Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МУКОСАЛИВАРНОГО СЕКРЕТА У ВЕТЕРАНОВ БОЕВЫХ ДЕЙСТВИЙ

На правах рукописи

Альтман Элеонора Давидовна

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МУКОСАЛИВАРНОГО СЕКРЕТА У ВЕТЕРАНОВ БОЕВЫХ ДЕЙСТВИЙ

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 СЕН 2011

Челябинск-2011

4655021

4855021

Работа выполнена на кафедре иммунологии и аллергологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоиразвития России»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

Зурочка Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Сашенков Сергей Львович

доктор медицинских наук, профессор

Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация: Учреждение Уральского отделения Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов г. Пермь

Защита диссертации состоится «_» _ 2011 года в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», по адресу 454092, г. Челябинск, ул. Воровского,64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России»

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

Л.С. Латюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность изучения проблемы

Актуальность изучения процессов старения на уровне мукозоассоциированной ткани саливарной зоны ротовой полости определяется выраженными структурными и функциональными изменениями связанными с возрастом, а также особым положением мукозального компартмецта иммунной системы в противоинфекционной защите организма.

Мукозоассоциированная лимфоидная ткань (MAJIT) ротовой полости является первой линией обороны против колонизации слизистых мембран вирусными и бактериальными патогенами, осуществляет процессы первичного распознавания антигенов и инициацию определенного типа иммунного ответа (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С 2001; Теплова С.Н., Алексеев Д.А., 2002; Ковапьчук JI.B. 2003; Ярилин A.A., 2003; Санникова Т.Е., Марчук Г.И. с соавт., 2003; Пальцев М.А., Кветной И.М., 2009; Сотникова Н.Ю., 2009).

От момента рождения человека и до глубокой старости происходят существенные изменения центральных органов иммунной системы (тимуса), ее периферических органов (лимфоузлов, селезенки, MAJIT), что обосновывает необходимость дифференцированной оценки иммунных параметров не только системного уровня, но и состояния отдельных компартментов мукозального иммунитета в разных возрастных периодах онтогенеза человека (Дмитриева Л.А., 2000; Данилевский Н.Ф., Леонтьев В.К. с соавт., 2001; Яшин AJL, 2007; Anisimov V.N., 2005, 2006, 2008; Masoro E.J., Austad S.N., 2006). Эти изменения имеют свои особенности, обусловленные специфическими свойствами данных систем и органов (Скулачев B.IL, 1997; Анисимов В.Н. 2000, 2008; Зайнуллин В.Г. , Москалев A.A., 2001; Боровский Е.В., 2005; Трофимов A.B., 2010; Anisimov V.N., Berstein L.M., 2008; Caballero Е., 2007). Достаточно рано признаки старения начинают проявляться и на уровне мукозоассоциированной лимфоидной ткани (МАЛТ) ротовой полости, что, по мнению ряда исследователей, является надежным индикатором физиологического старения организма в целом (Карсонова М.И., Пинегин Б.В., 2003; Пальцев М.А. и др., 2009; Куликов А.В, Архипова Л.В., 2010; Evans Р. et al., 2000; Vinogradova I.A. et al., 2009). Биологический секрет мукосаливарной области является весьма привлекательным материалом для фундаментальных и прикладных клинических исследований в области иммунологии, бактериологии, микробиологии, стоматологии (Григорьев И.В., Артамонов И.Д., Уланова Е.А., и др., 2003; Теплова С.Н., 2002, 2005, 2008; Ярилин A.A., 2003; Анисимов В.Н., 2008; Новосельцев В. Н., Михальский А.И., 2009).

В настоящее время имеются все технологические условия для анализа состояния молекулярно-клеточных механизмов врожденного и приобретенного иммунитета, в том числе механизмов иммунологической толерантности, иммунологических маркеров повреждения собственных клеток мукосапиварного барьера и процессов старения МАЛТ (Зурочка A.B.,

Хайдуков C.B., 2008; Barnett J.C., 1994; Brockmans F.J., 2007; Yamamoto H., 2007).

Необходимость вариативного сравнения иммунологических параметров у ветеранов боевых действий старших возрастных групп, полученных при различных формах патологии со стандартными значениями, поиск иммунологических маркеров старения на уровне мукосаливарной зоны, внедрение новых современных стратегий диагностики разных форм иммунопатологии явились основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: анализ показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости с определением иммунологических предикторов старения у ветеранов боевых действий старших возрастных групп.

Задачи:

1. С помощью метода проточной цитофлуориметрии оценить клеточный состав мукосаливарного секрета у изучаемого контингента.

2. Оценить состояние гуморального звена секреторного иммунитета ротовой полости на основе количественного определения уровней иммуноглобулинов основных классов и субклассов, общей активности системы комплемента и ее субкомпонентов СЗА, С5А, уровней протективных компонентов слизистых (белка и муцина) у ветеранов войн разных возрастных групп.

3. Определить уровень основных регуляторных цитокинов и молекул эндогенной тревоги - аларминов в саливарном секрете у ветеранов войн старших возрастных групп.

4. На основе полученных данных построить математическую модель старения MAJIT саливарной зоны ротовой полости у ветеранов боевых действий с определением иммунологических биомаркеров старения в разных возрастных группах.

Научная новизна исследования состоит в изучении показателей секреторного иммунитета ротовой полости у ветеранов боевых действий в возрастном аспекте. Впервые проведен цитофлуориметрический анализ популяционного состава иммуноцитов мукосаливарного секрета у ветеранов войн разного возраста, установлены характерные возраст-ассоциированные изменения. Установлено доминирующее значение факторов врожденного иммунитета при прогрессировании процессов старения на уровне мукосаливарной зоны ротовой полости. Определен баланс регуляторных цитокинов, определяющих тип иммунного ответа - у ветеранов войн пожилого и старческого возраста установлено превалирование Th2-антителоопосредованного типа иммунного ответа на уровне индуктивной зоны MAJIT ротовой полости.

Новыми являются данные об изменении количества эндогенных сигнальных молекул повреждения собственных клеток (аларминов) в мукосаливарном секрете у ветеранов боевых действий зрелого, пожилого и старческого возраста. Отмечен достоверный рост уровня лактоферрина в изучаемых группах пожилого и старческого возраста, что может быть связано с

наличием эндогенного клеточного стресса при прогрессировали процессов старения организма.

Проведен математический анализ с определением параметров секреторного иммунитета му косал иварной зоны ротовой полости, характеризующих иммунологический профиль старения в изучаемых возрастных группах.

Теоретическое и практическое значение работы состоит в изучении процессов старения в периферическом отделе иммунной системы на уровне мукозапьного иммунитета ротовой полости у ветеранов войн. Выявлены основные закономерности формирования принципиально нового уровня цитокиновой и аларминовой регуляции у пациентов старших возрастиых групп с преобладанием антителоопосредованного иммунного ответа. На основании многомерных статистических методов выявлены характерные для пожилого и старческого возраста иммунологические биомаркеры старения мукосаливарной зоны ротовой полости у ветеранов боевых действий, что позволит определять индивидуальные темпы старения, прогнозировать вероятность возникновения возраст-ассоциированных болезней, а также внедрять новые стратегии в диагностике разных форм иммунопатологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменения клеточных и гуморальных показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости у ветеранов боевых действий, полученные при комплексном иммунологическом обследовании, зависят от возраста индивидуума.

2. Пожилой и старческий возраст характеризуется доминированием врожденных факторов защиты слизистых и изменением типа регуляции иммунного ответа на ТЬ2-антителоопосредованный.

3. Биомаркеры иммунологического старения саливарной зоны ротовой полости у ветеранов боевых действий позволяют оценить соответствие совокупности иммунологических показателей определенному возрастному отрезку онтогенеза.

Внедрение результатов в практику

Результаты диссертации внедрены в диагностическую работу Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя ветеранов войн. Основные положения работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии и аллергологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России».

Апробация диссертации

Основные положения и результаты исследования по теме диссертации доложены и обсуждены на : Сибирской научно-пракгаческой конференции «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практичестической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011); Всероссийском

конгрессе с международным участием «Психосоциальные факторы и внутренние болезни: состояние и перспективы» (Новосибирск, 2011); IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011). Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 из перечня изданий рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах, состоит го введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 6 рисунками и 24 таблицами. Список цитированной литературы содержит 187 источника, в т.ч. 74 отечественных и 113 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Данное исследование проводилось на базе стоматологического отделения Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя ветеранов войн ( ГБУЗ ЧОКТГ ВВ ) и лаборатории воспаления Учреждения Уральского отделения Российской академии наук научно исследовательского института иммунологии и физиологии. Учреждение ГБУЗ ЧОКТГ ВВ является специализированным лечебным учреждением, оказывающим поликлиническую и стационарную медицинскую помощь лицам, принимавшим участие в боевых действиях Великой Отечественной войны (ВОВ) и современных локальных конфликтах (Афганистан, Чечня, Северный Кавказ и др.). Период после окончания боевых действий у всех ветеранов, включенных в исследование, составил от 10 до 65 лет. Максимальным он был в группе ветеранов ВОВ. Отбор участников исследования проводился согласно следующим критериям:

- пол - мужской;

- возраст пациентов согласно критериям возрастной периодизации Академии педогагических наук СССР (1965): II период зрелости (от 35 до 60 лет), пожилой (от 61 до 74 лет) и старческий (от 75 лет до 90 лет);

- стоматологическая санация ротовой полости за 30 и более дней до забора мукосаливарного секрета для проведения иммунологических исследований;

- отсутствие острых и обострений хронических заболеваний полости рта и носоглотки в течение последних 3 месяцев (респираторные инфекции, тонзиллиты, фарингиты, стоматиты, периодонтиты, хейлиты);

-отсутствие общих инфекционных, аллергических, аутоиммунных, психических болезней, злокачественных опухолей и заболеваний системы крови, эндокринной патологии (сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит); -отсутствие декомпенсированной и/или неконтролируемой патологии сердечно-сосудистой системы, пищеварительной, бронхолегочной системы, гепатобилиарного, урогенитальнош тракта;

- информированное согласие пациента на проведение обследования;

- отсутствие вредных привычек: курения;

- отсутствие иммунотропной терапии

Всего для исследования было отобрано 106 мужчин, которых распределили по группам в соответствии с возрастом: 1-я группа (35-60 лет) — 40 человек, средний возраст 45,1±3,9 лет, 2-я группа (61-74 года) - 30 человек, средний возраст 63,4±5,6 года и 3-я группа (75-90 лет) - 36 человек, средний возраст 81,1 ±1,6 год.

Перед проведением блока иммунологических исследований все пациенты прошли клинике- инструментальное обследование, которое включало сбор анамнеза, осмотры врачей специалистов (терапевт, невролог, хирург, уролог, стоматолог), по показаниям: общеклинические анализы крови, мочи, определение глюкозы, липидов крови, функциональные пробы печени и почек), ЭКГ, УЗИ, рентген, УЗДГ сосудов головы, ТКДГ, Эхо-КГ. Стоматологическое обследование пациентов проводилось по методике, разработанной Центральным научно-исследовательским институтом стоматологии (1979).

Методической особенностью работы явилось использование для иммунологических исследований неинвазивных методов забора биологического материала. Мукосаливарный секрет собирали без стимуляции слюноотделения, натощак в утренние часы до полоскания рта водой методом накопления в ротовой полости и последующего опорожнения каждые 60 секунд через воронку в полистироловые пробирки, размером 12*75 мм (BD Catalog № 352058) с дальнейшей фильтрацией через пористые фильтры фирмы Becton Dickinson диаметром пор 70 и 35 мкм (Cat.№ 340607; 340590).

Иммунологическое обследование включало цитофлюориметрическое определение клеточного состава мукосаливарного секрета, которое проводилось на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II с программным обеспечением «BD Facs Diva» с помощью наборов моноклональных антител (МКАТ), меченых флуоресцентными красителями 4-х видов: Fluorescein izotyocyanat (FITC); Phycoerytrin (PE); Perpidin chlorofliyll protein (PerCP); Allophycocyanin (APC), серии MultiTest, витальность определяли с применением красителя 7-AAD. Для контроля работы прибора, настройки напряжения и компенсации флуоресценции применяли набор «BD FACS 7-color setup beads». Лейкоцитарный гейт детектировали с помощью определения панлейкоцитарного маркера CD45+ (определяли все 4 изоформы: CD45RO, CD45RA, CD45RB, CD45RC) в сочетании с другими дифференцировочными маркерами лейкоцитов: CD45+CD14+CD13- (гранулоциты), CD45+CD13+CD14" (моноциты/макрофаги), CD45+CD3+CD4+ (Т-хелперы), CD45+CD3+CD8+ (Т-цитотоксические), С045+СТ>19+(В-лимфоциты), С045+С016+56+(ЫК-клетки), CD45+CD13+CD1 lb+ (гранулоциты с экспрессией р2-субъединиц интегринов), CD45+CD14 +CD11Ь+(моноциты/макрофаги с молекулами адгезии). К жизнеспособным лейкоцитам относили все клетки, отрицательные по 7-AAD и положительные по CD45+. Изучение гуморальных показателей мукосаливарного секрета включало определение количества белка и муцина с помощью тест-системы ЭКО-СЕРВИС КлиниТест-БМ ПГК с пирогаллоловым красным. Уровень общей активности комплемента в мукосаливарном секрете

определяли по 50% гемолизу (Резникова Л.С., 1967, Кэбот Е. и Мейер М., 1968). Количество растворимых иммунных белков в секрете определяли непрямым иммуноферментным методом с применением стандартных тест-систем: уровень slgA, общий IgE, общий IgG, субклассы IgGl-G4 (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ г. Новосибирск); количество анафилатоксинов СЗа и С5а (Цитокин, Санкт-Петербург); уровни регуляторных цитокиков: IL-4, IL-8, IL-17, TNF-a (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ, г. Новосибирск); IL-12 (Bender MedSystems GmbH Vienna, Austria); количество молекул семейства интерферонов: IFN-y, IFN-a (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ г. Новосибирск); ростковых факторов: TGF-ß (Invitrogen Corporation, Camarillo, CA); молекул эндогенной тревоги-аларминов: IL-lß, лактоферрин (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ, г.Новосибирск).

Статистическая обработка проводилась с применением пакета прикладных программ STATISTICA for Windows версия 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США). Описательная статистика включала медиану (Me), среднее арифметическое (М), стандартную ошибку (ш), интерквартильный размах (Q25-75). При сравнении групп использовали непараметрические критерии Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (Реброва О.Ю., 2002). Скрининговый непараметрический корреляционный анализ проводился по Спирмену. Для определения биологических предикторов старения мукосаливарной зоны применялся многофакторный анализ методом главных компонент с последующим варимаксимальным вращением матрицы данных. Построение иммунологической модели старения саливарной зоны МАЛТ проводилось с помощью дискриминантного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первые две группы составили мужчины, принимавшие участие в современных локальных конфликтах (Афганистан, Чечня, Северный Кавказ), в третью группу вошли ветераны Великой Отечественной войны. Распределение участников по возрасту (см. таблицу 1), среди изучаемых групп статистических различий не выявило.

Таблица 1

Средний возраст обследованных пациентов

Пациенты Общее количество, п Возраст в годах М±ш

1-я группа (35-60 лет) 40 45,6±3,9

П-я группа (61-74 лет) 30 63,4±5,6

Ш-я группа (75-90 лет) 36 81,1±1,6

При проведении клинико-инструментальных исследований нами были установлены признаки хронической мультисистемной соматической патологии у пациентов всех изучаемых групп. Так, у обследуемых в возрасте 35-60 лет выявлено в среднем 2-3 хронических заболевания, у лиц пожилого возраста (61-74 года) от 3-х до 5-и, в старческом возрасте (75-90 лет) 6-9 заболеваний в стадии компенсации. В периоде зрелого возраста лидирующей формой соматической патологии у ветеранов войн являлись заболевания органов пищеварения -18 чел. (45%). Патология сердечно-сосудистой системы зафиксирована у 15 чел. (37,5%), чаще в виде гипертонической болезни 1 и 2 стадии (ГБ), ИБС стенокардия 1ФК, заболевания опорно-двигательной системы (ОДС) - у 11 чел. (27,5%), болезни органов дыхания - у 10 чел (25%). Во второй группе ветеранов войн наблюдалась отчетливая тенденция роста сосудистой патологии, гипертонического и атеросклеротического генеза - 27 чел. (90%), патология ОДС наблюдалась у 25 чел. (83,3%), органов дыхания у 15 чел. (50%), патология органов пищеварения и органа зрения представлены соответственно в 36,6% и 30% наблюдений. ' Старческий возраст характеризовался наличием 100% патологии двигательного аппарата, заболеваниями сердечно-сосудистой системы в 97,2% случаев в виде ИБС стенокардии 2, 3 ФК, ГБ в сочетании с распространенным атеросклерозом магистральных сосудов, патология органов пищеварения зафиксирована у 28 человек (77,7%), системы дыхания у 22 пациентов (61,1%), мочеполовой системы (14 человек (38,8%), органа зрения у 12 человек (33,3 %).

Особое значение придавалось состоянию полости рта, при этом всем пациентам, включенным в исследование, были проведены гигиенические и санирующие процедуры не менее чем за 30 дней до забора мукосаливарного секрета. При наличии острых воспалительных явлений в полости рта, носоглотки, миндалин, слюнных желез участника исключали из исследования.

С помощью метода проточной цитофлюориметрии проведено изучение распределения клеточных популяций согласно экспрессии на иммуноцитах различных изоформ панлейкоцитарного маркера СБ45+. Его использование позволило четко отделить гейт иммуноцитов от клеток иного происхождения (буквальных эпителиоцитов) и дебриса.

Рисунок 1 демонстрирует распределение клеток мукозального секрета согласно экспрессии на мембране общелейкоцитарного линейно-ассоциированного дифференцировочного антигена С045+.

7 25/0З/ОЭ-ЭаНуа

Рис. 1. Клеточный состав слюны: иммуноциты (С045+), эпителиальные и другие клетки (СВ45~), клеточный детрит (дебрис).

Очевидно, что достаточно большой удельный вес принадлежит клеточному дебрису, т.е. осколкам клеточных мембран, детриту, поэтому важное значение при исследовании мукозапьного секрета приобретает преаналитический этап подготовки образцов. При этом гейт иммуноцитов в среднем составлял 1/3 от всей клеточной массы, включая дебрис.

Наибольшее число эпителиоцитов нами установлено в группе ветеранов боевых действий зрелого возраста в сравнении с другими возрастными группами (р<0,05). Напротив, у ветеранов войн пожилого и старческого возраста доля клеток иммунного происхождения (зрелые нейтрофилы, макрофаги, МК-клетки, популяции и субпопуляции лимфоцитов), экспрессирующих линейный дифференцировочный маркер СТ)45достоверно превышала аналогичный показатель в группе лиц зрелого возраста.

Изучение жизнеспособности СБ45+ клеток (С045ук+%) показало высокий процент вариативности значений от менее 10% до 40% и более (рисунок 2), при уровне общей жизнеспособности клеток во всех изучаемых группах более 80%. Низкий процент витальности иммунных клеток связан с низкой устойчивостью клеточной мембраны к действию разного рода агрессивных энзимов секрета.

Рис.2. Процент витальности иммуноцитов (2%) в отдельном образце.

Распределение клеточных популяций мукосаливарного секрета в изучаемых группах представлено на рисунке 3.

лимф. %

ГруПпаЗ-Группа 2------Группа 1

Рис.3. Клеточный состав иммуноцитов мукосаливарного секрета ветеранов боевых действий.

Согласно рисунку 3, состав мукосаливарного секрета претерпевает существенные изменения с возрастом: увеличивается число нейтрофилов, с максимумом в группе ветеранов старческого возраста (более 94% от общего чиста иммунных клеток), что, по данным многих авторов, обусловлено

хроническими воспалительными изменениями в ротовой полости у лиц пожилого и старческого возраста, связанных с недостаточной гигиеной полости рта, ношением протезов и неправильным уходом за ними (Ткаченко Т.Б. с соавт., 2007). Кветным И.М. с соавт. (2005) показано усиление процессов дифференциации гранулоцитов с возрастом. Количество гранулоцитов, несущих на своей поверхности ß2-mrre грины (CDllb+, LFA-1) нарастает с возрастом, достигая максимальных значений в группе старческого возраста. Пул моноцитов/макрофагов во всех группах был достаточно представительным, с максимумом в 1-ой группе ветеранов боевых действий (зрелого возраста) и последующим линейным уменьшением у лиц пожилого и старческого возраста. Нами также установлено, что с возрастом число мононуклеаров, экспрессирующих молекулы адгезии (CD11Ь+) достоверно снижается, достигая своего минимального значения в самой старшей возрастной группе (75-90 лет). Такой характер перераспределения клеточных популяций с возрастом может быть обусловлен возрастающей ролью нейтрофилов в качестве антиген-презинтирующих и фагоцитирующих клеток, о чем свидетельствуют исследования Meyer K.S., Soergel P., (1999), с параллельным увеличением их способности к межклеточным взаимодействиям (Knare V., Sodhi A., Singh S.M., 1999).

Особенности распределения с возрастом циркулирующих клеток врожденного иммунитета были изучены на примере одной из разновидностей популяции больших гранулярных лимфоцитов (LGL - Large Granular Lymphocytes)- натуральных киллеров (NK), имеющих фенотип CD3" CD56^CDl^CD2dim (Байдуков C.B., Зурочка А.В, 2008). Некоторыми авторами отмечено повышение с возрастом количества больших гранулярных лимфоцитов, дифференциация которых не связана с тимусом (Трофимов A.B., 2009). Однако, в нашем исследовании не было установлено достоверных различий в численности этих клеток среди изучаемых групп, что показывает приоритетность роли механизмов врожденного иммунитета в старших возрастных группах и подтверждает наличие онтогенетической сохранности механизмов врожденного иммунитета у ветеранов боевых действий старших возрастных групп, как фактора компенсации утраченных позиций адаптивного иммунитета.

Лимфоцитарный пул в составе мукосаливарного секрета был представлен в минимальном количестве и составил в среднем от 1,6 до 3,0%, с наименьшим представительством в группе пожилых пациентов. Согласно литературным данным, с возрастом пролиферация лимфоцитов сопровождается снижением их пролиферативного потенциала, связанного с уменьшением длины теломеров, концевых фрагментов ДНК, необходимых для репликации генома делящейся клетки (Санникова Т.Е. с соавт., 2003).

Распределение субпопуляций лимфоцитов в зависимости от возрастных интервалов представлено на рисунке 4.

Нами установлено достоверное снижение с возрастом популяции В-лимфоцитов с минимальным представительством у ветеранов войн старческого

возраста, что согласуется с данными Симоновой A.B. с соавт. (2001), продемонстрировавшей уменьшение численности B-лимфоцитов в циркуляции у пациентов старших возрастных групп с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта. В группе ветеранов старческого возраста выявлено существенное снижение численности Т-хелперов в сравнении с группами участников зрелого и пожилого возраста, что также согласуется с литературными данными о снижении с возрастом в циркуляции количества CD4+ лимфоцитов, ослаблении их контактов с антиген-презинтирующимися клетками (Haynes et al., 1999). Работами Eaton et.al. (2004) показано, что стареющие CD4+ лимфоциты продуцируют в два раза меньше IL-2, регулирующего процесс пролиферации CD8 клеток, что соответственно негативно сказывается на их популяции. Однако, в нашем исследовании значимого снижения с возрастом цитотоксической популяции (CD8) лимфоцитов не наблюдалось.

CD19, %

Группа 1 ——Группа2^«"^Труппаз]

Рис.4. Субпопуляционный состав лимфоцитов мукосаливарного секрета у ветеранов боевых действий.

Gavazzi G., Krause К. (2002) подчеркивают, что количественные изменения содержания основных популяций лимфоцитов в старших возрастных группах приводят к снижению иммунологической реактивности и аутотолерантности, способствуя развитию инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

Анализ состояния гуморального компартмента секреторного иммунитета на уровне MAJTT ротовой полости у ветеранов боевых действий позволил установить четкие возрастные закономерности изменения этих параметров.

Со стороны эффекгорных систем врожденного гуморального иммунитета, работающих по принципу ограниченного протеолиза, выявлено достоверное снижение с возрастом общей гемолитической активности комплемента (СН50) и уровня субкомпонентов - продуктов расщепления белков системы комплемента: СЗа и С5а. Максимальное достоверное снижение уровня СЗа и С5а-анафилактогенных белков установлено в самой старшей возрастной группе ветеранов войн. Снижение общей гемолитической активности комплемента (СН50) и субкомпонентов СЗа, С5а в пожилом и старческом возрасте, по мнению Горячкиной Л.А., и Кашкина К.П., (2009), может свидетельствовать о недостаточности антиген-специфического ответа на патогенные агенты и способствовать развитию аутоиммунных заболеваний.

Напротив, в группах ветеранов пожилого и старческого возраста показано с высокой степенью достоверности (р<< 0,01) увеличение в мукосаливарном секрете количества основных компонентов антиколонизационного барьера: белка и гелеподобнош крупномолекулярного гликопротеина- муцина, что,как правило, сопровождается явлениями гипосаливации (Михайлов В.В., 1993; вошБ Б.Т., 2004) и способствует повышению сухости слизистых оболочек. Согласно данным Ве11еу А. й а1. (1999), гликопротеины способствуют активной колонизации слизистых оболочек ротовой полости индифферентной аутофлорой и препятствуют прикреплению патогенных микроорганизмов.

Изучение состояния приобретенных факторов протекции слизистых оболочек ротовой полости позволило установить многократный рост секреторного иммуноглобулина (sIgA) у ветеранов войн старческого возраста, что является закономерным ответом МАЛТ на увеличение антигенной нагрузки СОПР с возрастом. Вместе с тем, увеличение концентрации муцина в слизистых секретах слюнных желез способствует формированию вязкой адгезивной среды, замедляющей движение микробов к поверхности эпителия и препятствуя микробной колонизации В. ЬатЫт й а1. (1993).

При изучении уровней иммуноглобулинов, ответственных за состояние первичного (1вМ) и вторичного (1$гО общий, субклассы Б1, 02, ОЗ, 04) иммунного ответа, зафиксированы следующие особенности: у пациентов зрелого возраста выявлено более низкое количество иммуноглобулина М (р=0,004) в сравнении с лицами старческого возраста. Исследованиями Подгорбунских Т.В. (2005) максимальные уровни 1£М в мукозальном секрете также были установлены в более старшем возрастном периоде (71-80 лет). Уровни иммуноглобулинов класса в (общего) и его субклассов (01, 02, 03) среди изучаемых возрастных групп значимо не различались, достоверные изменения концентрации установлены лишь для блокирующих антител подкласса 04, уровень которых в группе ветеранов пожилого возраста оказался максимальным. Уровень общего иммуноглобулина Е проявлял четкую тенденцию к снижению в период старческого возраста, при этом показано, что с возрастом нарастает уровень общей аллергизации организма, при этом реагиновый тип ответа уступает место псевдоаллергическим реакциям гиперчувствительности. Однако, как было указано выше, период пожилого

возраста характеризовался повышенным уровнем блокирующих иммунных антител субкласса G4, свидетельствующих о существовании определенного уровня сенсибилизации организма. Таким образом, акцентуация механизмов врожденного иммунитета в старших возрастных группах, на фоне выраженного дисбаланса факторов приобретенного иммунитета, носит скорее компенсаторный характер, и вносит существенные изменения в формирование локального иммунного гомеостаза ротовой полости.

Различные топические зоны MAJIT имеют характерную «цитокиновую среду» - матрицу оппонентных, часто меняющихся сигналов разного уровня (Swein S., 2007). Сложный многоуровневый характер взаимодействия определяет повышающий или понижающий тип регуляции иммунного ответа. Для исследования цитокинового спектра мукосаливарной области MAJIT нами были определены базовые концентрации регуляторных цитокинов, ростовых факторов, молекул системы интерфсронов, хсмокинов: TNF-a, IL-4, IL-17, IL-8, ILl-ß, IL-12, TGF-ß, IFN-y, IFN-a.

По результатам исследования установлено, что период старческого возраста у ветеранов боевых действий характеризуется снижением в мукосаливарном секрете уровня INF -у, принимающего непосредственное участие в клеточно-опосредованном иммунном ответе, что подтверждается данными, указывающими на снижение с возрастом уровня Thl-лимфоцитов и IL-2 в циркуляции (Beverli P.C., Grubeck-Lobenstein В., 2000; Mysliwska J., Bryl E., Tronkowski P. et al., 2000). Напротив, в группе старческого возраста линейно (4-х кратно) увеличивается концентрация в секрете ТЬ2- цитокина: IL-4, который регулирует антитело-опосредованный иммунный ответ. C.I.Yen, S.L. Lin, К.Т. Huang et al., (2000) также отмечают в своих исследованиях повышение в системном кровотоке уровня IL-4 в пожилом и старческом возрасте. Преобладание в составе мукосаливарного секрета цитокинов, продуцируемых Th2- лимфоцитами, оказывает понижающую регуляцию в отношении секреции INF-y Thl-лимфоцитами и приводит к девиации нормального Thl/Th2 баланса в сторону антитело-опосредованного ТЬ2-типа. Снижению Thl-зависимой продукции IFN-y У мужчин-ветеранов войн старческого возраста может способствовать низкий уровень регуляторного цитокина IL-12, уровень которого у лиц третьей группы оказался в три раза ниже аналогичного в группе зрелого возраста. Известно, что IL-12 способен оказывать повышающую регуляцию в отношении дифференцировки Thl-лимфоцитов и секреции ими IFN-y и, напротив, при недостатке его активирующего влияния происходит подавление синтеза Thl-лимфоцитами INF-y (Male D.et al., 2006).

К следующей характерной особенности возрастзависимых изменений цитокинового спектра мукосаливарной зоны у ветеранов боевых действий, можно отнести достоверное повышение концентрации провоспалигельного цитокина IL-17, в группах пациентов пожилого и старческого возраста. Одной из точек приложения действия IL-17 являются слизистые оболочки, где цитокин контролирует продукцию антимикробных протеинов типа ß-дефенсинов эпителиоцитами (Matsuzaki G., Umemura M., 2007). Имеются данные о

супрессивном действии IL-17 на дифференцировку Thl клеток, а градиентные концентрации IFN-7 и IL-4, в свою очередь, угнетают дифференцировку Thl 7 и продукцию ими IL-17 (Corthay А. , 2009). Установленное нами повышение уровня IL-4 и 1L-17 у лиц пожилого и старческого возраста, может быть следствием высокого уровня сенситизации организма к низкомолекулярным соединениям (гаптенам), входящим в состав металлоконструкций для протезирования.

Нами также установлены низкие уровни провоспалительного цитокина TNF-a у пожилых и старых пациентов-ветеранов войн в секрете, в сравнении с пациентами зрелого возраста, что свидетельствует о недостаточной активации мононуклеаров и нейтрофилов в слизистую оболочку полости рта (СОПР), снижении интенсивности хемотаксиса, синтеза острофазовых белков. Депрессия на этом фоне TNFa- зависимого пути реализации апоптоза, создает предпосылки для хронизации воспалительного процесса в тканях СОПР и развитию неопластических процессов. Вместе с тем, рядом авторов зарегистрировано увеличение с возрастом в системном кровотоке секреции макрофагами и моноцитами провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, №1-8, ТНФа (Gerli R., Monti D., Bistoni О. et al., 2000; Andrew D., Aspinall R., 2001; Mariani E„ Pulsatelli L„ Meneghetti A. et al., 2001).

Количество хемокина IL-8 в секрете, согласно нашим данным, оказалось минимальным в группе ветеранов пожилого возраста, максимум же значений выявлен в старческом возрасте. Локальное повышение концентрации хемокина в секрете слюнных желез в старческом возрасте, можно объяснить способностью IL-17, индуцировать продукцию моноцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF) и хемотаксических молекул подсемейства СХС (а-хемокинов), к которым относится IL-8 (Matsuzaki G., Umemura М., 2007).

Базовая концентрация в секрете IFN-a, с возрастом имела четко выраженную тенденцию к снижению (р=0,05 в сравнении между 1 и 3 группами), что может косвенно свидетельствовать о снижении противовирусного иммунитета в старческом возрасте.

Не было установлено значимых отличий в зависимости от возраста в концентрациях ростовых факторов в мукосаливарном секрете, в частности трансформирующего ростового фактора —р.

Известно, что развитие локального тканевого повреждения в любых тканях и слизистых оболочках, включая ротовую полость, как экзогенного (микробы, вирусы), так и эндогенного (альтеративные, постстрессорные изменения клеток) происхождения, сопровождается активной продукцией «сигнальных молекул опасности» нормальными клетками врожденного иммунитета в экстрацеллюлярное пространство (Yang De , Chen Qian , Bo Su Shao et al, 2007; Klune J.R, et al., 2008). Освобождающиеся при этом молекулы, являются эндогенным сигналом повреждения клеток и тканей и обозначаются термином «эндокины» (Harris Н.Е., Raucci А., 2006) или «alarmins» (Oppenheim, J. J., Yang, D., 2005). Нами изучены уровни двух

классических молекул тревоги - «аларминов»: интерлейкина -1 и лактоферрина. Ниже представлены рисунки 5 и 6, демонстрирующие уровни аларминов у ветеранов боевых действий разных возрастных групп.

Лактоферрин, нг/мп IL-1P, пг/мп

0 Группа 1 Ш Группа 2 г Группа 3 j 0 Группа1 И Группа 2 И Группа 3

Рис. 5. Уровень лактоферрина Рис.6. Уровень интерлейкина-ip

Продукция лактоферрина- продукта специфических гранул нейтрофилов, многократно увеличивается у ветеранов войн старческого возраста в сравнении с группами лиц зрелого и пожилого возраста. Это связано, прежде всего, с увеличением с возрастом в секрете ротовой полости численности нейтрофилов и других гранулоцитов, а также с активными антимикробными свойствами лактоферрина и его способностью к секреции независимо от индуцирующего сигнала (эндогенного или экзогенного). Напротив, уровень IL-1P, преимущественно макрофагального происхождения, многократно снижается в группе ветеранов пожилого и старческого возраста в сравнении с группой лиц зрелого возраста. Интерлейкин-1 является классическим (типичным) эндогенным сигналом тревоги и усиленно экспрессируется при стимуляции макрофагов ЛПС микробов, продуктами распада собственных тканей, аллогенными и ксеногенными имплантантами (Rao D.A., Pober J.S., 2008).

Оптимальный баланс функционирования иммунной системы на фоне имеющихся дефектов в отдельных ее звеньях формируется за счет компенсации недостающего компонента усиленным функционированием других компонентов. Процесс старения организма находит закономерное отражение в состоянии мукозального иммунитета ротовой полости и существенно меняет характер взаимосвязей между отдельными компонентами системы. По результатам проведения внутрисистемного корреляционного анализа по Spearman, установлено, что динамическое равновесие в рамках иммунной системы организма в каждый период онтогенеза характеризуется иным уровнем взаимодействия и взаимозависимости иммунных параметров внутри системы. Так, период зрелого возраста у ветеранов боевых действий характеризуется большим количеством положительных, разнонаправленных, слабых по силе

И Группа 1 Ш Группа 2 а Группа 3

. Уровень лактоферрина

взаимосвязей, что свидетельствует о физиологическом оптимуме работы иммунной системы в данном возрасте, на пике ее функциональной активности. Период пожилого возраста у ветеранов характеризуется снижением доли положительных связей, ростом отрицательных слабых и умеренных связей. Появляются качественно новые связи, отражающие наличие клеточного стресса на уровне MAJIT. Происходит активизация механизмов врожденного иммунитета, повышается уровень общей сенситизации организма, четко прослеживается снижение витальности иммуноцитов области МАЛТ. Для периода старческого возраста характерным является нарастание доли отрицательных различных по силе корреляционных взаимодействий, что отражает универсальный принцип «перемежающейся активности», характерный для функционирования разных физиологических систем организма (Саркисов Д.С. с соаэт., 1997). Появляется большое число связей с участием показателей отражающих влияние механизмов врожденного иммунитета, что является одним из факторов компенсации инволютивных процессов, происходящих в иммунной системе.

Для выявления факторной структуры показателей секреторного иммунитета у ветеранов боевых действий разных возрастных групп с определением факторной нагрузки переменных, входящих в эту структуру, нами был проведен многомерный факторный анализ с извлечением главных компонент с последующим varimax вращением матрицы данных. В качестве значимых для интерпретации принимались факторные нагрузки > 0,7. В результате проведенного многофакторного анализа установлено, что с возрастом повышается роль врожденных механизмов иммунной системы и нейтрофильного звена иммунитета. Максимально высокий удельный вес этих компонент выявлен в группе ветеранов старческого возраста (Factor 1: NK, СН50, СЗа, муцин, ФН=25.54%; Factor 2: vit, CD13+Ub, TGF-P, CD13, IL-1, лакгоферрин ФН= 14.99%) Напротив, зрелый возраст характеризуется высокой активностью факторов приобретенного иммунитета (Factor 1: CD4, CD8, IL-12, ФН=18.89%), а элементы врожденных факторов защиты встречаются как в составе ведущих компонент, так и в составе компонент с менее значительным вкладом в общую дисперсию, что соответствует оптимуму обеспечения защиты слизистых оболочек от биологической агрессии. В старших возрастных группах у ветеранов войн возрастает и роль молекул эндогенной тревоги - аларминов, как факторов сопровождающих развитие инволютивных процессов в иммунной системе в период старения.

Одной из задач настоящего исследования явилось построение «иммунологической модели старения» для ветеранов боевых действий, позволяющей распределять группы обследуемых по соответствию определенному возрастному отрезку жизни на основе определения показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны. При создании модели иммунологического образа старения анализировали 37 переменных величин в изучаемых группах с определением лямбды Уилкса, оценкой достоверности модели, функций классификации и коэффициентов для функций

классификации. Группой сравнения для 2 группы (ветераны пожилого возраста) служила группа 1 (ветераны зрелого возраста), группой сравнения для лиц старческого возраста соответственно служила группа 2 (ветераны пожилого возраста). Для иммунологической модели старения в возрастной группе 2 лямбда Уилкса составила 0,0022. Достоверность модели составила р<0,00001. Установлено, что между группами 1 и 2 с высокой степенью достоверности (р<0,05) различаются в зависимости от возраста значения 5-и показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны из анализируемых 37: относительное количество CD45+ иммуноцитов, относительное количество моноцитов (CD 14), относительное количество Т-хелперов (CD4), уровни цитокинов: IL-4 и IL-8 (пг/мл). Процент правильной классификации в обеих группах был равен 100%, что согласно Ребровой О.Ю. (2002), указывает на достоверно высокое качество распознавания. Далее нами был проведен расчет иммунологической модели старения для возрастных групп 2 (пожилой возраст) и 3 (старческий возраст). Лямбда Уилкса этой модели составила 0,0004. Достоверность модели р<0,00001. Для этих групп установлены следующие различия по 6-и показателям из анализируемых 37: уровни протективных факторов слизистых оболочек СОПР ( белка и муцина), количество секреторного IgA, молекул эндогенной тревоги- аларминов (лакгоферрина и IL-1) и уровень регуляторного цитокина IL-17. Процент правильного распознавания для обеих групп также был равен 100%. Биомаркерами иммунологического старения характерными для ветеранов пожилого возраста оказались следующие параметры, представленные на обобщающей схеме: относительное количество CD45+ иммуноцитов, относительное количество моноцитов (CD 14), относительное количество Т-хелперов (CD4), уровни цитокинов: IL-4 и IL-8. Иммунологический профиль старения у ветеранов войн в старческом возрасте определяют уровни протективных факторов слизистых оболочек полости рта (белка и муцина), молекул эндогенной тревоги-аларминов (лактоферрина и 1L-1) и регуляторного цитокина IL-17, количество секреторного IgA.

Таким образом, период возрастной инволюции организма сопровождается смещением приоритетной роли механизмов адаптивного иммунитета, уступая место филогенетически более устойчивым, генетически детерминированным факторам врожденного иммунитета. Необходимо рассматривать с современных позиций и роль активного участия в процессах старения клеточных элементов иммунной системы, сигнальных молекул, регулирующих разные биологические функции, синтез и секреция которых динамично меняется в процессе онтогенеза в ответ на реализацию инволютивных программ.

Зрелый возраст (35-60 лет)

Признаки инволюция

CD45- î IL12 t CD45+i CD134 Limf t CD141 CD13+llb; CD14+llb t CD19 î CD4t CD8=

Адаптивный иммунный ответ

CH50 t Белок | СЗа t Муцин ; С5а t NK =

Врожденный иммунитет

CD45"| slgAfV

CD45+t IgG4t\

CD13t IgMt

Limf 4 Lfî

CD14 4 IL1 4

CD13+llbt IL17Î

CD14+llb îf TNFa 4

CD19 4 IL 8 4

CD4 4

CD 8=

CH50 4 Белок t

СЗа 4 Муцин t

С5а i NK=

Факторный анализ

Старческий возраст (75-90 лет)

Инволюция регуляторных систем, морфофувхционалыше изменения МАЛТ, морфометрические изменения жевательного аппарата, гипосашшация

CD45* 4

CD45+Î CD13f t Limf I CD14J, CD13+llbt CD14+llb|| CD191 CD4 41 CD8=

slgAÎ IgMf Lfîî IL1 1 IL17Î TNFa J, IL 8 f IFNy I IL4 î

Дискриминантный анализ

Иммунологический профиль старения мукосаливарной зоны МАЛТ

Максимально высокий процент правильной классификации (100%) установлен для: CD45+ ,CD14, CD4, IL4, IL8

Максимальный (100%) правильный процент классификации в модели установлен для: ЬайоГепш. 1Ь-1,ПЛ7, 51ёЛ, белок, муцин

Схема 1.

ВЫВОДЫ

1. Методом проточной цитофлюориметрии у ветеранов боевых действий в зрелом возрасте в сравнении с ветеранами пожилого и старческого возраста установлено достоверное преобладание клеток неиммунного происхождения (CD45-), числа (%) : моноцитов с усилением экспрессии на них молекул адгезии (CD1 lb), лимфоцитов, субпопуляций В-лимфоцитов и Т-хелперов при снижении числа нейтрофилов со слабой экспрессией на них молекул адгезии.

2. Клеточный состав мукосаливарного секрета у ветеранов боевых действий пожилого и старческого возраста в сравнении с аналогичными показателями ветеранов зрелого возраста характеризовался нарастанием относительного числа нейтрофилов с молекулами адгезии (CD13+llb) при параллельном снижении количества моноцитов с рецепторами адгезии на них (CD14+llb). Во всех возрастных группах уровень Т-цитотоксических лимфоцитов и NK- клеток значимо не изменялся.

3. Изменения гуморального звена секреторного иммунитета у ветеранов в пожилом и старческом возрасте в сравнении с показателями в группе зрелого возраста, характеризовались достоверным ростом уровней секреторного IgA и IgM; у ветеранов в пожилом возрасте зафиксирован максимально высокий уровень IgG4. Количественные характеристики IgE с возрастом не менялись.

4. Со стороны гуморальных эффекгорных систем, относящихся к врожденным механизмам иммунной защиты, установлено снижение общей активности комплемента (СН50) и анафилотоксинов СЗа и С5а , достоверный возрастзависимый рост протективных компонентов слизистых - белка и муцина в старших возрастных группах.

5. По результатам многофакторного анализа установлено, что у ветеранов боевых действий в старческом возрасте лидирующие позиции в факторной структуре и максимальный удельный вес принадлежит факторам врожденного иммунитета : Factor 1: NK, СН50, СЗа, муцин, ФН=25.54%; Factor 2: vit, CD13+llb, TGF-P, CD13, IL-ip, лактоферрин ФН=14.99%. Клеточные параметры и их секреторные продукты (Factor 1 : CD4, CD8, IL-12, ФН=18.89%) занимают лидирующие позиции и, соответственно, вносят максимальный вклад в факторной структуре у ветеранов в зрелом возрасте .

6. Установлены возрастзависимые изменения алармин- и цитокинергической регуляции, проявляющиеся у ветеранов боевых действий в пожилом и старческом возрасте девиацией типа иммунного ответа в сторону ТЬ2 со снижением на этом фоне уровней IFN-y, TNF-a, IL-8, IL-10 и ростом уровней IL-4, IL-17, лактоферрина. Количество универсального ростового фактора TGF-P с возрастом существенно не изменялось.

7. В построенной математической модели иммунологического старения мукосаливарной зоны биомаркерами для группы ветеранов войн пожилого возраста являлись: относительное количество CD45+ иммуноцитов, моноцитов (CD14), Т-хелперов (CD4), уровни цитокинов IL-4 и IL-8; для

группы старческого возраста - уровни протективных факторов слизистых оболочек ротовой полости (белка и муцина), молекул эндогенной тревоги-аларминов (лакгоферрина и 1Ь-1Р) и уровень регуляторного цитокина 1Ь-17; количество в^А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Альтман, Э.Д. Цитокиновая регуляция на уровне мукозоассоциированной лимфоидной ткани саливарной зоны в

Варной

возрастном аспекте / Э.Д. Альтман, А-В.Зурочка, |С.Н. Теплова,

Е.В. Давыдова, Д.Ш. Альтман // Российский иммунологический журнал.- 2011.-том 5 (14).- №1.-С.56-61

2. Альтман, Э.Д. Стоматологическая патология у лиц пожилого и старческого возраста / Э.Д. Альтман // Проблемы геронтологии, нейроиммунологии. Организация медицинской помощи ветеранам войн: межрегиональный сб. научн. раб.- Челябинск, 2010,- Т.4.- С.170-172

3. Альтман, Э.Д. Взгляд врача стоматолога на проблему зубочелюстной системы у лиц пожилого и старческого возраста / Проблемы геронтологии, нейроиммунологии. Организация медицинской помощи ветеранам войн: межрегиональный сб. научн. раб,- Челябинск, 2010.- Т.4.- С.172-174.

4. Рахматулина, Э.Х. Цитофлуориметрическая оценка популяционного спектра иммунных клеток крови и слюны у здоровых молодых людей / Э.Х. Рахматулина, С.Н. Теплова, С.А. Коченгина, Э.Д. Альтман // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». - 2010. - №6 (182).- С. 62-65.

5. Альтман, Э.Д. Характеристика клеточного и гуморального звеньев иммунитета мукосаливарной зоны у лиц зрелого, пожилого и

старческого возраста / Э.Д. Альтман, А.В. Зурочка, |С.Н.Теплова|, Е.В.Давыдова, Д.Ш.Альтман // Медицинская иммунология. - 2011.-Т.13.- №2-3.-С.167-174.

6. Альтман, Э.Д. Иммунофенотипирование клеток мукосаливарного секрета при старении / Э.Д. Альтман // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской науч.-практ. конференции с междунар. участием, посвящ.35-летнему юбилею НИИ Медицинских проблем Севера СО РАМН и 30-летнему юбилею НИИ клинич. иммунологии СО РАМН,- Абакан.- 2011,-С.3-4.

7. Альтман, Э.Д. Иммунологические маркеры старения /Э.Д.Альтман II Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии: сборник докладов и тезисов - Новосибирск.- 2011.- № 1, С. 10.

8. Альтман, Э.Д. Старческий возраст и состояние зубочелюстной системы /Э.Д. Альтман // Психосоциальные факторы и внутренние болезни: состояние и перспективы: Сибирский медицинский журнал.- Новосибирск.-2011.- Том 26, приложение 1, -С. 38.

9. Альтман, Э.Д. Иммунологический профиль старения мукозоассоциированной ткани ротовой полости у лиц старших возрастных групп / Вестник Уральской медицинской академической науки: материалы IX Конференции иммунологов Урала.- Челябинск.-2011.-№2/1 (35).-С.8.

На правах рукописи

Альтман Элеонора Давидовна

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МУКОСАЛИВАРНОГО СЕКРЕТА У ВЕТЕРАНОВ БОЕВЫХ ДЕЙСТВИЙ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск 2011

Формат 60x84 '/]б. Бумага Снегурочка. Объем 1,5 усл. п. л. Тираж 100 экз. Заказ №1359

Изготовлено в полном соответствии с качеством предоставленных оригиналов заказчиком ООО «РЕКПОЛ», 454080, г. Челябинск, пр. Ленина, 77, тел.(351) 265-41-09,265-49-84

Актуальность изучения процессов старения на уровне мукосаливарной зоны ротовой полости определяется выраженными морфофункциональными изменениями жевательного аппарата у человека, связанными с возрастом, а-также ключевым положением мукозального звена иммунитета в* противоинфекционной защите организма. Иммунная система слизистых оболочек организма является особым компартментом иммунной системы и обеспечивает перманентную защиту полостей тела от эндогенных и экзогенных антигенов.

Специфическую противомикробную защиту мукосаливарной зоны ротовой полости обеспечивает мукозоассоциированная лимфоидная ткань (MAJIT), связанная* со слюнными железами - это индуктивная зона, расположенная^ в непосредственном контакте с поверхностью слизистых оболочек и внешним антигенным окружением (Rüper C.F. et al.,.2002; Cesta M.F. et al., 2006). MAJIT ротовой полости является первой линией обороны против колонизации слизистых мембран вирусными и бактериальными патогенами, осуществляет процессы первичного распознавания антигенов и инициацию определенного-типа иммунного ответа (Теплова С.Н., Алексеев Д.А., 2002; Санникова Т.Е., Марчук Г.И. с соавт., 2003; Пальцев М.А., Кветной И.М., 2009; Сотникова Н.Ю., 2009). Совсем недавно исследования мукозального иммунитета ограничивались оценкой антиколонизационных и бактерицидных механизмов врожденного иммунитета (Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е., 1996; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С 2001; Ковальчук JT.B. 2003; Ярилин A.A., 2003). В настоящее время имеются все технологические условия для анализа состояния молекулярно-клеточных механизмов врожденного и приобретенного иммунитета, в том числе механизмов иммунологической толерантности, иммунологических маркеров повреждения собственных клеток мукосаливарного барьера и процессов старения MAJIT. (Barnett J.C., 1994; Broekmans F.J., 2007; Yamamoto H., 2007; Зурочка A.B., Хайдуков C.B^, 2008).

В настоящее время установлено, что от момента рождения человека и до глубокой старости происходят существенные изменения центральных органов иммунной" системы; (тимуса), ее периферических органові (лимфоузлов, селезенки, МАЛТ), что обосновывает необходимость дифференцированной оценки иммунных параметров не ТОЛЬКО; системного уровня, но,- Иг состояния:, отдельных компартментов мукозального иммунитета в- разных возрастных периодах онтогенеза: человека, (Дмитриева; Jit А:, ,2000;: Данилевский-Леонтьев В:К: с.соавт., 2001; Яшин А.Я:, 2007; AnisimovV.N., 2005; 2006; 2008; Masoro E.J., Austad S.N., 2006). К основным проявлениям старения: относят инволюцию . регулягорных систем (нервной, эндокринной и иммунной), возрастные изменения которых ПОДЧИНЯЮТСЯ ; общим: закономерностями стареіїіія : организма. Эти изменения имеют свои особенности, обусловленные специфическими:; свойствами; данных систем и органов' (Скулачев В.П. 1997; Анисимов В.Н. 2000; B.F. Зайнуллин, A.A. Москалев; 2001; Боровский Е.НІ, 2005; Аниеимов В.Н., 2008; Трофимов А.В:, 2010; Anisimov V.N:,BèrsteihTL.]\^9 2008; Caballero Е., 2007). Возрастные инволютивные изменения^ органов и систем начинают проявляться уже в период зрелости, т.е. с 30-35 лет, в 40-49 лет изменения уже.отчетливо выражены (Ярплин A.A., 2003; Анисимов В.Ы., 2008; Новосельцев В. Н., Михальский А.Иі, 2009; Vinogradova I.A. et al., 2009). Начальные изменения: в иммунной системе при старении, непосредственно связанные: с возрастной; инволюцией: тимуса; выявляются уже в 25-30 лет (Бутенко F.M., 1993*- Карсонрва*'М.И.,:Шнегин БІВІj,2003;;Иальцев'ЖА.'. и Др;, 2009). Достаточно рано'признаки старения начинают проявляться и на уровне мукозоассоииированной лимфоидной ткани? (МАЛТ) ротовой полости, что, по мнению ряда исследователей, является: надежным индикатором физиологического старения организма в целом (Карсонова М.И., Пинегин Б.В. 2003; Куликов А.В, Архипова Л.В., 2010; Evans P. et al., 2000). Биологический секрет мукосал и Варной области является весьма привлекательным материалом для фундаментальных и прикладных клинических исследований в области' иммунологии,.бактериологии, микробиологии, стоматологии (Григорьев И.В., Артамонов ИД., Уланова Е.А., и др., 2003). Целенаправленный поиск иммунологических маркеров старения на уровне мукосаливарной зоны представляет большой научный интерес, как в, теоретическом, так и в практическом применении, позволит разработать формализованные схемы-прогнозирования-индивидуальных-рисков- развития возраст-ассоциированных заболеваний. Необходимость вариативного* сравнения иммунологических; параметров у ветеранов ■ боевых действий, разных возрастных групп;, полученных, при сочетанных формах полипатологии со стандартными значениями!И внедрение новых современных стратегий диагностики различных форм иммунопатологии,, послужило' важным побудительным мотивом к выполнению данной работы. . •

Настоящее, исследование является фрагментом многолетних исследований' по проблемам секреторного иммунитета, проводимых на кафедре иммунологии и аллергологии ГОУ BÏIO .Челябинской государственной медицинской академии Росздрава (Теплова С.Н., 1981; Архандеев A.B., A.B., 2000; Галимова О.В., 2003; Лепешкова Т.С., 2003; и др.):.

Цель исследования: анализ показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости с определением иммунологических, предикторов старения у ветеранов боевых действий разных: возрастных групп. Задачи:

Г. С помощью метода проточной цитофлуориметрии оценить клеточный состав мукосаливарного секрета у изучаемого контингента. . .

2. Оценить состояние гуморального звена секреторного иммунитета, ротовой ' полости у ветеранов боевых действий разных возрастных групп на основе количественного определения уровней иммуноглобулинов, основных классов и субклассов, общей активности системы комплемента и ее субкомпонентов СЗА, С5А, уровней протективных компонентов слизистых: белка и муцина.

3. Определить уровень основных регуляторных цитокинов и молекул эндогенной тревоги - аларминов в саливарном секрете у ветеранов боевых действий разного возраста.

4. На основе полученных данных построить.математическую модель, старения MAJ1T саливарной зоны ротовой полости с определением иммунологических биомаркеров старения у ветеранов боевых действий в разных возрастных группах.

Научная новизна исследования, состоит в изучении показателей секреторного иммунитета ротовой полости у ветеранов боевых действий в возрастном аспекте. Впервые проведен цитофлуориметрический анализ: популяционного состава иммуноцитов : мукосаливарного секрета у ветеранов боевых действий разного- возраста, установлены характерные возраст-ассоциированные изменения. Установлено доминирующее значение; факторов врожденного иммунитета при- прогрессировании процессов старения на уровне мукосаливарной зоны ротовой полости.: Определен баланс регуляторных цитокинов, определяющих.тип иммунного ответа, у ветеранов пожилого и г старческого- ' возраста установлено . превалирование ТК2антителоопосредованного типа иммунного ответа на уровне индуктивной зоны

МАЛТ ротовой полости.

Новыми являются данные об изменении количества эндогенных сигнальных молекул- повреждения, собственных клеток (аларминов) в мукосаливарном секрете у ветеранов боевых действий зрелого, пожилого и старческого возраста. Отмечен достоверный рост уровня лактоферрина в изучаемых группах пожилого и старческого возраста, что может быть связано с наличием эндогенного • клеточного стресса- при: прогрессировании процессов старения организма. . . . . . \

Проведен-' математический; анализ с определением параметров, секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости, характеризующих иммунологический профиль старения в изучаемых возрастных группах.

Теоретическое и практическое значение работы состоит в изучении процессов старения в периферическом отделе .иммунной системы на уровне мукозального иммунитета ротовой полости у ветеранов войн. Выявлены основные закономерности формирования принципиально нового уровня цитокиновой и аларминовой регуляции у пациентов старших возрастных групп с преобладанием антителоопосредованного иммунного ответа. На основании многомерных статистических методов выявлены характерные для: пожилого и > старческого возраста иммунологические биомаркеры старения мукосаливарной зоны ротовой полости, что позволит определять индивидуальные темпы старения у ветеранов боевых действий, прогнозировать вероятность возникновения возраст-ассоциированных болезней, а также внедрять новые стратегии в диагностике разных форм иммунопатологии. Положения, выносимые на защиту:

1. Изменения клеточных .и гуморальных показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости у ветеранов боевых действий, полученные при комплексном иммунологическом обследовании, зависят от возраста индивидуума.

2. Пожилой и старческий возраст характеризуется доминированием врожденных факторов защиты слизистых и изменением типа регуляции иммунного ответа на ТЬ2-антителоопосредованный.

3. Биомаркеры иммунологического старения саливарной зоны ротовой полости у ветеранов боевых действий позволяют оценить соответствие совокупности иммунологических показателей определенному, возрастному отрезку онтогенеза.

Внедрение

По- теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Материалы диссертации внедрены в диагностическую работу Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя для ветеранов войн. Основные положения работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия. Росздрава»; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Апробация диссертации Основные положения и результаты исследования по теме диссертации доложены и обсуждены на Сибирской научно-практической конференции «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Новосибирск, 2011), Всероссийской научно-практичестической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011), Всероссийском конгрессе с международным участием «Психосоциальные факторы и внутренние болезни: состояние и перспективы» (Новосибирск, 2011), IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011). Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 6 рисунками и 24 таблицами. Список цитированной литературы содержит 187 источников, в т.ч. 74 отечественных и 113

ВЫВОДЫ

1. Методом проточной цитофлюориметрии у ветеранов боевых действий в зрелом возрасте в сравнении с ветеранами пожилого и старческого возраста установлено достоверное преобладание клеток неиммунного происхождения (CD45-), относительного числа моноцитов с усилением экспрессии на них молекул адгезии (CD lib), относительной численности лимфоцитов, субпопуляций В-лимфоцитов (%) и Т-хелперов (%) при достоверном снижении на этом фоне относительного числа нейтрофилов со слабой экспрессией на них молекул адгезии.

2. Клеточный состав мукосаливарного секрета у ветеранов боевых действий пожилого и старческого возраста в сравнении с аналогичными показателями ветеранов зрелого возраста характеризовался нарастанием относительного числа нейтрофилов с молекулами адгезии (CD13+llb) при параллельном снижении количества моноцитов с рецепторами адгезии на них (CD14+llb). Во всех возрастных группах уровень Т-цитотоксических лимфоцитов и NK- клеток значимо не изменялся.

3. Изменения гуморального звена секреторного иммунитета у ветеранов в пожилом и старческом возрасте в сравнении с показателями в группе зрелого возраста, характеризовались достоверным ростом уровней секреторного IgA и IgM; у ветеранов в пожилом возрасте зафиксирован максимально высокий уровень IgG4. Количественные характеристики IgE с возрастом не менялись.

4. Со стороны гуморальных эффекторных систем, относящихся к врожденным механизмам иммунной защиты, установлено снижение общей активности комплемента (СН50) и анафилотоксинов СЗа и С5а, достоверный возрастзависимый рост протективных компонентов слизистых - белка и муцина в самых старших возрастных группах;.

5. По результатам многофакторного анализа установлено, что у ветеранов боевых действий в старческом возрасте лидирующие позиции в факторной структуре и максимальный удельный вес принадлежит факторам врожденного иммунитета : Factor 1: NK, СН50, СЗа, муцин, ФН=25.54%; Factor 2: vit, CD 13+1 lb, TGF-p, CD 13, IL-1(3, лактоферрин ФН=14.99%. Клеточные параметры и их секреторные продукты (Factor 1: CD4, CD8, IL-12, ФН=18.89%) занимают лидирующие позиции и, соответственно, вносят максимальный вклад в факторной структуре у ветеранов в зрелом возрасте .

6. Установлены возрастзависимые изменения алармин- и цитокинергической регуляции, проявляющиеся у ветеранов боевых действий в пожилом и старческом возрасте девиацией типа иммунного ответа в сторону Th2 со снижением на этом фоне уровней IFN-y, TNF-а, IL-8, IL-ip и ростом уровней IL-4, IL-17, лактоферрина. Количество универсального ростового фактора TGF-p с возрастом существенно не изменялось.

7. В построенной математической модели иммунологического старения мукосаливарной зоны биомаркерами для группы ветеранов войн пожилого возраста являлись: относительное количество СЭ45+ иммуноцитов, моноцитов (СО 14), Т-хелперов (С04), уровни цитокинов 11,-4 и 1Ь-8; для группы старческого возраста - уровни протективных факторов слизистых оболочек ротовой полости (белка и муцина), молекул эндогенной тревоги- аларминов (лактоферрина и ІЬ-ір) и уровень регуляторного цитокина 1Ь-17; количество б^А .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Актуальность изучения процессов старения на уровне мукосаливарной зоны определяется специфическими морфофункциональными изменениями жевательного аппарата человека, связанными с возрастом, а также ключевой ролью мукозального компартмента иммунной системы в процессах первичного распознавания антигенов и инициации определенного типа иммунного ответа на перманентно поступающие антигены. К основным проявлениям старения относят инволюцию регуляторных систем (нервной, эндокринной и иммунной), возрастные изменения которых подчиняются общим закономерностям старения организма. Эти изменения имеют свои особенности, обусловленные специфическими свойствами данных систем и органов (Скулачев В.П. 1997; Анисимов В.Н. 2000; В.Г. Зайнуллин, A.A. Москалев, 2001; Боровский Е.В., 2005; Анисимов В.Н., 2008; Трофимов A.B., 2010; Anisimov V.N., Berstein L.M., 2008; Caballero Е., 2007). Возрастные инволютивные изменения органов и систем начинают проявляться уже в период зрелости (с 30-35 лет) и в 40-49 лет изменения уже отчетливо выражены (Ярилин A.A., 2003; Анисимов В.Н., 2008; Новосельцев В. Н., Михальский А.И., 2009; Vinogradova I.A. et al., 2009). Не является исключением и мукозоассоциированная лимфоидная ткань (MAJ1T) ротовой полости - периферический отдел иммунной системы, обеспечивающий защиту слизистых оболочек от чужеродных антигенов (Карсонова М.И., Пинегин Б.В., 2003).

В недавнем прошлом исследования мукозального иммунитета ограничивались только оценками антиколонизационных и бактерицидных механизмов врожденного иммунитета. Разработка и внедрение современных технологий позволили существенно расширить представления о молекулярно-клеточных механизмах взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета, в частности, о реализации программы старения на уровне разных отделов MAJIT, оценить формирование иммунологической толерантности к собственным антигенам организма, установить эндогенные маркеры повреждения собственных клеток организма.

Характерные для старения изменения достаточно рано выявляются на уровне мукозоассоциированной лимфоидной ткани (MAJ1T) ротовой полости, в связи с чем, состояние слизистой оболочки полости рта (СОПР) может служить индикатором, отражающим общие закономерности старения целостного организма.

В настоящее время, к наименее изученным отделам MAJIT относится, в частности, лимфоидная ткань, ассоциированная со слюнными железами (salivary dact-associated- DALT) (Теплова С.Н., Алексеев Д.А., 2002; Сотникова Н.Ю., 2009; Cesta M.F. et al., 2006; Brandtzaeg P. et al., 2008). Нет данных о популяционном и субпопуляционном составе иммуноцитов мукосаливарного секрета в условиях инволюции MAJIT саливарной зоны, не установлены базовые уровни молекул эндогенной тревоги —аларминов при старении1 MAJIT. Малоизученными на сегодняшний день остаются вопросы, касающиеся интерферренции механизмов клеточного старения и генетически программируемой клеточной гибели (Хансон К.П., 1999; Stergiou L. et al., 2004; Yan N. et al., 2005; Jaramillo-Lambert A. et al., 2007; Djahanbakhch O., 2007; Tatone C., 2008). В то же время постулировано, что после рождения человека вплоть до глубокой старости происходят существенные изменения центральных органов иммунной системы (тимуса), ее периферических отделов (лимфоузлов, селезенки). Это позволяет предполагать столь же значительные изменения, связанные с возрастом и со стороны структур MAJ1T. Мукосаливарный секрет является уникальной субстанцией, представляющейся весьма перспективной для использования, как в фундаментальных исследованиях, так и в прикладной клинической диагностике (Григорьев И.В., Артамонов И.Д., Уланова Е.А. и др., 2004). Значительный научный и практический интерес представляют собой возможности исследования состава мукосаливарного секрета при различной патологии в диагностических и лечебных целях. Сбор данного биологического материала является неинвазивпым, безболезненным, содержание некоторых веществ в секрете (гормонов, антител, лекарственных препаратов и др.) отражает их концентрацию в крови (Mestecky J., 1993; Lac G., 2001). Наличие определенных корреляций между расстройствами разных физиологических систем и функциональной активностью слюнных желез послужило поводом для некоторых исследователей называть эти железы «зеркалом болезней» (Seifert G., 1997).

Настоящее исследование является фрагментом общей программы изучения секреторного иммунитета, проводимой на кафедре иммунологии и аллергологии Челябинской государственной медицинской академии в течение многих лет под руководством профессора ¡Тепловой С.Н.| Целью нашего исследования явртлась оценка показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости с определением иммунологических предикторов старения у ветеранов боевых действий в разные возрастные отрезки онтогенеза.

Для проведения настоящего исследования, согласно критериям включения (полная стоматологическая санация ротовой полости, отсутствие острых и обострений хронических заболеваний полости рта, онкологических, эндокринных болезней и др.) было отобрано 106 мужчин - ветеранов боевых действий (ВБД) в возрасте от 35 до 90 лет. Согласно критериям возрастной периодизации АПН СССР (1965) все они были разделены на три группы: 1 группа (40 человек) - II период зрелости (от 35 до 60 лет), средний возраст (М±ш) составил 45,6±2,2 года; 2 группа (30 человек) - лица пожилого возраста (от 61 до 74 лет), средний возраст составил 63,4±5,2 года. В 3-ю группу были включены 36 пациентов старческого возраста от 75 до 90 лет, средний возраст которых составил 81,1 ±1,6 года.

Перед проведением иммунологических исследований все ветераны прошли тщательное клинико-инструментальное обследование для выявления сопутствующей соматической патологии. Нами были установлены многочисленные признаки хронической соматической патологии без признаков экзацербаций у пациентов всех изучаемых групп. Так, у (ВБД) в возрасте 35-60 лет выявлялось в среднем 2-3 хронических заболевания, у ВБД пожилого возраста ( 61-74 года) от 3 до 5, а в старческом возрасте (75- 90 лет) уже 6-9 заболеваний в стадии компенсации.

Всем пациентам, включенным в исследование, предварительно, до забора секрета были проведены мероприятия по санации ротовой полости: лечение кариозных зубов, воспалительных процессов слизистой оболочки полости рта, удаление зубных отложений. При внешнем осмотре выявлялась выраженная асимметрия костей лицевого черепа у 8 (12%) ветеранов старших возрастных (2-я и 3-я) групп, как следствие частичной или полной утраты зубов (адентии). У большинства обследованных ВБД пожилого и старческого возраста (2 и 3-ей групп) после экстракции зубов возникли вторичные морфометрические изменения ротовой полости разной степени выраженности в виде значительной атрофии челюстей, образования дополнительных складок, смещения переходной складки по отношению к гребню альвеолярного отростка. Эти изменения, как правило, распространялись за пределы альвеолярных отростков, захватывая слизистую оболочку и небо. Углубление носогубных и подбородочной складок, западение губ, а также явления прогении выявлялись у 10% ВБД из 1-ой группы, у лиц пожилого и старческого возраста у 36 и 67% соответственно, в результате частичной утраты зубов и уменьшения высоты зубного ряда. При осмотре СОПР в группе среднего возраста слизистая оболочка была влажной, бледно-розового цвета, блестящей и гладкой. У более возрастных ветеранов (во 2 и 3-ей группах) практически в равной степени (в обеих группах почти у 67 %) отмечалась сухость слизистых оболочек ротовой полости, как следствие повышения вязкости и снижения скорости секреции слюнных желез, достигающая степени ксеростомии у 1 ветерана. В группе ветеранов старческого возраста • определялись возрастные изменения твердых тканей зубов в виде поперечной волнистости эмали, явлений эрозии эмали. Клиновидные дефекты обнаруживались у большинства ветеранов пожилого и старческого возраста (более 80% случаев). Во всех изучаемых группах отмечались признаки повышенной стираемости зубов, при этом II и III степень стираемости зубов встречалась у 82% обследованных. Нами так же было установлено, что с возрастом изменялась окраска эмали зубов: так в 1 группе преобладал цвет от белого до желтоватого, то у лиц пожилого и старческого возраста цвет эмали был желтовато-коричневым за счет образования вторичного дентина и большого количества микротрещин эмали, заполненных различными красителями (чай, кофе). У ветеранов зрелого возраста выявлено преобладание несъемных мостовидных протезов и одиночных коронок. В группах же пожилого и старческого возраста преобладающими по численности являлись съемные протезы (частичные или полные) с кламмерной фиксацией. Установлено, что большинство несъемных и съемных конструкций во всех группах эксплуатировались в среднем от 5 до 20 лет, были функционально некачественными с множественнымие сколами эмали, плохой фиксацией на челюсть и смещались при открывании рта. В результате у 75% ветеранов обнаруживались признаки дистрофических и атрофических изменений, слизистой протезного ложа.

Необходимо отметить, что уровень гигиенических знаний и навыков, а также мотивация ухода за полостью рта заметно менялась с возрастом. Так, только 1/4 -я пациентов из 1-ой группы при разговоре с врачом-стоматологом имели частичные представления (когда, с какой частотой и как правильно необходимо чистить зубы) о гигиене полости рта, остальные же интересовались только основными правилами гигиены. Большинство пациентов второй и, особенно, третьей групп (соответственно 93% и 97%) относились к процедуре чистке зубов формально, не владели достаточным объемом знаний и навыков гигиенических процедур. У части ветеранов процесс чистки зубов и съемных пластиночных протезов был затруднен по причинам физической слабости, ограничения самостоятельной подвижности и необходимости в постоянной помощи.

Для оценки показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны ротовой полости использовали мукосаливарный секрет, который собирали в пластиковые контейнеры методом спонтанного выделения натощак утром .

Для идентификации параметров клеточного и гуморального компартментов секреторного иммунитета изучали следующие составляющие: клеточный состав секрета (лимфоидные клетки,, эпителиоциты, нейтрофилы); количество белка и муцина; количество секреторного иммуноглобулина А, иммуноглобулина Е; общее количество иммуноглобулинов: класса G и его подклассы G1-G4; общую активность комплемента и уровень фрагментов СЗа и. С5а; уровни регуляторных цитокинов: IL-4, IL-8, 1L-12, IL-17, TNF-a; молекулы семейства интерферонов: IFN-y IFN-a; ростковые факторы: TGF-P;: алармины:;1Е-1р', лактоферрин.

При .определении показателей секреторного иммунитета использовали; методы проточной цитофлюориметрии и иммуноферментного; анализа;, общую активность комплемента определяли методом гемолитического титрования с оценкой результатов,на ФЭКе с вертикальным.лучом (Multiscan plus).

При цитофлюоримстрическом определении клеточного состава мукосаливарного секрета с целью отличия? иммунных клеток от эпигелиоцитов использовали линейный дифференцировочный CD45+ маркер, уровень, экспрессии которого; согласно литературным данным; нарастает по мере дифференцировки гемопоэтических клеток от незрелых предшественников до зрелых форм (Зуева ЕЕ., 2003, Луговская С.А. с соавт., 2005). Во всех« изучаемых группах преобладающими по численности: оказались- клетки неиммунного происхождения CD45" преимущественно эпителиоциты буккального*происхождения; существенную1 часть составлял клеточный детрит (Debris). В целом, на долю иммуноцитов приходилось более трети от общего числа клеток, включая дебрис. Наибольшее число эпителиоцптов нами установлено в группе зрелого возраста (Г группа) в сравнении с другими возрастными группами (р<0!05). Напротив же, у ветеранов пожилого и старческого возраста доля клеток иммунного происхождения (зрелые нейтрофилы, макрофаги,.NK-клетки, популяции и субпопуляции лимфоцитов), экспрессирующих линейный дифференцировочный маркер CD45+, достоверно превышала аналогичный показатель в. группе лиц зрелого1 возраста. Процент общей жизнеспособности всех клеток (витальность - Vit%), включая эпителиоциты и прочие, составил во всех группах более 80%. Показатели витальности иммуноцитарного гейта. (GD45vit+%) варьировали от значений менее 10% до 40% и более. Такая вариабельность показателя витальности иммуноцитов может быть связана с низкой устойчивостью клеточной мембраны к действию разного рода ферментных протеинов секрета. Распределение клеточных популяций мукосаливарного секрета в изучаемых группах представлено на рисунке 6.

Рис.6. Клеточный состав иммуноцитов мукосаливарного секрета у ВБД.

Установлено, что состав мукосаливарного секрета претерпевает существенные изменения с возрастом: увеличивается число нейтрофилов с максимумом в группе ветеранов старческого возраста (более 94% от общего чиста иммунных клеток), что, по данным многих авторов, обусловлено не только физиологическим старением, но и возможными хроническими воспалительными изменениями в ротовой полости у ветеранов пожилого и старческого возраста, связанные с недостаточной гигиеной полости рта, ношением протезов и неправильным уходом за ними (Ткаченко Т.Б. с соавт., 2007). Кветным И.М. с соавт. (2005) показано усиление процессов дифференциации гранулоцитов с возрастом. Нами аналогично установлено, что количество гранулоцитов, несущих на своей поверхности р2-интегрины (СБ11Ь+, ЬРА-1) нарастает с возрастом, достигая максимальных значений в третьей группе - у лиц старческого возраста. Рецепторами интегринов служат компоненты межклеточного матрикса, молекулы суперсемейства лимф. % 100^

СР14, %

ГруппаЗ

Группа 2. Группа 1 иммуноглобулинов и три типа молекул адгезии -ICAM (Intercellular adhesion molecules) - ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, расположенные на активированных лейкоцитах, эндотелиальных клетках слизистых оболочек, в том числе и в ротовой полости. Известно, что при инициации воспалительной реакции, эндотелиальные клетки в очаге воспаления активируются и приобретают свойства, аналогичные свойствам высокого эндотелия лимфоидных органов и способны пропускать в воспаленные ткани лейкоциты (Ярилин A.A. 1999, 2010). Пул моноцитов/макрофагов во всех группах было достаточно представительным, с максимумом в 1-ой группе (зрелого возраста) и последующим линейным уменьшением у ветеранов пожилого и старческого возраста. Нами также установлено, что с возрастом число мононуклеаров, экспрессирующих молекулы адгезии (CDllb+) достоверно снижается, достигая своего минимального значения в самой возрастной группе (75-90 лет). Такой характер перераспределения клеточных популяций может быть связан с возрастающей ролью нейтрофилов в качестве АПК и фагоцитирующих клеток, о чем свидетельствуют исследования Meyer K.S., Soergel P., (1999), с параллельным увеличением их способности к межклеточным взаимодействиям (Котельников Г.П., 1997; Knare V., Sodhi A., Singh S.M., 1999). Работами Duez С. (2006) продемонстрировано, что рецептор CD 14, экспрессированный на моноцитах/макрофагах, способен связывать ЛПС микробов и участвовать в активации мононуклеарных клеток через То11-подобный рецептор-4 (TLR-4). Однако экспериментальным способом доказана меньшая чувствительность макрофагов старых животных к стимулирующему действию INF-y и продуцирование ими NADPH оксидаз, измеряемая на основе продукции перекиси водорода и TNF-a (Davila D.R., Edwards С.К., Arkins S. et al., 1990, Ershler W.B., Keller E.T., 2000).

Особенности распределения с возрастом циркулирующих клеток врожденного иммунитета были изучены на примере одной из разновидностей популяции больших гранулярных лимфоцитов (LGL, Large Granular Lymphocytes)- натуральных киллеров (NK), имеющих фенотип CD3" CD56+CD16+CD2dim (Хайдуков С.В., Зурочка А.В, 2008). Функциональная активность NK-клеток проявляется способностью к секреции ряда цитокинов: GM-CSF, TNF-a, IFN-y (Biron С.А., et al., 1999; Cooper M.A., et. AI., 2001 ) и хемокинов CCL3, CCL4, CCL5 и XCL1 (Taub D.D., et al., 1999; Inngjerdingen M., et al., 2001). Активированные NK-клетки могут нести на своей поверхности CD25, HLA-DR, CD11/CD18, рецептор к трансферрину CD71. Некоторыми авторами отмечено возрастание с возрастом количества больших гранулярных лимфоцитов, дифференциация которых не связана с тимусом (Трофимов A.B., 2009). Мы не обнаружили достоверных отличий в численности этих клеток среди изучаемых групп, однако результаты проведенного многофакторного анализа убедительно показывают приоритетность роли факторов врожденного иммунитета в старших возрастных группах ВБД, о чем свидетельствует увеличение их удельного веса в общей дисперсии признаков и перемещение на ведущие факторные позиции. Это подтверждает наличие онтогенетической сохранности механизмов врожденного иммунитета у ВБД в старших возрастных группах, как фактора компенсации утраченных позиций адаптивного иммунитета.

Лимфоцитарный пул в составе мукосаливарного секрета был представлен в минимальном количестве и составил в среднем от 1,6 до 3,0%, с наименьшим представительством в группе ВБД пожилого возраста. Согласно литературным данным, с возрастом пролиферация лимфоцитов сопровождается снижением их пролиферативного потенциала, связанного с уменьшением длины теломеров, концевых фрагментов ДНК, необходимых для репликации генома делящейся клетки (Трофимов A.B., 2009).

Распределение субпопуляций лимфоцитов в мукосаливарном секрете в зависимости от возрастных интервалов представлено на рисунке 7.

CD19, %

Группа 1 -Группа 2 Труппа 3

Рис.7. Субпопуляционный состав лимфоцитов мукосаливарного секрета у ВБД.

Нами установлено достоверное снижение с возрастом популяции В-лимфоцитов с минимальным представительством у ветеранов старческого возраста. Наши данные отражают общую тенденцию к снижению пула циркулирующих в кровотоке B-лимфоцитов с возрастом. В частности, Симоновой A.B. с соавт. (2001), продемонстрировано уменьшение численности В-лимфоцитов в циркуляции у пациентов старших возрастных групп с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта.

В группе старческого возраста выявлено существенное снижение численности Т-хелперов в сравнении с группами ВБД зрелого и пожилого возраста, что также согласуется с литературными данными о снижении с возрастом в системной циркуляции количества CD4 лимфоцитов, ослаблении их контактов с АПК клетками (Haynes et al., 1999). Работами Eaton et.al. (2004) показано, что стареющие CD4 лимфоциты продуцируют в два раза меньше IL-2, регулирующего процесс пролиферации CD8 клеток, что соответственно негативно сказывается на их интенсивности. Однако, в нашем исследовании значимого снижения с возрастом цитотоксической популяции

CD8) лимфоцитов не наблюдалось. Gavazzi G., Krause К. (2002) подчеркивают, что количественные изменения содержания основных популяций лимфоцитов в старших возрастных группах приводят к снижению иммунологической реактивности и аутотолерантности, способствуя появлению инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

Нами было проведено определение гуморальных факторов врожденного и приобретенного секреторного иммунитета мукосаливарной зоны у ВБД разных возрастных групп. При этом установлены четкие возрастные закономерности изменения этих параметров. Со стороны эффекторных факторов врожденного гуморального иммунитета работающих по принципу ограниченного протеолиза, выявлено достоверное снижение с возрастом общей гемолитической активности комплемента (СН50) и уровня субкомпонентов — продуктов расщепления белков системы комплемента: СЗа и С5а. Максимальное достоверное снижение уровня СЗа и С5а-анафилактогенных белков установлено в самой старшей возрастной группе . Снижение общей гемолитической активности комплемента (СН50) и субкомпонентов СЗа, С5а в пожилом и старческом возрасте по мнению Горячкиной Л.А., и Кашкина К.П., (2009) может свидетельствовать о недостаточности антиген-специфического ответа на патогенные агенты.

Напротив, в группах пожилого и старческого возраста показано с высокой степенью достоверности (р < 0,01) увеличение в мукосаливарном секрете количества основных компонентов антиколонизационного барьера: белка и гелеподобного крупномолекулярного гликопротеина- муцина. Согласно данным Belley А. et al. (1999), гликопротеины способствуют активной колонизации слизистых оболочек ротовой полости индифферентной аутофлорой и препятствуют прикреплению патогенных микроорганизмов. Не исключено, что увеличение концентрации белка и муцина в слюне с сопутствующими явлениями гипосаливации и обусловлавливают феномен сухости слизистых оболочек полости рта у ветеранов в пожилом и старческом возрасте (Михайлов В.В., 1993; Sonis S.T., 2004). Серийными исследованиями Т.В. Подгорбунских (2005), проведенными на базе кафедры аллергологии и иммунологии ЧелГМА под руководством профессора Тепловой С.Н., также установлено повышение в слюне концентрации белка и муцина у лиц в возрасте 61-70 лет и, особенно, у лиц 71-80 лет.

Изучение состояния приобретенных факторов защиты слизистых оболочек ротовой полости позволило установить многократный рост э^А у ветеранов старческого возраста, что является закономерным ответом МАЛТ на увеличение антигенной нагрузки СОПР с возрастом. Вместе с этим, увеличение концентрации муцина1 в> слизистых секретах слюнных желез способствует формированию вязкой адгезивной среды, замедляющей движение микробов к поверхности эпителия и препятствуя его микробной колонизации ЬатЬНп В. е! а1., (1993).

При изучении уровней иммуноглобулинов, ответственных за состояние первичного (^М) и вторичного (1§С общий, субклассы: С1, 02, ОЗ, в4) иммунного ответа, зафиксированы следующие особенности: у ВБД зрелого возраста выявлено более низкое количество иммуноглобулина М (р=0,004) в сравнении с лицами старческого возраста. Исследованиями Подгорбунских Т.В. (2005) максимальные уровни ^М в слюне также были установлены в более старшем возрастном периоде (71-80 лет). Уровни иммуноглобулинов класса в (общего) и его субклассов (01, С2, вЗ) среди изучаемых возрастных групп значимо не различались, достоверные изменения концентрации установлены лишь для блокирующих антител подкласса С4, уровень которых в группе пожилого возраста оказался максимальным.

Известным является тот факт, что с возрастом, в целом, нарастает уровень аллергизации организма. При этом нередко реагиновый тип иммунного ответа замещается псевдоаллерическими или гаптензависимыми реакциями гиперчувствителыюсти. В наших же исследованиях уровень общего иммуноглобулина Е проявлял четкую тенденцию к снижению в периоде старческого возраста. Однако, как было указано выше, период пожилого возраста у ВБД характеризуется повышенным уровнем блокирующих иммунных антител субкласса 04, свидетельствующих о существовании определенного уровня сенсибилизации организма.

Таким образом, зафиксированная в нашем исследовании активация в старших возрастных группах врожденных механизмов- протекции СОПР на фоне существенно выраженного дисбаланса приобретенных факторов может носить компенсаторный характер. Сочетания с диспластическими1 изменениями в слизистых оболочках ротовой полости указывают на, существенные изменения локального иммунного гомеостаза с возрастом, что может способствовать патологической трансформации с развитием инфекционных, аллергических, дегенеративных и опухолевых процессов.

Современными иммунологическими исследованиями показано, что I различные топические зоны MAJIT имеют характерную «цитокиновую среду» -матрицу оппонентных, часто меняющихся сигналов разного уровня (Swein S., 2007). Сложный многоуровневый характер взаимодействия определяет повышающий или' понижающий тип регуляции иммунного ответа. Для исследований цитокинового спектра мукосаливарной области МАЛТ нами были определены базовые концентрации регуляторных цитокинов, ростовых факторов, молекул системы интерферонов, хемокинов: TNF-a, IL-4, IL-17, IL-8, IL 1-0, IL-12, TGF-P, IFN-y, IFN-a. По результатам исследования установлено, что период старческого возраста у ветеранов характеризуется снижением в мукосаливарном секрете- уровня INF -у, принимающего непосредственное участие в клеточно-опосредованном иммунном ответе, что подтверждается данными, указывающими на снижение с возрастом-уровня Thl-лимфоцитов и IL-2 в циркуляции (Beverli P.C., Grubeck-Lobenstein В., 2000; Mysliwska J., Bryl E., Tronkowski P. et al., 2000). Но в старческом возрасте линейно (4-х кратно) увеличивается концентрация в секрете Th2- цитокина: IL-4, который регулирует антитело-опосредованный иммунный ответ. Yen C.J., Lin S.L., Huang К.Т. et al., (2000) также отмечают в своих исследованиях повышение в системном кровотоке уровня IL-4 в пожилом и старческом возрасте. Преобладание в составе мукосаливарного секрета цитокинов, продуцируемых ТЬ2- лимфоцитами, оказывает понижающую регуляцию в отношении секреции INF-y Thl-лимфоцитами и приводит к девиации нормального Thl/Th2 баланса в сторону антитело-опосредованного ТЬ2-типа. Снижению Thl-зависимой продукции IFN-y у ветеранов старческого возраста может способствовать низкий уровень регуляторного цитокина IL-12, преимущественно моноцитарного происхождения, уровень которого у лиц третьей группы оказался в. три раза ниже аналогичного в 1 группе (у лиц зрелого возраста). Известно, что IL-12 способен оказывать повышающую регуляцию в отношении дифференцировки Thl-лимфоцитов и секреции ими- IFN-y и, напротив, при недостатке его активирующего влияния (при снижении его секреции, или усиленной продукции его оппонента IL-10) происходит подавление' синтеза Thl-лимфоцитами INF-y. (Male D.et al., 2006).

К характерным возрастзависимым изменениям цитокинового спектра мукосаливарной зоны можно отнести повышение концентрации провоспалительного цитокина IL-17, который секретируется Т-хелперами 17 типа. Нами зафиксировано его достоверное увеличение в группах пожилого и старческого возраста. Thl7 -особая популяция Т-клеток, необходимая для защиты от внеклеточных патогенов и миграции нейтрофилов в инфицированные ткани (Shean J.A.,. Dubin P.J., Kolls J. К., 2007). Одной из точек приложения действия IL-17 являются слизистые оболочки, где цитокин контролирует продукцию антимикробных протеинов типа (3-дефенсинов эпителиоцитами (Matsuzaki G., Umemura М., 2007). Имеются данные о супрессивном действии IL-17 на дифференцировку Thl, а градиентные концентрации IFNy и IL-4 в свою очередь угнетают дифференцировку Thl7 и продукцию ими IL-17 (A. Corthay, 2009). Установленное нами повышение уровня IL-4 и IL-17 у ветеранов пожилого и старческого возраста, может быть следствием высокого уровня сенситизации организма к низкомолекулярным соединениям (гаптенам), входящим в состав металлоконструкций для протезирования. Именно у вевтеранов этих двух групп в сравнении с ветеранами зрелого возраста, зафиксирован максимальный процент металлоконструкций. В качестве гаптена в данных случаях могут выступать ионы металлов, диссоциирующие в десневую жидкость. Соединяясь с аутобелками путем конъюгации, гаптены приобретают свойства «полпого» антигена. Сенсибилизированные клоноспецифические В-лимфоциты продуцируют антитела (преимущественно»блокирующие:IgG4), как к гаптенной части конъюгата, так и аутоантитела к модифицированному белку- носителю; формируя аутоиммунный профиль.

Нами также установлены низкие уровни, провоспалительного цитокина; TNF-a у ветеранов пожилого и старческого возраста в секрете, в. сравнении с ВБД зрелого возраста. Снижение локальной- продукций TNFa с возрастом может свидетельствовать о недостаточной активации; мононуклеаров! и нейтрофилов в СОГТР и приводить к снижению интенсивности хемотаксиса, синтеза острофазовых белков, а также- депрессии TNFa- зависимого- пути; реализации апоптоза, создавая предпосылки для хронизации- воспалительного-процесса в тканях СОПР и развития неопластических процессов. Вместе с тем, рядом авторов зарегистрировано, увеличение с возрастом в системном кровотоке секреции макрофагами и моноцитами; провоспалительных цитокинов: IL-lv IL-6, IL-8, TNF-a (Gerli R., Monti D;, Bistoni O. et al. 2000; Andrew D:, Aspinall R., 2001; Mariani E., Pulsatelli L., Meneghetti A. et al., 2001). Количество хемокина Ib-8 в секрете,, согласно нашим данным, оказалось минимальным в группе лиц пожилого возраста, максимум же значений-выявлен в- старческом возрасте. Локальное повышение концентрации хемокина в секрете слюнных желез в старческом возрасте; можно: объяснить способностью?. IL-17, индуцировать продукцию моноцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF) и хемотаксических молекул подсемейства СХС (а-хемокинов), к которым относится, IL-8 (Matsuzaki G., Umemura М., 2007).

Базовая концентрация в слюне IFN-a, преимущественно лейкоцитарного (и отчасти эпителиального) происхождения с возрастом имела четко выраженную тенденцию к снижению (р=0,05 в сравнении между 1 и 3 группами), что может косвенно свидетельствовать о снижении противовирусного иммунитета в старческом возрасте.

Не было установлено значимых, отличий в зависимости от возраста в концентрациях ростовых факторов в мукосаливарном секрете у ВБД, в частности, трансформирующего ростового фактора-р;

Как известно, развитие локального тканевого повреждения в любых тканях и слизистых оболочках, включая ротовую полость, как экзогенного (микробы, вирусы), так и эндогенного (альтеративные, постстрессорные изменения клеток) происхождения, сопровождается активной продукцией «сигнальных молекул опасности» нормальными клетками врожденного иммунитета (нейтрофилами, эозинофилами, базофилами и моноцитами/ макрофагами, NK и эпителиальными клетками, включая кератиноциты) в экстрацеллюлярное пространство (De Yang , Qian Chen , Shao Bo Su et al.,2007; Klune J.R,et al., 2008). Нами установлено, что продукция лактоферрина -компонента специфических гранул нейтрофилов, многократно увеличивается у ветеранов старческого возраста в сравнении с группами зрелого и пожилого возраста. Это может быть связано, прежде всего, с увеличением с возрастом в секрете ротовой полости численности нейтрофилов и других гранулоцитов, а также с активными антимикробными свойствами лактоферрина и его способностью к секреции независимо от индуцирующего сигнала (эндогенного или экзогенного), а также с наличием возрастных изменений нормальной архитектоники и биохимии клеточных мембран. Напротив, уровень IL-lß, преимущественно макрофагального происхождения, многократно снижается в группе ветеранов пожилого и старческого возраста в сравнении с группой зрелого возраста. Интерлейкин-1 является классическим (типичным) эндогенным сигналом тревоги и усиленно экспрессируется при стимуляции макрофагов ЛПС микробов, продуктами распада собственных тканей, аллогенными и ксеногенными имплантантами (Rao D.A., Pober J.S., 2008). Сравнительно низкий уровень этого алармина в мукозальном секрете может быть обусловлен уменьшением относительного числа моноцитов /макрофагов в секрете ветеранов старческого возраста, а также отсутствием признаков острого воспаления в ротовой полости.

Таким образом, наиболее характерными особенностями цитокинового и аларминового профиля мукосаливарной зоны у ветеранов в пожилом и старческом возрасте являются:

- снижение уровня IFN-y, IFN-a, TNF-a, 1L-8, XL-1 (3 ;

- рост количества IL-4, IL-17, лактоферрина;

- отсутствие возрастзависимых изменений концентрации TGF-p.

Следует отметить, что установленные нами конкретные цифровые значения цитокинов- и аларминов отражают лишь усредненную константу текущего момента и могут динамично видоизменяться под действием большого количества эндо - и экзогенных факторов.

В целом, особенности цитокинового и аларминового профиля, наряду с характерными изменениями клеточного и- гуморального компартментов мукозального иммунитета СОПР, достаточно наглядно отражают изменения в области MAJIT ротовой полости, связанные с процессами старения.

Одной из наиболее важных и труднорешаемых проблем клинической иммунологии является оценка индивидуального иммунного статуса человека. Оптимальный баланс функционирования иммунной системы на фоне имеющихся дефектов в отдельных ее звеньях формируется за счет компенсации недостающего компонента усиленным функционированием других компонентов. Принципиально новый подход был предложен Лебедевым К.А. и Понякиной И.Д. (1983, 2003), сущность которого состоит в том, что иммунный статус следует определять не по значению отдельных показателей, а путем установления наличия взаимосвязей между ними. Для оценки возрастных характеристик секреторного иммунного статуса нами были изучены взаимосвязи между иммунологическими параметрами мукосапиварного секрета во всех изучаемых группах. С помощью корреляционного и многофакторного-анализа были проанализированы парные корреляции и суммарная интенсивность связей между изучаемыми параметрами. Проведенный нами внутрисистемный парный корреляционный анализ по Spearman, свидетельствует о существенных различиях в характере взаимосвязей и взаимодействий отдельных показателей секреторного иммунитета у ветеранов старших возрастных отрезков онтогенеза. В группе ветеранов зрелого возраста установлено наличие подавляющего большинства слабых и умеренных разнонаправленных, преимущественно положительных связей

31 пара), что отражает физиологический оптимум функционирования иммунной системы в данном возрастном интервале. Отрицательные корреляционные связи между компонентами-врожденного и приобретенного иммунитета и их секреторными продуктами отражают действие общебиологического «принципа* перемежающейся активности» структур, обеспечивающего- оптимум функционирования различных физиологических систем и их функциональные резервы (Саркисов Д.С., Пальцев М.А., Хитров М.К., 1995). Тесные регуляторные взаимоотношения различных субпопуляций' иммунных клеток нашли отражение во взаимосвязях между клетками иммунной системы и секреторными продуктами оппонентного происхождения, таких как: СБ13 и 1Ь-8, СБ13 и 1Ь-12, СБ19 и 1Ь-4, СБ4 и ШЫ-а, СБ4*и 1Ь-12. В целом, корреляционная картина в периоде зрелого возраста отражает максимум, адаптивных возможностей иммунной системы с высоким функциональным потенциалом.

Период пожилого возраста у ВБД характеризуется нарастанием инволютивных изменений в иммунной системе, при этом уменьшается масса лимфоидных органов, ответственных за рост и дифференцировку иммуноцитов, снижаются резервные возможности иммунной системы, ее функциональная и секреторная активность. Меняется и характер взаимосвязей между компонентами мукозального отдела иммунной системы, формируя иной тип иммунной регуляции. Проведенный корреляционный анализ демонстрирует существенное изменение качественного состава корреляционных пар-связей, с полным отсутствием связей отражающих клеточно-клеточпые взаимодействия. При этом, на первый план выступают сильные и умеренные разнонаправленные связи между клетками врожденного иммунитета, компонентами протективного барьера слизистых (белком, муцином) и секреторными продуктами клеток адаптивного иммунитета, таких как интерфероны, ростовые факторы, иммуноглобулины. Наличие инволютивных процессов в иммунной системе отражают сильные и умеренные отрицательные связи между клетками иммунной системы и показателями витальности. Повышение уровня общей сенситизации организма отражает появление сильных положительных связей между плазмоцитами и уровнем Ig Е и отрицательных между slgA и IgE, что подтверждает литературные данные о значимости slgA для усиления проницаемости слизистого барьера и сенсибилизации по IgE —зависимому типу. Положительные средней интенсивности связи между уровнями IgE и субклассами иммуноглобулина G (G2 и G4) отражают параллельное с IgE участие иммуноглобулинов G в процессах сенсибилизации организма. Характерным для периода пожилого возраста ВБД является* появление взаимосвязей • между цитотоксическими субпопуляциями лимфоцитов и эндогенными сигнальными молекулами (1Ь-1 и лактоферрином), отражающих развитие эндогенного клеточного стресса при старении организма. На наш взгляд, появление умеренных и сильных разнонаправленных связей отражает напряженность взаимодействий внутри иммунной системы и переход на качественно новый уровень регуляции в период старения. При этом, усиление одних иммунных механизмов' сопровождается снижением других, что соответствует принципу «перемежающейся активности», характерному для всех биологических систем организма.

Период старческого возраста у ВБД характеризуется значительными морфофункциональными процессами^ перестройки клеток, тканей и систем организма с истощением или полным прекращением их функций (Трофимов A.B., 2009). Гомеостатические системы претерпевают ряд последовательных, инволютивных изменений, связанных с дегенерата вно-атрофическими процессами, что приводит к дизрегуляторным, как патологическим, так и адаптационно-компенсаторным изменениям в организме. Интенсивные инволютивные изменения происходят' и в иммунной системе, как в ■'ее центральных органах - костном мозге, тимусе, так и в периферических — селезенке, лимфоузлах, на разных уровнях MAJ1T. В старческом возрасте все большее влияние в поддержании гомеостаза на уровне MAJIT оказывают механизмы врожденного иммунитета (Сотникова Н.Ю., 2009). Качественно меняется характер взаимосвязей и взаимозависимостей между компонентами иммунной системы. Нами также установлено усиление с возрастом роли механизмов врожденного иммунитета, что, проявляется в увеличении: числа связей с компонентами этого звена/ иммунной системы: 12 пар-связей» с мукозальными протективными факторами: (белком и муцином) , и: 13 взаимосвязей; иммунных продуктов; с компонентами системы; комплемента; функционирующей шо> принципу ограниченного протеолиза. Наличие белковых, и: гликопротеиновых продуктов- в мукосаливарном секрете зависит от секреторной? активности1 бокаловидных, и других клеток буккального эпителия, которая снижается с возрастом, приводя к формированию; вязкой, адгезивной; среды на поверхности СОПР. ,

Согласноконцепции» клеточных коммуникаций Ма1гт§ег Р.(2002), инициация иммунного, ответа; на собственные; поврежденные или, измененные, ткани, сопровождается* синтезом эндогенных «сигнальных молекул» клеточного; стресса — аларминов. Нами обнаружено как повышение концентрации эндогенных сигнальных молекул (лактоферрина и интерлейкина -1) в мукосаливарном секрете; так и увеличение числа разнонаправленных, сильных и средних по силе корреляционных взаимосвязей с параметрами адаптивного и врожденного компартментов иммунной системы. Недавними исследованиями^ ЕНапсЫ М.Е. (2007) установлена способность^ аларминов к рекрутированию; и,активации- рецептор-экспрессирующих.клеток врожденного; иммунитетам В - целом, старческий возраст у ВБД характеризуется, существенными качественными и количественньши-изменениями5 взаимосвязей^ в сравнении с группами- ветеранов зрелого и пожилого возраста; при этом особую роль приобретают механизмы врожденного иммунитета, играющие важную компенсаторно-заместительную роль в условиях утраченных позиций адаптивного иммунитета. Проведенный скрининговый непараметрический анализ по Спирмену наглядно демонстрирует, что динамическое равновесие в рамках иммунной системы организма в период старения организма в. значительной мере отличается в разных возрастных интервалах, при этом каждый период онтогенеза характеризуется иным уровнем взаимодействия и взаимозависимости иммунных параметров внутри системы., .

Дополнительную информацию о значимости отдельных показателей иммунитета дает многомерный статистический анализ, одним из методов которого является факторный, который выполнялся методом главных компонент с последующим varimax вращением матрицы данных. В качестве значимых для интерпретации принимались факторные нагрузки > 0,7. Метод позволил выявить факторную структуру показателей секреторного иммунитета разных возрастных групп с определением факторной нагрузки переменных, входящих в эту структуру. В результате проведенного много факторного анализа установлено, что с возрастом повышается роль врожденных механизмов иммунной системы и нейтрофильного звена иммунитета. Максимально высокий удельный вес этих компонент выявлен в группе ветеранов старческого возраста (Factor 1: NK, СН50, СЗа, муцин, ФН=25.54%; Factor 2: vit, CD13+llb, TGF-p, CD13, IL-l, лактоферрин ФН= 14.99%). Напротив, у ветеранов период зрелого возраста характеризуется высокой активностью факторов приобретенного иммунитета (Factor 1: CD4, CD8, IL-12, ФН=18.89%), а элементы врожденных факторов защиты встречаются как в составе ведущих компонент, так и в составе компонент с менее значительным вкладом в общую дисперсию, что соответствует оптимуму обеспечения защиты слизистых оболочек от биологической агрессии. В старших возрастных группах возрастает и роль молекул эндогенной тревоги - аларминов, как факторов сопровождающих развитие инволютивных процессов в иммунной системе в период старения. Таким образом, с возрастом изменяются не только количественные характеристики отдельных факторов, но и характер внутрисистемных взаимодействий с изменением внутренней структуры главных компонент.

Одной из поставленных задач исследования являлось определение иммунологического профиля старения мукосаливарной зоны на основе использования количественных параметров секреторного иммунитета. С этой целью был применен дискриминантный статистический анализ для построения математической модели «распознавания образа иммунологического старения», т.е. соответствие количественных характеристик секреторного иммунитета определенному возрасту. Решаемая нами, так называемая задача классификации (Реброва О.Ю., 2002), т.е. отнесение изучаемого объекта к одной из нескольких групп на основе измерения у него некоторого числа признаков, заключается в том, чтобы определить, отличаются ли совокупности по среднему значению какой-либо переменной и затем использовать эту переменную, чтобы предсказать для новых членов их принадлежность к тому или иному иммунологическому профилю.

При создании модели иммунологического образа старения анализировали 37 переменных величин в изучаемых группах с определением лямбды Уилкса, оценкой достоверности модели, функций классификации и коэффициентов для функций классификации. Группой сравнения для 2 группы (пожилого возраста) служила группа 1 (лица зрелого возраста), группой сравнения для ВБД старческого возраста соответственно служила группа 2 (пожилоговозраста). Для иммунологической модели старения в возрастной группе 2 (пожилой возраст) лямбда Уилкса составила 0,0022. Достоверность модели составила р<0,00001. Установлено, что между группами 1 и 2 с высокой степенью достоверности (р<0,05) отличаются в зависимости от возраста значения 5-и показателей секреторного иммунитета мукосаливарной зоны из анализируемых 37: относительное' количество СВ45+ иммуноцитов, относительное количество моноцитов (СО 14), относительное количество Т-хелперов (СБ4), уровни цитокинов: 1Ь-4 и 1Ь-8 (пг/мл). Процент правильной классификации в обеих группах был равен 100%, что согласно Ребровой О.Ю. (2002), указывает на достоверно высокое качество распознавания. Далее нами был проведен расчет иммунологической модели старения для возрастных групп 2 (пожилой возраст) и 3 (старческий возраст). Лямбда Уилкса этой модели составила 0,0004. Достоверность модели р<0,00001. Для этих групп установлены следующие различия по б-и показателям из анализируемых 37: уровни протективных факторов слизистых оболочек СОПР ( белка и муцина), количество секреторного ^А, молекул эндогенной тревоги- аларминов (лактоферрина и 1Ь-1) и уровень регуляторного цитокина 1Ь-17. Процент правильного распознавания для обеих групп также был равен \№°/о

Результатом проведенного дискриминантного анализа явилось создание математической модели иммунологического образа старения на основе измерения количественных параметров секреторного иммунитета мукосаливарной зоны. Биомаркерами иммунологического старения характерными для ветеранов пожилого возраста оказались следующие параметры: относительное количество CD45+ иммуноцитов, относительное количество моноцитов (CD 14), относительное количество Т-хелперов (CD4), уровни цитокинов: IL-4 и IL-8. Иммунологический профиль старения в старческом' возрасте определяют уровни протективных факторов слизистых оболочек полости! рта (белка и муцина), молекул эндогенной тревоги-аларминов (лактоферрина и IL-1) и регуляторного цитокина IL-17, количество секреторного IgA.

Применение современных диагностических и информационных технологий, компьютерного моделирования в решении проблемы онтогенетического анализа старения регуляторных систем организма, нередко сводится к созданию формализованных общебиологических схем старения. По мнению Каурова Б.А. (2010), старение организма не-выделяется как особый самостоятельный процесс, а «растворяется» во множестве* возрастных изменений, оказывающих разное удельное влияние на вероятность смерти индивидуума. После рождения человека и до глубокой старости происходят существенные изменения центральных и* периферических органов иммунной системы, что обосновывает необходимость дифференцированной оценки не только показателей системного иммунитета, но* и состояния разных компартментов, в частности, MAJ1T. Возрастные изменения архитектоники ротовой полости и MAJTT саливарной зоны являются надежным индикатором процессов старения организма в целом (Карсонова М.И., Пинегин Б.В. 2003; Куликов А.В, Архипова JI.B., 2010; Evans P. et al., 2000). Вместе с тем, целенаправленный поиск ранних биомаркеров старения MAJ1T ротовой полости позволит прогнозировать индивидуальные риски возникновения возраст-ассоциированных заболеваний и внедрять новые стратегии в диагностике (по секрету мукосаливарной зоны) разных форм иммунопатологии.

Ниже представлена обобщающая схема, в которой отражены основные изменения иммунологических параметров секреторного иммунитета мукосаливарной зоны в разных возрастных группах с определением параметров, характеризующих иммунологический профиль старения в каждой из них.

Пожилой возраст

Старческий возраст (75-90 лет)

Старческий возраст

Максимально высокий процент правильной классификации (100%) установлен для: CD45+ ,CD14, CD4, IL4, IL8

Максимальный (100%) правильный процент классификации в модели установлен для: Ьа^оГегпп, 1Ь-1,1Ы7, э^А, белок, муцин

Таким образом, результаты наших исследований убедительно свидетельствуют о том, что процессы старения иммунной системы организма, изученные нами на уровне мукозоассоциированной ткани ротовой полости, нецелесообразно механистически относить лишь к возрастным дистрофическим процессам, обусловленным только дегенеративными изменениями клеток и тканей. Структурная и функциональная целостность мукозоассоциированной лимфоидной ткани организма позволяет нам с определенной долей вероятности экстраполировать полученные данные, характеризующие локальные возрастзависимые изменения в индуктивных сайтах МАЛТ ротовой полости на изменения, происходящие с возрастом и на территории всей системы МАЛТ. В период возрастной инволюции организма происходит смещение приоритетной роли факторов адаптивного иммунитета, уступая место филогенетически более устойчивым, параметрам врожденного иммунитета. Необходимо рассматривать с современных позиций и роль активного участия в процессах старения клеточных элементов иммунной системы, сигнальных молекул, регулирующих разные биологические функции, синтез и секреция которых динамично изменяется в процессе онтогенеза в ответ на реализацию инволютивных программ.