Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клоногенные стромальные клетки - предшественники кроветворной и лимфоидной ткани

-.........#

^ российская академия медицинских щук % i (лш'0-йсслгл§мте/]йский ордена грузового красного знамени

\ сда&итут эгадашопогии и микробиологии

я ^имени почетного академика н.ф.гамалеи

--:-------

На правах рукописи

ллциник наталия владимировна

клоноплшые стромальнь'5 клетки - предшественники кроветворной и лиьтоидной ткани

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой стспсни локгора биологических наук

Москва - 1994 г.

Работа выполнена о Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика К.Ф. Гамалеи РАМН

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук.

профессор А. Я. Фриденитейн

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.A. Михайлова

доктор медицинских наук, академик РАЫН, профессор Б. Б. Мороз

доктор медицинских наук И. Г. Сидорович

Ведущая организация: Центральный институт травматологии и ортопедии иц. Н.Н.Приорова НЗ РФ

... Защита состоится ■ I_ 199 1/г.

в часов на заседании Специализированного совета Д.001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЗМ им. Н.Ф. Гаыалои РАМН

Автореферат разослан " 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е. И. Коптелааа

1. общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Регуляция размножения и дифференци-ровки кроветворных л лимфеидных клеток связана с функционированием стромального микроокрукения (Wolf N.S.. Trentin 1.1.. 1968-1970; Bernstein S. E.. 1970). Микроокруш-ме определяет, какие кроветворные и лимфоидные клетки репопулируют. данный орган, пролиферируют и созревают в определенных его микроструктурах. Выбор пути, по которому дифференцируются стволовые клетки под влиянием микроокружения, мояет носить как индуктивный характер, так и разрешительный, обеспечивающий реализацию случайно (п8 внутреннему программированию) кошиткровашых предшественников в органах гемопоэза и иммунитета. В обоих случаях в сеть ци-токиновых взаимодействий в качестве продуцентов и мишеней вовлечены клетки самых различных категорий- элементы всех ростков кроветворения и лимфопоэза, а также все типы стромальных элементов.

Главным достикением последнего десятилетия является развитие культуральной техники, позволившей выращивать вне организма отдельные компоненты стромы, изучать их способность к поддержанию гемопоэза и лимфопоэза, а также идентифицировать и клонировать гены стромальных клеток, ответственные за продукцию ростовых и дифференцировочных факторов. Однако, роль стромы ке сводится только к поддержании дифференцирован кроветворных и иммунокоше-тентных клеток. В кроветворной и лимфоидной ткани была открыта новая категория клеток (А. Я. Фриденштейн, Р. К. Чайлахян, 1970), которая ответственна за формирование специфического микроокружения. При трансплантации таких клеток образуются новые кроветворные и лимфоидные органы. Клетки, обеспечивающие перенос микроок-рунения, способны формировать в монослойных культурах строыальные колонии (Р.К. Чайлахян, 1969). Для исследования механизмов, посредством которых клетки этой категории выполняют свою роль в установлении и поддержании микроокружения, необходимо было определить их клеточный тип и. соответственно, их гистогенетические взаимоотношения со стволовыми кроветворными клетками и их потомками в органах гемопоэза и иммунитета. Способность этих клеток формировать в культурах колонии стромальных элементов свидетельствует об их пролиферативном потенциале. Однако, для выявления . этих клеток методом колониеобразования. их количественного учета.

- г -

изучения их поведения с организме под влиянием различных факторов, выводящих кроветворную и лимфоидную ткань из состояния равновесия (в том число, при индукции иммунного ответа), необходимо иметь модель, позволяющую дискриминировать реакцию на эти факторы самих колониеобразущих клеток и сопутствующих им элеметсв (кроветворных или лимфоидных). Разработка такой подели, в свою очередь, требовала да::::ых о пролиферативном статусе колониеобразую-щих клеток 1п сИи к в культурах, о впиянии на их пролиферации,^о состояниэ клеток, естественно присутствующих в органах гемо- и лиифопоэаа. об адгезивности и других свойствах их мембран. Модель для изучения колониеобразущих строгальных клеток, основанная на их способности давать потомство в культурах в виде колоний, и первую очередь должна была располагать доказательствшш клональ-ного происхождения этих колоний. Получение такой модели и основных характеристик стромальных клеток должно было обеспечить возможность изучения роли этих клеток в процессах формирования и поддержания функционирующего микроокружения.

Цель» настоящего исследования являлись определение клеточного типа и характеристика стромальных колониеобразущих клеток, ответственных за формирование специфического микроокружения б органах гемопоэза и иммуни: ота, что позволило бм разработать юдоль для изучения стромальных клеток этой категории.

Основное задачи исследования:

1. Определить по специфическим синтезам и клеточным маркерам. к какому клеточному типу принадлежат клетки стромальных колоний. ответственные за создание микроокружения в органах геыо-позза и иммунитета.

2. Используя стабильные маркеры в сингенных смешанных популяциях ¡слеток, исследовать, имеют ли колонии стромальных клеток клональную природу, что необходимо для определения численности клоногенных стромальных клеток - предшественников по числу стромальных колоний.

3. Разработать модель для изучения свойств и количественного учета предшественников стромальных колоний на основании данных о клональной природе колоний и о различиях.некоторых структур клеточной мембраны колониеобразущих клеток кроветворной и лимфоид-ной ткани.

4. Определить содержание и маркеры колониеобразущих стро-мп^шх предаественников. ответственных за создание ыикроокруае-

ния в первичных и вторичных лимфоидных органах.

5. Исследовать гомогенность популяции стромальных колониеобразущих клеток по прочности связи с ткансвьш структурами, поскольку одной из функций стромы является создание механического каркаса органов гемопоэза и ишуни. эта.

6. Исследовать возможность самосборки кроветворного мнкроок-рузкения из дезагрегированных стромальных элементов для проведения анализа структуры популяции колониеобраэуюрх стромальных ыеток г" их способности организовать микроокружение при трансп' антации отдельных клеточных популяций.

7. Проанализировать способность колониеобразущих стромальных предшественников к г"популяции, что имеет важнейшее значение для создания и поддержания специфического микроокружения в органах гемопоэза и иммунитета.

8. Для анализа репаративных процессов в никроокрукении и его способности к самообновлению после повреждения определить радиочувствительность и исследовать пс ^традиационнке изменения численности колониеобразущих стромальных предшественников.

Научная новизна исследования.

В работе представлены основные характеристики новой категории клоток - предшественников кроветворной и лимфоидной ткани, образующих в культурах колонии стромальных элементов, которые обладают свойствами стволовых стромальных клеток и при трансплантации организуют специфическое микроокруяение.

Установлен клеточный тип колониеобразующих стромальных элементов в ыонослойных культурах клеток органов гемопоэза и иммунитета. На основании специфических синтезов, антигенных и цитохимических маркеров, поверхностных рецепторов и физиологических характеристик показано, что колониеобразующие клетки являются фиб-робластами, т. е. относятся к механоцитам, создающим каркас органа, включая его клеточные и межклеточный компоненты.

Впервые показано, что колониеобразующие стромальные клетки относятся к высокоадгезивным элементам. Это свойство позволило отделить категории стромальных клеток от большинства других предшественников, присутствующих в крозетворной и лимфоидной ткани.

Впервые установлено, что предшественниками стромальных колоний являются одиночные фибробласты, содержащиеся во взвесях кроветворных и лимфоидных клеток. В сингенных системах показано, что стромальные колонии являются клонами, а предшественники колоний -

кпоногенными клетками.

Впервые установлено. ,]то клоногенные строкальные предшественники в организме находятся вне пролиферативного ьула.

Разработана ыодель, позволяющая дискриминировать факторы, влияющие непосредственно на пролиферацию стромапьных предиествен-ников, и факторы, воздействующие на них через кроветворные и лим-фоидные элементы.

Впервые показано, что строгальные предшественники формируют фибробласгные колонии в культурах только при наличии колониести-мулирующей активности, продуцируемой элементами мегакариоцитарнэ-го ростка, или активности, имеющей аутокринкый характер. Впервые установлено, что колониестшулирущая активнее гь. продуцируемая мегакариоцитарными элементами и тромбоцитами, не идентична тром-боцитарному фактору роста (РОЕТ) и выводит стромальные предшественники в пролиферацию только при наличии других сывороточных факторов роста.

Предложен метод для определения линейной принадлежности предиественников стромальных колоний в химерных по гаппотипу клеточных популяциях с помощью иммунных цитотоксических лимфоцитов. Установлено, что клоногенные стромальные предшественники во взрослом организме гистогенетически независимы от стволовых кроветворных клеток. Клоногенные стромальные фибробласты относятся к местным элементы и не приживляются в кроветворной ткани при внутривенном введении костного мозга.

Впервые выявлена с подощью энзиматической обработки популяция стромальных предиественников, прочно связашх с тканевыми структурами костного мозга.

Пре^-охен метод, с помощью которого впервые получен перенос кроветворного микроокружения при трансплантации взвеси одиночных клеток костного мозга. Разработанный метод существенно расширил возможности исследования роли отдельных клеточк с популяций в морфогенезе и функционировании микроокрукения

Исследованы радиочувствительность закономерности пострадиационной кинетики клоногенных костномозговых фибробластов. Впер > вые выявлен резкий абортивный подъем численности клоногенных стромапьных предшественников через 6-8 часов после облучения в сублетрчьных дозах; причиной подъема не может быть только пролиферация перегиваамх клоногенных клеток. Строма," лишенная клоногенных предшественников в результате облучения в дозах более 15

Су. не способна к обновлению и длительному поддержанию гемопиэза.

На основе представлении): данных разработаны методы для идентификации. исследования и отделения стромальных к"с,ногенных клеток от других элементов органов гемо- и лимфопоэза.

Научно-практическая ценность ^¿следования: На основании результатов настоящей работы создано представление о новой "атего-рии предшественников - колониеобразуюцих стромальных элементах, ответственных за организацию специфического микроокруаения ь ор-г.лах гемопоэза и иммунитета. Изученный комплекс характери гик позволил выявить маркеры для идентификации и разработать методы выделения этих клеток, а такзе сделал возможным исследование свойств и потенций индивиду^лных стромальных предшественников. Представленная система доказательств клональной природы стромальных колоний позволила определять содержание клеток - предшественников в исследуемых популяциях по числу вырастающих в культурах колоний фибробластов, а также изучать дифференцировочные потенции предшественников индивидуальных колони*,. Разработанная модель явилась основой для нового направления в исследованиях стромзльног-о микроокружения - влияния фактороз экзо- и эндогенного происхоздения непосредственно на стромальнью клетки-предшественники и опосредованно через кроветворные и лимфоидные элементы и на взаимное регулирующее воздействие этих двух компартментсв в процессах гемопоэза и формирования иммунного ответа. Метод выявления этой категории предшественников нашел применение в клинике при патологиях кроветворной и лиыфоидной систем, а такке костной ткани. В настоящее время невозможно выяснение этиологии некоторых патологических состояний, в частности, различных форм ишунодефицитов, аплазий и миелопролифоративных заболеваний без определния в них роли стромы и ¿тег ;ни ее поражения. Поэтому разработанная модель для для изучения клопогонных стромальных предшественников имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как позволяет различать ттогрнныо факторы, влияющие непосредственно на стромальные предшественники, либо через естественно сопутствующие им клетки. На основании полученных "шных перед клинической иммунологией и гематологией поставлена задача по создании аналогич-' ной модели для исследования клоногенных стромальных лредаествен-ников в органах гемопоэза и иммунитета человека, что необходима для изыскания путей налравленного воздействия на процессы,протекающие в них. Стромальные предиественники служат источником для са-

«□обновления и регенерации ыикроокруяения, поэтому изучение динамики их численности после т воздействий, как радио- и химиотерапия. может служить тестом для оценки возможности восстановления гемо- и лимфошэза.

Результаты работы широко используются как в экспериментальных исследованиях, так и в практической здравоохранении (в Гематологическом научной центре РАМН. Центральном институте травматологии и ортопедии ш. Приорова РАМН, Институте медицинской радиологии МЗ РФ, Киевском институте ортопедии МЗ РУ. а также в лабораториях и клиниках ряда зарубежных стран - США, Великобритании, Нидерландов. Израиля и др.). Материалы диссертации включены в отечественные и зарубежные монографии ("Руководство по гематологии" под ред. А.И. Воробьева, М., 19В7 г.; "Гистология" А. Хам. Д.Кормак, U.. "Мир",1983 г.; "Индукция костной ткани и остеоген-ные каетки - предшественники", Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С.. М.. "Медицина", 1973 г.; "Клеточные основы кроветворения", И. Л. Чертков. А. Я. Фриденштейн, М.. "Медицина", 1977 г.; "Клеточные основы кроветворного микроокрунения", Фриденштейн А.Я,, Лурия Е.А.. М., "Медицина.". 1980 г.). а также в курс лекций по иммуно-морфологии в МГУ им. М. В. "смоносова.

Апробация диссертации . Диссертация апробирована на конференции отдела иммунологии НИИЭМ ш Н.Ф. Гамалеи РАМН 27 мая 1993 г. Основные по эжения диссертационной работы били представлены и обсуздеш на международных и всесоюзных съездах, конференциях и симпозиумах, заседаниях научных обществ, перечень которых приводен в конце автореферата.

Публикации- Основные положения диссертации опубликованы в 54 научных ; ^ботах.

Структура и объем диссертации. Работа написана по традиционному плану и включает следующие разделы: "Введение". "Обзор литературы" (3 главы). "Материалы и метода исследовг ш". "Собственные исследования и их обсуждение" (8 глав). "Заключение"." "Выводы" и "Список литературы" (546 источнк эв). Работа иллюстрирован рисунками и таблицами. Общий объем диссертации 340 страниц.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

I ;вотные. В работе использованы . мьши линий: СВА, C57BL/6, СВАТ6Т6, гибриды (СВА х C57BL/6)Fi, аутбредные морские свинки, кролики порода "аиниилла".

Материал для эксплантации. Костный мозг из трубчатых кс„тей, селезенку, тимус, лимфатические узлы, перитонеальный транссудат и экссудат получали от животных, умерщвленных эфиром.

Костный ыозг, выделенный из костей, и лимцюидные органы, освобожденные от капсулы, измельчал на 0,5-1 ымэфрагменты. Взвесь клеток готовили механической или энзиматической (трипсин.к^ллаге-наза) дезагрегацией.Клеточные взвеси отмывали, ресуспензировали в свежей среде, фильтровали через 4-слойный капроновый филь;^ н с п мощь» камеры Горяева подсчитывали количество живых клгток.Все этапы приготовления взвесей проходили при температуре тающего льда в силиконизированной посуде.

Приготовление взвес ,'й фидерных клеток . В качестве фидера использовали взвеси: клеток костного мозга, селезенки, тимуса и лимфоузлов, приготовленью механическим способом; лейкоцитов периферической крови, выделенных с помощью келатины; а также тромбоцитов. Взвеси облучали в дозе 40-100 Gy( Со).

Культуральные среды. Для клонирования стромапьных предшественников использовати а-МЕМ,НАМ F-12.RPMI-164.0 или FxJier's oedium + 20 % эмбриональной коровьей сыворотки + антибиотики (100 ед/ыл пенициллина +50 ед/мл стрептомицина).

Определение эффективности колониеобразования (ЗКОф). ЭКОф определяли в культурах, ■ выращенных в большинстве экспериментов в пластиковых матрасах с площадью дна 25 си в 5 tin среды. Для этого использовали культуры полных популяций клеток или культуры адгезивных клеток (в последнем случае через 0,5-2 часа после эксплантации из культур удаляли неприкрепившиеся клетки) с добавлением облученного фидера при постоянном рН 7,0-7,2.Через 10-12 дней культуры фиксировали этанолом, окрашивали азур-эозином по Романовскому Гш?-\ и подсчитывали число дискретных колоний, содеряа-щих более 50 фибробластов.

Облучение зивотных. Морских свинок подвергали общему (»Со) или местному (РУУ-3. фильтры А1 и- Си) облучению в дозах 4 или 20 Gy. Сразу или спустя 1-72 часа после общего облучения для определения ЗКОф эксплантировали костный мозг бедренных костей с добавлением фидера.Костный ыозг из болыаеберцовой кости левой задней' конечности, подвергнутой местному облучению дистально от середины бедра, эксплантировали сразу, через 1 и б час. .1-120 суток с добавлением фидера.

Облучение клеточных взвесей и культу?.. Взвеси клеток костно-

го мозга и фибробластов 2-3-го пассажей, либо 2-час.культуры в матрасах с прикрепившимися ''пгтками облучали в дозах 0.5-12 ву (Со).ЭКОф определяли в присутствии фидера. Подсчитывали долю выживания КОКф.

Радиорезистентность КОКф определяли на основании дозной кривой. описываемой уравнением: ]£ 5=В/Юо е + п. где Й-доля выживания; п-экспоненциальное число; Бо-доза облучения, при которой выживает 37% клеток.

Получение радиохимер. Мышей СВА и (СБА х С57ВЬ/6Ш облучали в дозе 9Су( • Со) или 9-13 йу (137Сб) , через 24 часа вводили в/в по 5х10ьипи 4-6x10 Ъингснных или са.шстгсиных костномозговых клеток. Через 1-67 дней трипсинизированный или дезагре*ированный костный мозг бедренных ксстей химер эксплангировали в культуры.

Гетеротопные трансплантаты костного мозга. Длнорами и реципиентами служили мыши-самцы. а)Трансплантация фрагментов. Костный мозг, извлеченный в виде цилиндров из диафизов бедренных костей, помещали целиком под почечную капсулу сингенных или семисингенных реципиентов. В культуры эксплантировали кроветворную ткань из костномозгового органа, образующегося на месте трансплантата, б)Трансплантация взвеси костномозговых клеток. Механически дезагрегированный костный мозг фильтровали и осаждали на миллипоровые фильтры НА. ЙА или АиГЙ площадью 20-25 . Фильтр складывали внутрь - клетка) ч и трансплантировали под почечную капсулу реципиентов. Трансплантаты подвергали гистологическому исследованию.

Определение степени химеризма кров створной ткани. Линейную принадлежность кроветворных клеток определяли в комплемент-зависимой цитотоксической реакции клеток костного мозга семисингенных радиациог ых химер и семисингенных гетеротопных трансплантатов костного мозга, где донорами и реципиентами были мыши линии СВА. либо гибриды (СВА х С57ВЬ/6)Р1. Циготоксическую реакцию ставили с СВА-анти- С57ВЬ/6 сывороткой, любезно предоставленной рук.лаб. И.Ю.Черняховской и ст.н.с. Е.В.Нагурской. Линейную принадлежность стромальных КОКф определяли с помощью иммунных цитотоксическлх лимфоцитов. ' .->

получение цититоксических анти-С57В1/6 лимфоцитов. Цито-гоксические лимфоциты получали либо в 5-дневной однонаправленной смешан' ой культуре спленоцитов мышей СВА и С57ВЬ/6 . либо из перитонеапьного экссудата мьшей СВА, иммунизированных в/бр клетками ЕЬ-4.

Определение рецепторов к IrG. IgM и СЗ компоненту комплимента. Наличие рецепторов изучали на первичных и пассажных культурах стромальных фибробластов методом розеткообразоваки« с эритроцитами барана, сенсибилизированными IgG, Iríí или IrM с комплементом.

Выявление коллагсн-синтезирую^их клеток. Клетки, синтезирующие коллаген I типа, выявляли в культурах костного мозга "ышей с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ), используя антитела, выделенные из гетерологичной антисыворотки против ¡„олла-г на I типа человека.

Выявление I.a-АГ несущих клеток. Наличие Ia-t- клеток в составе колоний стромальных фибробластов определяли с помощь» непрямой РИФ, где источником АТ i. Ia-АГ была культуральная среда от гибри-домы. любезно предоставленная проф. Б. Д. Бромдзом.

Выявление клеток, синтезирующих VIII фактор. С помощью непрямой РИФ в составе стромальных колоний, вырастающих в культурах костного мозга человека, определяли присутствие клеток, содерка-щих VIII фактор, используя АТ к АГ VIII фактора сыворотки крови человека.

Цитохимические исследования, а)Реакция на а-нафтилацетатэс-теразу ставили на первичных культурах костного мозга, фиксированных в парах формалина при 4 С, по модифицированному методу Пирса и Лефлера. б)Реакцию на щелочную фосфатазу ставили на первичных культурах костного мозга и на тотальных препаратах трансплантатов взвеси костномозговых клеток, фиксированных этанолом при 4 С. по методу Гомори. в)ШИК-реакцию по Пирсу ставили на гистологических срезах трансплантатов взвеси костномозговых клеток.

Кариологический анализ колоний мышиных костномозговых стромальных фибробластов. В лейтоновские пробирки с покровными стеклами экс лан'Провали по 0,3-5x10 ^ мышиных костномозговых клеток, предварительно обработанных карагенаном. Через 16 час. культуры прошвали, добавляли фидер. Через 8 дней культуры обрабатывали карагенаном. сиг-фонизиоовали "холодным" тимидином и после смены среды на 4 часа вводили колцемид. Культуры обрабатывали PBS, разведенным водой (1:3), фиксировали четанол-уксусной кислотой и докрашивали по Гимза.

Радиоавтографические исследования. В качестве предпественни-ка ДНК использовали отечественный Н-тимидин уд. активности 4.3 К/мМ. Реким введения Н-тшидина животным и в культуры представлен в соответствующих разделах.Для предотвращения реутилизации Фраг-

ментов меченой ДНК в культуральную среду добавляли"холодный"(немеченый) тимидин.

Определение величины пролиферативного пула. Выичину пролиферативного пула стромальных фибробластов в составе колоний определяли на радиоавтографах по кривым насыщения культур 3Н-тимиди-ном, отражающим зависимость доли меченых клеток от времени инкубации с эН-тимидином. Уровень плато на кривой соответствует величине пролиферативного пула. Время генерации стромальных фибробластов и продолжительность S-периода определяли из кривых насыщения по формулам для экспоненциально растущей популяции клеток.

Метод "тимидинового самоубийства". Взвесь клеток костного мозга экспонировали с 3Н-тимидином (16-25 iv/мЮ. Контрольную взвесь обрабатывали смесью 3Н- и "холодного" тимидина. Экспланти-ровали с добавлением фидера и "холодного" тимидина. В 10-дневных культурах определяли долю переживания КОКф.

Статистическая обработка результатов. Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стыэдента. Разница считалась достоверной, если уровень значимости не превышал 5% (р<0,05).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ИХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Определение клеточного типа элементов, образующих стро-мальные колони;-.

Решающее значение адгезивных клеток органов гемопоэза и иммунитета в создании микроокрукения для осуществления кроветворения и лимфопоэза вытекает из множества исследований. Однако, природа клеток, ответственных за эту функцию стромального компонента, длите ъное время оставалась дискуссионной.

При постановке вопроса о клеточном типе стромальных элементов, участвующих в создании ыикроокругения в органах кроветворения и иммунитета, следует разграничивать роли к хдого из компонентов. Как было показано, в кроветворной и -шфоидной ткани содержится категория клеток, образующих ; кидких культурах колонии стромальных клеток, которые in vitro имеют морфологические приз > наки фибробластов. Трансплантация только клеток стромальных колоний обеспечивает перенос специфического микроокрукения.Однако у разных тавотных отмечена вариабельность стромальных колоний по размеру, плотности упаковки в них клеток и даке по выраженности тех или других морфологических признаков фибробластов: степени

- И -

распластанности и отросчатости цитоплазмы, выраженности фибриллярных структур в ней и других свойств. Имея в виду такое разнообразие структуры стромальных колоний, а также способность самых разнообразных клеток при адгезии на культуральной поверхности в той или иной степени распластыватьсл и образовывать' цитоплазматп-ческио выросты, для классификации стромальных клеток в культурах следует пользоваться критериями но только морфологических, но и более стабильных клеточных признаков.

3.1.1. Изучение синтеза интерстициального коллагена г стромальных колониях костного мозга.

Мы изучали синтез интерстициального коллагена I типа в 9- и 14-дневных культурах кле.ок костного мозга мьшей СВА. дезагрегированного механически или с помощью трипсина. Через 2 часа после эксплантации мышиных клеток в лейтоновские пробирки с покровными стеклами (по 3-10 х 10^ клеток) добавляли облученный костномозговой фидер морской свинки ( Z х 10 ^клеток). Коллаген выявляли в культурах костномозговых клеток Ковшей. которые первые 9 дней вели на среде с 20% . а следующие 5 дней - с 5% а- орот-ки.Фибробласты стромальных колоний связывали в РИФ антиколлагено-вые антитела. В 9-днезных культурах отмечалось свечение в отдельных фибробластах в виде зерен разной величины в цитоплазме, а в 13-дневных культурах - интенсивное свечение всех фибробластов колоний. Нссвстяцисся клетки в колониях и между ними имели морфологию и другие характеристики макрофагов.

Таким образом. КОКф формируют в культурах колонии адгезивных клеток, принадлежность которых к фибробластам подтверждается синтезом интерстициального коллагена.Интерстициальный коллаген I типа синтезировали клетки всех просмотренных колоний ( >50 ) вне зависимо ти с- структуры колонии и способа дезагрегации ксстного мозга (механического или с помощью трипсина).

Представленные здесь данные по синтезу интерстициального коллагена клети?»"! стромальных колоний совпадают с аналогичными результатами, полученными на клетках стромальных колоний в культурах костного мозга человека, где найден синтез коллагенов I и III типа и отсутствовал коллаген II типа. Антисыворотка против коллагена I типа давала окрашивание цитоплазмы, но более интенсивным было окрашивание перицеллюлярного района, т.е. внеклеточного матрикса. Антисыворотка против коллагена III типа окрашивала и внутри- и внеклеточный материал. Множество линий трансформиро-

ванных стромальных клеток с разной способностью к поддержанию кроветворения получено из гостного мозга мьешей. Во многих случаях такие трансформированные линии синтезируют и ин.срстициальные коллагены (как фибробласты) и мембранный коллаген с ламинином(как эндотелиальные клетки),причем способны накапливать эти белки вне-клеточно в виде MaTpKKcaíCastro-Malasplna. 1980;Ziporl at al.1985).

3.1.2. Выявление синтеза антигена VIII фактора в стромальных колониях. В адгезивном слое длительно кроветворящих культур костного мозга имеются клетки, которые активно синтезируют основной мембранный коллаген IV типа и ламинин. а таюке продуцируют один из компонентов антигемолитического фактора - антиген VIII фактора. По этим признакам клетки были идентифицированы как эндотелиальные. Именно с присутствием этих клеток в адгезивном слое длительное время связывали его способность поддерживать кроветворение.

Наличие эндотелиальных клеток в стромальных колониях мы исследовали в культурах костного мозга человека по продукции антигена VIII фактора. На И-дневных культурах, фиксированных ацетоном, проводили реакцию иммунофлюоресценции с антителами к антигену VIII фактора человек? Антитела к антигену VIII фактора связывались на мазках костного мозга только с мсгакариоцитами и не окрашивали эмбриональные кожные фибробласты диплоидного шташа.

В качестс положительного контроля использовали культуры эндотелиальных клеток человека (ВКНЦ) . Всего на Î0 культурах костного мозга человека было исследовано более 100 стромальных колоний. Ни в одной из изученных колоний светящихся клеток не найдено. Таким образом, клетки костномозговых стромальных колоний не продуцирует антигена VIII фактора и . следовательно, не имеют вакнейшей мембранной характеристики, экспрессируемой эндотели-альными клетками.

Эти данные были подтверждены для клеток стрс дальных колоний костного мозга человека ( Castro - Malasplna, 1980 ). Кроме того, в цитотоксической реакции с антителам», ч антигену VIII фактора и комплементом на взвеси котномозговых клеток человека показано, что на КОКф этот компонент антигемолитического фактора токе отсутствует.

Î 1.3. Выявление 1а-антигена на стромальных клетках в культурах костного мозга и селезенки.

У мьшей Ia-АГ (бимолекулярный гликопротеин) экспрессирован

на большинство В-лимфоцитов, на активированных Т-лимфоцитах ;i на субпопуляции макрофагов, а также на всех дендритических клетках лимфоидных органов. Именно 1а+ макрофаги и 1а* дендритические клетки выполняют функции антигенпрезентирующих клеток. Кроме своей функции в иммунном ответе 1а-антлген связан также с процессам дифференцировки и созревания кроветворных клстск. Он присутствует на агаровых предшественниках костного мозга, а затем постепенно теряется в процессе дифференцировки гранулоцитов и эритроци-i м.

Экспрессию 1а-антигска на клетках стромальных колгмий мы изучали в культурах костного мозга и селезенки мышей СВА (гапло-типа Н2к ). Источником антител для первого этапа реакции иммуноф-люоресценции служила кул турапьная среда из-под клеток гибридомы, продуцирующей антитела к 1а-ангигену. Контролем служили культуры Костного мозга и селезенки мышей C57BL/6 (галлотипа Н2в). Всего было исследовано по 5 образцов опытных и контрольных культур костного мозга и селезенки, содержащих не менее чем по 30 стромальных колоний того и другого происхождения. Ни в одной колонии не найдено 1а+ стромальных клеток. Однако, в культурах селезл ¡очных клеток( в основном, между строгальными колониями) среди макрофа-гальных элементов встречались клетки, дающие положительную реакцию на 1а-антигек. Такие клетки составляли не более 10 % от иоио-цигарно-макрофагальных элементов. В культурах костного мозга встречались единичные светящиеся клетки с типичной морфологией ьакрофагов. Отсутствие 1а-антигена как на клетках стромальных колоний. так и на КОКф было показано также для клеток костного мозга человека ( Castro - Malaspina. 1984 ). Отсутствие конститутивной экспрессии 1а-антигенов было показано для фибробластов разного происхождения и разных видов доноров. В том числе из взвеси костномогговь'"' клеток человека с удаленными 1а+ клетками (в цито-' токсической реакции с участием комплемента) в системе для длительно кроветворящих культур устанавливался адгезивный стромаль-ный подслой, повдергивающий кроветворение (Castro-Malaspina. 1984).

В то же время на клетках мышиной ретикулярной саркомы , стимулирующей в культуре пролиферацию сингенных Т лимфоцитов, присутствовали 1а-антигены. L-фибробласты, 1а+ трансфецированные, способны презентировать белковые антигены Т клеткам и индуцировать аллоспсцифичсский ответ в смешанной культуре лейкоцитов. В презентации антигена участвовали только L-.-потки, несущие высокий

уровень 1а-антигена.

Индуцибельная экспрессия 1а-антигенов возможна наряду с другими типами клеток и на фибробластах. Такой индуц%/щей способностью обладает и ^-интерферон. Следует отметить, что фибробласты относятся к трудно индуцируемым клеткам. Выполняя различные функции в регуляции гемолоэза и иммунного ответа, #-интерферон, вероятно. может служить источником экспрессии 1а-антигена на стро-мальных клетках, ответственных за создание микроокружония.

3.1.4. Исследование поверхностных рецепторов клеток стромаль-ных колоний в культурах кроветворной и лимфоидной ткани.

Поскольку в регуляции гемо- и лимфопоэза большое значениа придается физическим межклеточным взаимодействиям, представляло интерес изучение характеристик стромальных клеток, связанных с их поверхностями. Мы попытались выявить методом розеткообразования рецепторы к 1бС , 1кМ и комплементу на клетках стромальных колоний в культурах кроветворной и лимфоидной тканей. Взвеси клеток костного мозга кроликов и мышей (СВА х С57ВЬ/6)Р1, селезенки и тимуса кроликов, а таюю пассированные фибробласты костного мозга и тимуса кроликов эксплантировали во флаконы с покровными стеклами. Реакцию розеткообразопания ставили на 10- 14-дневных первичных культурах или 2-дневных пассажных культурах. При инкубации культур с эритроцитами, сенсибилизированными на большинстве макрофагов образовывались эритроцитарные розетки, тогда как всо фибробласты в составе колоний розеток не образовывали. При инкубации культур с эритроцитами, сенсибилизированными 1кМ. ни на макрофагах, ни на фибробластах эритроцитарные розетки не образовывались.

Эритроциты, сенсибилизированные 1еМ + С, прикреплялись к по-' верхности значительной части макрофагов (и лимфоцитов, если они присутствовали в культуре), образуя часто очень густые розетки, содержащие значительно больше 5 эритроцитов. ' На ■ оверхности фиб-робластов, присутствующих в тех же первичных ч пассажных культурах. эритроцитарные розетки не образов! ались, то есть рецепторы к комплементу на фибробластах, в отличие от макрофагов, выявил, не удится (с помощью реакции розеткообразования). Показано, что по этим рецепторам стромальные фибробласты разных кроветворных и лимфои,рчых органов не отличаются. Высокий процент макрофагов, имеющих и С-р^цепторы. позволяет использовать эти клетки в качестве положительного контроля при исследовании рецепторов на

клетках стромальнык колоний. Отличил по IgG и С-рсцептарам могут служить маркерным признаком для различения двух категорий клеток в культурах кроветворных и лимфоидных органов: стромапыш фиб-робластов и макрофагов; Рецепторы для иммуноглобулинов, кг-; выяснилось в данной работе, отсутствуют на механоцитах in vitro. Если то se справедливо для этих клеток, находящихся и в организме, то следует считать, что участие ыеханоцитов в создании кроветворного и лимфоидного микроокруженкя не опосредуется иммунологическими механизмами, связанными с участием ишуноглобулиновых рецепторов.

3.1.5. Изучение фагоцитарной активности стромальных предшественников кроветворной и лимфоидной ткачи.

Принято било считать, что ретикулярная строма является частью специализированной фагоцитирующей системы - ретикулоэндо-телиальной. Возможность ■ клонирования ретикулярных фибробластов позволила исследовать фагоцитарную активность этого основного элемента стромы, поскольку способность к фагоцитозу является важной характеристикой клеточного типа. В связи с тем, что КОКф тлеют чрезвычайно низкую частоту в популяциях кроветворных и лимфоидных клеток /10-3-10~4/морфологические исследования процесса фагоцитоза в них невозможны. Поскольку идентификация стромальных предшественников основана на их колониеобразущой способности, для изучения фагоцитарной активности использовали методы, влияющие на это свойство. В качестве фагоцитируемых материалов использовали карбонильное железо ( инертные частицы размером 1 мкм3) и карагенан (полисахарид, образующий гель и не подверженный реутилизации) . В случае способности фагоцитировать птромагьные предшественники, поглотившие эти препараты, либо удаляется из взвеси (при фагоцитозе железа), либо погибают ( при фагоцитозе карагена-на). В обоих случаях после обработки и железом и карагенаном эффективность клонирования будет снижена, если КОКф способны к фагоцитозу. После удаления элементов, фагоцитировавших частицы коле за. в суспензии клеток костного мозга оставалось около 50% клеток. но эффективность их клонирования резко падала до 0 -0,7 КОКф на 10 клеток, т.е. во взвеси оставалось 0,5% клоногенных стромальных предшественников. В суспензиях клеток селезенки после ин-' кубации оставалось примерно столько же клеток, а ЭКОф после обработки железом падала почти в 10 раз. но оставалась в несколько раз более высокой, чем в костном мозге. Аддитивность ЭКОф в смешанных культ/рах обработанных и интакгчых клеток свидетельствует

об отсутствии ингибирующих факторов после обработки железом. т.е. при такой обработке КОКф физически удаляются из взвеси.

Таблица I. —тиянио обработки карбонильном железом на ЭНОр войссей кроветворных н Л№!!$оицных клеток.

Источник Сбрабо»-клеток Кол-во клеток после обработки!?,) » Число КОКф па Ю5 клеток Число КОКф о обработанной взвеси Г0\ число К1Д<ф в неОО^-ботоиной взвеси

КостныЯ _ 83.2 3,72+0,65

мозг +1 ьг.о 0.02Ю,02 0,5+0,3

Селезен- - Е0-.2 1,904), 68

ка 3&.6 0,20+0,14

Лоритоио«* альшй - 90+5

экссудат • 5+1 12.¿>2.6 12*5

х Взвеси клеток цсрскоЯ свинки, обработайте н необработанные железой при 3?°, экспллнтиропали о гоиологичнш фадерои £облученным костим иозгои). За 1(ХЙ примшалх число клеток до обработки. Каждая точка соотвествует 4~5 опиты.

Нагрузка железой удаляемых клеток может происходить как в виде фагоцитоза частиц келеза, так и в виде адгезии этих частиц на клеточной мембране. Установлено, что КОКф не фагоцитируют, а лишь адгезируют частицы яслеза на своей поверхности. После 60 мин. инкубации взвеси костномозговых клеток с карагенанои ЭКОф практически не отличалась от ЭКОф контрольной взвеси, а после 4-часовой обработки концентрация КОКф падала наполовину.

Эти данные означают, что строыалыше клоногенные предшественники, выделенные из костного мозга в течение первого часа практически не фагоцитируют, а за несколько часов выявляется чрезвычайно слабая фагоцитарная активность КОКф. Эти результаты были подтверждены ;.тя КОКф костного мозга человека и фибробластных колоний мышиного костного мозга (СазЬго-Ма1азр1па, 1984; £1рог1,1980).

3.1.6. Неспецифическая эстераза в клетках стромальных колоний.

Положительная реакция на неспецифическуг эстеразу - в частности, на с-нафтилацетатэстеразу, ингиб .эуемую фторидами, - является четким' маркером на принадлежность кроветворных клеток к мо-ноцитарно-макрофагальному ростку костного мозга человека и шши. Стабильное присутствие йермента на всех этапах дифференцирозки макрофагов позволяет отличать эти клетки в смешанных популяциях как от ыиелоидных, так и от лимфоидных цюрм. Физиологическая роль эстераз заключается в регуляции уровня активности ацетилхолина.

эти ферменты имеют отношение к Фагоцитозу и могут играть р_»ль в обмене белкоз. В культурах костного иозга мышей макрофагальные элементы, расположенные как на территории стромальных колоний, так и между ними, проявили интенсивную реакцию на ы-нафтилацетат-зстеразу и оказались интенсивно окрашенными за счет плотно упакз-ванных гранул бурого цвета, заполнивших всю цитоплазму. Клетки стромальных колоний в этих хе препаратах были бесцветны и совершенно но содержали бурых гранул. В контрольных препаратах с Нар б. рая окраска отсутствовала как в стромальных клетках, так и в макрофагах.

Совершенно иную картину представляли собой препараты культур костного мозга морских с ¡инок. Все стромальныс колонии состояли из окрашенных клеток. Интенсивность окраски клеток варьирозала от слабой до максимально высокой, так что некоторые клетки были окраисны практически в черный цвет. Наиболее интенсивно окрасива-лась перинуклеаркая зона. Часто самыми интенсивно окрашенными были гигантские фибробласты . расположенные по периферии колонии. В контрольных культурах окраска клеток стро. льных колоний не отличалась от опыта, т. е. но ингибировапась ИаР. Отсутствие реакции на эстеразу в клетках иьгииных стромальных колоний позволяет использовать этот метод для различения в адгезивной Фракции мышиного костного мозга макрофагальных и стромальных элементов. Таким образом, уровень активности и тип нсспецифичес-кой эстеразы оказались шдоспецифическими.

При определении принадлежности клеток, входящих в состав стромальных колоний, к тому или иному клеточному типу за критерий принимал \ .вг-первых, способность синтезировать интерстициальный коллаген - основной фибриллярный белок волокнистого компонента межклеточного вещества соединительной ткани. Другой важнейшей характеристикой р.™"'-очного типа является рецепторный аппарат, в значительной мере определяющий функциональные возможности клеток.

Способность клеток стромальных колоний продуцировать коллаген I типа позволяет отнести их к категории механоцитов кроветворной и лимфоидных тканей, синтезирующих белок для строительства основного опорного элемента каркаса этих тканей - коллагеновых и ретикулиновых волокон. На основании этого признака и соответствия морфологическим критериям клетки стромальных колоний следует ечн-

тать фибробластами. Именно синтез интерстициального коллагена отличает строналькне фибробласты от других клеток стромального компонента кроветворной ткани, присутствующих в адгезивной фракции культур. Этот вывод относится к стромальным колониям, вырастающим в культурах не только механически дезагрегированного костного мозга, но и дезагрегированных с помощью энзиматичеасой обработки фрагментов ткани. Как будет показано далее, в последнем случае из костного мозга выделяется в среднем в 10 раз больше стромальных колониеобразукзщих клеток. В таких культурах клзтки строма-ных колоний такяе синтезировали интерстициальный коллаген, т.е. это бь'ли колонии фибробластов. Следовательно, клетки - предшественники стромальных колоний - это клетки, образующие колонии фиб-робластог (КОКф) .

На фибропластах стромальных колоний культур кроветворной и лимфо-идной ткани не обнаружены IgG- и С- рецепторы.Эти признаки четко отличает их от мононуклеарных фагоцитов в первично эксплантиро-ванных и в пассированных культурах.

В составе стромальных колоний не найдено клеток, синтезирующих антиген VIII фактора, которые могли бы быть идентифицированы как зндотелиальные клетки. Это подтверждается и данными электронной микроскопии об отсутствии в клетках стромальных колоний телец Вейбла-Паллада. Стромалыпе фибробласты. как и фибробласты другой локализации, относятся к 1а- клеткам.

Таким образом, стромапьные колонии в культурах клеток кроветворных и лимфоидных органов состоят из фибробластов. Степень контаминации стромальных колоний ыононуклеарными фагоцитами и кроветворными клетками' колеблется в зависимости от вида донора и условий культивирования. Такие маркеры, как синтез интерстициального коллагена, отсутствие IgG-рецепторов и некоторые цитохимические маркеры позволяют надежно классифицировать состав стромальных колоний.

3.2. Определение клональной природы колоний стромальных фибробластов.

О клонапьноы происхождении стромальных колоний в культурах кроветворных клеток свидетельствовали линейная зависимость между числом эксплактированных клеток и.количеством вырастающих колоний и данные хромосомного анализа, полученные в смешанных культурах костного мозга самца и самки аутбредных морских свинок.Однако, существенным возражением такому доказательству клональной

природы стромальных колоний является несингенность использоваиной культуральной систеш: весьма вероятно, что в колонии могут объединяться только сингенные стромалькые фибробласты. Кроме того, было неясно, происходят ли стромальные колонии от одиночных клеток или часть колоний может образоваться из агрегатов стромальных клеток. В последнем случае не мояет идти речь о клональной природе колоний. Поэтому следует тлеть доказательства происхождения колоний от отдельных клеток в совокупности с моделью смешанной культуры сингенных клеток, различающихся по маркеру. Нами были использованы для стромальных колоний маркеры двух типов: хромосомный и изотопный.

Исследование проводили с учетом двух возможных источников ошибок при интерпретации результатов кариотипирования фиброб-ластов в культурах костномозговых клеток, смепаншх по хромосомному маркеру. Во-первых, необходимо избежать попадания в эксплан-тируемые суспензии [«диссоциированных на отдельные клетки стромальных агрегатов, из которых могут образоваться колонии фиброб-ластов одного кариотипа, не являющиеся клонами. Во-вторых, следует предотвратить контаминацию стромальных колоний в культурах костного мозга мышей гемопозтическими клетками и макрофагами , не являющимися потомками КОКф.

Чтобы выяснить, присутствуют ли в эксплантируемых клеточных суспензиях агрегаты стромальных клеток, по 10^ клеток помещали в пластиковые матрасы Т25, покрытые поли-1-лизином. Через 1 час культуры фиксировали глютарапьдегидом и окрашивали по Гимза. Слитую с культур среду осаждали на НА фильтры, которые затем окрашивали акридин-оранжем. Показано, что концентрация стромальных агрегатов среди фильтрованных костномозговых клеток ниже 10-5 при определении ЭКОф этих суспензий найдено, что она составляет для механически дезагрегированного костного мозга 7 х 10~5, а для трипсинизированного - 11 х 10"^ Отсюда следует, что если часть колоний и формируется за счет попадающих в культуры стромальных агрегатов, то из них образуется в случае трипсинизированного костного мозга менее 13Г> колоний, а в случае механически дезагрегированного - менее 14% колоний. Поскольку миелоидные клетки и' макрофагальные элементы интенсивно пролиферируют в культурах мышиного костного мозга, они могут быть источником ошибок при интерпретации данных о происхоадении фиброблаСтоз, полученных с помощью хромосомного маркера. Поэтому необходимо иметь культуры с

колониями фибробластов без пр.шеси макрофагальных и миелоидных элементов. С этой целью, использовали два приема. Во-первых, после адгезии экеплантирозаншх клегок (КОКф яилпютсн. как нами показано, высоко адгезивными клетками) . необходимо неприкрепленные 1СП0ТКИ тщательно удалять из культур. Во- вторых, была применена двукратная обработка карагенаном: сначала обрабатывали взвесь костномозговых клеток (КОКф не фагоцитируют карагенан) до эксплантации, и повторную обработку карагенаном прозодили ужо в культурах за сутки до кариотипичсского анализа. Примссь макрофагов в культурах, использованных для хромосомного анализа, была крайне незначительной - не более одной розеткообразуюшей клетки встречалось в 1% колоний. Кроветворные клетки в культурах та;.же практически отсутствовали.

Кариотипы делящихся ¡слеток были определены в 18 колониях в смешанных (1:1) культурах клеток СВА и СВАТ6Т6. В каждой колонии было протипировано от 5 до 8 метафазных пластинок: 12 колоний содержали пластинки только СВА, а 6 колоний - только СВАТ6Т6. При этом в одной из колоний с клетками кариотипа СБАТ6Т6 и в одной из колоний с клетками кариотипа СВА находились 2 тетраллоидные метафазные пластинки тех ле кариотипов. Таким образом, в пределах каждой колонии нее исследованные метафазные пластинки оказались относящимися к одному кариотипу. Следовательно, в тесте на коло-нисобоазование большинство колоний фибробластов (не менее 99?. в культурах трилсинизированного и 86% в культурах механически дезагрегированного костного мозга) представляет собой клеточные клоны.

Для изучения клепальной природы стромальных колоний нами был использован также установленный в этой работе факт, что КОКф не пролиферируют в организме, а гз культурах вступают в пролиферацию асинхронно, проходя первый Й - период спустя 20 -48 часов после эксплантации.

Вводя ^Н-тимидин на разные сроки в течение этого периода, можно получить культуры, в которых часть КОКф будет содержать изотопную метку, а часть - нет. Если, пометив КОКф, в дальнейшем культуры в течение непродолжительного времени (не превышающего 2 -3 циклов, чтобц избежать разведения метки) растить в отсутствие изотопа, КОКф образуют очаги фибробластов. Эти очаги фибробластов, потомков моченых или немеченых КОКф, будут или но будут содержать метку. При клональном происхождении все фибробласты очага

должны быть либо помечены изотопом, либо нет. Наличие смешанных колоний монет свидетельствовать о неклональной природе колоний фибробластов.

Костный мозг морской свинки эксплантировапи на покровные стекла в среду с ^-тнмидином. Через 31 - 52 часа культуры промывали, переносили на 2 суток в среду с холодным тимидином, который добавляли ежедневно. На радиоавтографах 3-5- дневных культур подсчитывали число колоний, состоящих только из меченых или немеченых фибробластов, а также число смешанных колоний, содержащих и меченые и немеченые клетки. Оказалось, что из 291 очага, состоящего не более чем из 10 клеток, лииь 11 (около Ш содержали и меченые и немеченые фибробласты. Остальные очаги состояли только либо из меченых, либо из немеченых клеток. Этот результат указывает, что практически каздып очаг происходит из 1 клетки, т.е. является клоном. Если такие очаги происходят более чем из одной клетки, то агрегировать долккы только фибробласты, синхронно проходяще 3-периоц штотнческого цикла. Это предположение весьма маловероятно.

Следовательно, оба использованных маркера - хромосомный и изотопный - подтвердили в сингенной системе клональную природу стромальных клеток в культурах кроветворных клеток. При этом КОКф - клетки, образующие колонии фибробластов. - являются клоногенны-ми стромальными клетками - предшественниками, а по числу стромальных колоний, вырастающих в культурах, можно судить о количестве клоногенных стромальных предшественников в эксплантирован-<юй клеточной популяции (с учетом эффективности клонирования) .

3.3. Адгезионные свойства клоногенных стромальных предшественников.

Адгезия клеток определяется биохимическим взаимодействием клеточных поверхностных рецепторов с адгезионными факторами.

Необходимые адгезионные факторы могут либо синтезироваться самими клетками, либо должны быть внесены в культуральную среду, (например, источником монет быть сыворотка). Различия в типах и количествах необходимых адгезионных факторов, в скорости синтеза их самими прикрепляющимися клетками определяют адгезионные харак-' теристики разных клеточных типов.

В данной работе изучали скорость адгезии стромальных пред-, шественников костного мозга в бессывороточной среде и в разных средах, содержащих различные виды и количества сывороток. Прове-

дено сравнение скорости адгезии стромальных предшественников кроветворных и лимфоидных органов.

Адгезивность стромальных предшественников костного мозга.

Для изучения адгезивности КОКф костного мозга мышей клеточную взвесь, приготовленную на 2 или 20% сыворотки, помещали на 2 часа в матрасы, после чего неприкрепивииеся клетки переносили вместе со средой в другие матрасы, где они находились без смены среды до конца культивирования ( концентрацию сыворстки дово; пи до 20% ). В контрольные матрасы клеточную взвесь эксплантировали на культуральной среде, которую не меняли до фиксации культур. Во все матрасы одновременно с полной культуральной средой добавляли облученные клетки костного мозга морской свинки в качестве фидера. Через 10 дней все культуры фиксировали спиртом и подсчитывали общее число фибробластных колоний. Более 75Ж КОКф прикрепляются за первые 2 часа после эксплантации ( табл.2) . и доля высокоад-гезивкых КОКф не зависит от количества сыворотки в среде. Однако, оказалось, что доля фосфатазополокительных колоний падает как от самой процедуры переноса клеток, так и , особенно, от снижения содержания сыворотки в среде. КОКф, выделяемые из прочно связанных тканевых структур при ферментативной обработке (трипсинизация костного мозга), обладали выраженными адгезивными свойствами, как и КОКф,выделяющиеся при механической дезагрегации костного мозга:

Табл. 2. Адювивнт свойстве КОКФ чышиного ■ • костного 1'озга

Культуры Число колоний число Фос-^атовстю-лохитель-ныд колони! ЭКС» в культур* зкилгтэттрол»

нв культуру среднее

гт) Контроль 279,345,386 339 259±27

'¿-часовая: адгезия : адгезивные нв 20} сы: «летки 240,267 254 14915 75

воротке :НйПрИйр5ПИВ-:лкеся клетки 80,84,87 84 46^40 25

'¿-чвеовая; адгеачк: вдга^иэные нз 2£ сы-: клетки 259,285,294 279 6015 62

вороги • :неприкр«пив-:виося клетки 28,43,53 41 12^1 12

х) по 2x10 иеханичвеки дввагрегироввнннх клетох _

активизировали нв 250 ил ыатрзеи в среде ВАК У -12 7 с 20} виОриоиальноИ бычьза сыворотхи с добавление« 4.10 облучвнных костномозговых хлетох иорехой свинки в качестве фидера.

хх) В контрольна х>льтуры фидер добавляли через 2 часа по еле эксплантации; в остальные культуры - после переноса неприкрепившихся клеток.

70 - 90% КОКф той и другой популяции за 2 часа прикрепляются к культуральной поверхности. Когда первые часы после эксплантации были разбиты на 30-минутные интервалы, с которыми неприкрепившие-ся клетки переносили из одних матрасов в другие, оказалось, что подавляющее большинство КОКф прикрепляются к субстрату за первые 30 минут, позже во взвеси остается весьма небольшое число стро-мальных предшественников. ■' •

Адгезия кроветворных и стромальных клеток в культурах костного мозга.

После 2-часовой адгезии взвеси мьпйиных костномозгоьых клеток неприкрепившиеся клетки сливали и в матрасах подсчитывали (табл. 3 ): 1)- сразу после сброса неадгезивных клеток на культурах, фиксированных 1% глютаральдегидом, - число прикрепленных клеток; 2)- через 24 часа - на культурах, зафиксированных спиртом, -число прикрепленных фибробластов; 3)- через 10 дней - на культурах, вы-ргщенных с гетерологичным облученным фидером, -число фибробласт-ных колоний. Из представленных данных следует,

.Таблица 3. Адгезия клеток в культурах мышиного костного мозга.

Числа эксплаити-'Лислэ прикреп-:Число а«брэблас+ Число колоний ровашшх клеток :ле«ных клеток "мв в 24-час. ; в 10-дневннх :в.2-чеи. куль-:культурах : культурах'

;туТх и3 / ■;

5x10

54, 77, 77

72, 84

58, 74, 80

что из 15% прикрепившихся клеток на доли КОКф пришлось менее 0,02% , т.к. практически все клетки, приобретающие после адгезии морфологию фибробластов, дают начало колониям. Проявление адгезивных свойств .фибробластов из колоний, вырастающих в культурах костного мозга, изучали при пассировании и реклонировании первичных культур. 81+5% пассированных фибробластов были найдены прикрепившимися к культуральной поверхности. ЭКОф при реклонировании составляет 42+2% при расчете на пассированные фибробласты, а на прикрепленные - 52% . Из приведенных данных следует, что потомки КОКф обладают выраженной адгезивностью при пассировании, сохраняя при этом и высокий пролиферативный потенциал, необходимый для образования вторичных колоний.

Адгезивность строыальных предшественников тимуса.

Изучение адгезивных свойств КОКф тимуса ».юрской свинни и кролика показано, что за 30 мин. после эксплантации число прикрепившихся КОКф составило 80-1003Е от соо-оетствуюцей величины в

контрольных культурах. В культурах, где неприкрбгшвшиеся клетки инкубировали в интервалах 30-60 мин. ■ и 60-90 мин., выросли единичные колонии, что составило около 10Ж от числа колоний в контрольных культурах. Следовательно, клоногенные стромальные предшественники ткмуса, как и костномозговые, обладают высокой адгезивной способностью.

Представленные данные показали, что стромальные клетки -предшественники кроветворной ( костный мозг ) и лимфоидной ( тимус ) ткани обладают выраженной адгезивностью к поверхности куль-туральнык сосудов. По скорости адгезии они сравнимы с такими высокоадгезивными клеткаш, ' как макрофаги. Высокая адгезивность КОКф выявлена у мышей, морских свинок и кроликов. Наши данные подтверждены и для КОКф костного мозга человека (Castro Malasplna , 1980) . Для определения адгезивности КОКф необходимо экспла]пировать тестируемую популяцию, содержащую КОКф, с достаточно низкой плотностью, в противном случае создаются условия, препятствующие прикреплению стромальных предшественников. С другой стороны, адгсзивность стромальных предшественников может иметь и видовые различия. Так, оказалось, что у хомяков костномозговые стромальные фибробласты в длительно кровстворящих и в пассированных монослойных культурах костного мозга значительно менее адгезивны, чем у других кивотных.

3.4. Пролиферативный статус КОКф и их потомков в культурах.

.ролиферация фибробластов, как и клеток других категорий, регулируется полипептидными факторами и соединениями непептидной природы. Принято считать, что запуск пролиферации in vitro адгезивных клеток, к которым относятся КОКф, является 3-х сигнальной системой. Первым обязательным этапом является заякоривамис экс-плантированной клетки, формирование фокальных контактов с субстратом. Ростовые факторы действуют только на уже прикрепившиеся клетки. Для пролиферации в культурах клеток иезенхклзмыюго про-исхондения, к которым, судя по полученным данным, относятся стромальные механоциты костного мозга, необходимы, кроме компонентов, присутствующих в синтетических средах, и факторы роста. Источником факторов роста - компетентности и прогрессии - может быть сыворотка, добавляемая в культуральную среду.

Первично эксплантируемые популяции костномозговых клеток, кроне механоцитов, содержат, в основном, кроветворные и лимфоид-

ные элементы, многие категории которых являются активными продуцентами факторов, влияющих на пролиферацию различных типов клеток. Т.о. , для изучения закономерностей пролиферации КОКф и их потомков необходимо выяснить их потребности в сывороточных и дополнительных факторах, обладающих митогенной активностью в отношении стромальных механоцитов.

3.4.1. Пролиферативкое состояние КОКф в организме.

Пролиферативное состояние КОКф изучали методом "тимидинового самоубийства" во взвеси костномозговых клеток. Из таблицы 4 видно, что КОКф, содержащиеся в костном мозге, не подвергаются "самоубийству" , т.е. не включают 3Н-тиидин, и, следовательно, КОКФ не пролиферируют во взвеси клеток выделенного костного мозга.

Таким образом, либо КЭКф не пролиферировали в организме в момент взятия костного мозга для эксперимента, либо в процессе приготовления взвеси пролиферация этих клеток прекратилась. Чтобы дискриминировать эти предположения, использовали введение 3Н-ти-мидина In vivo. Из анализа радиоавтографов культур следует, что г.ри импульсном введении ^-тимидина фибробласт-ы практически не метятся. При насыщении изотопом 2-недельных и взрослых морских свинок лишь 2 -5% фибробластов содержат метку, тогда как среди мак-рофагоз этот показатель превышает 5056 . У новорожденных свинок при насыщающей метке выявляется 1555 меченых фибробластов. а макрофаги метятся почти все. Поскольку все фибробласты, выявляете в таких ранних культурах, способны давать начало колониям, т.е. являются по определен!® КОКф, следовательно, КОКф в организме практически все находятся вне пролиферативного пула.

Таблица 4 . Влияние сЗрайотки 3Н-тимидтюм <ук. акт.16-£5 К/мМ) па ЭКОф взвеси костномозговых клеток морской свинки.

Долл пережинающих КИ№ (Г.)

а рыта

Обработка Число тимидином клеток

не- ме-

ме- че- матрас

че- ,ннм уШЬ

ним 311 *10

Число колоний в культурах

Число imfr на Ю1

1.

2. 3.

50 50

50 50

20 20 25 4 4 4

345 , 383 326, 404 ' 512, 555, 583 564, 576, 582 356, 370, ЗЭЬ 454, 546, 566 490, 503, 599

204, 238

205, 222. 232 198,208

0.7 0,7 I Д 1,1 1,Э 2,6 2,1

5,5 5,5 5 1

roo

100

137 ПО

100 92

* Все культуры вели в присугсг&ин гомолог*"; но го облученного костномозгового фидера и немеченого тимилт За IOO?. принимали 1 ЭКС4> вэвесеЯ, инк^оировамнах с немеченим тимисином.

4

' 3.4.2. Пролиферация. КСКф в культурах.

Вступление КОКф в первый митоз зависит в культурах от нескольких факторов.

а) . В культурах костного мозга мышей определяли зависимость эффективности колониеобразования от концентрации сыворотки. При прочих оптимальных условиях (плотность эксплантировэнных клеток, концентрация фидерных облученных клеток, тип сыворотки) 1% концентрация сыворотки (и человеческой и эмбриональной бычьей) гл стимулирует колониеобразования. Увеличение концентрации- сыворотки до 20% приводит к тому, что почти все фибробласты, выявляемые в 24-часовых культурах, вступают в пролиферацию и дают начало фиб-робластным колониям (рис. 1 ).

б) . Плотность клеток. Критичным для возможности КОКф вступить в пролиферацию оказался фактор эксплантационной клеточной плотности. Так, если начальная плотность мышиного костного мозга

4 2

меньше 10 клеток, см . колонии на образуются. То же происходит, если при больших плотностях через 30 - 120 минут после эксплантации из культур удалить неприкрепившиеся клетки. В таких культурах половина фибробластов вообще не проходит ни одного деления. Однако, если в эти ьультурц в день эксплантации добавить облученные костномозговые клетки, то около 90Э6 фибробластов вступают в пролиферацию (рис. 2).

Р*с. Вч*я»м<" hoi нитрации енвпротин и фи^рнм* кяггок >ш о^раммчче ЛСД» - soлотЯ,

0 *у**гум •)хси«<>'»т»рл1»1чи гм Ь'КУ* «KwnHiftCHH vwp^rww»-

•*>>-ыя К-to * ер«А» с ЬХ 'мПри»>и1«к1ю1 аоровь«й cn»o>vtt*x( О, ).

мли счмртт«»'*- л-жft* оси ^си'Чв- *01ич*с»

г г» о4«уч«1»м( n.^TiOM'Or-jfi* Kirri»* »»¿речи* емшш

••• DO оси ОрпииЯТ - чнед» КСИф - ЮЛОЬИЙ.

Ркс. 2« блкАмм« «Сиучеинм! {кдариия ывток и« ••личин" имя <хброб4«вто>.

по ы*Тос ы««амачес*п жв»«гр#тре»м-

«0С4 С ) «ДК ■« ^•.ю* и«««* т{итс*нк»нро««11кого ( И ) *бстнвГ9 мзг*. Часть в/льт/р (якеиродиш ч«рс) ] «у ».(IT, OcT&ibMut растм* до 10 ¿»«Я Со (яАера (0) адм » прис/»«-

ЯИЯ O&jriftHilUl фИД?р|1ИД ЯДСТ0«( »• «о 10 ЯЛ0Т6« «осгнуго to09гй »ореад* с*«ик* к* к/дьт/р/). По ром »бммее - jt»>»»» одиночки« iNOpfdriACTwtJ), чмыо фийройтегс» » состлд« очаг» ( соетмтепсиив 2.Э-4 ■ 9-49) » iuuou»»i(«30)- «Оыя еуьм* GUxcnKUl ♦*CpofljacToi, оч«г«а ■ водоин'1 во оси ep*»n*r--чпедо сдм«чк*х и« час*» «чаге» ш кмемк!*

в) . Скорость вхождения КОКф в первый митоз In vitro. Чтобы определить скорость вхождения КОКф в S-период первого цик-

ла клеточную взвесь костного мозга эксплантировали в среду с Н-тнмидином. Через различные промежутки времени культуры отмывали от изотопа и доращивали до 48 часов в присутствии "холодного'' ти-мидина и облученных фидерных клеток. При инкубации с изотопом менее 20 чг~ов меченые фибробласты отсутствовали. Первые моченые фибробласты (10,6%) появляются через 24 часа после эксплантации. Еще через 4 часа индекс метки составляет 3156 и достигает максимальной величины (96%) через 44 часа. Т.о., в течение вторых суток после эксплантации все фибробласты вступают в первый Б-псри-од, т.е. практически все КОКф в этот срок асинхронно начинают пролиферировать.

Если же из культур удалены неприкрепившиеся клетки, то первый митоз проходит половина КОКф: из них, в свою очередь, третья часть проходит второй и третий митозы и лишь 1-2% способны пройти более 5 митозов. Таким образом, в этих культурах лишь 10% клеток проходят более 3 митозов, а 90% либо но делятся вовсе, либо образуют очаги, содержащие 2-8 фибробластов (рис.2).

При добавлении облученного фидера не сразу после удаления неприкрепившихся клеток, а через 1-2 суток ЭКОф падает на 10 -20%. через 3-4 суток - на 50 - 60%, а через 7 суток - образуется менее 10% колоний. Следовательно, реализация пролиферативного потенциала КОКф зависит от присутствия в культурах других костномозговых клеток. Нативные костномозговые клетки мыши обладают более высокой колониестимулирующей активностью,чем облученные клетки. Последних надо добавлять в 10 раз больше, чтобы получить ту же ЭКОф. Более высокой КСА обладает гетерологичный облученный фидер - костный мозг морской свинки, которого нужно добавлять в 4 раза меньше, чтобы достичь того же эффекта.

г) . Зависимость ЭКОф от плотности облученных кроветворных клеток.

Максимальная ЭКОф фидера получена с плотностью гетерологи-ческого облученного фидера 4- 8x105 /см % Несколько ниже проходит кривая раститровки КСА сингенного мышиного костномозгового фидера, где максимальную ЭКОф можно получить при плотностях порядка 2х1с£/см2, что уке близко к границе физиологичности культуральной среды, т.к. высокая клеточная плотность исчерпывает ее буферную емкость. Следует отметить, что в отношении КОКф костного мозга мышей проявляют КСА и клетки костного мозга кролика и человека. 3.4.3. Линейная зависимость числа колоний от числа эксплан-

тированных клеток.

В присутствии облученых костномозговых клеток устанавливается линейная зависимость менду количеством образующихся колоний и числом эксплантированных клеток. ЗГ.Оф становится постоянной и составляет 1-2x10"^для механически дезагрегированного костного мозга и 10-20х1С"4для трипсинизированного костного мозга(табл. 5).

3.4.4. КСА кроветворных и лимфоидкых клеток.

На рис.3 приведено сравнение КСА различных популяций облученных кроветворных и лимфоидных клеток. Кроме костного мозга, КСА обладают клетки селезенки морских свинок и мышей. Их КСА. особенно селезенки мыши, значительно ниже, чем у костного мозга. Поскольку селезенка является депо крови, и. следовательно,в ней много тромбоцитов, мы проверили, не связана ли ее КСА с присутствием

Таблица 5 . Зависимость сЖЦф от числа костномозговых клеток, эксплантированных в присутствии фидера. *

Эксплантированные клетки

спосоо дезагрегации

кол-во хЮ4

Число

клеток

фидера

хЮ

Число колоний в культурах

Число КОКф на 104кле-

ток

Механический

Тркпси-ииг -;ия

50 50 ТОО 200

0,3 10 3 0

10,с

30,0 30,0

20

30

I, I, 2 77, 95, 99 168 191 212 328,3651397

3, 3, 3 ю п; II 21, 33, 37 101,105 118 298,338 О, О, I

0,03 18 2 0 i;s

10,0 10 7 10 0 10 8 10 5 ' 0 01

к Клетки костного мозга мыдей эксплантировали в матрасы на 250мл с добавлением фидераСоблученный костный мозг морской свинки).

тромбоцитов на клетках селезенки. Оказалось, что в отсутствие ад-гезированных тромбоцитов (обработка ЭДТА) костный мозг морской свинки сохраняет КСА. Взвесь спленоцитов морской свинки, обработанная ЭДТА, не обладает КСА. В отличие от морской свинки, мышиные спленоциты после обработки ЭДТА сохраняют КСА. хотя и на низком уроине. свойственном этой популяции. Клетки лимфоузлов и тимуса практически не проявляют КСА (рис. 3,4 ). .

Лейкоциты крови морских свинок, выделенные с помощью желатины. обладали нестабильной КСА. а после

обработки ЭДТА (для удаления тромбоцитов) - практически не проявляли КСА.

Тромбоциты из крови' морской свинки проявили высокую КСА, при этом эффект был дозозависишм: не проявлялся при плотности низе /см"^ г 5ыл близок к максимальному при плотности 1-2x10^ /смЯ

Р«сЗ. иктчяичсть «Илу««»*» к,е?ок р.еА Шо.мест**ул*рухл»п мпи«т салм^м! Киршк

кроветаорних и чмм^иа'«* оргп»к>». и«то», овраа«««« МТА г*«*««*« мг«з«рв»м-

И*| тромбоцято!.

По «<■ а*сц«се - истом »тк иЧдучии»** фмчерии* к»»точ морскоЯ С»*ЧК«<4) «14 «мч* чМлмл»"»« * ку*ьтурш, чун» *»исЯ'««-

т*ром«* по 11-5)'10s »PKanwfc«* »гзАгрлгмргныты« ««его*

К9СТ»ОГО моагк; ПО ОС К ОракнМ • Э"М*КТИ*1ЮСТ» Я<0"*.р0*»"НЛ *

ку1ктур»к с рл-мюй »»отжать« фчл«,рч¥« к«еток(ВЯ- 0.EJ3-ЕЭ - 2,5*fCb, &1Я - ЬхЮЬ, СЗ - W6> » -

• 4a 10^, 123) * 1.5410°, £3 * -4*10 ) «>» I с- «¿«ътурааьно! imepKnue*« к I • ЗСО^ » *у«ьтур1* С пдолюстю Улучвшш« яое-тиомоэго!»«* клеток морсяо! с»*>>я* Jofyo»*. I » *ост«мЛ noar; II - селезенка; Ш - **м<>*тическ*« уьлы; I/ • тии/е;У- леЯно-цкту крив«; У1" троч^оцчтн.

Lй

Й

;it(uiiitipciu> по JiIO5 метм мепинческ« деэвгрепроня-ногб 1мамиогп «ос'того иоэга на матрас Т~«!5. Чвреэ 2 чеса vamiuk *впг'/*рвпкш»вся метик'А) i »o^mui а х«чвст>« фкАврп по to'ftCay4eiin«i Kit то* judo коспюга мозга wcpcio* lavMKn(B).дивоем^меике ыореко! сгии*и<'С) ■ ойработамии* и» «Орюст а* нм ЭГ.ТА |!ь eci орднкагТкаюна лЧч«т»люсг< ¡лоньроваияя % культ?»

с раиичииин фщерямыя мсткамя » процента! ot •went*-»мостя мо«про»»нкл » кудктуро* с яеоараЗоганивик ЗДГА лрчеинния косткоыозго»ьии ы»т*»лк ьорисв сьяккя.

3.4.5. Влияние на оКОф костного мозга.

Хорошо выраженный дозозависимый фидерный эффект тромбоцитов предполагат возможность существенной роли РОЙ!7, хотя следует помнить, что в отсутствие кроветворных клеток,КОКф не вступают в пролиферацию на среде даже с 20% сыворотки. Высокий процент сыворотки (но не 1-2%) обеспечивает практически все адгезивные клетки достаточным уровнем не только факторов прогрессии, но и РССТ. Тем не менее, было проверено непосредственное действие дополнительного количества РЕЮР. соизмеримого с содержанием его в добавляемых тромбоцитах. В 35 ым чалки эксплантировали по Зх1с£ '¿леток механи-

ТаЯлица 6. Влияние трои^оцктерного фактора роста на образование КОСф-колониД в культурах адгезивных клеток иехаитески дезагрегированного костного мозга.

оксплан- РостопоЯ фактор Число. Число колония тированных фидерных

клеток (мг/*л ) клеток

_ 0, I. 2

10 0. 0

3.10ь 50 0. 0

(35 им чавкк! _ 2. Ю? 12, 45

- 4.10с ад

6.I06 58. 61

чески дезагрегированного костного мозга мышей. Через 2 часа удаляли неприкрепивыиеся клетки. К 1 мл среды добавляли РШР, либо костномозговой фидер морской свинки. Показано, что РОйГ в использованных концентрациях (10 - 50 нг/мл ) не обладает КСА для КОКф. В предварительных опытах было проверено, что эти количества РЭйР выводят в пролиферацию остановленные ЗТЗ фибробласты (на 0,5% сыворотки) (табл. 6 ).

3.4:6. Влияние межклеточных контактов на КСА костномозгового фидера.

Нами была предпринята попытка выяснить, необходимы ли непосредственные контакты КОКф и фидерных клеток для проявления КСА. С этой целью в лунки (12-луночных плат) помещали покровные стекла с прикрепившимися за 2 часа клетками мышиного костного мозга: 1) на дно без фидера; 2) на дно с добавлением фидера; 3) на кольцо высотой 3 им без фидера; 4) на кольцо высотой 3 мм в присутствии фидера, предварительно осажденного на дно лунки. КСА костномозгового фидера морской свинки одинаково проявлялась-как при непосредственном контакте с КОКф, так и на расстоянии между источником КСА и КОКф. Эти данные свидетельствуют в пользу гуморальной природы стимулирующего фактора.

3.4.6. Аутокринная стимуляция пролиферации КОКф.

КСА облученного фибробластного подслоя была дозозависимой с максимальной ЭКОф при плотности облученных фибробластов 2-6x10 / смЗЗКОф достигает при этом тех же значений, что и при костномозговом фидере. Органоспецифичности КСА фибробластов не обнаружено: фибробласты и костномозгового и селезеночного происхождения одинаково стимулировали пролиферацию костномозговых КОКф.

3.4.7. Пролиферативное состояние потомков КОКф. •

На кривых насыщения ^-тимидином видно, что пролиферативный пул' в колониях фибробластов в процессе культивирования постепенно снижается, т.е. часть клеток перестает делиться. Это происходит ухе на 6 - 7 день, а в 12 - дневных культурах около 30Ж клеток не пролифериоуют.

Как долго фибробласты, вышедшие из пролиферативного пула, остаются в составе колоний, мы определяли, используя 3Н-тимидино-вую метку. В 10 - дневные культуры вводили на 30 минут 3Н-тимидин (0,1 мкк/мл) . Затем культуры отмывали от изстопа и растили в присутствии "холодного" тимидина. В 10 - дневных культурах самую интенсивную метку - 40 зерен серебра - содержали 7% фибробластов.

Оказалось, что фибробласты с такой меткой присутствуют в культурах вплоть до 17-го дня .В 19 - дневных культурах клеток, меченых 40 зернами, не найдено. Следовательно, непролиферирующие фибробласты остаются в составе колоний 7-8 дней.

3.4.8. Пролиферация потомков КОКф в пассированных культурах.

Пота, л КОКф, образующие в первичных культурах колонии фибробластов, можно пассировать. с большой и малой плотностью. Судя по кривой насыщения^ ^-^гимидином.при пассировании с большой плот. ностью (2 - 5 х 10 /см 1 , на среде с 20 % ЭС фибробласты проли-ферирувт с таким же Т. что и в составе первичных культур. При этом отсутствует 24-часовая 1ад-фаза: спустя 2 часа после пассажа около 24% клеток содержат метку, а через сутки метка достигает 91% . При пассировании с малой плотностью (5 - 40 клеток /см^ ) пролиферация фибробластов чрезвычайно замедлена и клоны практически не достигают размеров колоний в первичных культурах. Однако, если в такие культуры при пассировании добавить облученные костномозговые клетки, (5 х Ю^см^) образуются колонии фибробластов, по морфологии но отличимые от первичных культур. Эффективность реклонирования составляет при этом для 16 опытов 19,6+3,3%.

Методом "тимидинового самоубийства" показано, что предшественники реклонированных колоний находятся в первичных культурах в состоянии активной пролиферации: 40% предшественников погибают в результате 30 мин. обработки высокоактивным 3К-тимидином.

То есть, стромальные фибробласты, способные при. пассировании к активной пролиферации, принадлежат к пролиферативному пулу первичных культур.

Высокие пролиферативные потенции КОКф вне организма были продемонстртрованы уже в первых работах. Полученные нами результаты о том, что практически все КОКф находятся In situ вне пролиферативного пула были подтверждены всеми авторами, воспроизводившими их на' других видах животных и человеке . Условия начала пролиферации КОКф в культурах оказались многофакторной системой. Если удалять из культур неадгезивные клетки, то практически все КОКф либо не вступают в пролиферацию, либо проходят 1 -3 митоза. Совсем иная картина в полных культурах на 20% сыворотки: показано с ЧЬтимидиногзой моткой, что практически все экеллан-тированные фибробласты вступают в S-фазу 1-го цикла между 20 и 44

часами от начала культивирования. Как отмочено ранее, эти данные правомерно отнести к КОКф и можно сделать вывод о том, что к концу 2-х суток все КОКф вступают в пролиферацию. Формирование строгальных колоний требует дополнительной КСА в течение первых 6-8 ».птозов, а затем, судя по размерам колоний, становится независимым от нее. Это, по-видимому, связано с проявлением аутокринной активности стромальных фибробластов, которая, как оказалось, действует не только на потомки КОКф, но и на сами КОКф, обеспечивая прохождение ими тех же первых 5-8 митозов, которые нуждаются в присутствии КСФ, выделяемого тромбоцитами. Известно, что ау-токринная регуляция наиболее характерна для трансформирующих ростовых факторов. Не исключено, что тромбоцитарная и аутокринная КСА имеют одинаковую природу.

Выделенный в последние годы БСГ - фактор роста стволовых клеток( СКК) продуцируется почти всеми фибробластами, в том числе и строгальными фибробластами костного мозга. Он мог быть гшоке претендентом на роль аутокринного стимулятора. Однако, судя по предварительному сообщению (А. Я. Фриденштейн, 1993) , БСР не вызывает вступления КОКф в пролиферацию. При реклонировании первичных культур субклоны образуются, как показано методом "тимиди-нового самоубийства" . из потомков КОКф, входивших в состав про-лиферативного пула первичных колоний. Пролиферация стромальных фибробластов продолжается при этом без 1ай-фазы. Те не клетки, которые вышли из пролиферативного пула, остаются в составе первичных колоний не менее 7 дней.

Следует отметить, что в течение первой недели после эксплантации пролиферация КОКф и их потомков требует не только сывороточных факторов (РЭСР и факторов прогрессии), но и фактора(-ов) , продуцируемой» сопутствующими кроветворными клетками.

Изучение различных категорий кроветворных и лимфоидных клеток показало, что КСА связана только с популяциями, содержащими мегакариоциты и тромбоциты. Однако она не идентична РЮСР. Показано, что для проявления КСА не нужны межклеточные контакты между КОКф и фидерными клетками. Эти результаты подтвердились (Фриденштейн и др.,1991) в системе, где эти две категории были разделены -ембранами, что позволило сделать вывод о существовании колониес-тлмулирущего фактора для КОКф, содержащегося в тромбоцита?:. Предложенная в рассматриваемом исследовании модель культуры адгезивных клеток костного мозга позволяет различать факторы, которые

влияют на пролиферацию КОКф и их потомков,действуя непосредственно на сами стромалыше механоциты или опосредованно через сопутствующие кроветворные и лимфоидшо клетки.

3.5. ■ истогенетическое происхождение клопогонных стромальных предшественников костного мозга.

Присутствие предшественников фибробластных колоний наряду с предшественниками различных ростков дифференцировки- гемопоэтичес-кой ткани в составе костного мозга но является доказатсльтвом их общего происхождения из стволовой кроветворной клетки. В классических работах по дискримонтному анализу костномозговых механо-цитов ( Куралесоаа А.И., Фридеимтейн А.Я.. 1968) показано, что микроокружение при гстсротропмой трансплантации переносится кустками, которые не являются кроветворными. Эти результаты указали на присутствие в костном мозге гистогенетичегки независимой от кроветворных клеток линии стромальных механоцитов. Удобной моделью для изучения взаимоотношений различных популяций процессорной и лимфоидной ткани являются химеры. Во-первых, это радиационные химеры, у которых кроветворная и лимфоидная ткань замещается потомками донорских стволовых кроветворных клеток. Во-вторых, это животные - реципиенты, которым трансплантировали кроветворный ор-ган(костный мозг, селезенку). В этом случае трансплантат заселяется реципиентскими стволовыми кроветворными клетками и их потом-кали. Происхождение клокогенных стромальных предшественников в условиях химеризма кроветворных органов мы определяли в работе, выполненной совместно с А.А. Ивановым - Смоленским и др. (1978) .

Семисингенных химер получали внутривенным введением 10® костномозговых клеток мышей СВА летально облученным мышам (СВАхС57В1 /6 ) Р1. Гетеротопный орган гемопоэза у мышей ( СВА х С57В1/6) Р1 получали трансплантацией фрагмента костного мозга от мьшей СВА.

Линейную принадлежность фибробластных колоний в культурах клеток гстср'-топного органа гемопоэза и костного мозга радиохимер исследовали иммуногисгохимическим методом флюоресцирующих антител с изолинейной СВА - адти - С57В1/6-сьтороткой. Все 62 фиброб-ластиыс колонии в культурах костномозговых клеток радиохимер давали положительную окраску с сывороткой, а все 30 колоний из ге-тсротопного трансплантата не связывали ее. Это означало, что фиб-робластные колонии в культурах костного мозга радиохимер имели гаплотил реципиента, в отличие от кроветворных клеток, имсал"-донорский гаплотил. То есть,при внутривенной трансплантации п.-'

си костномозговых клетск у реципиента не найдено донорских стро-мальных клопогонных клеток. Наоборот, в случае солидного гетеро-топного трансплантата костного мозга все клоногенные стромальные клетки были донорского гаплотипа, l отличие от кроветворных клеток реципиента, мигрировавших в трансплантат.

Однако, представленная работа имела существенный методический недостаток, т.к. флюоресценция фибробластов, связывающих изо-линейную антисыворотку, чрезвычайно слаба и находится на грани распознавания. Поэтому нами была предпринята попытка разработать метод определения линейной принадлежности стромальных колоний с помощью цитолитических лимфоцитов в монослойных культурах кроветворной ткани.

■ С этой целью использовали цитолитические лимфоциты, полученные иммунизацией in vivo и in vi tro. В обоих случаях это были лимфоциты мыией СБА (Н2к ) , иммунизированные против клеток С5731/6 (Н2Ь).

Постановка цитолитической реакции.

На 8 день после эксплантации в отмытых от фидера культурах костного мозга мышей СБА.(СБА х С57В1/6) F1, и смеси СБА + F1 (1:1). отмечали под инвертированным микроскопом колонии, содержащие более 100 фибробластов, и в часть культур добавляли лимфоциты-кил-лоры. полученные в M.LC или из перитонеального экссудата из расчета 0,5 - 10 х 106 живых лимфоцитов на матрас. Культуры с лимфоцитами инкубировали при 37 9да тех пор, пока на матрасах с культура-mi костного мозга мышей F1 не происходил полный лизис отмеченных колоний. Длительность инкубации зависела от количества лимфоцитов и составляла обычно 18-40 часов.

На фиксированных и окрашенных культурах под микроскопом среди отмеченных колоний подсчитывали число лизированных и сохранившихся клонов.

При получения иммунных лимфоцитов в MLC оптимальной оказалась доза 3 х 10 лимфоцитов на 25 см^ матрас, где росли 50 - 100 фибробластных колоний. Оптимальное количество киллеров, полученное из перитонеального экссудата оказалось 5 х 10^ лимфоцитов. Использование больших доз (10?) лимфоцитов приводило к аутокиллинг гу, при меньших дозах (10®) лимфоцитов не проходил полностью лизис полуаплогеннкх колоний F1. Данные по лизису в культурах смеси к;; ток костного мозга мыией СБА и F1 (1:1) показали незначительную разницу (0 - 850 мевду количеством отмеченных лизированных

колоний и теоретически рассчитанным числом колоний, которые должны быть лизированы в такой смеси. Ожидаемый лизис определяли, исходя из эффективности клонирования каждого из компонентов смеси при раздельном культивировании. Совпадение реального и ожидаемого процента лизированных колоний в смешанных культурах, с помощью которых I моделировали возможную ситуацию в кроветворной ткани химер, позволило нам сделать вывод о пригодности разработанного метода для изучения происхождения клоногенных стромальных пред-'шественников.

3.5.1. Происхождение клоногенных стромальных предшественников в костном мозге радиационнных химер.

18 летально облученным мышам СВА через 6 часоз вводили внутривенно по 4 х 10' клеток механически дезагрегированного костного мозга мымей (СВА х С57В1/6) Е1. При эксплантации костного мозга доноров показано, что в составе трансплантированных клеток было введено 3200 КОКф.Пул костного мозга из бедренных костой 4- 5 выживших химер из 3-х партий либо механически дезагрегировали, либо обрабатывали трипсином (60 дней химеризма) . Обг>. типа взвесей эксплантировали для определения ЭКОф и обработки киллерами. На механически дезагрегированной взвеси ставили цитотпксичсскую реакцию с анти-С57В1/6-сывороткой. Судя по цитотоксическому индексу. во всех 3-х партиях химер практически все костномозговые клетки были донорского происхождения. В культурах костного мозга химер из 224 отмеченных колоний одна была лизирована полностью, а 7 - частично, что в суше составило чуть больяе 3%, т.е. доля колоний. подвергшихся киллингу в культурах как механически дезагрегированного, так и трипсинизированкого костного мозга была одина-копой и находилась в пределах величины возможного аутокиллннга. Т.о., судя по данным цитотоксической реакции, кроветворные клетки в костном мозге радиационных химер имели донорское происхождение, а клоногенные стромальные предшественники, потомками которых в культуре« являются фибробластные колонии, принадлежали реципиентам. То же самое можно сказать о других 4 партиях описанных химер, у которых механически дезагрегированный костный мозг эксплантировали на 1, 31 и 45 дни химеризма. Химер 2-й группы (облученные реципиенты (СВА х С57В1/6) Р1, а доноры костного мозга -мыши СВА) исследовали по той же схеме, что приведена для 1-й группы. Цитотоксичсский индекс с анти-С57В1/6-сывороткой и среднем составил 0.08 0.04, т.е кроветворные клетки костно о мозга

практически осе имели донорское происхождение. У выживших химер этой группы (31 и 67 дней химеризма) цит^литическими лимфоцитами обрабатыоали стромальные колонии в культурах и механически дезагрегированного (отмечено 57 колоний) и трипсинизированного (отмечено 69 колоний) костного ыозг . 100% колоний подверглись лизису, т.е. имели галлотип И реципиентов. Приведенные данные означают, что костномозговые КОКф, потомками которых являются стромальные колонии, у радиационных химер имели реципиентское происхождение. .

3.5.2. Происхождение клоногенных стромальшх предшественников в кроветворной ткани гетеротопного трансплантата. Содержимое медуллярной полости бедренных костей мышей СБА трансплантировали под почечную капсулу мышей (СБА х С57В1/6) Р'1. Спустя 9 - 16 месяцев извлекали образовавшийся на месте трансплантата эктопический костномозговой орган. Фрагменты кроветворной ткани дезагрегировали механически, либо трипсинизировали для приготовления клеточной взвеси. Число клеток в трансплантатах составило 17 - 32 х 10®, а цитотоксический индекс с анти-С57В1/6-сывороткой и комплементом - от 0.15 до 1,0. ЭКОф трансплантата не отличалось от ЭКОф обычного бедренного костного мозга. Всего киллерами обрабатывали культуры кроветворной ткани из 18 трансплантатов, которые эксплантировали порознь. В культурах механически дезагрегированных и трипсинизированных клеток было отмечено почти 1400 стромальшх колоний. Доля полночью и частично лизированных колоний не превышала 4%, т.е. была соизмерима с величиной аутокиллинга колоний костного мозга мышей СБА. Т.о.. фиброГ пастные колонии и. следовательно.стромальные предшественники имели гаплотип донора.

3.5.3.' Действие цитолитических лимфоцитов на ЭКОф в культурах костного мозга радиац! иных химер.

Поскольку было желательно получить модификацию метода, позволяющую исследовать всю популяцию КОКФ. а не только предшественники крупных колоний, необходимо было обеспечить в культурах равномерное поддержание .соотношения числа киллеров с-мишенями (КОКф или их потомками). Можно было бы обрабатывать киллерами исходную взвесь костномозговых клеток до эксплантации, а затем,проведя 1-2-час. адгезию КОКф,отмыть культуры от неадгезивных клеток (в том числе, от киллеров) и учитывать как обычно ЭКОф в 10-дн. культурах. Однако, известно, что киллинг фибробластов требует более 17-час. контакта киллер-мишень. Это справедливо и для фиброб-ластог костного мозга: первые признаки лизиса стромальных колоний

ш отмечали после 20-час. контакта с киллерами. Показано, что после эксплантации КОКф быстро прикрепляются, в течение 2-х суток постепенно распластываются и асинхронно вступают в первый митоз. Поэтому для экспозиции КОКф с цитолитическими лимфоцитами были выбраны 3-4-суточные культуры. В это зремя культур» состоят, в основном, из 4-8- клеточных колоний. Режим инкубации культур с киллерами, добавленными в количестве 10 на матрас, обеспечивает совпадение реальной и ожидаемой ЭКОф в смешанных культурах, обработанных киллерами, что позволяет использовать разработанную систему для изучения: происхождения КОКф в смешанных по гаплотипу популяциях кроветворных клеток. Для изучения происхоа-дения КОКФ нами были выбраны химеры с ;,-дн. сроком химеризма, что должно было выяв- • соотношение донорских и реципиентских КОКф без наложения ;.^.следующих процессов регенерации популяции строгальных предшественников. Через сутк'< после облучения мышам СВА вводили по 4 х ¿0 ( клеток костного мозга мышей СВА (6400 - 8000 КОКф) или б х 10клеток мышей ?\ (3000-4700 К0Кф).4-дн. культуры костного мозга сингенных ; ли семисингснных х^мес обрабатывали киллеров в точение 24 часов. Оказалось, что в обработанных и необработанных культурах ЭК0Ф не различалось, т.е. не было лизиса колоний. Следовательно, у семисингэкных химер ;<0Кф имели гаплотип реципиента - мышей СВА (табл. 1).

ТоЛдица 7.ДеЯст»иб СВА-енти-Е! 4 цитотохсических пимфоцкто»

на число фи<5ровластных квлоииЯ а культурен костного мозга 1 - на. раяиацношал химер

Линия донора Лини» реципиектг. Сйравотка культур киллерами Число клеток па аат- рас Числ колоний фиЗроЛластоэ на матрас.

СВА Р1 ~ СВА М СВА ♦ ♦ ♦ 2x10° 2хЮ6 ГО6 32 ♦ 4 31 * 7 31+5 28 1 6. ««£!

СВА . С1 Р) о СВА аи. £ СВА ♦ ♦ 2, 1хЮь 2,?хЮ5 Ю5 41 * 5 40 ? 3 19 ♦ 4 19 Т 5 78 ♦ 4 бтт х

На основании представленных данных можно сказать, что разработан метод, позволяющий с помощью цнтолитических лимфоцитов распознавать, а при необходимости и элиминировать в смешанной популяции мишеней клоногенные стромальные предшественники кроветвоп-ной ткани, несущие антигенные детерминанты, к которым ишунны

киллеры.

Обе представленкые кодификации метода дополняют друг друга. Так обработка киллерами сформированных колоний позволяет изучать происхождение.того или иного компонента стромы. имеющего морфологические маркеры. Это особенно важно для минорных компонентов, поскольку их присутствие не сказывается существенным образом при определении ЭКОф.

Разработанный метод для изучения происхождения стромальных предшественников позволил определить, что КОКф являются местными элементами, т.е. не способны к репопуляции и не замещаются потомками стволовых кроветворных клеток во взрослом организме. В костном мозге радиохииер КОКф принадлежат реципиенту и не обновляются за счет клеток донора.

3.6. Гетерогенность стромальных колониеобразующих клеток по связи с тканевыми структурами костного мозга.

Клетки, образующие колонии стромальных фибробластов в культурах, содержатся в суспензии костномозговых клеток в очень малой концентрации - не более 1-3 КОКф на 104 кроветворных клеток. Од-гечко, п срезах и магмах костного мозга стромальные элементы - ретикулярные клетки всех типов - составляют до 336 от общего числа ядросодеркащих клеток, т.е. менее 1% стромальных элементов обнаруживают клопогонные свойства. Мошо предполагать, что остальные стромальные элементы либо лишены клоногенных свойств, либо, будучи пр- -но связанными в структурах костного мозга, лишаются колони-еобразуюцей способности в результате частичного повреждения в процессе суспензирования ткани.

Нами была предпринята попытка увеличить ЭКОф костного мозга с помощью предварительной ферментативной обработки фрагментов кроветворной'ткани.

• В качестве тканевых дезинтеграторов использовали трипсин, трипсин+ЭДТА, проназу и коллагеназу (табл. 8).

Трипсинизация мышиного' костного мозга бедренных костей привела к 10-кратному росту ЭКОф. Сходный результат получен при обработке костного мозга морской свинки и мышей коллагеназой, трипсином + ЭДТА, а также последовательной обраипткой трипсином и

Таблица 8. Нлг не 4»Гм'нтМыно1 оСреботкж «оотнаго юзга аа ай>ехтшнзег» кэлэнвеобрамаанил. :

Донора ¡Обработка ¡Число акс- ¡Числа колонка каинам ¡комнаг» ;алаит«равакних:* культурах мозга :иоэга :клетэ^ |05 ;

Число КОК® на Ю5 клеток

!Дарсмв Механическая

-------- /шприц/

ТрилО1и/0,25Х/

5,3

СЫ1ЯК1 /впр»

/трилои/0,25Х/ 1,0

^Трипсвя/О.ОеЯ/ 1,0

■^Прошв/О, 1$/ 0,3

'Прояаза/0Л%/ 1.0

70, 71, 74

298, 329, 1540 308, 319, 353 92,124, 131 242. 271. 2Я8

1.4

32,2

32.6 34,0

26.7

Миш Р. Механическая /СВАХС57 /сорил/

в^/гриясы^о.гб*/ » ЭДТА

Зх20ушн,А Каллагеназа

3x60 иин./ Тсвпсяя , /0,25*;30м1!Я./ . * кодлагечаэа , /0,№37с,60ми1/

7,0 0.5 0,5

0,9

0,5

301, 348, 360 179, 191, 204 82, 85, 141

4.1

33,2 20,6

213 / 224 , 244 25,2 112, 149, 162 28,2

коллагенаэой. В процессе трипсинизации не отмечается гибели значительного количества костномозговых клеток, что могло бы при высокой выживаемости КОКф быть причиной резкого увеличения их концентрации. Это подтвердилось в опыте, в котором сравнили ЭКОф костного мозга, целиком обработанного трипсином, и костного мозга, в котором трипсином обрабатывали только плотно связан! .ыа структуры, предварительно отделив легко вымывающиеся клетки. Следует отметить, что после трипсинизации костного мозга размеры вырастающих стромальных колоний не меняются, т.е. пролиферативный потенциал КОКф. прочно связанных в тканевых структурах, по-видимому, не отличается от потенциала легко выделяющихся КОКф. Стро-мальные предшественники костного мозга, дезагрегированного с помощью трипсинизации фрагментов кроветворной ткани, проявили столь кв выраженные адгезивные свойства, что и КОКф механически приготовленных взвесей. Судя по ЭКОф и числу фосфатазополоаительных колоний, дезагрегация костного мозга механическим путем высвобождает практически все слабо связанные стромальные к етки (в основном, фосфатазоотрицательные).а трипсинизация - прочно связанные -преимущественно фосфатазополокительные. Для сравнения формообоа-зовательных потенций популяций слабо- и лрочносвязанных стромаль-

ных предшественников мы разработали метод переноса кроветворного микроокружения клеточными взвесями. Позднее, усовершенствовав метод, Фридснштейн и др.(1982) показали, что трипсинизированный костный мозг гораздо более эффективен в образовании кости и переносе кроветворного микроокружениг.

9956 стромальных клеток костного мозга не способны прикрепиться к субстрату либо потому, что не обладают этим свойством, либр в процессе приготовления суспензии повреждаются таким образом. что теряют эту способность (в мазках и срезах костного мозга содержание ретикулярных клеток одинаково). Ферментативная обработка кроветворной ткани, которая, как известно, не увеличивает высвобождение кроветворных клеток-предшественников, позволила увеличить эффективность колониеобразования стромальных клеток в 10 раз, т.е. после трипсинизации костного мозга уже 10Х стромальных клеток проявляют в культурах способность к пролиферации. Как и в случае механической дезагрегации, большинство фибробластов. обнаруживаемых в 24-час. культурах, способны стать клоногенными клетками. Обработка субстрата поли-1-лизином не увеличивала числа КОКф. Выделяемые с помощью трипсина КОКф дают начало колониям, клетки которых синтезируют коллаген I типа и не отличаются по этому и некоторым другим признакам (изученные рецепторы, антигены. маркеры) от фибробластов в колониях, вырас аюцих в культурах механически дезагрегированного костного мозга. Гетерогенность стромальных"предшественников по прочности межклеточных связей оказалась свойственной не злько кроветворной, но и лимфоидной ткани (Фриденштейн и др.,1981).

' Результаты представленного исследования по гетерогенности прочности межклеточных контактов стромальных предшественников были подтверждены на костном мозге мышей (Р1оегаасЬег. 1985).- Однако, н при ферментативной обработке лишь меньшая часть стромальных клеток костного мозга обнаруживается в культурах и дает начало стромальным колониям. Судьба остальных стромальных элементов, способы их выделения и формообразовательные потенции подлежат изучению.

3.7. Радиочувствительность и пострадиационные изменения костнг'чзговых стромальных механоцитов.

Пострадиационные иг-енения кроветворения зависят прежде всего от повреждений собственно гемопоэтических клеток. Кроме того, в результате облучения происходят изменения в гемопоэтичес-кой строме, которая обеспечивает поддержание пролиферации и диф-ференцировки кроветворных клеток.

3.7.1. Определение радиочувствительности КОКф.

Радиочувствительность КОКф определяли по кривой выживания КОКф костного мозга из бедренной кости, облученного In vitro. Были построены три кривые выживания КОКф костного мозга, облученного i г, vitro в виде взвесей, фрагментов или 2-час. культур, которые отражают степень сохранения колониеобраэования облученным костным мозгом по сравнению с тем же необлученным. Кривая 1 (облучение суспензий) и кривая 2 (облучение фрагментов) имеют практически одинаковые параметры (рис.5 ): Do 1,87 * 0,16 Gy и 1.93 ■» 0. 56 Gy и п - 1, 5. ЭКОф была аддитивна, когда костномозговые клетки, облученные (1,5 или 8.0 Су) и необлученные, эксплан-тировапи как смеси или отдельно.

^'Г**** ■ ОС."ЛГ, -э.гт шорс.щ, Г*е 6. ...р.«. в«т„ (|| т KOU ftl

,„.», - —I" • ««• ■»""»— 111 ... .„г. .„„„^ „.р,,^

»•«'«• uemixw мрс.,1 , „ш , Я)(1, , w Q/(g)

В опытах, где культуры облучали через 2 часа после эксплантации костного мозга.' определили Со и п для КОКф. уже адгезированных на кульгуральной поверхности. Их значения (Бо 2.16 + 0.02 Су и п ■ 1.2) не значительно отличаются от соответствующих величин для КОКф до их выделения из тканевых структур (во фрагментах) и до прикрепления к к>льтуральной поверхности (в

суспензии). Определяли радиочувствительность потомков КОКф, входящих в состав стромальных колоний : первичных культурах и даищих начало новым колониям при реклонировании. Кривая их выживания характеризовалась Бо 1, 26 Су и п •• 2, 3.

3.7.2. Влияние общего сЗлучения на численность КОКф в костном мозге.

Количество КОКф с костном мозге бедренной кости определяли, исходя из числа ядросодеркащих клеток в нем и его ЭКОф. В каждом опыте параллельно культивировали костный мозг от облученных и необлученных доноров.

Через 15 минут после облучения 4 йу численность КОКф в бедре упала до 29% от нормы, через 6 часов она возросла в 2,5 раза и приблизилась к норме. Затем эта величина начала вновь падать и на 48 - 120 часов стала ниже, чем сразу после облучения. Позже численность КОКф снова увеличивалась. При эксплантации костного мозга нормальных и облученных животных как в смеси, так и отдельно, величины ЭКОф были аддитивны. После 1,5 Су кривая*содержания КОКф не отличалась от описанной для 4 Су, с той разницей, что степень выживания КОКф сразу после облучения выше (6815), а спустя 6 часов их численность несколько превышала норму. После 16 йу КОКФ в течение суток не выявлялись, в том числе и через 6 часов.

3.7.3. Изменение численности КОКф после местного облучения.

При определении влиянии местного облучения на КОКф сравнивали содержание КОКф в большеберцовых костях облученной и экранированной конечности морских свинок. Предварительно было выяснено, что по содержанию КОКф правая и левая больаоберцовые кости нормальных животных практически не различаются, а экранирование достаточно эффективно защищай костный мозг при облучении. Поэтому при определении числа КОКф в облученной голени можно использовать в качестве контрольной величины число КОКф в экр нированной голени.

В экспериментах, результаты которых представлены на рисунке 6. число ядросодержащих клеток и КОКф в облученной голени были представлены как процент от соответствующих величин для экранированной голенк того же облученного животного. После местного облучения в дозе 4 Су пострадиационная аплазия достигала максимума на 3 - 5 сутки. Позже численность клеток костного мозга быстро нарастала, приближаясь к норме на 14 - 15 дни. Динамика числе! ости КОКф была иной. Облучение поражало до 8036 КОКф.

однако через 6 часов их количество резко увеличивалось. Далее число КОКф снова начинало падать, достигая минимума к 3-м суткам. В течение следующей недоли и вплоть до 3 месяцев численность КОКф постепенно нарастала, оставаясь, однако, ниже нормального уровня. В период восстановления кроветворения в облученной конечности степень восстановления численности ядросодеряащих клеток костного мозга всегда была выше уровня регенерации численности КОКф.

После местного облучения в дозе 20 Су динамика численности ядерных клеток костного мозга до 20-х суток была сходна с таковой для конечностсл, облученных в дозе 4 Су, но КОКФ в течение этого периода практически отсутствовали. Начиная с 3 недель и до 4 месяцев развивалась вторичная аплазия костного мозга, хотя и менее глубокая, чем первичная. Численность КОКф в этот период не превышала 1 - 3/6 от нормы, т. е. практически не восстанавливалась.

Число клоногенных ;тромальных клеток мы оценивали по количеству колоний - клонов, состоящих не менее чем из 50 фибробластов. При т?"ой оценке в разряд погибших после облучения могут попадать колониеобразующие клетки, которые либо утрачивают способность к более чем 5 последовательным делениям, либо перестают прикрепляться к поверхности стекла, либо не переносят обычную травму, связанную с эксплантацией. Как выяснилось, радиационная инактивация клоногенных стромальных клеток зависит не от повреждения их адгезивных свойств, так как получено практическое совпадение величины Ро при облучении костного мозга в суспензии и после прикрепления его клеток к поверхности культурального сосуда. Степень подавления эффективности клонирования оказалась одинаковой при облучении клеточной взвеси и фрагментов костного мозга. Отсюда следует, что облучение не увеличивает чувствительность клоногенных стромальных клеток к одному из наиболее травматичных воздействий, связанных для механоцитов с процедурой клонирования - разобщение клеток при приготовлении клеточной взвеси. Эти же опыты показывают, что различие в кислородном обеспечении КОКф во г ^мя облучения костного мозга в виде мелких фрагментов или клеточных взвесей не влияет на их выживаемость. В целом, хотя клонирование являемся культуральным феноменом и имеет все соответствующие ограничения.

можно считать, что основную роль в радиационной инактивации стромальных колонисобразующих клеток. В' лвляемых этим методом, действительно играет повреждение их способности к пролиферации.

Вторичные КОКф. дающие начало колониям при реклонировании костномозговых фибробластов мс ,>ской свинки, как показано в этой работе, имеют более высокую радиочувствительность, чем КОКф. Однако, она совпадает с радиочувствительностью пассированных костномозговых фибробластов человека (Castro - Malaspina, 1984); п в. том и другом случае больше 1. По-видимому, КОКФ имеют сходные параметры радиочувствительности in vitro и in vivo, так как доля их выкивыния сразу (через 15 мин. ) после общего облучения животных в дозе 1,5, 4 и 16 С-у вполне укладываются на представленную кривую радиорезистентности in vitro. Клонирование позволяет обнаружить изменения в стромс костного мозга уже после облучения в дозе нескольких Gy и проследить за характером пострадиационных изменений в разные сроки после облучения. Уменьшение численности КОКф сразу после облучения животных находится в " соответствии с величиной радиочувствительности, полученной при облучении клеток костного, мозга in vitro. Однако, через 6 часов число КОКф значительно возрастает. Наблюдаемое увеличение за столь непродолжительный промежуток времени нельзя объяснить делением оставшихся после облучения стромальных предшественников, для которых Т. определенное in vitro, составляет 18-20 часов. Поскольку это увеличение происходит как после местного, так и после общего облучения. причиной его, по-видимому, не является миграция КОКф в облученный костный мозг из других органов. Скорее, оно является результатом репарации потенциально летальных повреждений, характерных для покоящихся клеток, к которым относятся, как нами показано, КОКф in situ. Другим объяснением может быть либо "рекрутирование" в число клоногенных клеток ранее неклоюгенных и неад-гозипных механоцитов; либо в суспензию костномозговых клеток попадает дополнительное число КОКф из выявленной нами фракции механоцитов, прочно связанных с тканевыми структурами, в результате ослабления этих связей после облучения. 2 - 3-кратное увеличение числа КОКф в течение первых 6 часов, носит абортивный характер и сменяется падением численности КОКф. Такая динамика подтвердилась и при облучении мышей в дозе 1,5 Gy (Горская, .1975). При облучении морских свинок в дозе 16 Gy КОКф ни сразу после облучения, ни п бли* "шше 24 часа но выявлялись. Это соответствует данным о ра-

диочувствительности КОЮ" Видимо, после 16 Су не срабатывает ни один из механизмов, обеспечивающих абортивный 6-часовой подъем численности КОКф. Дополнительное падение числа КОКф (с минимумом на 3 - 5 сутки) по сравнению с их количеством, оставшимся сразу после облучения, напоминает падение численности СКК у мышей после облучения в небольших дозах. Можно предположить, что для стромальных предшественников, как и для СКК, этот процесс связан с тратой части их на восполнение пула дифференцирующихся из них клеток. В дальнейшем после местного облучения в дозе 4 Су происходит постеганное увеличение численности стромальных клеток -предшественников со временем удвоения 30 - 35 час. Начиная с 10 -12 суток темп регенерации снижается.

Необходимо отметить, что при местном облучении источником регенерации КОКф может быть не только пролиферация предшественников, но и репопуляция из необлученных участков костного мозга. Однако, учитывая, что динамика восстановления численности КОКф сходна при местном и общем облучении, можно предположить, что КОКф не мигрируют из неоГ ученных в облученные участки костного мозга, т.е. относятся (в противоположность гемопоэтическим клеткам), к нерепопулируг-'им клеткам кроветворной ткани.

Представленные здесь данные могут служить указанием на то, что КОКф несут ответственность за поддержание и обновление стромальных структур, вырабатывающих факторы микроокружения, и что время сохранения этих структур (срок жизни) при отсутствии обновления составляет, видимо, несколько недель.

ВЫВОДЫ.

1. Получены основные характеристики новей категории клеток -предшественников кроветворной и лимфоидной ткани, которые ответственны за организацию специфического микроокружения.

2. На основании специфических синтезов, антигенных и других маркеров, а также клеточных рецепторов определен клеточный тип этих предшественников. Показано, что клетки, переносящие микраок-ружение. являются ф.ибробластами. т.е. относятся к механоцитам, создающим каркас органов гемопоэза и иммунитета, включая его клеточный и межклеточный компоненты.

3. В сингенной системе с использованием хромосомного и изотопного маркеров установлено клональное происхождение колоний стромальных фибробластоо. Изучение экиы! актируемой и адгезивной

популяций костномозговых клеток показало, что родоначальниками одиночны;: колоний являются отдельные стр-сальные фибробласты.

4. Выявлены 2 субпопуляции клеток, образующих колонии фиб-робластов (КОКф) , отличающиеся по прочности межклеточных контактов в тканевых структурах кр- зетворных и лимфоидных органов. Предложен метод для выделения с помощью энзшатичоской обработки костного мозга Фракции КОКф, обогащенной предшественниками, переносящими кроветворное микроокружение.

Ь. Клетки, дающие начало стромальным колониям в культурах кроветворной и лимфоидной ткани, относятся к высоко адгезивным элементам.За первые 30 мин. после эксплантации 80 - 90% КОКф прикрепляются к культуральной поверхности.

6. Установлено, что стромальныс предшественники костного мозга in situ находятся вне пролиферативного пула.

7. Для пролиферации КОКф и их ближайших потомков in vitro необходимы не только сывороточные ростовые факторы, но и факторы, продуцируемые кроветворными клетками. Более S01S фибробластов, выявляемых в 24-час. культурах интактных кроветворных клеток, являются КОКф, т.к. при наличии колониестимулирующей активности способны давать начало клонам стромальных клеток. Колониестимулирую-щая активность кроветворных клеток не видослецифична и проявляется только теми популяциями, в состав которых входят мегакариоциты и тромбоцита. Колониестимул...рукщая активность не связана с наличием в них PDGF и проявляется только на фоне высокой концентрации сыворотки, содержащей PDGF и другие фактоу . Более поздние потомки КОКф продуцируют в достаточном количестве активность, обеспечивающую аутокринную стимуляцию их пролиферации и- пролиферации КОКф.

. 8, Разработан метод с использованием иммунных цитотоксичес-ких-лимфоцитов, с помощью которого на семисинго'чых системах показано, что костномозговые клоногенные стромальные фибробласты являются местными элементами и не мигрируют между органами гемо-поэза. Во взрослом организме они способны к построению микроокру-кения и самоподдержанию независимо от стволовых кроветворных клеток (СШ в течение времени, соизмеримого с длительностью существования организма, т. е. являются гистогенетически независимыми от СКК.

9. С помощью цитотоксических лимфоцитов установлено, что КОКф н приживляются в костном мозге облученного реципиента при

внутривенно« трансплантг ■ ;ии взвеси костномозговых клеток.

10. Впервые показана возможность формирования нового кроветворного органа при гетеротопной трансплантации взвеси костномозговых клеток, что существенно расширило возможности исследования закономерностей морфогенеза и роли в нем отдельных клеточных популяций.

11. Исследованы возрастные изменения содержания клоноген-ных стромальных предшественников в органах первичного и вторичного иммунитета. Показано отсутствие прямой корреляции между динамикой общей неточности органа и содержанием КОКф в костном мозге и селезенке. В процессе инволюции тимуса содержание КОКф о нем падает до 0.

12. Изучено пространственное распределение клоногенных стромальных предшественников в костном мозге трубчатых костей. • Концентрация КОКф (слабо и прочно связанных) в периферической части медуллярной полости в 1,5 - 2,5 раза выше, чем в ее центре. Такое распределение КОКф коррелирует с распределением наименее зрелых предшественников кровотвс ,.жых клеток.

13. Исследованы радиочувствительность и закономерности пострадиационной кинетикг клоногенных костномозговых фибробластов. ответственных за установление специфического микроокружения. Показано, что стромальные предшественники более радиорезистрчтны, чем стволовые кроветворные клетки и они могут полностью или частично восстанавливать свою численность после радиационного повреждения организма. Строма, лишенная клоногенных предш'ественникои в результате облучения, не способна к обновлению и поддержанию ге-мопоэза.

14. Разработана модель клонирования стромальных предшественников, позволяющая изучать.эту новую клеточную популяцию, и факторы, влияющие на пролиферацию и свойства этих клеток. Выявлены маркеры и исследованы характеристики, необходимые для идентификации стромальных клеток - предшественников, ответственных за организацию микроокружения в органах гемопоэза и иммунитета. Разработаны приемы для отделения этих клеток от других элементов популяции. .

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ПРЕДСТАВЛЕНЫ И ОБСУЖДЕНЫ НА :

1. Всесоюзном симпозиуме по вопросам консервирования, культивирования и типирования костного мозга. Москьл, 1971; 2. Всесоюзных конференциях по радиационной hmi.., нологии и микробиологии. Москва, 1972, 1977;' 3. Всесоюзной гистологической конференции, посвященной 50-летию образования СССР. Ленинград, 1972; 4. VIII Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов. Ташкент, 1974; 5. Всесоюзной конФерен чм по общей и прикладной иммунологии. Москва. 1974; 6. I Всесоюзном съезде гематологов и трансфу-зиологов. Москва, 1979; 7. IX Международном симпозиуме по сравнительному изучению лейкозов и родственных заболеваний. Сухуми, 1979; 8.Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии". Москва, 1981; 9. Международном симпозиуме "Стромальная и Т-кле-точная регуляция кроветворных стволовых клеток" . Москва, 1984; 10. Всесоюзной конференции "Вопросы иммунологии и молекулярной биологии" . Нальчик, 1981; 11. Всесоюзном симпозиуме "Кроветворные клетки - предшественники в механизмах повреждения и консолидации системы крови при действии на организм экстремальных факторов" . Челябинск. 1986; 12. Всесоюзном обществе иммунологов. Москва, 1986, 1989; 13. Всесоюзном обществе анатомов, гистологов и эмбриологов. 1972, 1987, 1990; 14. 1-й международной конференции памяти A.A. Максимова. Гамбург, 1987; 15. Ежегодной конференции по остеогенезу. Кембридж, 1989; 16. Междунаоодном симпозиуме "Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка" М.-Л. ,1990.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кроветворная ткань в органных и монослойных культурах.-Вестник АМН СССР. -1970. -N7. /соавторы: Фриденштейн А. Я., Лурия Е.А., Чайлахян Р. К./.

2. Изучение фибробластоподобных клеток в монослойных культурах эмбриональной печени,- Бюлл. экспер. Ьиоп. и мед. -1971. -N6. /соавторы: Кейлис-Борок И. В. /.

3. Определение пролифервтивного пула и длительности митоти-ческого цикла в колониях фиоообластоподобных клеток в монослойных культурах костного мозге.. -Бюлл. экспер. биол. и мед.-Í971.-N7./соавторы: Кейлис-Борок И. В., Епихина С.Ю./.

4. Динамика формирования колоний фибробластов в монослойных культурах костного мозга по данным включения У тимидина. -Цитология.-Í971.-N11./соавторы: Кейлис-Борок И.В., Ьпихина С.Ю., Фриденштейн А. Я./.

5. Концентрация клеток - предшественников для колоний фибробластов, возникающих в кроветворной и лимфоидной ткани. -Материалы всесоюзного симпоз. по ^опросам консервирования, культивирования и типирования костного мозга.-Москва.-1971./соавторы: Кузь-менко Г. Н.. Фриденштейн А.Я./.

6. Способность предшественников колоний фи робластоподобных клеток, вырастающих в монослойных культурах костного мозга, включать Н-тимидин In vivo.-Материалы всесоюзного симпоз. по.вопросам консервирования, культивирования и типирования костного мозга. -Москва. -1971. /соавторы: Кейлис-Борок И. В., Дериглазова Ю. Ф./.

7. Влияние облучения донора на количество костномозговых клеток - предшественников для колоний фибробластов. выращенных в монослойных культурах. -Материалы всесоюзного симпоз. по вопросам консервирования, культивирования и типирования костного мозга. -Москпа.-1971./соавторы: Кейлис-Борок И.В./.

S. Изучение динамики формирования очагов фибробластов в монослойных культурах костного мозга морской свинки.-Архив анатомии. гистологии и эмбриологии.-1972.-N2./соавторы: Кейлис-Борок И. В./.

9. Пролиферативная активность предшественников стромальных элементов кроветворной т-нни. -Материалы научной гистологической конференции. -Ленинград. -.J72. /соавторы: Кейлис-Борок И.В./.

10. Характеристика костномозговых клеток - предшественников для фибробластоиодобных клеток по включению ими Н-тимидина.-Бюлл. экспор. биол. и мед.-1973.-N10./соавторы: Кейлис-Борок И. В. У.

11. Приобретение чувствительности к эритропоэтину эмбриональными кроветворными клетками в условиях культивирования.-Материалы симпозиума по гуморальной регуляции кроветворения. Ереван. -1972. /соавторы: Самойлина Н.Л./.

12. Стромальные клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфоидной ткани: клонирование in vitro и обратная трансплантация в организм. -Проблемы гематологии и переливания кропи. - 1973. -N10. /соавторы: Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К., Панасюк А. Ф.. Герасимов Ю. В. /.

13. Адгезивные свойства клеток кроветворной и лимфоидной ткани, образующих колонии фибробластов в монослойных культурах. -Бюлл. экспер. биол. и мод. -1973. -Ni 2. /соавторы: Епихина

14. Фибробласты, формирующие строму кроветворных и лимфоид-ных органов.-Тезисы VIII Всесоюзного с-ьезда анатомов, гистологов и эмбриологов.-Ташкент.-1974./соавторы: Чайлахян Р.К.. Герасимов Ю. В.. Сидорович С. !0. /.

15. Stromal cell responsible for transferring the microenvironmcnt of the hemopoietic tissue.-Transplantation.-1974. -17. -N4. /соавторы: Фридснштеин А.Я., Чайлахян P.К.. Герасимов Ю. В.. Панасюк А.Ф. /.

16 Адгезивные и пролиферативные свойства стромальных клеток - предшественников in vitro и in vivo.-Материалы Всесоюзной конференции по общей и прикладной иммунологии.-Москва.-1974./соавторы: Епихина С. Ю., Кей ic-Борок И.В./.

17. Пролиферативная активность стромальных клеток - предшественников костного мозга, обладающих клоногенными свойствами, -Бюлл. экспер. биол. и мед. -1976. -N1. /соавторы: Епихина С Я./.

18 0 самоподдеркании индуцированной костной ткани.-Бюлл. экспер. биол. и мед.-1976.-N2./соавторы: Лалыкина К. С., Епихина С.О./.

19. Происхождение стромальных механоцитов в культурах костного мозга. -Бюлл. экспер. биол. и мед.-1976. -N10. /соавторы:Смоленский A.A.. Куралесова А. П., Горская Ю. Ф. /.

20 Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochirae-ras and heterotopic transplantats. -Experimental Hematology.-1978. -N6. /соавторы: Иванов-Смоленский A. A., Чайлахян P. К. и др. /.

21. Происхождение стромальных механоцитов костного мозга по данным их типирования по изоантигенам и хромосомным маркерам. -Онтогенез. -1978. -N3. /соавторы: Иванов-Смоленский A.A. Чайлахян Р. К. и др./.

22. О происхождении стромальных механоцитов костного мозга радиохимер и гетеротопных трансплантатов по данным исследооания с антилинейными сыворотками.-Сборник научных трудов "Клетки - предшественники кроветворной ткани". -Москва.-1977./соавторы: Иванов-Смоленский A.A.-, Горская 0..Ф.. Куралесова А. И./,

23. Кинетика изменения числа костномозговых стромальных клеток - предшественников после облучения.-Сборник • лучных трудов "Клетки - предшественники кроветворной ткани".-Me оа.-1977./соавторы: Епихина С. Ю., Кейлис-Борок И. В., Пронин А. Ь./.

24. О самоподдержании стромы эктопического костного мозга. -Сборник научных TpvaoB "Клетки - предшественники кроветвор эй ткани". -Москва. -1977. /соавторы: Фриденшт ^ин А. Я., Лальи/ина К. С.. Кпихина С. К). /.

25 Изучение фагоцитарной способности стромальных клеток -предшссчпенников кроветворной • ткани. -Бюпп. экспер. биол. и мед. -1978. -N8. /соавторы: Сидорович С. Ю. /.

26. Содержание клоногенных стромалы„.х клеток - предшественников в кроветворных органах морских свинок разного возраста. -Вилл. экспоо. биол. и мед.-1978.-N7./соавторы: Сидорович С.Ю./.

27. Адгезивные и пролифер. чвные свойства стромальных клеток - предшественников костного мозга. -Материалы Всесоюзной конференции по общей и прикладной иммунологии. "Медицина" .-Москва. -1978. /соавторы: Сидорович С. D./.

28. Перенос гомолоэтического микроокружения при гетеротопной трансплантации взвеси клеток костного мозга.-Актуальные вопросы-пересадки органов и тканей. ТС XIII Серия - хирургия в. 23,-Моск-ва.-1978./соавторы: Сидорович С.Ю., Лазорснко-Мансвич Е.Р./.

29. Регенерация гетсротопных трансплантатов костного мозга.-Актуальные вопросы пересадки органов и тканей. ТС XIII Серия -хирургия в.23. -Москва.-1978. /соавторы: Лазоренко-Манесич Б. Р.. Сидорович С. (0. /.

30. Стромальные механоциты костного мозга: клонирование в культурах и создание кроветворного микроокружения.-Тезисы материалов IX Международного Симпозиума по сравнительному изучению лейкозов. -1979./соавторы: Фриденитейн А.Н., Лурия Е. А., Кузнецов С. А., Куралссова А. И. /.

31. Радиочувствительность и пострадиационные изменения клоногенных стромальных предшественников костного мозга. -Радиобиология. -1979. -N6. /соавторы: Сидорович С. Ю., Горская Ю.Ф., Пронин A.B. и др./.

32. •Свойства стромальных механоцитов кроветворной и лимфоид-ной ткани. -I Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов. тезисы докладов.-Москва.-1979./соавторы: Сидорович С.Ю., Иванов-Смоленский А. А. /.

. 33. Bone marrow stromal nccttanocytes: cloninß In vitro and the transfer oí ftcmopoietyc mtcroenvironment,-Proc. 9 Intern.Syrap. on comparative leyfccmla and . Jated deseases. -1979./соавторы; Фри-денштей.н А.Я., Сидорович С.Ю., Чайлахян Р.К. и др./.

34. Пострадиационные изменения кроветворного микроокружения по данным клонирования стромальных механоцит ч костного мозга. -Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Радиочувствительность и процессы восстановления у животных и растений" .-Ташкент. -1979. /соавторы: Сидорович С.Ю./.

35. Перенос кроветворно*""1 микроокружения при гетеротопной трансплантации взвеси клеток костного мозга.-БЭБМ.-1980.-N9. Усо-авторы: Сидорович С.Ю./.

. 36. Образование кроветворных территорий пои гетеротопной трансплантации костного мозга. -Онтогенез. -1980. • ..11, N3. /соавторы: Куралесопа А. И.. Сидорович С. Ю., Филякина Н. С. и др. /.

3/. Исследование поверхностных рецепторов стромальных механоцитов кроветворных органов. -Иммунология. -198Í). -N4. /соавторы: Сидорович С.Ю., Тарханова И. А./.

38. Radiosensitivity and postirradlation changes of bone marrow clonoROnic stromal melanocytes.-International Radloöi-o] op,у. -1981. -v. 39. -N5. /соавторы: Фриденштейн А. Я., Горская Ю. Ф., Сидорович С.Ю. /.

39. Влияние трипсинизации костного мозга на эффективность образования колоний фибробластов в монослойных культурах. -БЭБМ. -1981 . -N9. /соавторы: Сидорович С.Ю., 'Фриденштейн А.Я./.

40. Влияние способа приготовления клеточных суспензий кро-ветвор' 1й ткани на содержание в них клоногенных стромальных предшественников и некоторые их цитохимические характеристики.-Тезисы

докладов Всесоюзной конференции "Вопросы иммунологии и молекулярной биологии".-Нальчик.-198J./соавторы: Сглорозич С. В. /.

41. Исследование рецепторов к Iß и комплементу на культивируемых механоуитах кроветворной и лимфоидной ткани.-Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии". -Москва. -1981. /соавторы: Сидорович С.0., Тарханова И.А./.

42. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.-Experimental Hematology.-1982.-v.10.-N2. /соавторы: Фри-денштейн А Я., Трошева А.Г.. Горская Ю.Ф./.

43. Гетерогенность популяции кпоногенных стромальных клеток по их связи с тканевыми структурами в кроветворных и лимфоидных органах. -Тезисы докладов I Всесоюзной конференции "Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология".-Москва.-1982. /соавторы: Сидорович С. Ю. /.

44. Изучение фагоцитарной активности стромальных клеток -предшественников кроветворной и лимфоидной ткани. -"Фагоцитоз и иммунитет".-Москва.-1983./соавторы: Сидорович С.Ю./.

45. Клетки - переносчики кросетворного микроокружгния.-Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия 'Иммунология".-Москва.-1983. /соавторы: Фриденштейн А.Я., Куралесова Л.И., Чайлахян Р.К. и др./.

46. Содержание стромальных колониеобразующих клеток (КОКФ) в костном мозге мышей и клонапьная природа образуемых ими колоний фибробластов.-Онтогенез.-1986.-N1./соавторы: Горская Ю.Ф., Трошева А. Г. /.

47. Клонирование стромальных клеток - предшественников костного мозга мышей.-Тезисы докладов на симпозиуме "Кроветворные клетки - предшественники при действии экстремальных факторов". -Челябинск. -1986.

48. Клональная природа колоний фибробластов, образуемых стромальными - костномозговыми клетками (КОКФ) в культурах. -БЭВМ. -1986. -МЗ. /соавторы: Павленко Р.Г., Трошева А.Г. и др. /■49. Содержание стромальных клоногенных клеток (КОКф) в костном мозге мышей.-БЭБМ.-1986.-М4./соавторы: Павленко Р. Г., Горская Ю.Ф. и др./.

50. Stromal colony formation requires stimulation by hemopoietic cells.-Molecular factors of h matopoiesis and stem cell.-Moscow.-1990./соавторы: Фриденштейн А.Я.,Горская Ю.Ф. /.

. 51. Зависимость образования КОКф колоний от стимулирующего воздействия гемопоэтических клеток.-БЭБМ.-1990.-N11./соавторы: Фриденштейн А.Я., Горская Ю.Ф., Москвина И.Л. и др./.

52. Гуморальная природа колониестимулирущего воздействия к тномозговых клеток на образование стромальных колоний t3 культурах костного мозга.-БЭБМ.-1990.-N11./соавторы: Фриденштейн А. Я., Горская , Лурия Е. А./.

ЬЗ. Bono narrow stromal colony formation requires stimulation by haemopoletic cells.-Bone and mineral. -1992. -N18. /соавторы: Фриденштейн А. Я., Горская Ю. Ф.. Лурия Б. А., Москвина И.Л./.

54. Transfer of lymphoid raicroenvironmcnt by the spleen str-onal fibroblasts strain and immune responce in the newly-formed orpans.-XXV Congress of the international .society of Hematology.-Cancun. Mexico.-1994./соавторы: Чайлахян P.К., Герасимов К). В.. Куралесооа А. И. и др./.

55. Immune responce in lymphoid organs formed in the place of transplantation of spleen stromal fibroblasts.-Abstract of 12th European immunology meet inj». -Barcelona.-1994. /соавторы: Чайлахян P.K., Герасимов Ю.В., Куралесова А.И./.

список 'сокращений

АГ - антиген

AT - антитела

К.ОКФ - клетки, образующие колонии фибробластов

КСА - • колониестимулирующая активность

КСС - колониестимулирующий фактор

СКК - стволовая кроветворная клетка

ЭКОф - эффективность образования колоний фибробластов

ЭС - эмбриональная коровья сыворотка

PBS - фосфатно - солевой буфер

PDGF - трс:*боцитарный фактор роста