Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Возрастные изменения пролиферативной активности клеток тимуса человека
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.53
Автореферат диссертации по медицине на тему Возрастные изменения пролиферативной активности клеток тимуса человека
На правах рукописи
ЧЕСНОКОВА Анастасия Юрьевна
ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ТИМУСА ЧЕЛОВЕКА
14.00.53 - геронтология и гериатрия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2008
003458948
Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН
Научный руководитель
доктор биологических наук Полякова Виктория Олеговна
Официальные оппоненты
доктор биологических наук Кветная Татьяна Викторовна
доктор биологических наук Чернышева Марина Павловна
Ведущее учреждение
ГУ «Институт физиологии им. И.П. Павлова» Российской академии наук
Защита диссертации состоится « 2008 г. в ' часов на
заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.
С* диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).
Автореферат разослан « »
2008 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, доцент
Козина Л.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Тимус (вилочковая железа) представляет собой центральный орган иммунной системы, в котором осуществляется продукция Т-лимфоцитов из клеток предшественников, поступающих из красного костного мозга [Ноздрачев А. Д. и др., 2001]. В тимусе происходит постоянная пролиферация клеток: из общего количества тимоцитов 20-25% клеток ежедневно образуются при их делении de novo. Однако только 2-5% из них покидают тимус в виде зрелых Т-лимфоцитов, поступая в кровь и расселяясь в лимфоидных органах. Остальная часть клеток (95-98%) погибает в процессе положительной и отрицательной селекции путем запрограммированной клеточной гибели (апоптоза). Несмотря на то, что процессы дифференцировки и пролиферации тимоцитов происходят на протяжении всей жизни человека, их интенсивность значительно снижается с возрастом. Возрастные изменения тимуса, в свою очередь, играют важную роль в происходящем по мере старения угнетении иммунитета, приводящем к возникновению многообразных дисфункций гомеостаза в пожилом возрасте [Кветной И.М. и др., 2005].
Для расширения представлений о механизмах возрастной инволюции тимуса крайне важны исследования о влиянии локально продуцируемых гормонов тимуса на пролиферацию и дифференцировку тимоцитов. В этом отношении прежде всего большой интерес представляет мелатонин, который обладает выраженными пролиферотропными свойствами и синтез которого верифицирован в тимусе [Полякова В.О., Кветной И.М., 2006].
Выяснение локальных гормонотропных механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов позволят также разработать новые подходы к профилактике иммунного истощения, ассоциированного с возрастом, и тем самым будут способствовать продлению периода активной жизни человека.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования явилось изучение особенностей процессов пролиферации и апоптоза в тимусе человека при старении и выяснение возможной роли мелатонина в регуляции указанных процессов.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
1. оценить динамику пролиферативной активности клеток тимуса у людей разных возрастных групп;
2. определить уровень экспрессии проапоптозного белка Р53 и антиапоптозного белка Мс1-1 в тимусе людей разных возрастных групп;
3. выявить особенности экспрессии мелатонина в структурах тимуса в зависимости от возраста;
4. выяснить существование корреляций между экспрессией мелатонина в тимусе и пролиферацией тимоцитов;
5. оценить роль локальной экспрессии мелатонина в регуляции пролиферативной активности и апоптоза тимоцитов человека при старении.
Научная новизна работы
Впервые изучена динамика экспрессии белков пролиферации и апоптоза в тимусе человека при старении. Установлено достоверное снижение пролиферативной активности клеток в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с детьми умершими антенатально и детьми первого года жизни. При этом во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру РСЫА в тимусе значительно превышал индекс пролиферации по маркеру циклину А.
Максимальная интенсивность экспрессии антиапоптозного белка Мс1-1 отмечена у плодов, впервые выявлено, что ее снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза с параллельным возрастанием экспрессии проапоптозного белка Р53. Это свидетельствует о ранней инволюции тимуса. Установлено, что замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии антиапоптозного белка Мс1-1, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53.
В тимусе человека верифицирована активная экспрессия мелатонина и впервые изучена возрастная динамика его паракринной секреции. Выявлена положительная корреляция между интенсивностью экспрессии мелатонина и сохранностью лимфоидной ткани в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей. Впервые зарегистрированы корреляционные связи между интенсивностью процесса клеточной пролиферации в тимусе и уровнем локальной экспрессии мелатонина.
Полученные данные свидетельствуют о важном участии локальной экспрессии мелатонина в паракринной регуляции морфо-функционального статуса тимуса в процессе онтогенеза.
Практическая значимость работы
Детальное изучение показателей пролиферации и апоптоза в тимусе у людей разных возрастных групп позволило расширить представленияо механизмах функционирования и возрастной инволюции тимуса. Верификация экспрессии мелатонина - гормона, обладающего иммунорегуляторными, биоритмологическими и геропротекторными свойствами, в тимусе человека и регистрация его стимулирующего действия на пролиферативную активность Т-лимфоцитов позволяет расценивать мелатонин как возможную молекулярную мишень для фармакологической коррекции возрастных иммунодефицитов.
Положения выносимые на защиту
1. Экспрессия проапоптозного белка Р53 и антиапоптозного белка Мс1-1 верифицирована в тимусе у людей разных возрастных групп. У людей пожилого и старческого возраста, а также у долгожителей замедление процесса инволюции тимуса связано не с усилением экспрессии антиапоптозного белка Мс1-1, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53.
2. В тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей происходит снижение пролиферативной активности клеток по сравнению с детьми, умершими антенатально, и детьми первого года жизни. Во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру РСЫА значительно превышает индекс пролиферации по маркеру циклину А.
3. На всех этапах онтогенеза в тимусе зарегистрирована экспрессия мелатонина, что подтверждает представления о тимусе, как органе, совмещающем иммунную и эндокринную функции.
4. В группах людей пожилого возраста и старческого возраста, а также у долгожителей обнаружена достоверная отрицательная связь между экспрессией мелатонина и степенью выраженности инволюции сохранившейся лимфоидной ткани в тимусе, что может свидетельствовать о геропротекторном действии мелатонина на тимоциты человека.
5. Мелатонин обладает выраженным стимулирующим действием на пролиферацию Т-лимфоцитов, что позволяет считать перспективным поиск и разработку методов профилактики возрастных иммунодефицитов, связанных с усилением его локальной продукции в тимусе при старении организма.
Связь с научно - исследовательской работой Института
Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы о структурно-функциональной организации тимуса, функциях мелатонина в организме человека и животных, влиянии мелатонина на функции тимуса, о механизмах апоптоза и пролиферации. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в диссертационном исследовании. В главе 3 представлены результаты собственных исследований и их обсуждение. Текст диссертации изложен на 120 страницах, содержит 14 таблиц и иллюстрирован 46 рисунками. Указатель литературы включает 133 источника, из которых 46 отечественных и 87 зарубежных.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований.
Апробация и реализация диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); П-ой научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой (Санкт-Петербург, 2006); Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); 11-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007); 6-ом Европейском конгрессе биогеронтологии (Санкт-Петербург, 2007); IV-ой научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой (Санкт-Петербург, 2008); Проблемной комиссии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2008).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на тимусе людей разных возрастных групп, умерших от различных соматических заболеваний, полученном при аутопсиях в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской городской больнице №3 и в Санкт-Петербургском городском патологоанатомическом бюро.
Исходя из основной цели работы, для исследования были взяты образцы тимуса на пике своего физиологического развития (детский тимус) и стареющего тимуса (претерпевающего возрастную инволюцию). Всего исследовано 90 тимусов.
Секционный материал онтогенетически был разделен на группы в соответствии с международной возрастной классификацией ВОЗ:
группа I - внутриутробная смерть (с 19 по 33 неделю развития; п = 17); группа II - дети первого года жизни (п = 23); группа III - пожилые люди (60 лет-74 года; п = 19); группа IV - люди старческого возраста (75-89 лет; п = 17); группа V - долгожители (старше 90 лет; п = 14). Фрагменты тимуса фиксировали в нейтральном растворе формалина (рН=7,2); обезвоживали и заливали в парафин по стандартной методике. Из
парафиновых блоков на микротоме Leica 540М готовили срезы 3-5 мкм и монтировали их на предметные стекла со шлифованным краем. Для обеспечения адгезии среза на стекле чистые обезжиренные стекла предварительно были обработаны поли-Ь-лизином (Sigma).
Для морфологического изучения срезы окрашивали гематоксилином-эозином и толуидиновым синим по стандартной методике.
Для верификации в тканях тимуса экспрессии мелатонина, белка PCNA, циклина А, протеинов Мс1-1 и Р53 был использован иммуногистохимический метод с применением авидин-биотиновой системы визуализации. При иммуногистохимическом исследовании использовали реактивы фирмы Novocastra (нормальная неиммунная сыворотка) и фирмы Dako (первичные антитела, вторые биотинилированные антитела, авидин-биотин-пероксидазный комплекс, диаминобензидин. Использованы антитела к мелатонину (1:75), PCNA (1:150), циклину А (1:150), Mcl-1 (1:150) и Р53 (1:100).
Количественную оценку результатов исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обеспечения «АСТ-1» (версия 2.12) и «Видеотест-Морфология» (версия 5.0). Определяли оптическую плотность иммунопозитивного окрашивания (в относительных единицах) и суммарную площадь иммуноокрашенных клеток (в процентах). Пролиферативный показатель по PCNA и циклииу A (Ipcna и Icyci¡n А) определяли как отношение количественной плотности PCNA-позитивных ядер (Npcna) и циклин А-позитивных ядер (Ncyc]in л), соответственно, к количественной плотности ядер клеток (Nkok), окрашенных гематоксилином. Количественную плотность клеток определяли по числу сечений ядер на 1 мм2 площади среза.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. for Windows 2000 с учетом характера распределения данных. Проверка гипотез о различиях между группами проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. Для определения корреляционных зависимостей был использован метод корреляционного анализа Пирсона. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии различий и влияний) принимали равным 0,05 [Автандилов Г.Г., 1990].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Светооптическос исследование тимуса людей разных возрастных
групп
При светооптическом исследовании препаратов тимуса детей, умерших антенатально (I группа) были обнаружены все структурные компоненты тимуса. На препаратах I группы тимус был покрыт широкой
соединительнотканной капсулой, от которой отходили септы, разделяющие паренхиму на дольки; пространство долек было заполнено мелкими лимфоцитами и эпителиальными клетками; в мозговом веществе обнаруживались формирующиеся тельца Гассаля.
У детей первого года жизни (II группа) тимус имел сходное строение. В отличие от эпителиальных клеток тимуса детей, умерших антенатально, у большинства эпителиальных клеток в образцах тимуса II группы выявлялись отчетливые отростки. Лимфоциты были многочисленны и их больше располагалось в корковом веществе, чем в мозговом слое. В мозговом веществе верифицировались тельца Гассаля.
Насыщенность корковой зоны тимуса по ядрам составила 34685+3112 клетки на 1 мм2 площади среза у детей, умерших антенатально, и 41978±762 у детей первого года жизни. В мозговой зоне выявлена значительно меньшая плотность клеток: 25389±1431 и 34835±490 у детей I и II группы соответственно.
У людей пожилого возраста (III группа), старческого возраста (IV группа) и долгожителей (V группа) наблюдались инволютивные процессы в тимусе с замещением лимфоидной ткани на жировую. В сохранившихся дольках отмечалось присутствие гиперплазированных телец Гассаля. Обнаружено, что степень сохранности лимфоидной ткани в тимусе в III, IV и V группах заметно варьировала. При этом отсутствовала корреляция между возрастом пациента и абсолютным или относительным количеством лимфоидной ткани в тимусе (табл. 1).
Таблица 1
Количество сохранившейся лимфоидной ткани в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей
Группа Среднее значение абсолютной площади лимфоидной ткани, 2 ММ Среднее значение лимфоидной ткани относительно площади среза, %
III - люди пожилого возраста 5,8±3,1 16,26±8,92
IV - люди старческого возраста 7,0±4,8 19,0±13,4
V- долгожители 7,0±6,6 15,7±14,9
Насыщенность корковой зоны тимуса по ядрам у пожилых людей, людей старческого возраста и долгожителей по ядрам составила 26282±3568, 25732±1395,25039±1808 клеток на 1 мм2 площади среза, соответственно.
Таким образом, светооптическое исследование позволило установить, что тимусы плодов и детей первого года жизни имели нормальное строение для своего возраста. Тимусы пожилых людей, людей старческого возраста и долгожителей демонстрировали отчетливо выраженные признаки инволюции.
Показатели экспрессии маркеров апоптоза в нелимфоидном компоненте тимуса человека
Старение живого организма сопровождается снижением интенсивности пролиферации и потерей клеток. Процесс элиминации клеток генетически детерминирован и имеет одинаковые цитологические и биохимические проявления в различных органах и тканях, обозначаемые как физиологическая программированная гибель клеток (апоптоз). В лимфоидном компоненте тимуса уровень апоптоза остается высоким на протяжении всей жизни человека (95-98% тимоцитов погибают ежедневно путем программированной клеточной гибели) и связан с процессами положительной и отрицательной селекции образующихся Т-лимфоцитов. В то же время, уровень гибели клеток нелимфоидного компонента тимуса может свидетельствовать об интенсивности инволютивных процессов в тимусе, так как известно, что клетки нелимфоидного компонента составляют основу микроокружения тимуса и обеспечивают выработку сигнальных молекул - нейропептидов, цитокинов и гормонов, необходимых для нормального функционирования тимуса.
Для оценки интенсивности апоптоза в нелимфоидном компоненте тимуса исследовали уровни экспрессии протеина Р53 (проапоптозный белок, участвующий в запуске программы клеточной гибели) и белка Мс1-1 (антиапоптозный фактор - ингибитор клеточной гибели). Сравнительное исследование этих факторов позволяет судить об интенсивности процессов апоптоза клеток микроокружения тимуса и, соответственно, скорости инволюции в рассматриваемых возрастных группах.
Экспрессия антиапоптозного белка Мс1-1 была обнаружена во всех структурах нелимфоидного компонента тимуса: капсуле, междольковых перегородках, тельцах Гассаля и стенках сосудов. Кроме того, на одном препарате (тимус ребенка в возрасте 5 месяцев) в субкапсулярной зоне тимуса были обнаружены макрофаги, также специфически окрашенные антителами к белку Мс1-1.
Показатели компьютерного анализа возрастных особенностей экспрессии Мс1-1 в нелимфоидном компоненте тимуса человека представлены в таблице 2.
Для рассматриваемых возрастных групп была выявлена обратная корреляция между площадью экспрессии белка Мс1-1 в структурах нелимфоидного компонента тимуса и возрастом людей. Так максимальная площадь экспрессии Мс1-1 была обнаружена на препаратах тимусов детей, умерших антенатально (3,9±0,7%). У детей первого года жизни эта величина оказалась достоверно ниже и составила 3,1±0,5% (р<0,05). Площадь иммунопозитивно окрашенных клеток оказалась существенно ниже на препаратах тимуса у людей пожилого, старческого возраста и долгожителей
по сравнению с первыми двумя группами и составила 1,4±0,3%, 1,3±0,5% и 1,4±0,7% соответственно (р<0,05). Не обнаружено достоверных различий между площадью экспрессии Мс1-1 в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей.
Таблица 2
Показатели экспрессии белка Мс1-1 в клетках нелимфоидного компонента тимуса человека
Группа Средняя площадь, % Средняя оптическая плотность, у.е.
I - дети, умершие антенатально 3,9±0,7 2,05±0,09
II - дети первого года жизни 3,1±0,5* 2,06±0,06
III - люди пожилого возраста 1,4±0,3** 1,95±0,06
IV - люди старческого возраста 1,3±0,5** 1,97±0,05
V - долгожители 1,4±0,7** 1,94±0,08
* - достоверное отличие от площади экспрессии в тимусе I группы (р<0,05), ** - достоверное отличие от площади экспрессии в тимусе I и II групп (р<0,05).
При изучении оптической плотности МсИ-иммунопозитивно окрашенных клеток в тимусе не было выявлено достоверных различий между группами. Однако отмечалась тенденция к уменьшению ее значений в группах людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с I и II группами.
Экспрессия белка Р53 у детей, умерших антенатально, и детей первого года жизни была обнаружена в капсуле, междольковых перегородках и сосудах. Единичные иммунопозитивно окрашенные ядра встречались в клетках, формирующих тельца Гассаля. В группах людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей экспрессия Р53 была выявлена во всех структурах нелимфоидного компонента тимуса. Показатели компьютерного анализа возрастных особенностей экспрессии белка Р53 в нелимфоидном компоненте тимуса человека представлены в таблице 3.
На препаратах тимуса детей первого года жизни площадь экспрессии белка Р53 оказалась достоверно выше по сравнению с препаратами тимуса детей, умершими антенатально (0,54±0,11% и 0,84±0,12%, соответственно; р<0,05).
У людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей площадь иммунопозитивного окрашивания антителами к фактору Р53 на препаратах тимуса оказался достоверно ниже, по сравнению с детьми первого
года жизни (р<0,05) и составил 0,61±0,09, 0,46±0,12% и 0,52±0,22%, соответственно. Кроме того, было обнаружено, что у людей старческого возраста и долгожителей происходит уменьшение экспрессии белка Р53 в нелимфоидном компоненте тимуса по сравнению с пожилыми людьми (р<0,05). Не выявлено достоверных различий между величинами относительной оптической плотности экспрессии белка Р53 на препаратах тимуса исследуемых возрастных групп.
Таблица 3
Показатели экспрессии белка Р53 в клетках нелимфоидного компонента тимуса человека
Группа Площадь экспрессии, % Оптическая плотность, у.е.
I - дети, умершие антенатально 0,54±0,11 2,04±0,11
II - дети первого года жизни 0,84±0,12* 2,02±0,04
III - люди пожилого возраста 0,6 Ш,09** 1,94±0,56
IV - люди старческого возраста 0,46±0,12*** 1,96±0,03
V - долгожители 0,52±0,22*** 1,92±0,07
* - достоверное отличие от площади экспрессии в тимусе I группы (р<0,05), ** - достоверное отличие от площади экспрессии в тимусе II группы (р<0,05), *** - достоверное отличие от площади экспрессии в тимусе II и III групп(р<0,05).
Таким образом, иммуногистохимическое исследование показало, что максимальная площадь экспрессии белка Мс1-1 выявляется в тимусе плодов, и ее снижение происходит в течение уже первых месяцев жизни. В то же время в тимусе детей первого года жизни достоверно усиливается экспрессия проапоптозного белка Р53. Полученные результаты подтверждают данные литературы о том, что инволюция тимуса начинается уже в первый год жизни ребенка [Higley Н., O'Morchoe С., 1984; Hsu Н„ 2005].
Следует отметить, что в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей, продолжается экспрессия белка Мс1-1, хотя и на заметно более низком уровне по сравнению с тимусом плодов и детей первого года жизни. В то же время площадь экспрессии белка Р53 ниже более чем на 25% у людей пожилого возраста, примерно на 55% у людей старческого возраста и на 40% у долгожителей по сравнению с детьми первого года жизни.
Эти данные отражают замедление процессов инволюции на более поздних стадиях старения организма человека.
По данным литературы известно, что к 40 годам происходит замещение значительной части паренхимы тимуса жировой тканью, после достижения этого возраста инволюция органа замедляется, и атрофия паренхимы происходит со скоростью 0,1% в год [Серова Л.Д., 2001]. Исходя из полученных нами результатов, можно предположить, что это замедление связано не с увеличением продукции антиапоптозного белка Мс1-1 в нелимфоидном компоненте тимуса, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53 у пожилых и старых людей.
Пролиферативная активность клеток тимуса человека
Для оценки пролиферативной активности клеток в тимусе были использованы антитела к маркерам клеточного цикла - циклину А и PCNA. Циклин А (60 кДа) является цитоплазматическим фактором, который в соматических клетках млекопитающих обнаруживается в S и G2 фазах клеточного цикла. В связи с этим циклин А используют в качестве маркера пролиферации в нормальных и опухолевых клетках [Leonhardt Н., Nadal-Ginard В., 1993; Huuhtanen R. L. et al., 1999; Cardoso М.С.].
При иммуногистохимическом исследовании тимуса детей, умерших антенатально (I группа), и детей первого года жизни (II группа) основная масса клеток, окрашенных иммунопозитивно к циклину А, выявлена в корковом веществе с тенденцией концентрироваться в периферической части долеки в мозговом веществе; в периваскулярном пространстве наблюдались единичные случаи окрашивания клеток. При этом индекс пролиферации по маркеру циклину А (отношение количественной плотности иммуноокрашенных ядер к количественной плотности ядер клеток, окрашенных гематоксилин-эозином) оказался достоверно выше (р<0,05) в корковом веществе тимуса по сравнению с мозговым веществом в обеих группах (табл. 4).
Таблица 4
Индекс пролиферации по маркеру циклину А в тимусе детей
Группы IcyclinA? У»®»
Корковая зона Мозговое вещество Среднее значение в тимусе
I - дети, умершие антенатально 11,71±1,17* 2,63±0,71 7,2±0,6
II - дети первого года жизни 13,33±2,54* 3,34±0,93 8,4±0,8
* - достоверное отличие от IcydmA в мозговом веществе (р<0,05).
При статистической обработке результатов было обнаружено достоверное увеличение индекса пролиферации по маркеру циклину А в тимусе детей первого года жизни по сравнению с детьми, умершими антенатально (Р<0,05).
У людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей отсутствует четкое деление тимуса на мозговую и корковую зоны. В связи с этим нами были определены средние значения экспрессии маркеров в тимусе данных возрастных групп. Значения индекса пролиферации по маркеру циклину А в тимусах людей III, IV и V групп приведены в таблице 5.
Таблица 5
Индекс пролиферации по маркеру циклину А в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей
Группа Среднее значение IcyCi¡nA в тимусе, у.с.
III - люди пожилого возраста 0,46±0,25
IV - люди старческого возраста 0,78±0,59
V - долгожители 0,74±0,42
У людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей было показано достоверное (р<0,05) снижение индекса пролиферации по маркеру циклину А по сравнению с I и II группами (рис. 1).
В качестве второго маркера пролиферации был использован маркер PCNA. Долгое время PCNA относили к циклинам, поскольку его экспрессия приурочена к концу G1 фазы (последние 5% от ее продолжительности) и началу S фазе (первые 35% от ее продолжительности). Впоследствии оказалось, что PCNA ни в структурном, ни в эволюционном отношении не связан с белками циклинами.
Известно, что белок PCNA является вспомогательным фактором репарационной ДНК-полимеразы дельта [Bravo R., Frank R., et al., 1987; Prelich G., Tan C.-K., et al., 1987]. В отсутствие PCNA ДНК-полимераза дельта имеет низкую процессивность на длинных однонитевых матрицах, однако благодаря участию PCNA процессивность возрастает в 10-100 раз. Белок PCNA и фактор репликации С (RFC) образуют стабильный комплекс с ДНК-полимеразой дельта, а в определенных условиях стимулируют и активность ДНК-полимеразы эпсилон [Zeng X. R. et al., 1994; Lou Y., Hurwitz J., Massague J., 1995].
12 10 8 6 4 2
А 0
*
-
** **
» d« fife
30 25 20 15 10 5
В 0
*
J
Alt is'M A"A'
ттШ
!Группа I □ Группа II в Группа III н Группа IV и Группа V
Рис. 1. Индекс пролиферации по маркерам циклину А (А) и РСКА (В) в тимусе людей разных возрастных групп; группа I - внутриутробная смерть; группа II - дети первого года жизни; группа III - люди пожилого возраста; группа IV - люди старческого возраста; группа V -долгожители; * -достоверное отличие от аналогичных показателей, полученных для тимусов I группы (р<0,05) ; ** -достоверное отличие от аналогичных показателей, полученных для тимусов I и II группы (р<0,05).
Поскольку высокая концентрация белка РСЫА в клетке приурочена к моменту репликации, его определение в клетке используют для косвенной оценки количества пролиферирующих клеток.
В ходе иммуногистохимического исследования клетки, окрашенные иммунопозитивно к маркеру РСМА, были выявлены во всех исследованных возрастных группах.
При оценке уровня пролиферации в тимусе по маркеру PCNA были получены результаты, сходные с результатами, полученными для маркера циклина А (табл. 6, 7). Так, индекс пролиферации по маркеру РСКА в тимусе детей первого года жизни оказался достоверно выше по сравнению с тимусом детьмей, умерших антенатально, и составил 19,5±2,4 и 22,9±2,6, соответственно. При этом в обеих группах индекс пролиферации по РСЫА был достоверно выше в корковом веществе по сравнению с мозговым. При исследовании уровней пролиферации в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей было показано достоверное (р<0,05) снижение пролиферативного индекса по сравнению с тимусами в I и II группах.
Статистическая обработка результатов показала наличие положительной корреляции между индексом пролиферации по маркеру циклину А и маркеру РСИА в тимусах всех исследованных групп (рис. 2). В то же время во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру РСЫА в тимусе значительно превышал индекс пролиферации по маркеру циклину А (р<0,05). Этот факт подтверждает данные о том, что РСМА является длительно живущим белком, способным накапливаться и верифицироваться в клетках, уже
закончивших деление, что дает в связи с этим более высокие показатели пролиферации [Fortune J. М. et al, 2006].
Таблица б
Индекс пролиферации по маркеру PCNA в тимусе детей
Группа Ipcna» у-е.
Корковая зона Мозговое вещество Среднее значение в тимусе
I - дети, умершие антенатально 29,75±2,61* 10,43±0,85 19,5±2,4
II - дети первого года жизни 33,15±1,80* 12,64±2,08 22,9±2,6
* - достоверное отличие от Ipcna в мозговом веществе (р<0,05).
Таблица 7
Индекс пролиферации по маркеру РСЫА в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей
Группа Среднее значение Ipcna в тимусе, у.е.
III - люди пожилого возраста 2,8±1,2
IV - люди старческого возраста 2,9±1,7
V - долгожители 3,2±1,4
0 1 2 3 4 5 6
I cyclin А
Рис. 2. Корреляционная связь между пролиферативной активностью тимоцитов по маркерам PCNA и циклину А.
Таким образом, в ходе иммуногистохимического исследования было показано, что наибольший уровень пролиферации отмечается у детей первого года жизни. Показано достоверное снижение пролиферативной активности клеток в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с детьми, умершими антенатально, и детьми первого года жизни.
Снижение пролиферативного статуса в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с тимусом, находящимся на пике своего физиологического развития (в детском возрасте) представляется закономерным явлением, и согласуется с данными о возрастной инволюции тимуса, а также соответствует общей картине снижения пролиферативного потенциала всех тканей организма при старении.
Детальное изучение механизмов локальной регуляции клеточного деления в тимусе и причин снижения пролиферативной активности тимоцитов при старении необходимо для теоретической и практической иммунологии и геронтологии, в том числе для разработки подходов к профилактике иммунного истощения, ассоциированного с возрастом, и для продления периода активной жизнедеятельности человека.
В этом отношении большой интерес для изучения представляет мелатонин, поскольку известно, что этот гормон не только способен оказывать влияние на функциональный статус клеток, но также контролирует процессы пролиферации и дифференцировки клеток [Macchi М. М., Bruce J. N., 2002].
Экспрессия мелатонина в тимусе человека
При иммуногистохимическом исследовании экспрессия мелатонина была обнаружена как в структурах нелимфоидного компонента тимуса: капсуле, междольковых перегородках, тельцах Гассаля и стенках сосудов, так и в Т-лимфоцитах корковой и медуллярной зон тимуса.
Максимальная площадь экспрессии мелатонина была обнаружена в тимусе антенатально умерших детей (группа I) и детей первого года жизни (группа II) и составила 13,9±1,3% и 11,8±1,7% от общей площади срезов соответственно, при этом не было выявлено достоверных отличий между этими двумя группами (рис. 3). В обеих группах основная масса клеток, окрашенных иммунопозитивно к мелатонину, обнаруживалась в лимфоидном компоненте тимуса (в корковой и медуллярной зонах). Уровень экспрессии мелатонина оказался значительно ниже в клетках внутридолькового периваскулярного пространства (табл. 8).
Площадь клеток, окрашенных иммунопозитивно к мелатонину, была достоверно ниже (р<0,05) в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с тимусами детей, умерших антенатально, и детей первого года жизни и составила 1,59±1,09%, 2,4±2,3%, 2,87±1,17% соответственно. Достоверных различий в площади экспрессии мелатонина между старшими возрастными группами найдено не было.
При изучении оптической плотности иммунопозитивно окрашенных клеток не было выявлено достоверных различий между исследованными группами.
16 14 12 10 8 6 4 2
А 0
Рис. 3. Возрастные показатели экспрессии мелатонина в тимусе человека; А - оптическая плотность иммуноокрашенных структур, условные единицы; В - суммарная площадь иммуноокрашенных структур, %; группа I -внутриутробная смерть; группа II - дети первого года жизни; группа III - люди пожилого возраста; группа IV - люди старческого возраста; группа V -долгожители; * - достоверное отличие от площади экспрессии в I и П группах (р<0,05).
Таблица 8
Показатели экспрессии мелатонина в структурно-функциональных зонах тимуса детей
Группа ВПП Корковая зона Мозговое вещество
Площадь экспрессии, %
1 - дети, умершие антенатально 7,48±2,16* 17,95±1,34 16,53±2,77
II - дети первого года жизни 6,49±1,64* 13,73±2,58 15,18±1,31
Оптическая плотность, у.е.
I - дети, умершие антенатально 0,31 ±0,05 0,27±0,03 0,22±0,02
II - дети первого года жизни 0,24±0,04 0,30±0,07 0,27±0,03
* - достоверное отличие от площади экспрессии мелатонина в коре и медуллярной зоне тимуса (р<0,05); ВПП - внутридольковое периваскулярное пространство.
Статистический анализ полученных данных с использованием расчета коэффициента линейной корреляции Пирсона показал наличие достоверной положительной связи между экспрессией мелатонина в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей и абсолютной площадью сохранившейся лимфоидной ткани (г = +0,9; р < 0,05), а также процентным соотношением лимфоидного компонента к общей площади среза тимуса (г = +0,8; р < 0,05) (рис. 4).
1 2 3 4 5 6 7
Экспрессия мелатонина
2 3 4 5 Экспрессия мелатонина
Рис. 4. Корреляционная связь между уровнем экспрессии мелатонина и площадью сохранившейся лимфоидной ткани (А) и процентом сохранившейся лимфоидной ткани в тимусе (В) у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей
Для всех возрастных групп выявлена положительная корреляция между экспрессией мелатонина в тимусе и индексом пролиферации по маркерам РСКГА (г = +0,9; р<0,05) и циклину А (г = +0,9; р<0,05) (рис. 5).
В настоящее время многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о важной роли мелатонина в регуляции физиологических и патологических процессов в живом организме. Помимо пинеальной железы, клетки, продуцирующие мелатонин, выявлены в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе и других органах [Кветной И.М., 1975, 1981, 1999].
Предполагают, что экстрапинеальный мелатонин может играть ключевую роль в качестве паракринной сигнальной молекулы взаимодействия клеток и локальной координации клеточных функций [Кветной И.М., Пальцев М.А., 2006]. Также показано, что в то время как уровень секреции пинеального мелатонина прогрессивно снижается с возрастом, экстрапинеальная экспрессия мелатонина в различных органах стабильно сохраняется до 60 лет и старше [Кветная Т.В., 2005].
Рис. 5. Корреляционная связь между уровнем экспрессии мелатонина и индексом пролиферации по маркеру циклину А (А) и РСЫА (В) в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей
Проведенные нами исследования показали активную экспрессию мелатонина в тимусе человека на всех этапах онтогенеза и старения. Обнаружена положительная корреляция между площадью экспрессии мелатонина и пролиферативной активностью клеток в тимусе и достоверная отрицательная корреляция между экспрессией мелатонина и степенью выраженности инволюции лимфоидной ткани в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей. Полученные данные свидетельствуют о том, что мелатонин обладает выраженным пролиферотропным и регуляторным действием на клетки тимуса человека и отражают актуальность дальнейшего изучения механизмов геропротекторного эффекта мелатонина.
ВЫВОДЫ
1. Экспрессия проапоптозного белка Р53 и антиапоптозного белка Мс1-1 верифицирована в тимусе у людей разных возрастных групп. Максимальная интенсивность экспрессии Мс1-1 отмечена у плодов, ее снижение происходит уже в течение первых месяцев постнатального онтогенеза. У детей первого года жизни заметно усиливается экспрессия проапоптозного белка Р53. Выявленная динамика экспрессии ключевых факторов регуляции апоптоза свидетельствует о ранней инволюции тимуса.
2. Замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии антиапоптозного фактора Мс1-1, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53.
3. Установлено достоверное снижение пролиферативной активности клеток в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с детьми, умершими антенатально, и детьми первого года жизни. Во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру
РСИА значительно превышал индекс пролиферации по маркеру циклину А.
4. Экспрессия мелатонина впервые верифицирована в структурах нелимфоидного компонента тимуса (капсуле, междольковых перегородках, тельцах Гассаля и стенках сосудов) и в Т-лимфоцитах корковой и медуллярной зон тимуса человека во всех исследованных возрастных группах.
5. Наиболее высокая площадь экспрессии мелатонина обнаружена в тимусе антенатально умерших детей и детей первого года жизни. Площадь экспрессии мелатонина была достоверно ниже в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с группами детей.
6. Выявлена положительная корреляция между площадью экспрессии мелатонина и индексом пролиферации по маркерам РСЫА и циклину А во всех возрастных группах, что свидетельствует о влиянии локальной продукции мелатонина на процессы пролиферации и дифференцировки тимоцитов.
7. В группах людей пожилого возраста и старческого возраста, а также у долгожителей обнаружена достоверная отрицательная корреляция между экспрессией мелатонина и степенью выраженности инволюции сохранившейся лимфоидной ткани в тимусе, что может свидетельствовать о геропротекторном действии мелатонина на тимоциты человека.
Практические рекомендации
1. При диагностике иммунодефицитных состояний, протекающих самостоятельно или отягощающих течение других заболеваний у больных пожилого и старческого возраста, рекомендуется проводить анализ содержания мелатонина в плазме крови или его метаболитов в моче.
2. Учитывая установленные иммуногеропротекторные свойства мелатонина по отношению к клеткам тимуса целесообразно провести клинические испытания данного гормона в качестве геропротекторного средства широкого действия.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Возрастная динамика экспрессии NO-синтазы и CD35 в тучных и дендритных клетках тимуса человека/В.О. Полякова, Е.С. Федорова, Е.В. Чернышева, А.Ю Чеснокова (Чебракова), И.В. Князькин, П.Н. Зезюлин//Н-я научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения». - 2006. - С. 180-181.
2. Полякова В.О. Возрастные изменения экспрессии вазоактивных гормонов и факторов апоптоза в тимусе человека/В.О. Полякова, Е.В. Чернышова, А.Ю. Чеснокова (Чебракова), П.Н. Зезюлин, Е.С. Федорова//Медицинская иммунология. - 2006. -Т. 8., № 2-3. - С. 380-381.
3. Полякова В.О. Геропротекторные эффекты мелатонина на старение клеток тимуса in vitro/B.O. Полякова, А.Ю. Чеснокова (Чебракова), Е.В. Чернышова//Всероссийская конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». - СПб, 2005. - С. 93.
4. Чернышова Е.В. Возрастная динамика экспрессии гормонов в тимусе человекаУЕ.В. Чернышова, В.О. Полякова, А.Ю. Чеснокова (Чебракова), Е.С. Федорова, П.Н. Зезюлин//Всероссийская конференция «Перспективы фундаментальной геронтологии» - СПб, 2006. - С. 157-158.
5. Чеснокова (Чебракова) А.Ю. Возрастные изменения экспрессии р53 и mcl-1 в структурах нелимфоидного компонента тимуса человека/ А.Ю. Чеснокова (Чебракова), Е.С Федорова, Е.В. Чернышова, И.В Князькин., А.В Трофимов//Всероссийская конференция «Перспективы фундаментальной геронтологии». - СПб, 2006. - С. 155156.
6. Чеснокова А.Ю. Верификация экспрессии мелатонина в тимусе людей разных возрастных групп//Сборник тезисов 11-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2007. - С. 289.
7. Чеснокова А.Ю. Возрастные аспекты изучения пролиферативной активности клеток тимуса человека/А.Ю.Чеснокова, С.С. Коновалов, Е.С. Сопова/ЯП-я научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения». - 2007. - С. 187-188.
8. Чеснокова А.Ю. Возрастные изменения пролиферативной активности клеток тимуса человека/ЛУ-я научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения». - 2008. - С. 225-226.
9. Чеснокова А.Ю. Возрастные особенности экспрессии протеина Мс1-1 в тимусе человека/А.Ю.Чеснокова, В.О. Полякова/ЯИ-я научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения». -2007.-С. 189.
Чеснокова (Чебракова) А.Ю. Экспрессия проапоптозного белка р53 в структурах нелимфоидного компонента тимуса человека разных возрастных групп/А.Ю. Чеснокова (Чебракова), В.О.Полякова//Десятая Всероссийская медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье».- СПб, 2007. — С. 499.
11.Эффекты действия мелатонина на старение клеток тимуса и периферические Т-лимфоциты in vitro!В.О. Полякова, И.В. Князькин, С.С. Коновалов, И.М. Кветной, А.В. Трофимов, Е.В. Чернышова., А.Ю. Чеснокова (Чебракова)//Успехи геронтологии. - 2005. - Вып. 17. -С. 10-14.
ll.Chesnokova (Chebrakova) A. Iu. The Role of Proteins Encoding of Apoptosis in Thymic Involution in Aging/A.Iu. Chesnokova (Chebrakova), S.S. Konovalov//International association of gerontology and geriatrics VI European Congress. - SPb, 2007. - P. 26.
Чеснокова Анастасия Юрьевна ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ТИМУСА ЧЕЛОВЕКА // Автореф. дис. канд. биол. наук: 14.00.53 -СПб., 2008.-22 с.
Подписано в печать 17.11.2008. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.
_Тираж 100 экз. Заказ 99._
Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А
Оглавление диссертации Чеснокова, Анастасия Юрьевна :: 2008 :: Санкт-Петербург
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. введение.:.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1Л. Основные сведения о структурно-функциональной организации тимуса.
1Л Л. Анатомия и морфология тимуса.
1 Л.2. Формирование тимуса человека в ходе эмбриогенеза.
1 Л.З. Пролиферация и дифференцировка Т-лимфоцитов в тимусе.
1.2. Циклин А и PCNA как возможные маркеры пролиферации в тимусе
1.3. Апоптоз и его регуляция.
1.4. Апоптоз в тимусе.
Л.5. Старение тимуса.
1.6. Нейроэндокринная регуляция функционирования тимуса.
1.7. Мелатонин.
1.7.1. Функции мелатонина в организме человека и животных.
1.7.2. Влияние мелатонина на функции тимуса.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Характеристика исследуемого материала.
2.2. Подготовка препаратов для гистологического исследования.
2.3. Метод иммуногистохимической окраски.
2.4. Количественная оценка результатов исследования.
2.5. Определение пролиферативного индекса ткани.
2.6. Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖЕНИЕ.
3.1. Светооптическое исследование тимуса людей разных возрастных групп.
3.2. Показатели экспрессии маркеров апоптоза в нелимфоидном компоненте тимуса человека.
З.З.Пролиферативная активность клеток тимуса человека.
3.4.Экспрессия мелатонина в тимусе человека.
ВЫВОДЫ.
УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТГ — адренокортикотропный гормон
ВПП - внутридольковые периваскулярные пространства
ГК — глюкокортикоидные гормоны
ИЛ - интерлейкин
ИФ - интерфероны
КС - кортикостерон
СТГ - гормон роста
ТЗ - трийодтиронин
Т4 - тироксин
ФНО — фактора некроза опухолей цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат
AA-NA - арилалкиламин N-ацетилтрансфераза
A1F - апоптоз индуцирующий фактор
Cdk - циклин-зависимая киназа
CD - кластер дифференцировки
CRH — кортикотропин высвобождающего гормона
DD - домен смерти
DED — эффекторный домен смерти
FADD — Fas-ассоциированный домен смерти
HIOMT — гидроксииндол-О-метилтрансфераза
5-НТ - серотонин (5-гидрокситриптамин)
Icyciin л — количественная плотность циклин А-позитивных ядер
Ipcna - количественная плотность PCNA-позитивных ядер
МНС - major histocompatibility complex (главый комплекс гистосовместимости)
NK - натуральные киллеры ок - количественная плотность ядер клеток, окрашенных гематоксилин-эозином
PCNA — proliferating cell nuclear antigen (ядерный антиген пролиферирующих клеток)
TCR — Т-клеточные рецепторы
Введение диссертации по теме "Геронтология и гериатрия", Чеснокова, Анастасия Юрьевна, автореферат
Актуальность темы
Тимус (вилочковая железа) представляет собой центральный орган иммунной системы, в котором осуществляется продукция Т-лимфоцитов из клеток предшественников, поступающих из красного костного мозга [Ноздрачев А. Д. и др., 2001]. В тимусе происходит постоянная пролиферация клеток: из общего количества тимоцитов 20-25% клеток ежедневно образуются при их делении de novo. Однако только 2-5% из них покидают тимус в виде зрелых Т-лимфоцитов, поступая в кровь и расселяясь в лимфоидных органах. Остальная часть клеток (95-98%) погибает в процессе положительной и отрицательной селекции путем запрограммированной клеточной гибели (апоптоза). Несмотря на то, что процессы дифференцировки и пролиферации тимоцитов происходят на протяжении всей жизни человека, их интенсивность значительно снижается с возрастом. Возрастные изменения тимуса, в свою очередь, играют важную роль в происходящем по мере старения угнетении иммунитета, приводящем к возникновению многообразных дисфункций гомеостаза в пожилом возрасте [Кветной И.М., Ярилин А.А., Полякова В.О. и др., 2005].
Для расширения представлений о механизмах возрастной инволюции тимуса крайне важны исследования о влиянии локально продуцируемых гормонов тимуса на пролиферацию и дифференцировку тимоцитов. В этом отношении прежде всего большой интерес представляет мелатонин, который обладает выраженными пролиферотропными свойствами и синтез которого верифицирован в тимусе [Полякова В.О., Кветной И.М., 2006].
Выяснение локальных гормонотропных механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов позволят также разработать новые подходы к профилактике иммунного истощения, ассоциированного с возрастом, и тем самым будут способствовать продлению периода активной жизни человека.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования явилось изучение особенностей процессов пролиферации и апоптоза в тимусе человека при старении и выяснение возможной роли мелатонина в регуляции указанных процессов.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
1. оценить динамику пролиферативной активности клеток тимуса у людей разных возрастных групп;
2. определить уровень экспрессии проапоптозного белка Р53 и антиапоптозного белка Мс1-1 в тимусе людей разных возрастных групп;
3. выявить особенности экспрессии мелатонина в структурах тимуса в зависимости от возраста;
4. выяснить существование корреляций между экспрессией мелатонина в тимусе и пролиферацией тимоцитов;
5. оценить роль локальной экспрессии мелатонина в регуляции пролиферативной активности и апоптоза тимоцитов человека при старении.
Научная новизна работы
Впервые изучена динамика экспрессии белков пролиферации и апоптоза в тимусе человека при старении. Установлено достоверное снижение пролиферативной активности клеток в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с детьми умершими антенатально и детьми первого года жизни. При этом во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру PCNA в тимусе значительно превышал индекс пролиферации по маркеру циклину А.
Максимальная интенсивность экспрессии антиапоптозного белка Мс1-1 отмечена у эмбрионов, впервые выявлено, что ее снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза с параллельным возрастанием экспрессии проапоптозного белка Р53. Это свидетельствует о ранней инволюции тимуса. Установлено, что замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии антиапоптозного белка Мс1-1, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53.
В тимусе человека верифицирована активная экспрессия мелатонина и впервые изучена возрастная динамика его паракринной секреции. Выявлена положительная корреляция между интенсивностью экспрессии мелатонина и сохранностью лимфоидной ткани в тимусе у людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей. Впервые зарегистрированы корреляционные связи между интенсивностью процесса клеточной пролиферации в тимусе и уровнем локальной экспрессии мелатонина.
Полученные данные свидетельствуют о важном участии локальной экспрессии мелатонина в паракринной регуляции морфо-функционального статуса тимуса в процессе онтогенеза.
Практическая значимость работы
Детальное изучение показателей пролиферации и апоптоза в тимусе у людей разных возрастных групп позволило расширить представленияо механизмах функционирования и возрастной инволюции тимуса. Верификация экспрессии мелатонина - гормона, обладающего иммунорегуляторными, биоритмологическими и геропротекторными свойствами, в тимусе человека и регистрация его стимулирующего действия на пролиферативную активность Т-лимфоцитов позволяет расценивать мелатонин как возможную молекулярную мишень для фармакологической коррекции возрастных иммунодефицитов.
Положения выносимые на защиту
1. Экспрессия проапоптозного белка Р53 и антиапоптозного белка Мс1-1 верифицирована в тимусе у людей разных возрастных групп. У людей пожилого и старческого возраста, а также у долгожителей замедление процесса инволюции тимуса связано не с усилением экспрессии антиапоптозного белка Мс1-1, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53.
2. В тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей происходит снижение пролиферативной активности клеток по сравнению с детьми, умершими антенатально, и детьми первого года жизни. Во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру PCNA значительно превышает индекс пролиферации по маркеру циклину А.
3. На всех этапах онтогенеза в тимусе зарегистрирована экспрессия мелатонина, что подтверждает представления о тимусе, как органе, совмещающем иммунную и эндокринную функции.
4. В группах людей пожилого возраста и старческого возраста, а также у долгожителей обнаружена достоверная отрицательная связь между экспрессией мелатонина и степенью выраженности инволюции сохранившейся лимфоидной ткани в тимусе, что может свидетельствовать о геропротекторном действии мелатонина на тимоциты человека.
5. Мелатонин обладает выраженным стимулирующим действием на пролиферацию Т-лимфоцитов, что позволяет считать перспективным поиск и разработку методов профилактики возрастных иммунодефицитов, связанных с усилением его локальной продукции в тимусе при старении организма.
Связь с научно - исследовательской работой Института
Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Заключение диссертационного исследования на тему "Возрастные изменения пролиферативной активности клеток тимуса человека"
выводы
1. Экспрессия проапоптозного белка Р53 и антиапоптозного белка Мс1-1 верифицирована в тимусе у людей разных возрастных групп. Максимальная интенсивность экспрессии Мс1-1 отмечена у плодов, ее снижение происходит уже в течение первых месяцев постпатального онтогенеза. У детей первого года жизни заметно усиливается экспрессия проапоптозного белка Р53. Выявленная динамика экспрессии ключевых факторов регуляции апоптоза свидетельствует о ранней инволюции тимуса.
2. Замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии антиапоптозного фактора Мс1-1, а с уменьшением экспрессии проапоптозного фактора Р53.
3. Установлено достоверное снижение пролиферативной активности клеток в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с детьми, умершими антенатально, и детьми первого года жизни. Во всех возрастных группах индекс пролиферации по маркеру PCNA значительно превышал индекс пролиферации по маркеру циклину А.
4. Экспрессия мелатонина впервые верифицирована в структурах нелимфоидного компонента тимуса (капсуле, междольковых перегородках, тельцах Гассаля и стенках сосудов) и в Т-лимфоцитах корковой и медуллярной зон тимуса человека во всех исследованных возрастных группах.
5. Наиболее высокая площадь экспрессии мелатонина обнаружена в тимусе антенатально умерших детей и детей первого года жизни. Площадь экспрессии мелатонина была достоверно ниже в тимусе людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей по сравнению с группами детей.
6. Выявлена положительная корреляция между площадью экспрессии мелатонина и индексом пролиферации по маркерам PCNA и циклину А во всех возрастных группах, что свидетельствует о влиянии локальной продукции мелатонина на процессы пролиферации и дифференцировки тимоцитов.
7. В группах людей пожилого возраста и старческого возраста, а также у долгожителей обнаружена достоверная отрицательная корреляция между экспрессией мелатонина и степенью выраженности инволюции сохранившейся лимфоидной ткани в тимусе, что может свидетельствовать о геропротекторном действии мелатонина на тимоциты человека.
Практические рекомендации
1. При диагностике иммунодефицитных состояний, протекающих самостоятельно или отягощающих течение других заболеваний у больных пожилого и старческого возраста, рекомендуется проводить анализ содержания мелатонина в плазме крови или его метаболитов в моче.
2. Учитывая установленные иммуногеропротекторные свойства мелатонина по отношению к клеткам тимуса целесообразно провести клинические испытания данного гормона в качестве геропротекторного средства широкого действия.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Чеснокова, Анастасия Юрьевна
1. Автандилов Г. Г. Медицииская морфометрия: Руководство. М.: Медицина. 1990. - 384 с.
2. Агол В.И. Генетически запрограммированная смерть клеток // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - № 6. - с. 20-24.
3. Анисимов В.Н., Соловьев М.В. Эволюция концепций в геронтологии. Спб.: Эскулап. - 1999. - 129 с.
4. Анисимова В.П. Роль морфофункциональных перестроек тимуса в обменно-эндокринных нарушениях организма // Рос. Вестник перинатологии и педиатрии. 1994. — Т.39, №1. — С. 35.
5. Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. Гистология: Учебник, 5-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина. - 1999. - 744 с.
6. Белушкина Н.Н., Хасан Хамад А., Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биологической, медицинской и фармокологической химии. 1998. - №4. - С. 15-24.
7. Быков В.Л. Частная гистология человека. — СПб.: СОТИС. -1997.-207 с.
8. Банков В.П., Петкова Л.Б. Вилочковая железа / М.: Медицина. 1974.-235 с.
9. Донцова В.И. Регуляция лимфоцитами клеточного роста соматических тканей и новая иммунная теория старения. // Профилактика старения. 1998. - Вып. 1. - С. 40-63.
10. Заварзин А.А. Сравнительная гистология. / СПб.: Изд-во. СПбГУ. 2000. 520 с.
11. Ивановская Т.Е., Зайратьянц О.В., Леонова Л.В., Волощук И.Н. Патология тимуса у детей. СПб: СОТИС. - 1996. - 272 с.
12. Кветная Т. В., Князькин И. В., Кветной И. М. Мелатонин -нейроиммусноэндокринный маркер возрастной патологии. — СПб.: Издательство ДЕАН. 2005. - 144 с.
13. Кветной И.М., Ярилин А.А., Полякова В.О., Князькин И.В. Нейроиммуноэндокринология тимуса. СПб.: Издательство ДЕАН. -2005.- 160 с.
14. Кемилева 3. Вилочковая железа // Пер. с болг. — М.: Медицина. 1984. - 256 с.
15. Копнин Б. П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцрогенеза // Биохимия. 2000. - Т. 65., №1.-С. 5-33.
16. Коркушко О.В., Хавинсон В. X., Бутенко Г. М., Шатило В. Б. Пептидные препараты тимуса и эпифиза в профилактике ускоренного старения. СПб.: Наука. 2002. 202 с.
17. Коркушко О.В., Шатило В.Б. Шишковидная железа: физиологическая роль в организме, функциональная недостаточность в пожилом возрасте, возможные пути коррекции // Медичний Всесвто -2003. Т. 3, №2. - С.45-49.
18. Крутъко В. И., Подколзин А. А., Донцов В. И. Общие причины, механизмы и типы старения // Успехи геронтол. — 1997. — Т. С. 34-40.
19. Львова Л. В. Он не щадит никого // Провизор —1999. №9. -С. - 45-49.
20. Макинодан Т., Юнис Э. Иммунология и старение. — М.: Мир. 1980.-277 с.
21. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология: Учебное пособие для студентов медицинских вузов. М.: Медицинское информационное агентство. - 2003. — 544 с.
22. Ноздрачев А.Д., Баженов Ю.И., Бранникова И.А., Батуев А.С. и др. Начала физиологии. Учебник для вузов / Под ред. акад. А.Д. Ноздрачева. СПб.: Лань. 2001. - 1088 с.
23. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. — Казань: Титул. — 2003. 456 с.
24. Полак Дж.; Ван Норден с. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы (пер. с англ.). М.: Мир. — 1987. — 74 с.
25. Полякова В.О., Кветной И.М. Тимус и старение: нейроиммуноэндокринные механизмы. СПб.: Система. - 2004. - 102 с.
26. Полякова В.О., Кветной И.М., Хавинсон В.Х. и др. Тимус и старение // Успехи геронтологии. — 2001. №8. — С. 50-57.
27. Полякова В.О., Князькин И.В. Мелатонин: регуляторное действие на клетки тимуса // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва. 2005. — с. 514.
28. Райе Р.Х., Гуляева Л.Ф. Биологические эффекты токсических соединений. — Новосибирск. 2003. — 208 с.
29. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: пер. с англ. -М.Мир. 2000. - 592 с.
30. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. — 2001. -№10.-С. 18-25.
31. Серова Л.Д. Иммунология старения // Медицинский вестник. -2001.-№27.-С. 13-16.
32. Серова Л.Д. Особенности организма при старении // Клиническая геронтология. 2001. - №8. - С. 81.
33. Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций // Биохимия. 2003. - Т. 68, №4. - С. 23-27.
34. Фрейдлин И.С. Загадки тимуса. Возраст и иммунитет // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. - №5. - С 24-28.
35. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В. и др. Пептидэргическая регуляция гомеостаза. СПб.: Наука. - 2003. - 194 с.
36. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения. СПб.: Фолиант. - 2001. - 158 с.
37. Хавинсон В.Х., Чалисова Н.И., Морозов В.Г. Малинин В.В. Роль пептидов тимуса в регуляции рака лимфоидной ткани у крыс разного возраста // Докл. РАН. 1999. - Т. 369, № 5. - С. 701-703.
38. Харченко В.П., Саркисов Д.С., Ветшев П.С., Галил Оглы Г.А., Зайратьянц О.В. Болезни вилочковой железы. М.: Триада-Х. — 1988. — 232 с.
39. Хирокава К. Тимус и ожидаемая продолжительность жизни // Геронтология и гериатрия: Иммунитет и старение. 1987. - С. 33-43.
40. Чернышева М.П. Гормоны животных. Введение в физиологическую эндокринологию / СПб.: "Глаголь". — 1995. — 530 с.
41. Эллидини В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуноцитохимия. Санкт-Петербург. — 2002. - 35 с.
42. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена в целостном организме. // Патол. физиол. эксп. терап. 1998. - №2. — С. 38-48.
43. Ярилин А.А. Цитокины в тимусе. Биологическая активность и функции цитокинов в тимусе // Цитокины и воспаление. 2003. - Т.2, №2. -С. 3-11.
44. Ярилин А.А., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы // Иммунология. 1996. - № 1. - С. 4 -10.
45. Ярилин А.А., Пинчук В.Г., Гриневич Ю.А. Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов. — Киев: Наукова думка. — 1991. — 244 с.
46. Agarwal S., Gupta S. Increased activity of caspase 3 and caspase 8 in anti-Fas-indused apoptosis in lymhocytes from ageing humans // Clin. Exp. Immunol. Vol. 117. - 1999. - P.285-290.
47. Andrew D., Aspinall R. Age-assosiated thymic atrophy is linked to a decline in IL-7 production // Exp. Gerontol. Vol. 37. - 2004. - P.45 5^163.
48. Antonica A, Magni F, Mearini L, Paolocci N. Vagal control of lymphocyte release from rat thymus. // J Auton Nerv Syst. 1994. - Vol. 48. -P. 187-97.
49. Aspinal R., Andrew D. Thymic atrophy in the mouse is a soluble problem of the thymic environment // J. Vaccine. 2000. - Vol. 18. - P. 16291637.
50. Babu J. P. Cell death induced by acute renal injury: a perspective on the contributions of apoptosis and necrosis // Renal Physiol. 2003. — Vol. 284, N4 - P. 608-627.
51. Bach M.A., Bach J.F. Stadies on age-related decrease of thymic secretion and its concequences on T-cell function // Gerontology 1979. - Vol. 25.-P. 159-160.
52. Beetz A., Messer G., Oppel Т., van Beuningen D. Induction of interleukin-6 by ionizing radiation in a human epitelial cell line: control by corticosteroids // Int. J. Radiat.Biol. 1997.-Vol.72, № l.-P. 33-43.
53. Behrens S. H., Borkovec M., Schurtenberger P. Aggregation in charge-stabilized colloidal suspensions revisited. // Langmuir. 1998. Vol. 14, N. 8.-P. 1951-1954.
54. Boehmer H. von. Thymus development // Curr. Top Microbiol. Immunol. 1986.-Vol. 126.-P. 19-25.
55. Botham C.A., Jones G.V., Kendall M.D. Immuno-characterisation of neuroendocrine cells of the rat thymus gland in vitro and in vivo // Cell Tissue Res.-2001. Vol. 303.-P. 381-389.
56. Bravo R., Frank R., Blundell P.A. et al., Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta. // Nature. Vol. 326. - 1987. - P. 515-517.
57. Burnet F. Role of the thymus and related organs in immunity // Brit. Med J. 1962. - Vol. 2. - P. 807-811.
58. Cardoso M.C., Leonhardt H., Nadal-Ginard B. Reversal of terminal differentiation and control of DNA replication: cyclin A and cdk2 specificity localize at subnuclear sites of DNA replication. // Cell. — Vol. 74. — 1993.-P. 79-992.
59. Cox L.S. Who binds wins: competition for PCNA rings out cell-cycle changes // Trends in Cell Biology. Vol. 7, N.12. - P. 493-498(6)
60. Dardenne M. Role of thymic peptides as transmitters between the neuroendocrine and immune systems // J. Ann. Med. 1999. - Vol. 31. - P. 34-39.
61. Dubocovich M.L., Cardinali, D.P., Delagrange P.R.M., Krause, D.N., StrosberG, D., Sugden, D., Yocca, F.D. Melatonin Receptors. // The 1UPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification 2000 - P. 270-277.
62. Evan G., Littlewood T. Role c-myc in cell growth // Curr Opin Gouct Dev. 1993. - Vol. 3. - P. 44-49.
63. Fortune J. M., Stith С. M., Kissling G. E., Burgers P. M. J., Kunkel T. A. RPA and PCNA suppress formation of large deletion errors by yeast DNA polymerase delta // Nucleic Acids Research 2006. - Vol. 34, N. 16.-P. 335-341.
64. Furuno N., Elzen N., Pines J. Human Cyclin A Is Required for Mitosis until Mid Prophase // The Journal of Cell Biology. 1999 - Vol. 147, N. 2-P. 295-306.
65. Galand P., Degaref C. Cyclin PCNA immunostaining as an alternative to tritiated thymidine pulse labelling for marking S phase cells in parafm sections from animal and human tissues // Cell Tiss. Kinet. 1989. -Vol. 22, N. 5.-P. 383-392.
66. Gaudecker В von. Functional histology of the human thymus // Anat. Embryol. 1991. - Vol. 183. - P. 1-15.
67. Geenen V., Brilot F. Role of the thymus in the development of tolerance and autoimmunity towards the neuroendocrine system // Ann N У Acad Sci.- 2003. -Vol. 992.-P. 186- 195.
68. Ginaldi L, De Martinis M., D'Ostilio A. The immune system in the elderly: 11. Spesific cellular immunity // Immunol. Res. 1999. - Vol. 20, №2. -P. 109-115.
69. Goya R. G., Brown O. A., Bolognani F. The thymus-pituitary axis and its changes during aging // 1999. Neuroimmunomodulation. - Vol 6. - P 137-142.
70. Goya R.G., Bolognani F. Homeostasis, thymic hormones and aging // Gerontology. 1999. - Vol. 45. - P. 174-178.
71. Green D., Kroemer G. The central executeoners of apoptosis: caspases or mitochondria // Trends in cell biology. 1998. - Vol 8. - P. 267272.
72. Hall N.R., O'Grade M.P., Menzies R.A. Thymic regulation on the hypothalamic-pituitary-gonadal axis // Int. J. Immunophannac. 1992. - Vol. 14.-P. 353-359.
73. Higley H., O'Morchoe C. Morphometric analysis of thymic medullary nonlymphoid cells // Dev. Сотр. Immunol. 1984. - Vol. 8. -P.711-714.
74. Hirokawa К. The thymus and aging // Immunology and aging. / New York-London. Pergamon Press. 1977. - P.51-72.
75. Hirokawa K., Utsuyama M., Kobayashi S. Hypothalamic control of thymic function // Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 2001. - Vol. 47. - P. 97-102.
76. Hoijman E., Viegas L. R., Sarmiento M. I. K., Rosenstein R. E., Pecci A. Involvement of Bax protein in the prevention of glucocorticoid-induced thymocytes apoptosis by melatonin // Endocrinology. — 2004. Vol. 145.-P. 418-425.
77. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver-staining of nucleouls organizer regions with a protective colloidal developer: on a step method // Experientia.-1980.-Vol.36, №8.-P. 1014-1015.
78. Hsu H.-C. Genetic regulation of thymic involution // Mechanisms of ageing and development. 2005. - Vol. 126. - P. 87-97
79. Iguchi H, Kato K.I., Ibayashi Y. Melatonin serum levels and metabolic clearance rate in patients with liver, cirrhosis // J Clin Endocrinol Metab.- 1982.-Vol. 54-P. 1025-1027.
80. Karasek M. Melatonin, human aging, and age-related diseases. // Exp. Gerontol. -2004. Vol. 39. - P. 1723-1729.
81. Kato S. Thymic microvascular system // Microscopy Research and Technique. 1997. - Vol. 38, N. 3. - P. 287-299.
82. Kendall M.D. Functional anatomy of the thymus microenvironment//J. Anat. 1991. - Vol. 177. - P. 1-99.
83. Krishna Т. S., Kong X. P., Gary S., Burgers P. M., Kuriyan J. Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA. // Cell. 1994. Vol. 79, N. 7. - P. 1233-1243.
84. Kvetnoy I. M. Neuroimmunoendocrinology: Where Is the Field for Study? // Neuroendocrinology Lett. 2002. - Vol. 23. - P. 119-120.
85. Loning Т., Caselitz J., Otto H. The epithelial framework of the thymus in normal and pathological conditions: immunohistochemical demonstration of any autopsy series // Virchovs Arch. B. — 1980. — 392. — P.7-20.
86. Lou Y., Hurwitz J., Massague J. Cell-cycle inhibition by independent CDK and PCNA binding domains in p21Cip. // Nature 1995 -Vol. 375.-P. 159-161.
87. Macchi M. M., Bruce J. N. Human pineal physiology and functional significance of melatonin // Front. Neuroendocronol. 2004. - Vol. 25.-P. 177- 195.
88. Maestroni G. J. The immunoendocrine role of melatonin. // J. Pineal Res. 1993. - Vol. 14, N. 1. P. 1 - 10.
89. Maestroni G. J. The photoperiod transducer melatonin and the immune-hematopoietic system. // J. Photochem. Photobiol. B: Biology 1998. -Vol. 43.-P. 186- 192.
90. Manley N.R. Thymus organogenesis and molecular mechanisms of thymic epithelial cell differentiation // Immunology.-2000.-V.12.-P. 421-428.
91. Maroder M., Bellavista D„ Vacca A., Felli M.P., Screpanti I. The thumus at the crossroad of neuroimmune interactions // Ann. NY Acsd. Sci. -2000.-Vol. 217.-P. 741-747.
92. Martens H., Malgrange В., Robert F. Cutokine production by human thymic epithelial cells: control by the immune recognition of the neurohypophysial self-antigen // Regul. Pept. 1996. - Vol. 14. - P. 39-45.
93. Mathews C.E., Pietropaolo S.L., Pietropaolo M. Reduced thymic expression of islet antigen contributes to loss of self-tolerance // Ann N Y Acad Sci.-2003.-Vol. 1005.-P. 412-417.
94. Mocchegiani E., Fabris N. Age-related thymus involution: zinc reverses in vitro the thymulin secretion defect // Int. J. Immunopharmacol. -1995.-Vol. 17.-P. 745-749.
95. Morgan D. O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. // Annu Rev. Cell Dev. Biol. 1997. - Vol. 13. - P. 261-291.
96. Morozov V.G., Khavinson V.Kh. Natural and synthetic peptides as therapeutics for immune disfunction // Int. J. Immunopharm. 1997. - Vol. 19, №9-10.-P. 501-505.
97. Noginova O.A., Riabenco V.V., Kaidashev I.P. Influence of peptide complexes from kinney on dexametasone- and ionophore- induced apoptosis in thymocytes snd peripheral blood lymphocytes // Exp. Oncology. -2002.-Vol. 24. P.69-71.
98. Noguchi Т., Dobashi Y., Minehara H., Itoman M., Kameya T. Involvement of Cyclins in Cell Proliferation and Their Clinical Implications in Soft Tissue Smooth Muscle Tumors // American Journal of Pathology. 2000. -Vol. 156.-P. 2135-2147.
99. Odaka C, Morisada T, Oike Y, Suda T Distribution of lymphatic vessels in mouse thymus: immunofluorescence analysis // Cell Tissue Res. -2006. Vol 325, N. 1. -P 13-22.
100. Pattabiraman N., Kellogg G. E., Lemcke Th., Kunick C., Sausville E. A., Zaharevitz D. W., Edward A, Daniel W., Gussio R. Homology Model of the CDKl/cyclin В Complex //J. of Biomol. Structure and Dynamics. 2005. -Vol. 22, N. 5.-P 493-502.
101. Pawelec G., Effros R.B., Caruso C. T-cells and aging // Frontiers in Bioscience. 1999. - Vol. 4. - P. 216-269.
102. Pearse A. G. E. The cytochemistry and ultra structure of polypeptide hormone-producing cells of the APUD series and the embryologic, physiologic and pathologic implications of the concept. // J Histochem Cytochem.- 1969.- Vol. 17.-P. 303-313.
103. Penault-Llorca F, Cayre A, Bouchet M. F. Induction chemotherapy for breast carcinoma: predictive markers and relation with outcome // Int J Oncol. 2003 - Vol. 22, N 6. - P. 1319-25
104. Pratt W.B. The role of heat shock proteins in regulating the function, folding, and trafficking of the glucocorticoid receptor // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 21455-21458.
105. Prelich G., Tan C., Kostura M., Mathews M.B., So A.G., Downey K.M., Stillman B. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase- auxiliary protein. // Nature. 1987. - Vol. 326 -517-520.
106. Presman D. M., Hoijman E., Ceballos N. R., Galigniana M. D., Pecci A. Melatonin inhibits glucocorticoid receptor nuclear translocation 1 n in mouse thymocytes // Endocrinology. 2006 - Vol. 147, N. 11. - P. 5452-5459
107. Pugliese A. Central and peripheral autoantigen presentation in immune tolerance // Immunology. 2004. - Vol.111, №2.-P. 138-146.
108. Raica M., Encica S., Motoc A., Cimpean A.M., Scridon Т., Barsan M. Structural heterogeneity and immunohistochemical profile of Hassall corpuscles in normal human thymus // Annals of Anatomy.-2006.-Vol. 188, N. 4.-P. 345-352.
109. Reiter R. J. Pineal melatonin; cell biology of its synthesis and of its physiological interaction // Endocr Rev. 1991. - Vol 12. - P. 151-180.
110. Sainz R. M., Mayo J. C., Reiter R. J., Antolin I., Esteban M. M., Rodriguez C. Melatonin regulates glucocorticoid receptor: an answer to its antiapoptotic action in thymus. 1999 - FASEB J. - Vol. 13. - P. 1547-1556.
111. Savino W., Dardenne M. Neuroendocrine control of thymus physiology // Endocr. Rev. 2000. - Vol. 21. - P. 412-443.
112. Scollay R., Shortman K. Identification of early stages of T lymphocyte development in the thymus cortex and medulla. // J Immunol. -1985 -Vol. 134, N. 6.-P. 3632-3642.
113. Srinivasan V., Maestroni G. J. M., Cardinali D. P., Esquifino A. I., Perumal S. R. P., Miller S. C. Melatonin, immune function and aging // Immun. Ageing. 2005. - P. 2-17.
114. Strasser A., Bouilliet Ph. The control of apoptosis in lymphocyte selection // Immunol. Rev. 2001. - Vol. 76. - P.82-92.
115. Sugden D. Melatonin Receptors. I I Tocris Reviews 2000. - N. 14 -P. 1-3.
116. Taub D. D., Longo D.L. Insights into thymic aging and regeneration // Immunol. Rev. 2005. - Vol. 205. - P. 72 - 93.
117. Throsby M., Pleau J., Dardenne M., Homo-Delarche F. Thymic expression of the pancreatic endocrine hormones // Neiroimmunomodulation.-1999.-V.6, №l-2.-P. 108-114.
118. Tian Y. M, Zhang G. Y, Dai Y. R. Melatonin rejuvenates degenerated thymus and redresses peripheral immune functions in aged mice. // Immunol. Lett.-2003.-Vol. 88.-P. 101-104.
119. Van E. W. Immunohistology of limphoid and non-lymphoid cells in the thimus in reletion to lymphocyte differention // Amer. J. Anat. 1984. -N70. - P.643 - 644.
120. Wu L., Li C., Shortman K. Tymic dendritic cell precursor: Relationships to the T lymphocyte lineage and phenotype of the dendritic cell progeny // J exp. med. 1996. - Vol. 184. - P. 903-911.
121. Yajima N., Sakamaki K, Yonehara Sh. Age-related thymic involution is mediated by Fas on thymic epithelial cells // Int. Immunol. -2004.-Vol. 16, N 7.-P. 1027-1035.
122. Yarilin A.A. What the thymus is needed for? Intrathymic events and their uniqueness // Russian J. of Immunol. 1998. - N1. - P.6-20.
123. Zatz M., Goldstein A. Thymosins, lymphokines and the immunology of ageing // Gerontology. 1985. - N31. - p. 263-277.
124. Zeng X. R., Hao H., Jiang Y., Lee M. Y. Regulation of human DNA polymerase delta during the cell cycle. // J Biol Chem. 1994. - Vol. 269, N. 39. - P. 24027-24033.