимо от дозы облучения. Только при увеличении доз удалось обнаружить поражение кроветворного микроокружения в культуре. В первую очередь оно выражалось в резком снижении содержания КОЕк в первые же 2 над. после облучения культур в дозах 200 и 300 Гр; подобный эффект наблюдался и при облучении в дозе 150 Гр, но в одном опыте он наступил лишь через 3 нед. Данные в более поздние сроки для этих доз облучения оказались малоинформативными, так как происходила макрофагальная трансформация кроветворения и как клеточность, так и КОЕк в этих культурах поддерживались только макрофагами и их предшественниками. Способность культур обеспечивать необходимое для гранулоцитопоэза микроокружение терялось необратимо.

В целом полученные результаты говорят о существенно более высокой радиорезистентности зрелых клеток кроветворного микроокружения, чем это было определено в организме. Сами по себе клетки, обеспечивающие длительное поддержание пролиферации и диффе-. ренцировки' кроветворных элементов в культуре, переносят облучение

в дозе до 100 Гр, Необратимое поражение кроветворного микроокружения in vivo уже дозами 30 Гр и выше связано, видимо, с системными эффектами радиации (в первую очередь нарушающими микроцирку-ляцто), а не с прямым действием на кроветворную строму. Это заключение подтверждается и тем, что в культуре радиация вызывает гибель микроокружения уже в течение 1-2 нед. Между тем, после облучения в организме дозами порядка 20-30 Гр вторичная аплазия развивается только через 2 мес., т.е. обусловлена опосредованными эффектами.

4. Феномен гибридной резистентности в культуре

Феномен гибридной резистентности к костномозговому трансплантату заключается в задержанном росте стволовых кроветворных -клеток некоторых линий мышей в облученном реципиенте-гибрвде Fj. Феномен вызывает большой интерес в связи с тем, что он представляет собой модель для изучения регуляции пролиферации стволовых клеток. Однако до сих пор природа его неясна. Метод длительного культивирования костного мозга пригоден для анализа этой проблемы вне организма. Феномен гибридной (аллогенной) резистентности воспроизвести в культуре не удалось. "

Представлял интерес вопрос, способны ли клетки культур при их реимплантации в организм построить эктопический очаг кроветворения, в котором осуществлялся бы феномен гибридной резистент-' ности, нак^это происходит в эктопических очагах, образованных некультивированным костным мозгом. "

Работа проведена на мышах-самках линии C57BI/6 (далее В6)', а также на гибридах (CBAxC57BI/6)Pj (CBPj) в возрасте ъ начале исследований 8-12 нед. В связи о тем, что in vivo задержка роста родительских клеток у гибрида S-j имеет место только в течение первых 10 дней после трансплантации, в таблице 3 приведены данные

о кроветворной клеточности культур через 7 дней после посадки клеток на сингенный или семисингенный СПК. Эксплантация костномозговых клеток фенотипа C57BI на облученный подслой, сингешшх C57BI или семисингениых (СВР|) культур обеспечивала одинаковое кроветворение в культурах обоих типов. Идентичность кроветворения при использовании обеих клеточных комбинаций культур наблюдалась но-, зависимо от числа кроветворных клеток, использованных для второй посадки, в пределах от 1x10® клеток. Между тем в организме генотипа CBIj клетки C57BI ингибируются наиболее сильно.

Отсюда следует, что структурная организация подслоя культури не в состоянии обеспечивать феномены гибридной и аллогенной резистентности; очевидно, в культуре теряются какие-то компоненты, обязательные для осуществления этих феноменов.

С целью рассмотрения этих возможностей подслой культур был перенесен обратно в сиигенный (С57ВІ в С57ВІ или СВР]- в СВЗ^) или сешкзингенный (С57ВІ в СЫ^) организм. После образования культивированными клетками эктопических очагов кроветворения было изучено наличие в них механизмов гибридной резистентности (табл. 4). В очагах генотипа СВР-]- осуществлялась сильная гибридная резистен'/тность к введенным кроветворным клеткам С57ВІ. В таких очагах через 10 дней после облучения и трансплантации клеток С57ВІ содержалось столько же КОЕс, сколько и в костном мозге бедра реципиентов СВЕр и примерно в 100 раз меньше КОЕс, чем в костном мозге реципиентов С57ВІ. Следовательно, в результате обратной трансплантации клеток СВЕ1 из культуры в организм их способность осуществлять гибридную резистентность к костномозговым клеткам С57ВІ полностью восстановилась. Это можно объяснить восстановлением необходимой структурной организации или миграцией в эктопический очаг утерянных в культуре компонентов кроветворного микроокружения, необходимых для осуществления феномена гибридной резистентности.

Полученные результаты позволяют сделать некоторые важные выводы. В культуре теряется компонент микроокружения, необходимый для осуществления феномена гибридной резистентности. Зтот компонент может быть восстановлен при обратной имплантации СПК культуры в организм, что впервые прямым образом доказывает способность к миграции какого-то компонента кроветворного микроокружения, необходимого для регуляции пролиферации стволовых кроветворных клеток, во всяком случае в семисингенной системе.

5. Влияние кроветворения на клеткл-прддшест-

■ венники стромы костного мозга

Подслой прилипающих клеток играет эссенциальцую роль для поддержания кроветворения в длительной культуре костного мозга. Наличие или отсутствие кроветворения имзег важное значение для функционирования стромальных предшественников. •

Было экспериментально изучено влияние кроветворения на . клетки-предпественники кроветворной строки, способные к пере-

Таблица 3

Число кропетворны:: клеток в культуре через 1 над после посадки

костномозговых клеток на облученный сингеннып или семисингеннып подслоя

! N ¡Генотип облученно- Генотип клеток ¡Доза клеток!Клеточность!

!опы! го подслоя вторсп подсадки ¡второй ПОД; I культуры В|

!та 1 !садки(* 1 о ~ !1МЛ(*10) !

1 1 ! Е6 В6 I 7 I 2,45 I

1 ! СВР В6 ! 7 I 2,58 !

! 2 ! Об1 В6 I 5 ! 1,55 1

I ! СВР В6 1 5 1 2,85 1

! I ВВ1 СВР ■ свр: В61 ! 5 I 4,65 1

! - ! СВР 1 5 1 2,65 !

I 3 1 В61 1 1 1 2,83 ^

1 I СВР 1 В6Х Вб ! 1 1 2,98 I

1 В6 1 10 ! 0,40 !

1 1 СВР1 В6 1 10 1 0,60 I

Таблица 4

Число КОЕс в эктопическим очагах кроветворения через 10 днеп после трансплантации клеток В6 облученному реципиенту

! N 1 ¡опыта 1 Генотип облученной стромы Источник облученной стромы ¡Генотип реци-¡Число КОЕс! 1 пиента облу-1 на орган 1 ¡ченной СТРОМЫ1 1

I 1 I В6 СПК культуры 1 В8 1 12,2 !

В6 То же ! СВР ! - 7,9 I

СВР. ВБ - " - 1 СВР, 1 2,5 I

1 2 1 СПК культуры 1 В61 ! 65,2 I

В6 То же 1 СВР. 1 1 свр: 1 5,1 1

СВР, ВБ - " - 1 , 1 1

Костный мозг бедра ! 1 1 1 1 I 142,4 I

СВР1 То же 1 1 1,7 !

носу кроветворного микроокружения in vivo с образованием очагов эктопического кроветворения и in vitro с образованием слоя прилипающих клеток, поддерживающих кроветворение в длительной культуре костного мозга.

Получены следующие виды химер: стандартные химеры, однопассажные химеры, двухпассаяные химеры, двойные химеры. Исследования проводили через 3-9 мес. после получения химер.

Все группы использованных химер по анализу метафаз в костном мозге содержали только донорские кроветворные клетки (анализировали не мейее 100 метафаз из пула клеток костного мозга всех химер группы). Отсутствие реверсий позволяет считать, что в разных группах кроветворные клетки действительно проделали I, 2 или

3 цикла интенсивной пролиферации в ходе восстановления кроветворения у химер, а не являются потомками облученных клеток реципиента. Таким образом, по степени прямого радиационного поражения стромы химеры групп I, 2 и 3 равноценны; различия между ними ограничиваются лишь пролиферативной историей стволовых клеток, поддерживающих кроветворение химер.

Данные о способности стромальных предшественников к переносу кроветворного микроокружения in у^опредставлены на рис. 3. Очаги, образованные у стандартных реципиентов костным мозгом стандартных химер, были в 2 раза меньше очагов, продуцированных нормальным костным мозгом. Еще в 2 раза меньше были очаги, продуцированные костным мозгом двойных химер, что хорошо соответствует как радиочувствительности стромальных предшественников, так и их неспособности к полному восстановлению от радиационных поражений.

У пассажных химер способность к переносу микроокружения была снижена так же сильно, как и у двойных химер, хотя полученная ими • суммарная доза облучения была в 2 раза ниже. Принципиально те же, хотя и несколько менее выраженные, различия были выявлена и у облученных реципиентов.

- При эксплантации в длительную культуру коотный мозг всех химер поддерживал кроветворение примерно одинакового и худшего качества, чем нормальный костный мозг. Морфологически это выражалось в меньшей площади дна матраса, занятой участками активного кроветворения (области "булыжника"). Число кроветворных меток в культурах химер в течение всего времени культивирования составляло 1x10'1 --5х104 в I мл, тогда как в культурах нормального костного мозга оно поддерживалось на уровне IxIO5 в I мл. Результаты .

А ' Б

Рис.4.7.1. Размер эктопических очагов кроветворения, продуцированных нормальным костным мозгом (А) или после культивирования (Б) у сингенных реципиентов

По оси абсцисс - группы доноров:

1 - нормальные мыши •

2 - стандартные химеры

3 - однопассажные химеры

4 - двухпассажные химеры '

5 - двойные химеры д

По оси ординат - клеточность очагов /х 10“°/ >

Светлые столбики - интактные реципиенты, штрихованные столбики - химеры. Цифры в скобках - число изученных очагов

изучения содержания стромальных предшественников в слое прилипающих клеток культуры представлены на рис. 3. При имплантации подслоя необдуманным реципиентам величина образованных очагов эктопического кроветворения была снижена у стандартных химер на 1/4 по сравнению с подслоем нормального костного мозга. Существенно большее (на 80 %) снижение наблюдалось у двойных химер. Промежуточное положенно занимали одно- и двухпассажные химеры, у которых размер очагов составлял около 40 % от очага, образованного подслоем нормального костного мозга. Следовательно, эти результаты соответствуют полученным in vivo а именно поражение стромы определялось не только дозой облучения, но и качеством пролиферирующих на ней кроветворных клеток. При имплантации слоя прилипающих клеток облученным реципиентам величина очага оказалась сниженной примерно одинаково для культур всех групп химер.

Сходство в поведении стромальных предшественников в культуре и при переносе из культуры в облученного реципиента, выражающееся в поддержании одинакового во всех группах кроветворения в первом случае и построении одинаковых по величине очагов эктопического кроветворения во втором, позволяет предполагать, что оно не случайно. Среди множества возможных объяснений наиболее простым представляется наличие специальной популяции стромальных предшественников ШЖМ, отвечающих на внешние воздействия (запрос со стороны облученного организма in vivo или созда- . ние подслоя на всей площади дна Матраса in vitro) наряду с КМПЕ, на запрос не отвечающими, в связи с чем число их соответствует степени поражения и различно у разных химер.

Полученные данные представляют собой первое экспериментальное доказательство того, что кооперативные воздействия строма- ■ лышх и кроветворных клеток, лежащие в основе локальной регуляции кроветворения, не носят односторонний характер в направлении от стромальных к кроветворным клеткам. В частности, пролиферация в костном мозге стволовых клеток со сниженным пролиферативным потенциалом приводит к дополнительному вторичному поражению стромальных предшественников радиационных химер.

Исходя из подученных данных можно прийти к залючению о том, что микроокружение у разных типов химер в организме и в культуре строится по-разному. У нормальных мышей и у однократных хи- . мер - главным образом за счет функционирования КПМЕ, а у двухпас-

сажных и двойных химер - в основном за счет ИПКМ.

. 6. Происхождение клеток кроветворной СТРОМЫ

.V химер

У радиоционных химер различного типа изучали происхождение стромальных клеток-предшественников, способных при имплантащга к переносу кроветворного микроокружения. Ни в одной системе, в том числе и после длительного культивирования костномозговых клеток, не удалось обнаружить стромальных предшественников донорского происхождения.

После летального облучения мышей предшественники кроветворной стромы снижаются до 1/5 исходного и медленно регенерируют до субнормального уровня в течение 6 мес. Число костномозговых клеток, использованных для восстановления мншей, не сказывается на темпе восстановления КМПЁ (табл. 5). Через 2-6 мес. после об- . лучения содержание стромальных предшественников в бедре мыши составляло 40-50 % от исходного, судя по клеточности образованных . ими очагов, в обеих группах мышей, восстановленных как минимальной дозой костномозговых клеток (2хЮ5), так и в десятки раз более высокой дозой. В этих условиях КМПЕ не способны к репопуляции, что.не обусловлено сохранением структурной организации кроветворной стромн и ее зрелых клеток, которые существенно болоо радиорезистентны, чем КМПЕ. •

Действительно, регенерация КМПЕ у облученных мышей в.бедрах, третированных сразу же после облучения и реконструкции, также не зависела от дозы введенного им костного мозга (табл. 6, опыт № 2).- После аблации костного мозга бедра летально облученных мышей, когда кроветворное микроокружение строится целиком заново из сохранившихся предшественников, введенные внутривенно КМПЕ не принимают участия в процессе регенерации стромальных предшественников. Те же результаты были получены и у аллогенных химер, у которых сохранение донорских клеток в момент исследования было подтверждено серологически (табл. 6, опыт № 3). У сублетально облученных мышей трансплантация, большой дозы костномозговых клеток . значимо не увеличила.содержание стромальных предшественников в третированном бедре через 1,5 мес, после облучения и кюре тали (табл. 6, опыт № I). У мышей обеих групп содержание КМПЕ было восстановлено до нормы независимо от того, вводили им или не вводи-

Таблица Б

Предшественники кроветворной стромы в костном мозге ведра у смертельно облученных мышеи, восстановленные большой и малой дозой сингенных кроветворны:: клеток

Шнсло введен-1 Время после!Очаги эктопического кроветворения,об - 1 I ны:: клеток I восстанов-! разованные имплантацией костного моз-!

1 1 ленив, ! га от восстановленных мышеи !

I 1 мес !образовано очагов/1клеточность 1масса !

1 1 ¡число имплантантов!очагов*10 Iкосточ!

1 ' 1 1 1 >КИ, МГ1

1 2*10® ! 2 ! 8/8 ! 4,0 ! 1 ,4 1

! 7,4*ю' 1 2 ! 8/8 ! 4,8 ! 1,4 1

1 2*10» 1 6 ! 8/8 1 Б,5 12,0 1

1 7,4*10* I 6 ! 8/8 I 5,4 12,1 !

. Таблица 6

Предшественники кроветворной стромы в кюретированных ведрах у сублетально и смертельно облученных мышей, инъецированных и не инъецированных костномозговыми клетками. Смертельно облученные мыши восстановлены большой и малой дозой костномозговых клеток.

1 N 1 Доза!Введено!Время!Очаги эктопического кроветворения,про- 1 1 опыта! об-! клеток!после 1дуцированные имплантацией бедренного 1 1 , ! лу-1KOCTHO-!кюре-1 цилиндра от кюретированных мышей ■ 1

1 1 че- !ГО моз- !тажа, (образовано 1 клеточность.!масса косточ-I

1 1 ния I га ‘ !мес 1очагов/имп-1 очагов,*10 1 КИ, МГ I

1 1 ! 1 . 1 плантантов! 1 I

1 1 I 6 I - , 1 1.6 1 14/14 ! 9,4 1 г .5 !

I .. ! 6 I 1*10' ! 1,6 1 12/12 1 15,0 1 2 .7 1

1 2 113 1 2*10% 1 3 1 10/10 1 9,1 I 1 ,0 !

* А ! 13 17,4*10 1 3 1 13/17 1 '5,7 I 1 .0 . I

1 3 113 1 2*10 I 1 2/2** 1 10,3 1 0 9 >

1 1 1 7 ! 3 1 2/2 1 0,8 ! 0 Б I

1 113 16,5*10 1 1 5/5** 1 3,7 1 1 ,0 1

1 I I 1 3 I 6/5 1 1,0 1 0 ,4 I

* В опыте использовали мышея CBF,, восстановленных костным мозгом мышей СВА, ,

** Имплантировали костный мозг голени.

ли кроветворные клетки. Возможно, летальное облучение так поражает кроветворные ткани, .что репопуляция на них КМПЕ не моиет происходить. Данный опыт с сублетальным облучением и последующим кюретажем свидетельствует против этой возможности, так как ре- . генерация КМПЕ оказалась одинаковой как у только облученных, ■ • так и у восстановленных инъекцией большой дозы костномозговых клеток мышей.

В костном мозге полных химер как через 6 мес., так и через к

I год после облучения и введения кроветворных клеток (3x10^ -5x10®) при дискриминантном анализе выявлено присутствие КМПЕ только реципиентского происховдения. Костный мозг химер, импланти-. рованный мышам линии донора (С57В1), всегда отторгался, и перенос кроветворного микроокружения удавался только на линию реципиента (СВР^).

При дискриминантном анализе происховдения стромальных предшественников слоя прилипающих клеток в длительных культурах кост- ■ ного мозга химер С57В1-в-СВ5-£ с длительностью химеризма I год. После имплантации СПК продуцируются эктопические очаги кро’ветво- • рения (4 из 4) только на линии реципиента (СЕЗ?^), но не на линии донора (0 из 4) и, следовательно, способные к переносу микроокружения стромальные предшественники подслоя тлели реципиентское происхождение. Эти данные свидетельствуют об отсутствии в костном мозге химер донорских КМПЕ, способных к функционированию

Дискриминантный анализ происхождения стромальных предшественников в очагах эктопического кроветворения был проведен как с нативными клетками, так и после образования игш СПК в длительных культурах. В очагах, образованных в результате имплантации костного мозга'мышей СВА'или С57В1 и СВРр в течение 5-8 мес. не про- . исходило замены стромальных предшественников донора на реципиен-тские. При имплантации кости из этих очагов происходило образование НОВЫХ кроветворных территорий у реципиентов И ЛИНИИ СВЗ?£ ' и линии донора имплантанта. СПК длительных культур кроветворных клеток из тех же очагов при имплантации аналогичным реципиентам также вызывали образование очагов эктопического кроветворения.

Эго доказывает, что КМПЕ донора не были заменены на реципиенте-кие, не способные к приживлению-у мышей родительских генотипов. . .

Полученные результаты говорят о том, что гемопоэтичесчоа

микроокружение не может быть перенесено при внутривенной инъекции и принимать участие в регенерации КМПЕ после облучения. Действительно, регенерация КИПЕ оказалась одинаковой у мышей, получивших минимальную защитную дозу (2x10^ клеток), и у мышей, которых восстанавливали в 360 раз большей дозой (табл. 5).

Представленные данные являются серьезным, хотя и не исчерпывающим доказательством независимого-происхождения стромальных и кроветворных клеток. Они демонстрируют также, что костномозговая строма нетрансплантабельна при внутривенном введении. Если эти результаты применимы и к ситуации у человека, они опровергают предположение, что успешная трансплантация костного мозга требует не только трансфузии стволовых кроветворных клеток, но и переливания и приживления стромальных предшественников.

Б. Стволовые кроветворные клетки в длительных культурах костного мозга

7. Пролиферативный потенциал стволовых кроветворных . клеток (КОЕс)

Метод длительного культивирования костного мозга, обеспечивающий поддержание пролиферации и дифференцировки СКК в течение многих недель, открыл новые возможности для изучении проблемы ,самоподдержания СКК в бЪлее простых модельных условиях. При этом исключаются маскирующие факторы целого организма, связанные 'в первую очередь с миграцией СКК, разнородностью их .по пролиферативному потенциалу, зависимостью от стромального микроокру- ’ жения разного качества. Было показано, что в длительных культурах костного мозга пролиферативный потенциал-СКК быстро снижается в течение первых 3 нед. культивирования, после чего он много недель оотаегся стабильным ( Маис11 р., еъ а1 ( 1980). Особенно быстро и глубоко снижается пролиферативный потенциал СКК, находящихся во вввеси, потерявших контакт с клеточным подслоем, обеспечивающим в культуре кроветворное микроокружение. Предполагалось, что снижение, пролиферативного потенциала обусловлено интенсивной пролиферацией всех СКК в течение первых 3 нед. культивирования, после чего продолжают делитьсй лишь' некоторые СКК, а основная их масса остается в покое, в связи с чем потенциал но-цуляции СКК в целом сохраняется постоянным.

Костномозговые клетки одних и тех же мышей эксплантировали

фрагментами либо в виде одноклеточной взвеси наносили на предварительно выращенный подслой кроветворной стромы (через 3 иод. после первоначальной эксплантации костного мозга). В последнем случае матрасы облучали перед второй посадкой в дозе 10 Гр для уничтожения в подслоо кроветворных клеток первой культуры. Стро-'' мальный подслой облучением в такой дозе не уничтожается. Следовательно, в этих опытах изучали пролиферативный потенциал одних и тех же СКК, но в одном случав они попадали на сформированный подслой, на построенное микроокружение, во втором же первое время они существовали в условиях только создающегося микроокружения. Принципиальных различий между культурами обнаружено не было (рис. 4). Пролиферативный потенциал СКК, культивированных в условиях предсозданного микроокружения, был не выше, чем у'клеток из обычных культур. Следовательно, эти результаты позволяют исключить предположение о связи снижения пролиферативного потенциала СКК с отсутствием адекватного микроокружения. Действитель- ■ но, в обеих типах культур в точение первых 2-3 нед. происходило заметное снижение числа дочерних колоний как в прикрепленных, так • и в находящихся, во взвеси СКК, в последнем случае более глубокое. Однако, в более поздние сроки не наблюдалось стабилизации пролиферативного потенциала СКК. На протяжении многих недель отмечались резкие колебания этого показателя, который иногда оказывался даже выше, чем у исходных костномозговых клеток. Такой результат может объясняться тем, что в культуре происходит постоянная смена клонов кроветворных клеток, которые используются последовательно и происходят из каких-то сохраняющихся в культуре клеток пре-КОЕс, отличающихся друг от друга степенью дифференциров-ки, т.е. по пролиферативному потенциалу.

Подтверждение наличия в культуре клеток пре-КОЕс было полу- • чено в опытах с клонированием клеток из культур в полужидких средах. Оказалось, что пролиферативный потенциал клеток, образующих смешанные колонии, состоящие из разных рядов дифференци-ровки, может быть существенно выше пролиферативного потенциала суммарной популяции клеток исходной культуры до их клонирований. Отсюда следует, что в культуре действительно содержатся клетки, не способные образовывать колоши в селезенке облученных мышей за 14 дней роста в ней, т.е. не являющиеся КОЕс. Однако в процессе образования клона в мотилцеллшозе такая клетка образует до-

- за -

Рис.0.2.1. Пролиферативный потенциал КОЕс из длительных культур костного мозга . ■

а - прикрепившиеся КОЕс • б - КСЕс из взвеси.

По оси абсшсс - длительность культивирования (нед)

По оси ординат - число дочерних КОЕс в II дневной селезеночной колонии .

Сплошная линия - стандартные культуры Штриховая - вторая посадка на выращенном подслое

черние КОЕс, обладающие но только способностью образовывать колонии в'селезенке, но и производить дочерино КОЕс в большом количестве. По определению такая клетка является пре-КОЕс, т.е. принадлежит к классу менее дифференцированных предшественников, . чем те (КОЕс), которые принято считать СКК. -

Таким образом, в результате исследования пролиферативного потенциала СКК в культуре можно прийти к заключению, что в культуре имеются пре-КОЕс клетки, обладающие более высоким пролифе- <■ ративным потенциалом и принадлежащие к классу менее дифференцированных предшественников, чем КОЕс. Возник вопрос о наличии иерархт в отделе ранних кроветворных предшественников. .

8. Иерархия ранних кроветворных предшественников

В работе была предпринята попытка определить число пре-КОЕс

в костном мозге нормальных мышей. В качестве пре-КОЕс рассматривали клетки, дававшие в селезенке за 22 сут. (с промежуточным пассажем через II сут.) колонии, содержание.дочерних КОЕс в которых было по меньшей мере в 2 раза большим, чем в среднем в данном опыте. Для определения числа пре-КОЕс использовали метод лимитирующего разведения. Принимая, что в костном мозге бодренной кости молодых шшей содержится ок. 5000 КОЕс, число пре-КОЕс

в костном мозге бедра составляет 222 + 17» т.'в. в 20-25 раз меньше числа КОЕс. ■ •

Пре-КОЕс содерташея я в других кроветворных тканях. Они обнаружены в печени 17-18 сут. эмбрионов, где относительное их содержание в 3-4 раза ниже, чем в костном мозге взрослых мышей. В гетеротопных очагах кроветворения пре-КОЕс содержится столько же, сколько и в костном мозге;

. Как КОЕс-8, так л КОЕс-И оказались высоко чувствительными. . к оксимочевине (ОМ): после обработки сохранялось меньше 1% обоих предшественников. Чувствительность пре-КОЕс к ОМ оказалась ■ ниже: выживало рк. 5 % этих клеток. ' '

С'целью выяснения вопроса, ответственны ли пре-КОЕс за длительной поддержание кроветворения или они сами образуются из более раших йредшественников, было изучено действие ОМ на клетки, .обеспечивающие поддержание кроветворения в длительных культурах костного мозга. '

Для уничтожения пролиферирующих кроветворных предшестенни-ков мышам-донорам вводили внутрибрюшшшо оксимочевину в дозе ЮООмг/кг, 6 раз о интервалом 6 ч. Мышей забивали через 2 ч. после поолодного введения. Затем предварительно облученные (10 Гр) культуры (5 матрасов в группе) были вторично засеяны:

A. Смооыо клеток костного мозга нормальных мышей .шиши СМ и обработанных ОМ мышей генотипа CBATQT6.no 0,6 эквивалента бэдра (ЭБ) каждого. Всего было внесено в культуру соответственно 2460 • и 42 КОЕс; Б. Смесью клеток костного мозга нормальных мышей генотипа СВЛТ6Т6 и обработанных СИЛ мышей лиши СВЛ, по 0,6 ЭБ каждого. Всего было внесено в культуру соответственно 3240 и 3 КОЕс;

B. Смесью клеток нормальных мышей линии СВА (0,6 ЭБ) и нормальных мышой генотипа СВАТ6Т6 (0,006 ЭБ). Всего было внесено в культуру соответственно 2460 и 42 КОЕс; Г. Смесью клеток нормальных мышей генотипа СВАТ6Т6 (0,6 ЭБ) и нормальных мышей линии СВА

(О, '006 ЭБ), Всего было внесено в культуру соответственно 3240 и

25 КОЕо. . ■

Изучали происхождение делящихся неприлипающих клеток в процессе культивирования смесей клеток нормальных и обработанных ОМ мышей разного кариотипа. В опытных группах А и Б первоначально, черев I нед, обнаруживались только метафазы нормальных мышей. Далее появлялась и постепенно нарастала доля метафаз мышей, обработанных ОМ, Через 6-7 нед. содержание их составляло в среднем ок. 30 % всех метафаз. Контрольные группы В и Г, в которых смешивали «летки костного мозга нормальных мышей, отличающихся карио-логически, в соотношении 100:1 показали хорошую воспроизводимость использованного метода. В обеих группах среднее содержание клеток, взятых в меньшем количестве, за весь срок культивирования значимо не отличалось от расчетного (I $). Если бы все клетки, поддерживающие длительное кроветворение в культуре, выжили пооле обработки СМ, доля их потомков должна была бы после стабилизации культуры составлять 50 %. Таким образом, результаты показывают, что. у обработанных ОМ мыиеП сохранялось по крайней мере 60 % предшественников. Таким образом, результаты конкрентноА репопуллцпи говорят о тоы, что не КОЕс клетка отвечает за длительное кроветворение в культуре. Вероятно, стабильный гемопоэз в культуре поддерглваотся популяцией более ранних предшественников (примитивными стволовкми кроветворная .клетками (П-СКК), не чувствительных к действию стадаоспецпфпческих цитостатсков.

Данные о существовании II—GKK и их низкой чувствительности к ОМ существенно обесценивают представление о бессмертности КОЕс, сделашюе на основании их способности к сохранению пролиферативного потенциала после десятков циклов интенсивной пролиферации, вызванных повторными введениями ОМ или триэтиленамина, так как -регенерация обеспечивается не КОЕс, а их более ранними предшественниками, чувствительность которых к циклоспецифическим агентам очень низка. • и

Обнаружение в культуре последовательно происходящей смены клонов кроветворных клеток косвенно свидетельствует об ограниченном времени функционирования отдельных П-СКК, хотя существующие методические трудности не позволяют решить вопрос об отсутствии самоподдержания у П—СКК однозначно. Наиболее простой, требующей наименьшего числа допущений, гипотезой в настоящее время является представление о том, что П-СКК образуются только в эмбриогенезе и в течение жизни расходуются последовательно, одна за одной, не пополняя своей популяции за счет самоподцержания, как это происходит, например, с яйцеклетками. • ’ -

9. Клональное кроветворение в культуре

В 'настоящем разделе будут представлены косвенные и прямые данные о клональном характере кроветворения в длительных культурах костного мозга мцшей. ' .

На облученный трехнедельный СПК сажали кроветворные клетки

4 кариотипов: СВА самцы и самки, СВАТ6Т6 самцы и самки. Всего сажали 2x10^ клеток на матрас, причем брали одинаковое количество клеток кадого вида. При одинаковом участии в кроветворении всех внесенных в культуру КОЕс следовало ожидать, что клетки любого генотипа будут представлены одинаково, в среднем по 25 % каждого. Однако результаты существенно отличались от такого ' предположения. Во всех 3 культурах представительство клеток разного происховдения быстро изменялось от недели к неделе. Так, через I нед. культивирования в одном матрасе делящиеся клетки, кариотипа СВА/ХУ отсутствовали, через 2 нед. их доля составляла

26 %, а еще.через I год. - 8 %. В другой культуре доля делящихся клеток кариотипа СВАТ6Т6/ХХ составляла с I-й по 4-ю нед. культивирования соответственно 63,29,10 и 37 %. Эти результаты не могут объясняться селективным преимуществом клеток того или иного кариотипа как потому, что способность их к репопуллщш в орга-

щзме одинакова гак и потому, что колебания клеточного состава культур не носили закономерного характера и клетки ни одного из кариотипов нэ вытесняли других в процессе культивирования. В среднем за 4 нед. культивирования представительство клеток любого ка-риотипа не имело тенденции к снижению или увеличению, а их сука,ирная доля за весь период культивирования значимо не отличалась от теоретической (25 %). Следовательно, в культуре происходит клональное кроветворение о последовательной сменой участвующих в нем ■ клонов. Этому соответствуют обнаруженные ранее и подтвержденные в настоящей работе резкие колебания пролиферативного потенциала КОЕс.

С целью обнаружения индивидуальных клонов кроветворных клеток, несущих радиационные маркеры, на облученный подслой прилипающих клеток в 3 матраса был посажен пулированный костный мозг от 15 мышей СВРр облученных в дозе 7,5 Гр (10 б.э./матрас). Аналогично в

3 матраоа был посажен костный мозг от 6 мышей СВ?р облученных в дозе 6 Гр (2 б.э./матрас). Среди делящихся неприлипающих клеток втих культур было обнаружено по 3 клона, несущих радиационные маркеры. Время появления, длительность и размер клонов представлены па рис. 5.

Клоны кроветворных клеток появлялись в разное время: через I,

2, 3, 4 и 5 над. после эксплантации. Длительность функционирования клонов составляла от I до 6 нед. Размер клонов, о котором судили по суммарному числу обнаруженных в течение всего времени культивировании метафаз, был также очень различен. Кинетика каждого клона характеризовалась довольно быстрым нарастанием и последующим снижением числа делящихся клеток клона. Ни в одном случае не.было • отмечено присутствия примерно одинакового числа маркеров метафаз в течение всего срока культивирования.

Во всех опытах отсутствовала корреляция между размером клонов, временем их появления и длительностью существования. С чем может быть связана такая гетерогенность в разиере и длительности существования клонов? Наиболее вероятным объяснением гетерогенности клонов кажется предположение, что в процессе развития клона число делений потомков исходной клоногенкой : клетки строго не фиксировано и регулируется либо стохастическими механизмами, либо детерминируется внешними факторами, например, интенсивностью запроса на продукцию зрелых клеток, доступностью адекватного микро-окру же: дя, активностью ростовых факторов ж др. Величина клона может зависеть и от общего числа ыонов, одновременно функционирую-

20-

15-

10-

10-

5 -

1 2 3 4 5 б ? 6 12 ]} 4 5 Із

НО _65 Л J59 ¿2 44 _0_ -£i- Jlfi -22. і» 24 13 4 0 8

3,6 '0,2 1,3 4,4 1,2 2,8 1,6 2,0 г,2 3,2 4,2 TT 2,0 0^ ТГГ

Рис.6.4.3.Кинетика в культуре клонов кроветворных клеток из костного мозга мышеи, облученных в дозах 7,5 Гр (з\

6 Гр (б -, 6,5 Гр (в-еї ' •

а,б - СВгт, в - BBFj, г - ВЮ, д - Ba!b/c, е - СЗН. 1-16 номера клонов; $0 - не определяли. По оси ординат: число маркерных метафаз индивидуальных клонов; по оси абсшсс: .

время культивирования (в нед.). Дроби под сроками культивирования: числитель - число изученных метафзз; знаменатель -число, клеток/матрас (хКо) ' .

5

-за-

тих в культуре.

Полученные данные представляют собой первое прямое доказательство клонального характера кроветворения в длительной культуре костного мозга мышей. Клоны появляются, увеличиваются в размере и исчезают последовательно; исчезнувшие клони не появляются повторно. Это хорошо соответствует .представлению о последовательной смене кроветворных клонов. .

10. Содетоканио примитивных СКК в длительных культурах костного мозга

Представленные данные говорят о том, что додательное поддержание кроветворения в культуре обесцвечивается, существенно более ранними, чем КОЕс предшественниками,~а именно, примитивными СКК (П-СКК). Заложенные в онтогенезе П-СКК не образуютсяае novo в поотнатальном периоде, не самоподцерживаются, а расходуются последовательно путем смены клонов кроветворных клеток. Необходимо определить содержание П-СКК, способных к длительному поддержанию кроветворения в культуре. ■

Мы пытались решить этот вопрос с помощью метода лимитирующих разведений. Б качестве П-СКК в работе рассматривали предшественники, ,спсобные в течение 5-7 нед. культивирования продуцировать КОЕс восьмидневные (КОЕс-8). Длительные культуры (не менее 20 на точку) засевали такими, лимитирующими количествами кроветворных клеток. Через 5-7 нед. по доле культур, в которых КОЕс—8 выявлены не были Сйустые" культуры), г.е. которые не содержали ни одной П-СКК, устанавливали их содержание в исходной взвеси кроветворных клеток. В настоящей работе представлены первые результаты по оценке содержания П-СКК.

Содержание П-СКК в костном мозге нормальных мышей было определено в пяти опытах, в двух из которых культуры были засеяны двумя дозами костномозговых клеток: 0,01 и 0,0033 бедренного эквивалента (.бэ.) на матрас. В остальных опытах для эксплантации использовали лишь одну дозу (0,01 б.э.). Была обнаружена высокодостоверная линейная зависимость мевду количеством экспланти-рованншс кроветворных меток и числом П-СКК, причем линия регрессии проходит через начало координат (у= 0,0671 при Х=0), что доказывает пригодность метода лимитирующих разведений для количе- . ственного определения ранних .кроветворных предшественников у мышей изученных генотипов содержание П-СКК составило 90+20 на бедро.

Примитивные СКК были обнаружены также в печени 16-17 сут. зародышей шшей в количество 1j2 на орган.

. Результаты изучения чувствительности П-СКК к действию щио-статиков (5-фторурацил и ОЫ) представлены в табл. 7. Оба цито- . статика сильно поражали отдел КОЕс-8, содержание которых в костном мозге составило ок. I % от исходного после окончания обработки 0!Л л менее I $ через 2 сут. после введения 5-фторурацила; через 4 сут. после его введения, когда начинается регенерация кро-,-В8творения, число КОЕс-8 повысилось в 5 раз по сравнению с содержанием через 2 сут. и составило 2,5 %. Количество П-СКК в костном мозге шшей изменено практически не было, и их число на бедро между различными группами значимо не отличалось.

В табл. 8'представлены данные о содержании П-СКК в костном мозге химер через 6 и 7,5 мес. после облучения и восстановления "большой" или "малой" дозами сингенннх костномозговых клеток. У таких химер клеточиость костного мозга, а также содержание в нем ■ КОЕс-8 оказались одинаковыми независимо от использованной для -восстановления гемопоэза дозы кроветворных клеток. Однако ' две ■ группы химер существенно отличались по содержанию клеток, и в обоих опытах было в 2-3 раза ниже у мышей, восстановленных "малой" клеточной дозой. ‘

Если гипотеза клональной сукцессии кроветворных клеток верна, то П-СКК не обладают способностью к регенерации и в течение жизни организма, следовательно, только расходуются. Поэтому'у химер, восстановлениях большим количеством кроветворных клеток, т.е. получивших больше П-СКК, следовало ожидать более высокое их содержание в костном мозге независимо от срока регенерации гемопоэза; если же П-СКК обладают способностью к самоподдержанига, что соответствует более распространенной точке зрения, независи- . мо от дозы введенных костномозговых клеток, содержание П-СКК у ■ химер в поздние сроки после облучения и восстановления гемопоэза должно быть одинаковым. Полученные данные не позволяют еде-' лать выбор между этими альтернативами. К моменту эксплантации в культуру клеточность костного мозга и содержание в нем КОЕс-8 было одинаковым у обеих групп химер, тогда как содержание П-СКК было существенно ниже у животных, восстановленных "малой" дозой кроветворных клеток. Это в целом соответствует первой модели; однако ■ содержание П-СКК у химер, восстановленных "большой" клеточ-

ной дозой било выше всего в 2-3 раза, что далеко от расчетных различий в два порядка. Трудно сказать, на связано ли это, например, с тем, что П-СКК могут проделать 4-5 делений без того, чтобы снижение их пролиферативного потенциала стало заметным при использованном методе определения их количества. Возможно, что существуют более сложные механизмы,-лежащие в основе наблюдаемого феномена. •

Таблица 7 П-СКК в костном мозге мышей, обработанных цитостатиками , при эксплантации в культуру 0,01 в.э. на матрас.

1 Цитостатик 1 1 ! Число КОЕсв/бедро после обработки цитостатиком Число П-СКК/бедро 1 1

1 - 1 7680 79 1

1 Оксимочевина 1 1

1(введение 6 раз 1 1с интервалом єч 1 79 1 65 1

1 5-фторурацил 1

1 введение за гсуті 28 53 1

■ 5-фторурацил ! 1 введение за 4сут! 191 1 48 1

Таблица в П-СКК в костном мозге химер через 6 и 7,Б мес.

после облучения и.восстановления донорскими клетками при ' эксплантации в культуру 0,01 в.в. на матрас.

1 Сроки после 1 облучения 1 Число КОЕсв/бедро в мо-Імент эксплантации в куль-1 туру Число П-СКК/бедро 1 1

1 1 6 мес 1 1 0,35 X 106 40 1

1 1 35 X О О) 94 1

1 1 Т,5 мес 1 1 0,35 х ю6 * 59 I

1 1 1 35 10 О X 165 " 1

'• а - •

Число КОЕс-8 у иарм.чль:ао: ¡ясй - 5~8х1С'Убодро. Учитывая, что фактор^(доля КОЕс, попазгис в селезенку при внутривенном введении) равен 0,05-0,1, общее -шсло КОЕс в бедре ппш состааплет 50-150 тысяч. Отсюда следуем, что кавдая П-СКК может продуциро- . вать клон, содержащий 500-1500 КОЕс-8, с учетом размеров 8-дневных колоний в селезенке (до 4x10® клеток/колонн»), 1-4x10^ дифференцированных кроветворных клеток. Очевидно, что клоны таких размеров могут легко обеспечивать в течение всей жизни мыши постоянное поддерживание кроветворения за счет последовательного расходования относительно небольшого числа заложенных в онтогенезе П-СКК. В организме взрослой мыши общая масса гемопоэтической ткани составляет около 4х108 клеток. Если принять, что практически полное замещение всех кроветворных клеток в костном мозге происходит всего за 4 сут. (что заведомо меньше реальных сроков), то одной П-СКК, при размере продуцируемого его клона в Ю9 клеток, будет достаточно для поддержания кроветворения по крайней мере в • течение 10 сут., а за всю жизнь мыши может быть израсходовано не более нескольких сотен П-СЖ. • ’ ■

• Другой важный результат, полученный в работе заключается в том, что П-СКК практически не чувствительны к цитостатикам, в том числе к такому строго щгиюспецпфичному, как Ш, которая действует только на клетки, находящиеся в фазе синтеза ДНК. В условиях, когда использованные цитостатики практически нацело уничтожали более зрелых предшественников (КОЕс-8), число П-СКК в костном мозге практически не снижалось. Следовательно, П-СКК находятся, видимо, в йо периоде клеточного цикла, в глубоком резерве не чувствительны к запросу и не переходят в состояние пролиферации даже при тяжелых гемопоэтических стрессах. Результат находится в полном соответствии с данными, полученными методом конкурен- . тной репопулящш. Это не только подтверждает пригодность метода лимитирующих разведений для количественного анализа отдела П-СКК, но’и не противоречит гипотезе о наличии во взрослом организме заложенной в эмбриогенезе популяции покоящихся кроветворных клеток-предшествеяников,.расходуемых в постнатальном периоде последовательно и образующих -сменяющие друг друга клоны гемопоэтических клеток. . . '

II. Способность к регенерации примитивных СКК

Изучение количества П-СКК у химер не позволяет однозначно считать, что они не обладают способностью к регенерации. В изу-

чанном слу ;ае П-СКК были поставлены в условие запросного кроветворения. Что но происходит в условиях радиационного воздействия на П-СКК? С настоящем разделе была использована модель регенерации кроветворной системы после сублеталъного облучения мышей.

Для сублеталъного облучения мышей-доноров костного мозга использовали дозы 2 и 4 Гр. Костный мозг для культивирования от таких мышей брали сразу или через 2-5 мес. после облучения. На облученный трехнеделышй СПК сажали смесь клеток костного мозга от- ■ личающихся по генотипу мышей, сублетально облученных непосредственно перед опытом и за 2-5 мес. до него. Клетки обоих генотипов не имели селективного преимущества при росте на облученном подслое прилипающих клеток любого происхождения (как СВР]-* так и ЦЦРр данные не приведены), что хорошо свидетельствует отсутствию феномена аллогенного ингибирования КОЕс в длительных культурах костного мозга мышей. Через 2-6 нед. культивирования в суспензии ноприлипающих клеток определяли число КОЕс кавдого генотипа, вводя внутривенно по 2-6 х105 клеток на мышь иммунным реципиентам СВР]- и ВДр£ (по б мышей кавдого генотипа).

Ранее было показано, что при второй посадке в культуру смеси костного мозга мышей двух разных кариотипов популяция делящихся неприлшщщих клеток на протяжении всего срока культивирования была предотавлена клетками обоих кариотипов в соотношении, строго соответствующем «сходному при эксплантации. На основании втого был сделан вывод, что в процессе культивирования поддерживается исходное соотношение и на уровне П-СКК, поскольку они не имеют селективного преимущества. Следовательно, этот метод поз- • воляет определять в используемых клеточных взвесях относительное содержание П-СКК по их потомкам. .

В настоящей работе для анализа относительного содержания П-СКК в культуру эксплантировали смесь клеток от несингешшх партнеров, происховдение П-СКК устанавливали не кариологически, т.е. на уровне миелоцитов, а по значительно более ранним предшественникам КОЕо. '

. В табл. 9 представлены результаты конкурентной репоцуляции . в культуре кроветворных клеток из костного мозга остро облученных мышей и мышей, регенерировавших после сублеталъного облучения. Как видно из табл., в костном мозге мышей после 'сублетальг ного облучения в дозе 2 1^)' через 10 нед. содержалось в 5-10 раз большо КОЕс, чем сразу после облучения. •

Таблица я

Конкурентная репопуляция а кугьтуре кроветворны:: клеток костного мозга остро облученных мыиеп и мыыеп с регенерировавшим поело суо летального облучения кроветворением

! НЫМИ ! ! Поза !облуче ! НИЯ, ! Гр Срок после облу- чения Эксплантиро! вано клеток! на матрас 1 СОО’ (регенерг исходное гноиение КОЕс 1 ЗЦНП:острое Облучение)! после культивирования 1

О.э. 1КОЕс ! через 2НЄЯ!через бнед!

ПОР ! г Юнел 1 1784! ! I

! і і - 0,5 И 1 4,9 0,4 I 1,8 !

СВР і 1 ч 1 3631 ! !

СВР ! 1 онея 1 2394!

! * 1 - 0,5 ! * ! 9,1 2,5 ! 0,5 1

ВОР ! 1 ч ! 262! ! !

ВОР ! 10НЄД ! 4297! ! !

! і ! - 1.0 ! * ! 60,5 2,1 1 1,7 !

СВР 1 1 ч ! 71!

СВР 1 - 10НЄД ! 42Б11 ! 1

1 + 1 1,0 !♦ ! 76, 1 0,8 ! 0,6 1

ВОР ! г 1 ч 1 55! 1 !

ВОР і - 1 Энея ! 2173! ! !

! * і 0,5 !» ! 24,7 . 0,5 - !

СВР ! г 1 ч ! 88! ! 1

СВР ! - 13НЄД ! 4200! ! !

! ^ і 0,5 1 * 1 70,0 0,2 1 - 1

ВОР ! 4 1 ч ! 60! ! !

СВР ! - 1 энед 0,5 ! 2100! ! !

1 + ! 1 + 1 63, 6 0,7 ! - 1

ВОР 1 4 - 0,006! 331

Несмотря на это, содержание П-СКК оказалось одинаковым: в течение 2-6 над. культивирования соотношение КОЕс в остро облученном костном мозге и в регенерировавшем значимо не отличалось от единицы. Еще более демонстративны результаты при использовании дозы 4 Гр. В этом случае в регенерировавшем костном мозге содержалось в 60-75 раз больше КОЕс, чем в остро облученном. Однако, содержание П-СКК и здесь оказалось одинаковым, т.е. регенерации П-СКК не происходило. Принципиально те же результаты были получены и при использовании костного мозга мышей через 19 нед. после облучения. Прямое сравнение содержания П-СКК в нормальном костном мозге и через 19 нед. после облучения показало, что их количество в регенерировавшем костном мозге составляет примерно 0,5 % от уровня П-СКК в бедре необлученной мыши.

В целом полученные результаты демонстрируют, что П-СКК не обладают способностью к регенерации. Этот факт не может быть объяснен, например, их замедленной по сравнению,с КОЕс регенерацией, так как даже через 19 нед., что составляет более 1/4 продолжительности жизни мыши, восстановления популяции П-СКК не наблюдалось. Таким образом, можно заключить, что СКК, по крайней мере те из них, которые ответственны за поддержание длительного кроветворения в культуре, не обладают способностью к самоподцержанш.

Однако исключить возможность того, что П-СКК могут проделать 4-5 делений без снижения пролиферативного потенциала, мы не можем. Таким образом, полученные результаты еще раз подтверждают гипотезу о клональной сукцессии кроветворных клеток, заложенные в эмбриогенезе СКК не способны к регенерации и расходуются прак- • тически без -восстановления в течение всей жизни.

• ВЫВОДЫ

1. В длительных культурах костного, мозга стромальные предшественники строят микроокружение, способное к долговременному поддержанию кроветворения. Происходит пролиферация и'дифференци-ровка стволовых кроветворных клеток. Пролиферативный потенциал КОЕо в,культуре сильно'варьирует в процесое культивирования.

2. Строыалыше предшественники в культуре при ретранспланта-

ции в организм способны переносить нормальное кроветворное микроокружение. • ' ' ■ '

3. Обнаружено, что в культуре существуют две категории стро-

мальных предшественников: стволовые клетки - кроветворное микроокружение переносящие единицы, и более зрелые - щщуцибелышв предшественники кроветворного микроокружения, из которых в основном строится слой прилипающих клеток. .

4. В основе локальной регуляции кроветворения лежат коопера-

тивные взаимодействия стромалышх и кроветворных клеток, носящие двусторонний характер. Сгромальныэ клетки влияют на гемопоэз, а от качества кроветворения зависит функционирование стромального ч микроокружения. .

5. При трансплантации клеток костного мозга облученным реци-

пиентам, у химеры строма имеет реципиентское происхождение, а . кроветворные клетки - донорское, Т.е. ІІЄ происходит переноса Г0-мопоэтического микроокружения внутривенным путем. .

6. Стромальные и кроветворные клетки-предшественники имеют гистогенетичэски независимое происхождение.

7. Кроветворение в длительной культуре костного мозга НОСИТ '

клональный характер. Происходит последовательная смена клонов ге-мопоэтических клеток. • - '

■ 8. Клональность гемопоэза обеспечивают примитивные стволовые кроветворные клетки, содержание которых составляет 90 + 20 на бедро мыши. Эти клетки не обладают способностью к регенерации.

9. Примитивные стволовые кроветворные клетки не чувствитель-

ны к действию стадиосйдафических цитостатиков и дифференцируются в пре-КОЕс клетки, способные продуцировать в культуре КОЕс с высоким пролиферативным потенциалом. •

10. Время созревания в культуре кроветворного клона от примитивной стволовой кроветворной клетки до зрелых гемопоэтических клеток составляет 5-7 недель, из которых более половины времени приходится на их дифференцировку до стадии пре-КОЕс.

■ . .СПИСОК • . _

■ 'опубликованных работ по теме диссертации .

I. Длительные культуры костного мозга как модель для изучения клеток-предшественников кроветворной стромы. - Гуревич O.A., Дризе Н.И., Удалов Г.А., Чертков И.Л. //Пробл. гематол. - 1982.-

- 7. - С. 7-12. . ^

■ 2. Значение клеточных контактов для дифференцировки клеток

предшественников кроветворной стромы в длительных культурах КОСТ-

ного мозга. - Гуревич О.Л., Дризе II. И., Чертков ИЛ. Билл, эксшр. биол. - 1982. - 8. - С. 97-100.

3. Влияние кроветворения на кло ткн-лродшо сtdqшшки сгроьш . костного мозга. - Гуревич О.А., Дризе II.И., Удалов Г.А., Чертков Л.И. //Бюлл. экопор. биол. - 1982. - 10. - С. 115-11?.

4. Hemopoietic atromal precursore in long-term culture of

marrow« 1 Precursor characteristics} kinetics in culture, end dependence on quality of donor hemopoietic cells in chimeras,-Chertkov J.L., Drize N.J., fluravitch O.A., Udalov G.A.// Exp.Hematol,-

i933.-rv.11.-3.-p.231-244.

o. Hemopoietic stromal precursors in long-term culture of bone marrow« 2 Significance of initial packing for creating a hemopoietic microenvironment and maintaining stromal precursors in the culture.- Chertkov J.L., Drize N.J., Gurevitch O.A. f/ Exp. Hema-

tol.- 1983.-7.11.-3.-?.243-250.

6. Hemopoietio microenvironment and hemopoietic etroma pre-

oureors.-Chertkov J.L., Drize N.J., Qurevitoh O.A. // Hecenfc advsn- j cee in Hematology, Immunology, and Blood Transfusion. Eds« S.K. Hollen ot all, Budapest:.-1983.-p.133-147.

7. О возможности использования стволовых кроветворных клеток в зависимости от их генерационного возраста. Гуревич О.А., Дризе Н.И., Чертков II.Л. //Бюлл. экспер. биол. - 1983. - 9. - С. 101—103.

8. Регенерация клеток-предшественников кроветворной стромы после облучения. -Гуревич О.А., Дризе Н.И., Чертков И.Л. //Радиобиология. - IS83. - Т. ХХШ. - Вып. 5. - С. 659-662. '

. 9. Возможность артефакта при определении пролиферации ство-

■ ловых кроветворных клеток методами самоубийства. - Дризе Н.И., ' Чертков И.Л. //Бюлл. экспер. биол. - 1983. - 12. - С. 81-83.

10. Способность к самоподдержанию стволовых кроветворных клеток (КОЕс) из длительных культур костного мозга. - Дризе Н.И., Чертков И.Л. //Гематол. и трансфузиол. -Д984. - 4. - С. 19-24.

11. Cell forming spleen colonies.at 7 or 11 days after injection have different proliferation rate a.-Chertkov J.L., Drize N.J^ Oeil Tissue Kinet.-1984.-17.-p.247-252.

12. Гибридная резистентность в длительной культуре костного козга и в образованных ею очагах эктопического кроветворения. -1^рвггч О.А., Чертков И.Л., Дризе Н.И. //Болл, экспер. • биол. и .

' мед. - 1984. - 4. - С. 466-468. % • '

; 13. Предпественники транзпторных селезеночных колоний в эмб-

риональной печени мыиой. - Ган О.И., Дризе Н.И., Тодрия Т.В., Чер-

тков И.Л. //Бюлл. экспер. &лол. и мод. - IS84. - 6. - С. 727-729.

14. Пролиферативный .потенциал стволовых кроветворных клеток

п их клональная экспансия. Гуревич О.А., Дризе Н.И., Удалов Г.А., Чертков И.Л. //Трансплантация костного мозга в клинике и экспе- . рименте. - М., 1984. - С. 92-93. • '

15. Пролиферация клбток-предшественников кроветворного микроокружения в длительных культурах костного мозга мышей. - Гуревич О.А., Дризе Н.И., Чертков И;Л. //Бюлл. экспер. биол. и мед. - ц

1984. - II. - С. 612-613. '

16. Смена кЛонов кроветворшх клеток в длительных культурах костного мозга. - Гуревич О.А., Дризе Н.И., Удалов Г.А., Чертков, И.Л. //Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1985. - 3. - С. 346-348.

17. Self-renewal capacity and clonal succesion of hemopoietic stem cells in long-term bone marrow culture.-Chertkov J.L*, Drize N.J.,Gurevitch O.A., Udalov G.A. // Cell Tissue Kinet.-

1985.- v.18.-5-p.483-491. .

18. Origin of hemopoiutic atromal progenitor cells ±n(chimeras.- Chertkov J.L., Drize H.J., Gurevitch 6,A,, Udalov G.A.-// '

Exp. Hematol.- 1985.-v.13.-11.-p.1217-1222.

19. Влияние дози вводимых кроветворных клеток на число дочерних селезеночных колониеобразующих клеток в селезеночных колони—

, ях. - Гуревич О.А., Дризе Н.И., Чертков И.Л. //Бюлл. экспер. биол, и мед. - 1986. - 10. - С. 349-350.

. 20. Происхождение клеток кроветворной стромы у химер, Чертков И.Л., Дризе Н.И..Гуревич О.А., Самойлова Р.С. //Гематол. и трансфузиол. - 1986. - 6. - С. 36-40.

21. Cells responsible for restoration of haemopoiesis in long-

term murine bone marrow culture.-Chertkov J.L., Drize N.J., Gure-vitch O.A.,Udalov G.A.//beuk.Hes.-l986.-V*10.-6.-pi659-663. ’

22. Клетки, подчеркивающие длительное кроветворение в куль-- •

туре, не обладают способностью к'регенерации после облучения. -Дерюгина Е.И., Дризе Н.И., Чертков И.Л. //Бюлл. экспер. биол. й мед. - 1987. - 7. - С. 96-99. ' ' • ’

23. Иерархия ранних кроветворных предшественников: пре-КОЕс

и родоначальная кроветворная клетка. - Гуревич О.А., Дризе Н.И., Удалов Г.А., Чертков И.Л. //Онтогенез. - 1987. - 18. - I. - С. 42-50. \ ^

• 24. Individual clones oi hemopoietic cells in murine long-

-term bone marrow cultures.-Chertkov J.L., Derjugina £.1., Drizo N.J., Udalov Ga.//Leukebia.-198?,-v.1.-6.- p; 491-496.

25.3411-X10 Radiosensitivity of hemopoietic stroma precursors and mature stronal cells;— Brize N.I.j Ohertkov J.L., Gurevitch. 0« k. //Toxicology abstracts.-1907.-V.10.-5.- p.94.

26. Радиочувствительность стропальных предшественшков И зре-

лых клеток кроветворной стромы в культуре. - Дризе Н.И., Чертков И.Л. , Гуревич О.Л. //Радиобиология. - 1986. - 26. - 3. - С.345-350. ■

27. Заложенные в онтогенезе стволовые кроветворные клетки ' расходуются последовательно, продуцируя клоны дифференцированных кроветворных клеток. - Дерюгина Б.И., Дризе Н.И., Удалов Г.А., Чертков, И. Л. //Онтогенез. - 1987. - 18. - 6. - С. 587-597.

28. Пролиферативный потенциал стволовых кроветворных клеток

( КОЕс), серийно пассируемых в облученных мышах в составе очагов эктопического кроветворения, - Дерюгина Е.И., Дризе Н.И., Удалов Г.А., Чертков И.Л. //Бюлл. экоперт. биол. и мед. - 1988. - 12. -0. 718-720. ' . '

29. Определение примитивных стволовых кроветворных клеток у

мышей методом лимитирующих разведений. - Дерюгина Е.И., Дризе Н.И., Садовникова Е.Ю., Чертков И.Л. //Гематол. и трансфузиол. - 1989. -

10. - С. 29-33. . .