Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Аутоантитела к эпителиальным клеткам тимуса и их влияние на функцию этих клеток

РГ6 од

1 з янв да

На правах рукописи

МИТИН Александр Николаевич

АУТО АНТИТЕЛА К ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМ КЛЕТКАМ ТИМУСА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИЮ ЭТИХ КЛЕТОК

14.00.36 - аллергология и иммунология Автореферат

диссертации иа соискание ученой степени кандидата медицииских наук

Москва 1996 год

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава России

Научный руководитель:

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор

Б.В.Пинегин

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Белецкая

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии

им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится 22 января 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава России по адресу: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С.Сеславина

Актуальность работы

В сыворотке крови большинства здоровых людей присутствуют аутоантитела, реагирующие с эпителиальными клетками тимуса. Их уровень снижен у новорожденных и возрастает при аутоиммуных и ревматоидных заболеваниях, а также при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и радиационном. Интерес к данным аутоантителам обусловлен как минимум тем, что эпителий тимуса, к которому эти антитела специфичны, определяет развитие Т-лимфоцитов. В норме, по-видимому, они не оказывают существенного влияния на функцию эпителиальных клеток тимуса. Однако, при повышении титра аутоантител и переключении их синтеза с IgM на IgG возможно отрицательное влияние на функцию тимусного эпителия, как-то, секрецию гормонов тимуса и дифферинцировку Т-лимфоцитов, что в целом должно отрицательно сказаться на деятельности тимусза-висимого звена иммунной системы.

Актуальность исследования свойств и биологической активности этих антител связана с важностью расшифровки механизмов поражения тимусзависимого звена иммунной системы при аутоиммунных заболеваниях и в отдаленные сроки после действия малых доз ионизирующей радиации для определения путей коррекции этих нарушений.

Цель работы:

Изучение биологических эффектов in vitro и in vivo аутоантител, реагирующих с эпителием тимуса, а также оценка их содержания у различных групп здоровых и больных людей с использованием новых методических подходов.

В соответствии с этой целью в работе решались следующие Задачи:

1. Отработка и апробация цитофлюорометрического метода определения аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса.

2. Определение уровня аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса в сыворотке крови людей различного возраста, больных системной красной волчанкой и лиц, подвергшихся радиационному воздействию.

3. Выделение IgM и IgG из сыворотки крови здоровых доноров и лиц, подвергшихся ионизирующему облучению.

4. Изучение действия препаратов, содержащих аутоантитела, на про-лиферативную и секреторную активность эпителиальных клеток линии HTSC, выделенных из тимуса человека.

5. Изучение биологических эффектов аутоантител в отношении тимуса и популяции Т-лимфоцитов у мышей.

Научная новизна работы:

В работе впервые показано, что содержание аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса в сыворотке крови людей увеличивается с возрастом, нарастание уровня аутоантител обнаружено также при системной красной волчанке и у лиц, подвергшихся радиационному воздействию. Показано, что данные антитела, взаимодействуя с клетками линии HTSC in vitro, угнетают их пролиферативную активность и секрецию al-тимозина.

В опытах in vivo введение данных антител приводит к снижению сывороточной тимической активности и уменьшению клеточности тимуса мышей.

Таким образом, данная работа приближает к пониманию связи между увеличением уровня аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса и нарушением функции Т-клеточного звена иммунной системы при различных физиологических и патологических состояниях.

Практическая значимость:

Разработан метод определения аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса, основанный на цигофлюорометрической оценке взаимодействия изучаемых сывороток с клеточной линией тимусного эпителия HTSC, который может быть использован в практике клинико-иммунологических исследований.

Содержащиеся в работе данные по ингибирующему действию аутоантител к эпителию тимуса на выработку тимусных гормонов могут служить обоснованием для использования препаратов тимусных пептидов для коррекции иммунодефицитов, сопровождающихся повышением уровня аутоантител данной специфичности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Содержание в сыворотке крови аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса повышается с возрастом, при заболеваниях, в частности СКВ, и у людей, подвергшихся лучевому воздействию.

2. Данные аутоантитеяа, взаимодействуя с эпителиальными клетками тимуса in vitro и in vivo, угнетают их секреторную и пролифе-ративную активность.

3. Цитофлюорометрический метод определения аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса может быть использован в клинической практике и при обследовании лиц, подвергшихся воздействию неблаго-

приятных факторов среды, для оценки потенциальной опасности нарушения функции тимуса.

Публикации:

Результаты работы доложены и обсуждены на научной конференции отдела клеточной иммунологии Института иммунологии Мин. здрава России и на Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы" (Москва 14-15 ноября 1995 г). Материалы диссертации изложены в 5 публикациях.

Объем диссертации:

Диссертация изложена на страницах машинописного тек-

ста, содержит рисунка и таблицы. В списке литературы источника, из них - отечественных авторов.

Материалы и методы:

Для отработки иммунофлюоресцентного метода определения ау-тоантител мы использовали пул сывороток 150 доноров из Москвы и второй пул сывороток 130 людей, подвергшихся лучевому воздействию во время ликвидации последствий Чернобыльской аварии.

Для определения уровня аутоантител к эпителию тимуса были исследованы сыворотки крови новорожденных (возраст 1-2 недели) и практически здоровых доноров обоего пола (возраст от 25 до 60 лет), сыворотки крови 28 больных системной красной волчанкой и 59 человек - ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Все -жители Москвы.

Опыты in vivo проводились на мышах (СБА X C57BL/6)F1, полученных из питомника лабораторных животных "Столбовая" РАМН РФ.

Линия эпителиальных клеток тимуса человека HTSC (Human Thymic Stroma Cells) была предоставлена Шаровой Н.И. Эпителиальная природа клеток установлена по наличию кератина и секреции а 1 -тимозина. Культивировались данные клетки при 37°С и 5% содержании СО? в полной питательной среде, состоящей из среды RPMI 1640 ("Flow Labs") с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалея), 2 мМ L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина ("Pharmachim"), 20 мМ HEPES ("Flow Labs"), с тимоцитами из тимуса детей, подвергшихся операции на сердце (возраст до 4 лет). Тимоциты использовались в качестве стимуляторов пролиферации клеток HTSC, начальная концентрация их составляла 107 кд/мл, к концу срока культивирования (7-8 сутки) оии полностью исчезали. Начальная концентрация клеток линии HTSC составляла 104 кл/мл и достигала в конце культивирования (4-6)* 10s кл/мл.

При постановке опытов in vitro сохранялись те же условия культивирования, при этом в полную питательную среду добавлялись исследуемые препараты до определенной концентрации.

IgG выделяли методом ДЭАЭ-хроматографии, и его концентрация в полученных препаратах у доноров и ликвидаторов составила 7,1 и 6,77мг/мл, соответственно. IgM получали методом гель-фильтрации, его концентрация у доноров и ликвидаторов составила 3,8 и 2,7мг/мл, соответственно.

Цитофлюорометрическое определение аутоантител проводилось по следующей схеме. Клетки линии HTSC дважды отмывают центрифугированием охлажденной до 4°С средой 199 с азидом натрия (1,3 мг/мл) и бычьим сывороточным альбумином (2 мг/мл) в течение 5 мин при 1500 об/мин. К клеточному осадку добавляют охлажденный до 4°С метанол и немедленно центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин, после чего дважды отмывают средой 199.

Отмытые клетки ресуспендируют до концентрации 2*106 клеток в 1 мл среды 199 и разливают по 50 мкл в лунки круглодонных планшетов. В те же лунки вносят по 50 мкл исследуемой сыворотки в разведении 1:80. Затем планшеты в течение ночи (16 ч) инкубируют при 4°С. Клетки трижды отмывают средой 199 по 5 мин при 1500 об/мин. К осадку добавляют по 100 мкл (0,02 мг) меченых флюоресцеинизотио-цианатом (ФИТЦ-меченных) кроличьих антител к иммуноглобулинам человека и инкубируют при 4°С в течение 45 мин. Трижды отмывают средой 199 (4°С, 1500 об/мин, 5 мин). Осадок фиксируют 1% раствором формалина, что позволяет стабилизировать пробы на 1-2 нед.

Контролем служат пробы клеток, инкубированных в отсутствие сыворотки (контроль на аутофлюоресценцию) или обработанные только исследуемой сывороткой и только ФИТЦ-меченными антителами. Обязательным является использование в каждом опыте пробы со стандартом, малые дозы которого однократно размораживаются перед употреблением.

Результаты оценивают методом проточной цитометрии на приборе "Epics Profile II" ("Cultronics") с аргоновым лазером мощностью 0,15 МВт при силе тока 6,41 А и длине волны 488 нм с использованием

фильтра для длины волны 525 нм. Объем каждого исследуемого образца составляет 100 мкл. Определяются два численных показателя - процент светящихся клеток и интенсивность флюоресценции. Исследуются триплеты опытных и контрольных образцов.

Концентрацию al-тимозина определяли с помощью радиоиммунологического анализа совместно с Аршиновым В.Ю. (Институт технологии кровезаменителей и гормональных препаратов, Москва) на основе метода, описанного Insefy G.S. Et al., 1986. В исследовании использовалась кроличья сыворотка специфичная к С-концевому сегменту 15-28 al-тимозина (стандарт данного гормона). Построение калибровочной кривой и расчеты концентрации al-тимозина в пробах производились автоматически системой обработки данных, которой снабжен используемый в лаборатории у-счетчик. Для расчетов использовалась программа RIACALC-2.

Сывороточная тимическая активность определяли азатиоприно-вым тестом (Bach J.F., Dardenne M., 1973). За титр сывороочной тимиче-ской активности принимали максимальное разведение фильтрата плазмы, при котором ингибирование розеткообразования составляло около 50%.

При оценке пролиферативного ответа клеток линии HTSC за 18 часов до окончания срока культивирования в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов вносили 3Н-тимидин по 1 мкКи в лунку (удельная активность 3Н-тимидина - 20 Ки/ммоль). Клетки переносили на стекло-волоконные фильтры ("Titertek") при помощи харвестера и просчиты-

вали уровень ß-излучения на жидкостном сцинтилляционном счетчике ß-Trac ("TM Analytik").

Результаты и обсуждение

Отработка и апробация цшпофлюорометрического метода определения аутоештител к эпителиальным клеткам тимуса.

Для определения аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса в сыворотке крови нашей лабораторией был предложен новый метод, основанный на цитофлюорометрической оценке взаимодействия изучаемых сывороток с линией эпителиальных клеток тимуса человека HTSC. Подробно методика исследования описана в главе "Материалы и методы".

При отработке метода пулы сывороток доноров из Москвы и людей, подвергшихся лучевому воздействию во время ликвидации последствий Чернобыльской аварии, а также полученные из данных сывороток препараты иммуноглобулинов класса М и G, тестировались в различных разведениях. Определялись процент меченых клеток и интенсивность флюоресценции. Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Данные результаты свидетельствуют о более высокой информативности определения интенсивности флюоресценции: именно этот показатель изменяется при разведении исследуемых образцов, тогда как процент меченых клеток при этом остается практически неизменным. В дальнейшем нами использовались разведения сывороток 1/160.

При аналогичном исследовании сыворотки кролика антител к HTSC обнаружено не было (данные не представлены), что косвенно

свидетельстствует о том, что связывание человеческих антител осуществляется за счет специфического взаимодействия с эпигопом, а не за счет неспецифического связывания с Рс-рецепгором.

рис.1

Интенсивность свечения НТБС в опыте непрямой ' иммунофлюоресценции с сыворотками доноров и ликвидаторов и полученными из них препаратами ^

в &

5 з

разведение

Сыворотка донора.

-о- ^-О донора - А - 1?-М донора

Сывороша ликвидаторов

ликвидаторов

ликвидаторов

Процент светящихся НТБС в опыте непрямой иммунофлюоресценции с сыворотками дояров и ликвидаторов и полученными из них препаратами

донора, "в" донора 1Й-М донора

Сыворотка ликвидаторов

ликвидаторов

-12-М ликвидаторов

разведение

Для апробации метода мы исследовали сыворотки 28 практически здоровых доноров обоего пола в возрасте от 25 до 50 лет из Москвы, в качестве стандарта в данном и последующих сериях определения аутоантител использовался пул сывороток 150 доноров из Москвы.

По этим данным мы определили показатели нормы для каждого из параметров, которые представлены в табл.1. Среднее количество окрашиваемых клеток составило 55,2+1,7%; а интенсивность флюоресценции - 27,5+1,5 усл.ед. Коэффициент вариации обоих показателей внутри опыта не превышал 5%, между опытами составлял (при исследовании стандарта) для доли окрашенных клеток 17%, для интенсивности флюоресценции - 21%,

табл.1 Показатели нормы для параметров, характеризующих содержание в сыворотке аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса

Параметр М+ш а Интервал нормы (от М-1,5ст до М+1,5в)

Процент меченых клеток 55,2+1,7 8,9 41,85-68,55

Интенсивность флюоресценции, усл.ед 27,5+1,5 7,9 15,65-39,35

Однако данные показатели нормы действительны только при использовании тех же самых реактивов и оборудования, что необходимо учитывать при проведении аналогичных исследований в других условиях. Поэтому для получения сравнимых результатов необходимо использование постоянного стандарта, о котором говорилось ранее (пул сывороток доноров).

В дальнейшем этот метод использовался нами для определения уровня аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса у различных групп населения в норме и при патологии.

Нами были обследованы 5 различных групп населения. Первые две представляли практически здоровых людей, которые отличались по возрасту (новорожденные и взрослые люди), третья группа - больные системной красной волчанкой (СКВ), и последняя - люди, принимавшие участие в ликвидации последствий Чернобыльской аварии.

Уровень аутоантител к ЭК тимуса в сыворотке крови различных возрастных групп.

Для определения уровня аутоантител к эпителию тимуса в зависимости от возраста были исследованы сыворотки крови новорожденных (возраст 1-2 недели) и практически здоровых доноров обоего пола (возраст от 25 до 60 лет). Все - жители Москвы. Полученные результаты представлены в табл.2.

табл.2 Уровень аутоантител к ЭК тимуса в сыворотке крови различных возрастных |рупп__

Возрастная группа Интенсивность флюоресценции (М+т) Процецт меченых клеток (М±ш)

новорожденные, 1-2 нед 7,9+0,84 46,8+1,3

доноры, 25-60 лет 27,5+1,5 55,2+1,7

Процент меченых клеток у новорожденных ниже, чем у доноров, и это отличие является достоверным (р<0,01), также и интенсивность флюоресценции у новорожденных достоверно ниже по сравнению с донорами (р<0,01).

В целом можно говорить о повышении уровня аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса в сыворотке крови здоровых людей с возрастом, то есть об обратном соотношении между уровнем аутоантител с одной стороны и функциональной активностью тимуса и Т-лимфоцитов, а также сывороточным уровнем гормонов тимуса - с другой.

Уровень аутоантител к ЭК тимуса в сыворотке крови больных системной красной волчанкой.

Нами были также исследованы сыворотки крови 28 больных системной красной волчанкой на наличие аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса. При этом по сравнению с теми же показателями у практически здоровых доноров было выявлено повышение как интенсивности флюоресценции: 41,6±0,1 усл.ед. (р<0,01), так и процента светящихся клеток: 61,4+0,2% (р<0,01). При этом 60% проб по интенсивности флюоресценции превышали показатели нормы, расчитанные для здоровых доноров. Данные представлены в табл.3.

табл.3 Уровень аутоантител к ЭК тимуса в сыворотке крови больных системной красной волчанкой (СКВ)__

Исследуемая группа Интенсивность флюоресценции Процент меченых клеток (М±ш)

(М±ш) Процент проб, превышающих М+1,5о для нормы

больные СКВ 41,6+0,1 60 61 >4+0,2

доноры 27,5+1,5 7,1 55,2+1,7

Уровень аутоантител к ЭК тимуса в сыворотке крови ликвидаторов последствий Чернобыльской аварии.

Следующая обследованная нами группа состояла из 59 человек -ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Все проживают на территории Москвы, мужчины от 33 до 62 лет. Результаты представлены в табл.4.

По сравнению со здоровыми донорами не было выявлено различий по интенсивности флюоресценции 28,1+0,5 усл.ед. В тоже время процент меченных клеток НТ8С был достоверно выше, чем у доноров, и составлял 66,1+2,3% (р<0,01).

табл.4 Уровень аутоянтител к ЭК тимуса в сыворотке крови ликвидаторов аварии па Чернобыльской АЭС._

Исследуемая группа Процент меченых клеток Интенсивность флюоресценции (М+т)

(М+т) Процент проб, превышающих М+1,5а для нормы

ликвидаторы 66,1+2,3 39,0 28,1+0,5

донры 55,2+0,5 3,6 27,5+1,5

Таким образом, можно говорить о повышении уровня аутоантител в сывороке крови людей с возрастом, при воздействии таких неблагоприятных факторов окружающей среды как радиация и при системной красной волчанке. Несмотря на то, что антитела во всех случаях выявлялся по взаимодействию с клетками одной и той же линии НТ5С, специфичность их, скорее всего, разная.

Основываясь на литературных данных о частом выявлении в сыворотке крови больных с аутоиммунными заболеваниями антител к полисахариду стрептококка группы А, перекрестно-реагирующих с эпителием корковой и медуллярной зоны тимуса, а также на сообщениях о том, что от 1,0 до 13,1% всех сывороточных ^М и от 0,5 до 9,5% -^О у здоровых людей являются антителами к терминальному О-связанному ^У-Ацетил-/Ш-Глюкозамину, иммунодоминантному эпито-пу стрептококка группы А, мы попытались ингибировать реакцию ау-тоантител с клетками линии НТБС растворимым Л'-Ацетил-/Ш-Глюкозамином. Однако нам не удалось ингибировать связывание антител из пула сывороток доноров и ликвидаторов с клетками линии НТБС. Данные представлены в табл. 5.

Табл.5 Анализ специфичности аутоантител к эпителию тимуса

Концентрация (»локатора (N-aueuut-/*-D-глюкозамия), мкг/мл сыворотка донора сыворотка ликвидаторов

процент светящихся клеток средняя интенсивность свечения процент светящихся клеток средняя интенсивность свечения

10 41 30 64 41

1 44 30 56 37

0.1 41 30 55 36

0.01 37 24 57 36

0 44 33 61 39

контроль МТС 5 11

Изучение действия препаратов, содержащих аутоантители, не функциональную активность эпителиальных клеток линии HTSC, выделенных из тимуса человека.

Следующей задачей нашего исследования была оценка биологических эффектов аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса in vitro. Полученные из пулов сывороток крови 130 облученных ("лмквидато-

ров" аварии на ЧАЭС) и 150 доноров из Москвы препараты иммуноглобулинов М и G, а также цельные сыворотки были исследованы в культуре ЭК тимуса человека HTSC (Human Thymic Stroma Cells). Подсчитывалось количество клеток на 2,3,4,5 и 6 сутки, и изучались концентрация а-1 тимозина (радиоиммунным методом) и пролифе-ративная активность клеток HTSC (по включению Н3-тимидина).

Действие препаратов, содержащих аугоангигела. на секрецию «1-тимозина клетками линии HTSC.

По результатам исследований не было выявлено качественных отличий между действием препаратов, полученных из крови облученных и здоровых доноров, при одинаковой концентрации аутоантител. Отмечено снижение уровня секреции а-1 тимозина, выраженное в сходной степени при использовании цельных сывороток и иммуноглобулинов классов М и G на 5 сутки культивирования - время достижения пика секреции а-1 тимозина в контроле (рис.2).

Для снятия данного эффекта мы попытались предварительно истощить сыворотку донора и полученный из нее препарат IgG клетками HTSC (1*106 кл/мл) в течение суток. Об истощении мы судили по уменьшению иммунофлюоресценцаи при взаимодействии данных препаратов с клетками HTSC (данные не представлены).

При культивировании клеточной линии HTSC с сывороткой доноров, предварительно истощенной HTSC, не наблюдалось каких-либо изменений секреции а 1-тимозина по сравнению с неистощенной сывороткой. Воздействуя на клеточную линию истощенным IgG из сыворотки доноров, было отмечено некоторое уменьшение угнетающего

действия данного препарата на секрецию а!-гимозина. Данные приведены на рис.3.

рис.2

Секреция а-1 тимозина эпителиальными клетками тимуса НТБС в культуре под воздействием сывороток и полученных из них препаратов иммуноглобулинов

9 ..........

□ контроль

В Сыворогса доноров 1/160

ОСьшоротка тпсвидаторов 1/160 П К'-О доноров

Ш1»-0 облученных

□ 1й-М доноров

В lg-M облученных

рис.3

Секреция а-1 тимозина клетками НТвС в присутсвии сыворотки доноров и полученного из нее препарата ^С, предварительно истощенных НТ8С _

Оконтроль ППС

□ сыворотка донора

"'j^F-fj

□истощенная сыворотка донора □ IgG донора

•

1 1

ВНСТОЩСНШ.ГО lgG донора

5 сутки

Эти результаты свидетельствуют о том, что аутоантитела к эпителиальным клеткам тимуса угнетают секрецию а 1-тимозина клетками HTSC в опытах in vitro. В тоже время в цельной сыворотке содержатся

и другие субстанции, угнетающее действие которых не снимается предварительным истощением клетками линии НТБС.

Действие препаратов, содержащих аутоантитела. на пролифератив-ную активность клеток линии НТБС.

Несколько отличная картина наблюдалась в тесте на включение Н3-тимидина клетками линии НТ8С. Пролиферативная активность оценивалась ежесуточно начиная с 3 и по 7 день культивирования.

Клетки линии НТБС (начальная концентрация 1*104 кл/мл) культивировались в полной питательной среде с тимоцитами (1*107 кл/мл) в качестве фидера. За 18 ч до окончания срока культивирования добавлялся 3Н-тимидин. В опыте в полную питательную среду добавлялись исследуемые препараты до определенной концентрации, в качестве контроля служили клетки линии НТБС с тем же фидером в полной питательной среде.

Сыворотка крови и облученных и доноров значительно угнетала пролиферацию клеток (рис.4). При использовании же иммуноглобулинов обоих классов происходило лишь замедление развития пролиферации клеток, пик которой смещался на двое суток (рис.5 и 6). При этом уровень пролиферации на пике ответа соответствовал максимуму, достигаемому в контроле.

Однако подсчет клеток в культуре при их размножении на тимо-цитах показал, что количество клеток при использовании как сывороток, так и препаратов иммуноглобулинов было все таки ниже, чем в контроле и в первые, и в последние дни культивирования. Данный эффект полностью отменялся при предварительном истощении препарата ^О донора клетками НТБС в течение суток, в тоже время истощение

цельной сыворотки не приводило к отмене угнетающего действия (табл.б).

рис.4 Изменения пролиферативной активности эпителиальных клеток тимуса НТСС в культуре под воздействием сывороток доноров и ликвидаторов

Табл.б Влияние сыворотки доноров и выделе препарата ^С на количество НТБС (*105 кл размножении с тимоцитами в качестве ( нного из нее /мл) при их >идера

0 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 5 сутки 6 сутки

контроль ППС 0.10 2.50 3.95 4.95 4.30 4.30

Сыворотка донора 1/160 0.10 2.15 3.30 3.65 3.52 3.85

донора 1/110 0.10 2.30 3.35 3.40 3.10 3.73

Сыворотка донора, истощенная НТБС 1/160 0.10 2.15 2.85 3.80 3.77 3.85

lgG донора, истощенный НТвС 1/120 0.10 2.15 3.10 5.00 4.33 4.65

Обобщая результаты опытов по функциональному влиянию ау-тоантител к эпителиальным клеткам тимуса in vitro, можно говорить об их угнетающем действии как на секрецию гормона тимуса, так и на пролиферацию эпителиальных клеток и их численность в культуре.

Учитывая отсутствие качественных различий между естественными ау-тоантителами доноров и облученных, можно предположить, что важную роль во влиянии на функцию эпителиальных клеток тимуса, а через них и на иммунную систему в целом играет именно повышенное количество этих антител в сыворотке крови облученных.

Рис.5 Изменения пролиферативной активности эпителиальных клеток тимуса ШТ5С в культуре под воздействием ^С из сывороток доноров и ликвидаторов

-с—Контроль (ППС)

донора ■»*» XgG ликвидатора

Рис.6 Изменения пролиферативной активности эпителиальных клеток тимуса ГГТЯС в культуре под воздействием 1{>М из сывороток допоров н ликвидаторов

3500 3000 250О

I 2000

Е

§ 1500 1000 500 0

--^ -Г дУ —Кошроль (ППС) допора '"**"!(( М анквндатора

XX: X /ж "

Уу '-гЛ?/

суйки

Тем не менее, результаты опытов in vitro нельзя автоматически переносить на организм в целом, потому что существует еще множество факторов, которые могут повлиять на конечный эффект. Так, наличие гемато-тимического барьера может препятствовать взаимодействию аутоантител с эпителиальными клетками тимуса. Учитывая данный фактор, а также необходимость оценить влияние аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса на иммунную систему в целом, были проведены эксперименты in vivo.

Биологические эффекты аутоантител в отношении тимуса и популяции Т-лимфоцитов у мышей in vivo.

Опыты in vivo проводились по следующей схеме: сначала исследовали сыворотку крови интактных мышей на наличие антител к эпителиальным клеткам тимуса HTSC и определили уровень сывороточной тимической активности. Затем одним мышам вводили IgG из сыворотки крови доноров и ликвидаторов однократно внутривенно, а другим трижды с интервалом в неделю внутрибрюшинно в двух разных дозах. IgG из сыворотки крови доноров вводился в дозах 800 и 2400 мкг на мышь. IgG из сыворотки крови ликвидаторов вводился в дозах 500 и 1500 мкг на мышь. Соответствующие минимальные дозы были расчитаны исходя из биологических эффектов в опытах in vitro, вторая доза была получена путем троекратного увелечения минимальной для достижения заведомо большей концентрации, чем та, которая оказывала эффект в опытах in vitro. Таким образом было получено 8 групп мышей. В качестве контроля ипользовались мыши, которым вместо препарата иммуноглобулина соответствующим путем (внутривенно или внутрибрюшинно) вводился 0.9% раствор натрия хлорида.

Через две и четыре недели сыворотки крови опытных и контрольных мышей проверялись на наличие антител к НТ8С и уровень сывороточной тиической активности. Мыши забивались на 14 и 28 сутки, и определялась клеточность тимуса.

Определение антител к НТ8С проводилось с целью выявления динамики уровня введенных антител, при этом антитела выявлялись с помощью кроличьих РГГС-меченных антител против иммуноглобулинов человека. Также мы исследовали сыворотки мышей на наличие собственных антител к НТЗС для выявления возможного усиления их продукции вследствие первичного повреждения етромы тимуса человеческими антителами. Данные антитела выявлялись с помощью Р1ТС-меченных Р(аЬ)2-фрагментов против иммуноглобулинов мыши.

При исследовании сывороток мышей на наличие человеческих антител данные антитела выявлены не были ни на14, ни на 28 сутки. Процент светящихся клеток и средняя интенсивноть свечения в опыте были на уровне контроля РГГС-меченных антител без исследуемой сыворотки в качестве первых антител (4.51% светящихся клеток при средней интенсивности свечения 1031 уся.ед). В контролях до введения процент светящихся клеток составил 6.0+0.71, интенсивность -893+276, после введения физ.раствора - 9.7+1.29 и 653+384, соответственно. Через 14 и 28 суток после введения в разных дозах процент светящихся клеток варьировал от 8.3+2.09 до 13.1+3.0, интенсивность -от 393.3+83 до 135Ц383.

Мышинные антитела к 1ПБС выявлялись в сыворотке крови всех мышей. Однако уровень данных антител на 28 сутки был достоверно ниже (р<0.05) при однократном внутривенном введении 2400 мкг

иммуноглобулина донора и обеих доз (500 и 1500 мкг) иммуноглобулина ликвидаторов. Таким образом стимуляции выработки собственных антител к НТ8С нами выявлено не было. Снижение же уровня антител при внутривенном введении препаратов на 28 сутки, возможно, обусловлено угнетением гуморального иммунитета, что требует дальнейшего анализа.

При определении сывороточной тимической активности (СТА) мышей было отмечено ее снижение вследствие введения животным препаратов (табл.7).

Табл.7 Влияние иммуноглобулина С из сыворотки крови доноров и ликвидаторовна сывороточную тимическую активность мышей.

Обработка 14 сутки, 28 сутки,

реципиентов 1оЯ2 1о&>

Контроль 0 сутки 3,25 3,25

Физ. р-р в/в 3,50 3,00

донора в/в 800 мкг 1,50 2,50

1^0 донора в/в 2400 мкг 2,50 1,50

^О ликвидат. в/в 500 мкг 3,50 0,50

ликвидат. в/в 1500 мкг 3,00 0,00

Физ. р-р в/бр 3,50 3,50

донора в/бр 800 мкг 2,50 2,50

донора в/бр 2400 мкг 0,00 2,00

ликвидат. в/бр 500 мкг 3,00 3,50

ликвидат. в/бр 1500 мкг 0,50 2,50

Наиболее четкие результаты получены при внутривенном введении ликвидаторов: на 14 сутки СТА при введении 500 мкг соответствует активности контрольных мышей; 1500 мкг - незначительное снижение СТА, а на 28 сутки СТА мышей, получивших 500 мкг составляет ¡од20.5 (при контроле у мышей же, получивших 1500 мкг СТА не определяется. Внутривенное введение донора приводило к менее выраженному снижению СТА. При внутрибрюшинном введении также отмечается тенденция к снижению СТА, однако, картина менее четкая.

Данные по клеточности тимуса мышей до и после введения исследуемых препаратов представлены в табл.8. (*р<0,05; **р>0,05)

Табл.8 Влияние иммуноглобулина 6 из сыворотки крови доноров и ликвидаторов на клеточность тимуса мышей.

Обработка реципиентов 14 сутки, * 10® клеток 28 сутки, *10? клеток

Физ. р-р в/в 1.91+0,19 2,05+0,26

донора в/в 800 мкг 1,24+0,13* 1,35+0,11*

донора в/в 2400 мкг 1,7+0,29** 1,11+0,25*

^О ликвидат. в/в 500 мкг 1.54+0,34** 1,18±0,2б*

ликвидат. в/в 1500 мкг 1,54+0,05* 0,84+0,09*

Физ. р-р в/бр 1,94+0,21 1,85+0,24

^О донора в/бр 800 мкг 1 >42+0,27* 1,67+0,17**

донора в/бр 2400 мкг 1,02+0,04* 1,52+0,22**

ликвидат. в/бр 500 мкг 1,32+0,31** 1,27+0,11*

^О ликвидат. в/бр 1500 мкг [,06±0,03* 1,35+0,23**

Введение lgG как доноров так и ликвидаторов приводило к снижению клеточности тимуса. Наиболее четкие и достоверные результаты получены при внутривенном их введении и снятии опыта на 28 сутки. И в этом случае наблюдался ингибируюгций эффект (снижение клеточности тимуса), которое выражено сильнее при введении большей дозы исследуемого препарата.

Таким образом введение IgG-фракции сыворотки крови людей, в которой содержатся аутоантитела к эпителиальным клеткам тимуса, приводит к падению уровня сывороточных гормонов тимуса и снижению содержания в нем лимфоидных клеток. Можно предполагать (хотя это и требует более серьезного обоснования), что снижение уровня сывороточной тимической активности является следствием взаимодействия аутоантител с эпителиальными клетками тимуса in vivo, что приводит к ослаблению их секреторной активности, результатом чего является не только падение уровня сывороточной тимической активности, но и ослабление заселения тимуса лимфоидными клетками.

Выводы.

1. Разработан цитофлюорометрический метод определения аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса человека, основанный на использовании клеточной линии HTSC.

2. В сыворотке крови здоровых людей с помощью нового метода выявлены аутоантитела к эпителиальным клеткам тимуса, их уровень повышается с возрастом, при СКВ и у людей, подвергшихся лучевому воздействию.

3. В опытах in vitro аутоангитеда к эпителиальным клеткам тимуса угнетают секреторную активность клеток линии HTSC.

4. При культивировании клеток линии HTSC в присутствии сывороток, содержащих аугоантитела к эпителиальным клеткам тимуса, или выделенных из них иммуноглобулинов класса G и М угнетается пролиферативная активность клеток и уменьшается их численность в культуре по сравнению с контролем.

5. В опытах in vivo введение препаратов иммуноглобулинов, содержащих данные антитела, приводит к угнетению сывороточной ти-мической активности и снижению клеточное™ тимуса, что говорит об их угнетающем действии на тимусзависимое звено иммунной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. A.A. Ярилин, Н.И. Шарова, О.И. Кузьменок, А.Н. Митин "Цитофлюорометрический метод определения аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса" - Иммунология, 1996, № 1, с. 58-60.

2. H.H. Шарова, A.A. Ярнлин, А.Н. Митин, Т.ГО. Харченко, В.Ю. Аршинов "Выработка гормонов эпителиальными клетками тимуса человека in vitro" - Иммунология, 1996, № 4, с. 36-38.

3. А.Н. Митин, A.A. Ярилин, Н.И. Шарова "Функциональные последствия взаимодействия аутоантител с клетками тимусного эпителия in vitro" - Иммунология, 1996, № 6, с. 30-33.

4. A.A. Ярилин, Н.И. Шарова, О.И. Кузьменок, А.Н. Митин, М.Ф. Никонова, М.М. Литвина "Изменения в иммунной системе пострадавших от действия факторов аварии на ЧАЭС. Проявления, при-

рода, возможные последствия" - Радиационная биология. Радиоэкология, 1996, Т.36, №4, с.549-562.

5. А.Н. Митин "Исследование функциональных эффектов in vitro аутоантител к эпителиальным клеткам тимуса из сывороток ликвидаторов и здоровых доноров" - Тез. докл. Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы", Москва, 1995, с. 16.