Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Возрастная иммуноархитектоника селезенки: экспериментальное исследование

На правах рукописи

□ОЗ166730

Рябикина Александра Ивановна

ВОЗРАСТНАЯ ИММУ НО АРХИТЕКТОНИКА СЕЛЕЗЕНКИ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

14.00.02 анатомия человека

03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О ДПР 2008

Вочгоград - 2008

003166730

Работа выполнена в Волгоградском государственном медицинском университете

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна

член-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Сергей Львович Официальные оппоненты

- доктор медицинских наук, профессор Коробкеев Александр Анатольевич

- доктор медицинских наук профессор Хлопонин Петр Андреевич

Ведущая организация - Тверская государственная медицинская академия

Защита состоится «_29_»_апреля_2008г в_10 00_час на

заседании

Диссертационного совета Д 208 008 01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу 400066 Волгоград, пл Павших борцов, I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волпнрадского государстенного медицинского университета (400066 Волгоград пл Павших борцов, 1)

Автореферат разостан » >уСС _2008г

Ученый секретарь Диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Иммунная система отличается очень динамичным развитием как в пренатальном, так и в постнатальном онтогенезе Несмотря на относительно раннее достижение функциональной зрелости иммунной системой по сравнению с другими системами организма, она достаточно долго остается чрезвычайно чувствительной к действию инфекций и довольно быстро начинает претерпевать возрастную инволюцию, которая отрицательно сказывается на качестве иммунного ответа Среди иммунных органов тимус первым претерпевает возрастную инволюцию, которая достаточно подробно описана в литературе как у человека, так и у экспериментальных животных (М.Р.Сапин и Б.Ю.Никитюк, 2000; М.Ю.Капитонова и С Л Кузнецов, 2007; А.вЬапкег, 2004; Т.Т.Маппоуа, 2005; Х.гИи е1 а1, 2007). Возрастная инволюция тимуса резко меняет условия функционирования периферических лимфоидных органов селезенки и лимфатических узлов, которые для обеспечения эффективного иммунного ответа вынуждены приспосабливаться к ослаблению функциональной роли випочковой железы Это обстоятельство приводит к развитию сложных перестроек морфологии периферических иммунных органов, не нашедших достаточного отражения в литературе Вместе с тем, четкое понимание гистофизиологических особенностей периферических иммунных органов и, прежде всего, селезенки как крупнейшего из них, позволит разработать методы эффективного контроля иммунного ответа при развитии инфекций, неоплазм, при стрессе или необходимости трансплантаций органов и тканей в каждый конкретный возрастной период, характеризующийся четко ограниченными морфо-функциональными параметрами различных структур лимфоидных органов, до сих пор не достаточно освещенными в литературе, а с применением современных методов количественной иммуногистохимии - практически не изученными (О.В.Федорова, 2005; 1.С. 1лшпа а!., 2001; А.^Кевепскв, е1

al., 2004; P.M. Dammers et al, 2005, M. Faldyna et al., 2005; T.Karaca et al., 2006).

Селезенка как самый крупный вторичный орган иммуногенеза ответственна за эффективность клеточного и гуморального иммунного ответа, как врожденного, так и приобретенного иммунитета Она отличается очень сложной зональностью и высокой специфичностью каждой своей зоны, определяющейся уникальным взаимодействием лимфоидных клеток и клеток стромы, создающих особое микроокружение на территории каждой из зон селезенки и обеспечивающих формирование адекватного иммунного ответа Недостаток исследований иммуноархитектоники лимфоидных органов затрудняет понимание закономерностей эволюции иммунного ответа в постнатальном онтогенезе (А.А. Нестерова, 2007; B.Steiniger et ab, 2001, P.Korkusuz et al., 2002; Т. Tada et al., 2006).

Основным проявлением модулированных возрастом сдвигов в иммунных органах, в частности в селезенке как наиболее сложно компартментализованном, является модификация ее зональности и изменение клеточности каждой из зон, среди причин которой указывают возрастное изменение миграции иммуноцитов, изменение масштабов и скорости гибели и пролиферации лимфоидных клеток, а также нарушение сигнальных взаимодействий между ними Известно, что значение каждого из перечисленных механизмов иммуномодуляции имеет различное значение в разные возрастные периоды Однако до последнего времени возрастная иммуномодуляция в лимфоидных органах, включая селезенку, изучалась преимущественно с использованием методов культуры клеток или иммунологических методов, не учитывающих особенностей микроиммуноархитектоники различных зон на территории селезенки Особую актуальность данная проблема приобретает в связи с совершенствованием технологий трансплантации органов и тканей, что вызывает необходимость модулирования иммунного ответа не только со знаком плюс, но и со знаком минус, поскольку трансплантационный

иммунитет может препятствовать приживлению пересаженных органов, что заставляет проводить иммуносупрессивное лечение, выбор которого, включая спленэктомию, необходимо проводить с учетом возрастных иммуномодуляционных изменений в лимфоидных органах, и прежде всего -в селезенке (Н.А.Мураева, 2006; Т.Рикито^ et а!., 2006; Н^ерапоуа е1 а1., 2007).

С учетом выше сказанного нами была предпринята попытка выяснить характер, выраженность и направленность возрастных иммуномодуляционных изменений в селезенке по данным иммуноцитохимических методов исследования, позволяющих оценить их иммуномикроархитектонику и гистофизиологию

Целью настоящего исследования является изучение закономерностей возрастной динамики морфо-функциональных особенностей селезенки экспериментальных животных в различные возрастные периоды постнатального онтог енеза

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1 Изучить структурные и иммуноцитохимические изменения, развивающиеся в селезенке до наступления половой зрелости, в молодом и среднем возрасте

2 Определить соотношение паренхиматозных и стромальных элементов селезенки в Т- и В-клеточных зонах на разных этапах постнатального онтогенеза

3 Установить динамику различных популяций лимфоидных клеток селезенки в период развития и возрастной инволюции лимфоидной ткани селезенки

Научная новизна исследования Впервые с применением панели иммуногистохимических методов исследования и имидж-анализа определена возрастная перестройка стромально-паренхиматозных взаимоотношений в различных компартментах селезенки экспериментальных

животных (крыс) от рождения до позднего среднего возраста и возрастная динамика важнейших клеточных популяций в Т- и В-зонах органа

Теоретическое значение работы заключается в выяснении механизмов иммуномодуляционных изменений в периферическом звене иммунной системы в различные возрастные периода постнатального онтогенеза

Практическая значимость работы в выделении возрастных периодов наиболее существенных качественных и количественных перестроек в периферической иммунной системе, которые определяют иммунный статус организма и его чувствительность к действию патологических иммуномодулирующих факторов

Внедрение в практику: полученные научные данные используются в курсах анатомии человека и иммунологии и аллергологии на соответствующих кафедрах ВолГМУ

Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», о Пхукет (Таиланд), декабрь 2007 года, заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов, декабрь, 2007, VII научной международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология», Хургада (Египет), февраль 2008 года, V научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайа (Тайланд), февраль 2008 года, а также включены в повестку 8-го Конгресса международной ассоциации морфологов (Бухара, май, 2008 года)

Основные положения, выносимые на защиту:

I Иммуномодуляционные сдвиги гемопоэтического и стромального генеза в селезенке у крыс имеют различные соотношения в разные возрастные периоды экспериментальных животных

б

2 Возрастная динамика клеточных популяций иммуноцитов в различных зонах селезенки у крыс характеризуется различными показателями и механизмами на разных этапах постнатапьного онтогенеза, соответствующих периоду качественных иммуномодуляционных изменений (период грудного вскармливания), количественных эволютивных изменений (преювенильный, ювенильный и молодой возраст) и количественных инволютивных изменений (средний возраст)

Объем и структура диссертации Текст диссертации изложен на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, излагающего современные представления о гистофизиологии селезенки как периферического органа иммуногенеза и об иммуномодулирующем действии возраста на него, и части II, представленной тремя главами, описывающими материалы и методы исследования, результаты, обсуждение полученных результатов и выводы Диссертация иллюстрирована 3 таблицами, и 42 рисунками, из которых 39 -микрофотографии Библиографический указатель составлен из 222 источников, в том числе 29 отечественных и 193 зарубежных

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Объектом исследования послужили 88 белых крыс-самцов породы Sprague Dawley в возрасте от рождения до 1 года, относящиеся к следующим возрастным периодам препубертный период, период полового созревания, период молодого и среднего возраста (T.B.Poole, 1987) Для количественных исследований использовалось 72 животных 9 возрастных подгрупп по 8 особей в каждой подгруппе 0, 10, 20 дней от роду (подгруппы 1а,1б,1в соответственно составили группу возраста грудного вскармливания), 30, 60, 90 дней (подгруппы 2а,2б,2в составили группу преювенилыюго, ювенильного и молодого возраста соответственно), 180, 270 и 360 дней (подгруппы За, 36 и Зв соответственно составили группу среднего возраста,

причем группы 36 и Зв объединили «стареющих» животных, A.Sahu et al., 1998). Кроме того, для качественных гистологических исследований использовались находящиеся на грудном вскармливании животные в возрасте 2,4,7,9,12,14,19, а также животные инфантного периода в возрасте 25 дней от роду - по 2 крысы на каждый возраст

Животные содержались в стандартных виварных условиях Перед забоем они взвешивались Забой крыс производился под анестезией При вскрытии селезенка животных извлекалась, взвешивалась, фиксировалась формалином и заливалась в парапласт Серийные гистологические срезы селезенки, изготовленные на микротоме фирмы Leica 2140 (Германия) с применением разовых низкопрофильных лезвий толщиной 3 мкм, окрашивались гематоксилин-эозином, по Ван Гизону и моноклональными антителами с использованием пероксидазной технологии В исследовании использовалась следующая панель 10 антител анти-СЭЗ (клон 1F4), CD8a (клон MRC ОХ8), CD20 (клон RLN-9D3), CD45RC (клон MRC 0X22), CD68 (клон EDI), ОХ62 (клон MRC ОХ62), PCNA (клон PC 10), каспаза-3 (все фирмы Серотек, Великобритания), анти-С090 (клон HIS51) (фирмы БД Фарминген, США), и анти-белок S100 (фирмы ДАКО, Дания)

Количественный анализ срезов, окрашенных с применением иммуногистохимических методов проводился с использованием имидж-анализа в программе «Имидж Про Плюс», версия 4 5, фирмы «Медиа Сайбернетикс» (США) Данные имидж-анализа транспортировались в программу Excel, с помощью которых проводилась статистическая обработка полученных цифровых данных, где рассчитывались средняя арифметическая, среднеквадратическое отклонение, ошибка репрезентативности, коэффициент корреляции Производился подсчет необходимого числа объектов наблюдения, по t-критерию Стьюдента проводилось определение достоверности различия средних величин

Полученные результаты и их обсуждение.

Определение массы тела экспериментальных животных показало, что она неуклонно возрастает с увеличением возраста крыс (таблица 1),

Таблица 1. Масса тела (г) экспериментальных животных, М+/-т.

группы/ подгруппы А Б В

грудной возраст/ 1-я группа 4,84*0,51 14,56 ± 1,33*** 31,64 ± 3,16***

преювенильный и молодой возраст/ 2-я группа 70,83 ± 6,05 228,98 ±20,74*** 320,98 ±29,95***

зрелый возраст/ 3-я группа 380,19 ±35,74 450,52 ±39,06 521,06 ±47,01*

- р<0,05 но сравнению с исходной подгруппой -р<0,001 по сравнению с исходной подгруппой

Абсолютная масса селезенки также неуклонно увеличивается с

возрастом, и лишь при переходе в группу среднего возраста она начинает незначительно снижаться (таблица 2)

Таблица 2. Масса селезенки (г) экспериментальных животных,

М+/-Ш.

группы/ подгруппы А Б В

грудной возраст/1-я группа 0,023 ± 0,002 0,068 ± 0,006*** 0,104 ±0,009***

преювенильный и молодой возраст/2-я группа 0,310 ±0,052 0,726 ±0,065*** 0,913 ±0,088***

зрелый возраст/3-я группа 0,891 ±0,091 0,754 ± 0,074 0,686 ± 0,070

*** - р<0,001 по сравнению с исходной подгруппой

Динамика относительной массы селезенки показывает, что в грудном возрасте она незначительно увеличивается, после перехода на самостоятельное питание она начинает уменьшаться и после достижения половой зрелости снижается достоверно, продолжая значимо уменьшаться вплоть до конца наблюдаемого периода позднего среднего возраста (таблица 3)

Микроскопическое изучение гистологических срезов селезенки, окрашенных гематоксилин-эозином, в целом подтвердило данные о возрастной динамике микроструктуры органа, полученные другими

исследователями (Т.М.Аверина и М.Ю.Капитонова, 2001; Р.Е1ке1епЬоот а1, 1979; С.О.ОцЫга е! а1., 1983; Р.а Кгоеве а!., 1987; К.Э.Аскегтап е1а!., 1989).

Таблица 3. Относительная масса селезенки (%) экспериментальных животных, М+/-ш.

группы/ подгруппы А Б В

грудной возраст/1-я группа 0,471 ±0,054 0,493 ± 0,045 0,536 ± 0,060

преювенильный и молодой возраст/2-я группа 0,479 ± 0,042 0,371 ±0,037 0,285 ± 0,022***

зрелый возраст/3-я группа 0,236 ±0,021 0,174 ±0,019* 0,133 ± 0,015**

* - р<0 05 по сравнению с исходной подгруппой ** -р<0,01 по сравнению с исходной подгруппой *** -р<0,001 по сравнению с исходной подгруппой

Однако проведенное параллельно иммуногистохимическое исследование с использованием панели антител против маркеров лимфоидных и стромальных клеток позволило нам получить принципиально новые данные о возрастной динамике зональности селезенки крыс, которые значительно расширяют представления о ее онтогенетическом развитии и возрастных особенностях иммунного статуса организма, который в значительной степени определяется состоянием крупнейшего периферического органа иммунной защиты

Так сразу после рождения селезенка представлена красной пульпой -незрелой гемопоэтической тканью с очагами миелопоэза без выраженной зональности Начиная с 2-дневного возраста, вокруг артериол начинают намечаться концентрические лимфоидные скопления - периартериальные лимфоидные влагалища (ПАЛВ), с 9-дневного возраста вокруг них определяется маргинальная зона, которая становится границей между красной и белой пульпой и контур которой по границе с белой пульпой очерчивается маргинальным синусом До 20-го дня белая пульпа, как правило, представлена лишь ПАЛВ, после чего в ней начинают определяться первичные лимфоидные узелки, а у 25-дневных крыс у части узелков появляются центры размножения В последующем возрастная динамика

определяется количественными изменениями, связанными с увеличением доли белой пульпы и маргинальной зоны, дифференцировкой внутренней и наружной зон ПАЛВ, изменением клеточного состава зон селезенки

Иммуногистохимическое исследование показало, что при окрашивании на CD8 - маркер Т-суппрессоров и цитотоксических лимфоцитов - сразу после рождения вокруг артериол отчетливо контурируются скопления иммунореактивных клегок, они достигают диаметра, в 2-3 раза превышающего диаметр артериол, вокруг которых они формируются В этих скоплениях присутствуют единичные С090-иммунореактивные клетки, число которых начинает заметно увеличиваться, начиная с 2-х дневного возраста В пределах этих скоплений лимфоидных клеток определяются немногочисленные OX-62-позитивные клетки, которые

иммуногистохимически идентифицируются как интердигитирующие дендритные клетки (K.W.Tinsley et a 1, 2003) При этом С020+клетки - В-лимфоциты - неупорядоченно распределены по всей паренхиме органа и скоплений не образуют Лишь начиная с 7-го дня, они образуют вокруг формирующихся ПАЛВ бледно окрашенные ободки, которые намечают контуры их маргинальных зон и которые также слабо окрашиваются антителами против CD45RC В 1-ю неделю жизни селезенка практически не окрашивается антителами против белка S100 - маркера фолликулярных дендритных клеток (L.Alos et al., 2005) К концу 2-ой недели в селезенке (у 12-дневных животных) появляются первые скопления белок S-100 иммунореактивных клеток - формирующиеся лимфоидные узелки, - которые образуют очень нежную и рыхлую сеть (Н Hoshi et al., 2001) Петли этой сети начинают заполняться CD20+ иммунореактивными клетками В течение 3-ей недели (у 18-дневных крыс) эта сеть становится плотнее, однако у 19-дневных животных в некоторых узелках в самом центре наблюдается ее разрежение - так формируются вторичные лимфоидные фолликулы Таким образом, проведенное нами иммуногистохимическое исследование селезенки в течение периода грудного вскармливания на качественном уровне

показало, что развитие ее белой пульпы происходит динамичнее, чем это было принято считать на основе классических гистологических исследований, выполненных с применением рутинных методов (А.ХУесгтап, 1975; A:\Veirsbowsky ег а!., 1982).

Количественный автоматический анализ во многом подтвердил результаты качественных наблюдений о диапазоне и направленности возрастных иммуномодуляционных сдвигов в крупнейшем лимфоидном органе - селезенке, дополнив их новыми деталями об их амплитуде и соотношениях этих изменений (рис. 1-7).

Рис.1.Возрастная динамика распределения белок вЮО+клеток в селезенке крыс

грудной возраст

молодой возраст

подгруппа А подгруппа Б подгруппа В

* -р<0,05

** - р<0,01

относительно

предыдущей

подгруппы

средним возраст

ь - р<0,05 | относительно н+ - р<0,01 I предыдущей [ группы

При окрашивании на белок 5100 показано (рис.1), что иммунореактивные клетки практически отсутствуют у крыс 1-го и 11-го дня жизни. Появляясь в возрасте 20 дней, они достоверно увеличивают свою удельную площадь вплоть до 3-х месячного возраста. Далее до 6-месячного возраста удельная

площадь иммунореактивных клеток продолжает незначимо увеличиваться, после чего начинает неуклонно снижаться так, что у стареющих крыс это снижение достигает уровня значимости по сравнению с соответствующей подгруппой группы молодого возраста.

Рис.2 Возрастная динамика распределения СБ20+клеток в селезенке

крыс

30 -

подгруппа А подгруппа Б подгруппа В

грудной возраст

*

молодой возраст

относительно

предыдущей

подгруппы

средний возраст

+ - р<0,05 | относительно 1 предыдущей

+++ - РС0.001 Г

Окрашивание на С020 показало (рис.2), что доля иммунореактивных клеток высоко достоверно возрастает, начиная с 10-дневного возраста. Прирост их удельной площади замедляется, оставаясь достоверным, начиная с молодого возраста. При переходе к среднему возрасту

иммунореактивность остается практически на том же уровне, а у стареющих крыс она начинает снижаться, и к 12-месячному возрасту это снижение достигает уровня значимости. Сравнение возрастной динамики С020+ и белок 5100+ клеток демонстрирует, что последняя несколько опережает первую по связанному со старением снижению иммунореактивности лимфоидных и стромальных клеток соответственно.

Рис.3 Возрастная динамика распределения ОХ62+клеток в селезенке

крыс

+++

+++ т

1

** НЕ-

■ Г

1 +

Г

•к "к "к 1 +++

1 «3 : цэ <£> <У> .

-К -н' +1 ■И -Н -н ■н

Ф СО (О а>

. эт. 1Л «О .". ^.'. " ш .. •ч?

грудной возраст

молодой возраст

|_| подгруппа А

Г , П подгруппа Б П ■ I ■" ■ 1 подгруппа В

** - р<0,01 *** - р<0,001

относительно

предыдущей

подгруппы

средний возраст

+ - р<0,05 "1 относительно I предыдущей

+++ -рО.оЛ

Как следует из рис.3, содержание интердигитирующих дендритных клеток резко повышается, начиная с периода перехода на самостоятельное питание, затем продолжает неуклонно повышаться вплоть до 3-месячного возраста, после чего начинается постепенное снижение, которое у стареющих крыс достигает уровня значимости по сравнению с соответствующей подгруппой группы молодого возраста. При этом возрастное уменьшение доли ОХ-62- иммунореактивных клеток также опережало связанное со старением снижение содержания СЭ8+клеток (рис.4), последнее достоверно снижалось, начиная с 9-месячного возраста, демонстрируя определенный параллелизм с возрастной динамикой С090+клеток - недавних тимусных иммигрантов - в период грудного вскармливания и в среднем возрасте (рис.5).

Рис.4 Возрастная динамика распределения С08+клеток в селезенке

крыс

+++ =5=

=!= I

•н

V 1 ^Л-} ] ■ -г-

.8 ' •. О» ' '

-И +1

ы.

■ ГЧ

-и

грудной возраст

молодой возраст

средний возраст

* -р<0,05 ** - р<0,01

относительно

предыдущей

подгруппы

относительно

предыдущей

группы

подгруппа А подгруппа В подгруппа В

Рис.5 Возрастная динамика распределения С090+клеток в селезенке

крыс

+++ +

+++ гЩ I

■ 1

■к-к

А + + +

т

1

& -к гЧЧ ± •

X

Я: ■. оО\\ ■ Г^'.". (О •-<М . . К

+Г 8 .■.ТТ.'.- о ■н а «0 - - О • ■

со ? "-о +1 Ш «Г- •: Л : во" Ж'.. со,- о 00 со" СЧ ' 5" . • МГ . '. ••(О-. •,

грудной возраст молодой возраст средний возраст

подгруппа А подгруппа Б подгруппа В

относительно ** - р<0 01 I предыдущей

*** - р<0,00г

подгруппы

. - р<0,05 относительно ( предыдущей

+++ -р<0,001

Рис.6 Возрастная динамика распределения каспаза-3+клеток в селезенке крыс

20 18 16 14 12 10 8

4

2 О

* - р<0,05 1 относительно + - р<0,05 "1 относительно ** - р<0 01 I предыдущей ++ . р<0 01 I предыдущей

*** - Р<о!оо1] «дата™« +++ - р<о,оо1] гРуппы

При окрашивании на каспазу-3 (рис.6) отмечена поступательная динамика увеличения числа иммунореактивных клеток в грудном и среднем возрасте, максимальная доля гибнущих апоптозом клеток отмечена у стареющих животных.

При окраске на РСЫА (рис.7) отмечено увеличение доли иммунореактивных клеток вплоть до конца 1-го месяца жизни, когда она достигает максимальных значений, после чего, к моменту наступления половой зрелости, она начинает снижаться, и далее подвергается незначительным колебаниям с тенденцией к уменьшению к концу изучаемого периода.

Нами проведен корреляционный анализ иммуногистохимических параметров селезенки в контексте онтогенетического развития органа. Из наиболее существенных корреляций - наличие достоверной отрицательной

+

■4-

++

* —Ь 1

+

+ + + 1

Л т • '

нь 1

*

г_Н

— -ЯГо •н <7> Я о" ■н ".'Г** •. -. • о" ■. • - -н .' • СТ . . о», о" -н со о о. г-■и »Л • ° • ■ х-нх .'.то.'.' . •. о». ■. со ■Н СП , Т -НИ <п . • .«у. ■. •• -к \ • ■. ■ ю. ■. • ---

«Г .-.от' . о тГ

грудной возраст молодой возраст средний возраст

1 I подгруппа А ["■'"--':' I подгруппа Б I .'■.'■■'■ 1 подгруппа В

корреляционной связи средней силы (г=0,68; р<0,05) между удельной площадью белок БЮО+клеток и каспаза-3+ клеток лимфоидных узелков в среднем возрасте и достоверной сильной положительной корреляционной связи между ОХ-62- иммунореактивными клетками и С090+лимфоцитов в белой пульпе (г=0,73; р<0,05).

Рис.7 Возрастная динамика распределения PCNA+клcтoк в селезенке

крыс

30 25 20 15 10 5 О

I I подгруппа А I'1' - '■'1 нодгоУппа Б 1Т-1-1-1 подгруппа В

Таким образом, проведенное нами исследование с применением панели из 10 антител, позволило составить комплексную иммуногистохимическую характеристику селезенки крыс на разных этапах постнатального онтогенеза (от рождения до позднего среднего возраста) и получить при этом новые данные относительно формирования компартментов органа в раннем постнатальном онтогенезе и закономерностей возрастной инволюции лимфоидной ткани селезенки у стареющих животных.

++

т ++ т

т

-1-

Г1"! \ Т

I

V :'.

■ч- ; . Я , 4 я ■ *» . со Я ¡к а Я

■н ф тГ •. • -СМ ' . ' . ТЛ. • . • . •. -00. •. • гч •н г- гп сч •и 1 ч-х-х \ • •. \ -. • ¡н •. •. •н Й Ф \ .Ю'.'. '.' ■' • . ■ .оо". ■ .

грудной возраст молодой возраст средний возраст

относительно ** - р<0,01 I предыдущей [ подгруппы

относительно ++ - р<0,01 I предыдущей | группы

Полученные нами результаты позволили представить возрастную динамику иммуномодуляционных сдвигов в селезенке и на основании данных иммуногистохимического исследования выделить в ее развитии период качественных эволютивных изменений, соответствующий грудному возрасту, количественных эволютивных изменений, соответствующий молодому возрасту, и количественных инволют ивных изменений, соответствующий среднему возрасту, показать последовательность развития инволютивных изменений в различных компартментах селезенки Т- и В-зонах белой пульпы, а также в маргинальной зоне, и выявить различие их механизмов в разные возрастные периоды, продемонстрировать первичность изменений стромальных клеток по отношению к лимфоидным клеткам в ПАЛВ и лимфоидных узелках белой пульпы, что имеет важное значение для определения мишени и выбора методов иммуномодуляционной терапии при иммунодефицитах, развивающихся в различные возрастные периоды.

Нарушение функции иммунной системы с возрастом или иммунологическое старение вносит значительный вклад в показатели заболеваемости и смертности среди лиц старших возрастных групп (De la Fuente et al., 2004). Как показали многочисленные исследования, больше всего при старении изменяется Т-клеточный компартмент иммунной системы, причем наиболее постоянным сдвигом является резкое уменьшение вплоть до полного исчезнования наивных Т-лимфоцитов и естественных киллеров (С Coleman 2006). Одновременно с возрастом в организме, в частности в селезенке, возрастает доля С08+лимфоцитов памяти (В Vesosky et al., 2006).

С применением окрашивания на различные популяции Т-лимфоцитов (CD90, CD3, CD8) и стромальных клеток Т-зон (интердигитирующие дендритные клетки и CD68 t макрофаги) мы продемонстрировали, что уже в 1-ый день жизни в селезенке присутствует не только красная пульпа, но и белая пульпа в виде четко контурируемых вокруг артериол ПАЛВ Эти наблюдения свидетельствуют о более раннем начале становления Т-

клеточного компартмента в селезенке крыс, чем это было продемонстрировано в классических исследованиях по возрастной иммуноморфологии органа (А.Л.Уеегшап а1., 1975; Р.Е|ке1епЬоош е4 а1., 1979), на которых до настоящего времени основаны представления об иммуноархитектонике селезенки крыс Нами также было продемонстрировано более раннее появление вокруг них маргинальной зоны - крупнейшего В-клеточного компартмента селезенки у крыс, с появлением которого связывают способность вырабатывать иммунный ответ против Т-независимых антигенов II типа определенных инкапсулированных бактерий (С КшвсИник! а!., 2004) и который определялся нами у всех 7-дневных крыс при окрашивании на СЭ20 и СЭ45ЯС, т е раньше, чем это описано у большинства исследователей с применением рутинных методов исследования (С.П О^к^га с1 а1., 1983).

Нами было установлено, что в среднем возрасте наблюдается уменьшение траффика недавних тимусных иммигрантов в селезенку, проявляющееся снижением доли С090+клеток в ее Т-зонах, сопровождающимся параллельным снижением в них СЭ45ЛС+ (наивных Т-лимфоцитов), а также снижением удельной площади С08+клеток, которому также предшествует сокращение доли стромальных клеток ПАЛВ (фенотипа ОХ-62+)

Достаточно много в литературе противоречий относительно времени и механизма появления первичных лимфоидных узелков в белой пульпе селезенки экспериментальных животных В соответствии с классическими представлениями, первичные лимфоидные узелки появляются в селезенке крыс на 20-ый день, а вторичные - на 25-30-ый день жизни (А.С.Уеегтап е! а1., 1975) Другие исследователи показывают, что появление первичных фолликулов происходит на 3-ей неделе (Р Е|ке1епЬоош е! а1., 1979), уже на 14-ый день (РС.Кгоеве е1 а1, 1987), именно тогда, когда в них появляются фолликулярные дендритные клетки, а спонтанное появление в них герминативных центров - к 21-ому дню (А.ХУмгэЬоп'зку et а1., 1982). С

19

применением иммуногистохимических методов исследования мы

продемонстрировали, что появление первичных лимфоидных узелков

р

определяется уже у 12-дневных крыс, а гшинативных центров в них - у 19-дневных животных Таким образом, в противоположность данным других исследователей, определившим, что после 28-го дня изменений в клеточной компартментализации уже не происходит (К.О.Аскегтап е( а1., 1989), нам удалось показать, что качественно компартментапизация завершается уже во время перехода на самостоятельное питание (подсосный период), после чего изменения ее носят количественный характер Полученные нами новые данные о возрастной динамике иммуноархитектоники селезенки у крыс и се механизмах имеют большое практическое значение, так как подавляющее большинство экспериментальных иммунологических исследований по испытанию новых иммуномодуляторов, канцерогенезу, иммунодефицитным состояниям выполнены именно на крысах, в строении селезенки которых отмечается много сходств с селезенкой человека, а имеющиеся различия, связанные со строением маргинальной зоны, соотношения Т- и В-клеточных зон, наличия маргинального синуса и парафолликулярной зоны, хорошо известны и учитываются при экстраполировании результатов экспериментальных исследований (А^ет^ег е! а!., 2001, Р.Когки$иг е1 а!., 2002), которое необходимо производить также с учетом особенностей возрастной иммуноморфологии органа на каждом этапе онтогенетического развития

В своем исследовании мы использовали онтогенетический подход для получения информации о взаимоотношениях стромальных и паренхиматозных клеточных элементов в лимфоидной ткани селезенки экспериментальных животных Результаты проведенных нами иммуногистохимических исследований показали, что как в Т-, так и в В-зонах белой пульпы селезенки изменения стромальных клеточных элементов играют активную роль в возрастной инволюции лимфоидной ткани

Известно, что В-лимфоциты и фолликулярные дендритные клетки -главные иммунокомпетентные клетки в В-зонах - играют важную роль в гуморальном иммунном ответе, в то время как Т-лимфоциты и интердигитирующие клетки, которые являются главными иммунокомпетентными клетками в Т-зонах, играют важную роль в клеточном иммунном ответе (У.1та1 е! а1., 1998) Взаимодействие В-клеюк и интердигитирующих дендритных клеток в Т-зонах также существенно для В-клеточного ответа против Т-зависимого антигена, следовательно, взаимодействие лимфоцитов и дендритных клеток важно для ответа на антигенную стимуляцию и индуцирования появления мощных эффекторных клеток Взаимодействия В- и Т-лимфоцитов с дендритными клетками, а также взаимодействия в системе дендритные клетки - В-лимфоциты - Т-лимфоциты регулируются в предопределенных участках периферических лимфоидных органов сложными и разнообразными механизмами Доказано, что дендритные клетки модулируют свойства лимфоцитов в самых широких аспектах, включая генерацию, дифференцировку, пролиферацию и активацию (в. Кооршап е1 а1., 1997; 2001)

Возрастные изменения в гуморальном иммунном ответе классически связывают с нарушениями Т-хелперного звена, но появляется все больше свидетельств, что с возрастом у человека и других млекопитающих развиваются также дефекты В-клеточного звена (М.УегсЬег е1 а1, 2006). Полученные нами данные показали, что уровень спонтанного апоптоза не только в Т-, но и в В-зонах селезенки неуклонного возрастает, начиная с молодого возраста, и уровень последнего обратно коррелирует с уровнем возрастного уменьшения доли фолликулярных дендритных клеток, которое в свою очередь предшествует снижению удельной площади В-лимфоцитов, отмечающемуся в селезенке лишь у стареющих крыс Тенденция более ранней редукции стромалыюго компонента в ПАЛВ демонстрируется более ранним снижением доли интердигитирующих дендритных клеток, начинающимся у крыс в среднем возрасте и предшествующим уменьшению

числа С08-иммунореактивных клеток, которое отмечалась у стареющих животных, а также достоверно коррелирующим с долей недавних тимусных иммигрантов, характеризующей интенсивность трафика Т-лимфоцитов в Т-зоны периферических лимфоидных органов и также достоверно снижающейся в позднем среднем возрасте, что указывает на активную роль дендритных клеток в процессе иммунологического старения организма Полученные в настоящем исследовании данные согласуются с данными других исследователей (Z.F. Kapasi et al., 1998, J.Stanislawska et al, 2005) об особенностях стромапьно-паренхиматозных отношений в белой пульпе селезенки, дополненных нами подробностями онтогенетической динамики их становления от периода грудного вскармливания до позднего среднего возраста экспериментальных животных

Предпринятые нами попытки установления механизмов возрастной инволюции белой пульпы селезенки показали также, что в изучаемые возрастные периоды снижения уровня спонтанной пролиферации лимфоидных клеток, с которым связывают иммуномодуляционное воздействие некоторых факторов (стресс, лечение иммунодепрессантами, возраст и проч ) не было отмечено в средней возрастной группе ни в Т-, ни в В-зонах По данным иммуногистохимического окрашивания на PCNA, отмечается увеличение доли иммунореактивных клеток от рождения до молодого незрелого возраста, а со 2-го месяца жизни - ее незначительное снижение, не достигающее уровня значимости В противоположность этому, другие исследователи указывают на снижение пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов в периферических иммунных органах с возрастом (A.E.Nel et al., 2002; A.L.Gruver et al., 2007). Это противоречие объясняется тем обстоятельством, что в цитируемых исследованиях результаты основаны на изучении митоген-индуцируемой, а не спонтанной пролиферации лимфоидных клеток, как в наших исследованиях, а также вариациями изучаемых возрастных интервалов у объектов исследования

Старение - это сложный процесс, который негативно влияет на развитие иммунной системы и ее способность функционировать (ЛХ.Сгиуег а1., 2007) Глубокое понимание сложных механизмов, задействованных в ослаблении иммунных функций стареющего организма, поможет исследователям вырабатывать новые методы лечения и создавать новые вакцины, специально направленные на преодоление дефектов в иммунной системе, возникающих при старении

ВЫВОДЫ.

1 Качественные иммуномодуляционные изменения в селезенке белых крыс породы Бр^ие-ОауЛеу завершаются, по данным иммуногистохимического исследования, появлением вторичных лимфоидных узелков на 20-ый дней после рождения, соответствующий концу периода перехода на самостоятельное питание

2 Количественные иммуномодуляционные изменения, характерные для преювенильного, ювенильного и молодого возраста у крыс, проявляются увеличением объема и клеточности белой пульпы последовательно в ее Т-зонах (популяции лимфоидных клеток фенотипа СП90+, С045ЯС+, СОЗ+, СЭ8+, и стромальных клеток фенотипа ОХ-62+ и СЭ68+), маргинальной зоне (популяции лимфоидных клеток фенотипа С020+, СОЗ+, С0451^С и СЭ8+) и В-зонах (популяции лимфоидных клеток фенотипа СЭ20+ и стромальных клеток фенотипа белок 8100+)

3 В среднем возрасте у крыс иммуномодуляционные сдвиги в селезенке носят инволютивный характер, затрагивают последовательно ПАЛВ, лимфоидные фолликулы и маргинальную зону и проявляются гипоплазией и гипоцеллюлярностью белой пульпы

4 Редукция Т-клеточных компартментов в среднем возрасте характеризуется уменьшением удельной площади как лимфоидных, так и стромальных клеток, при этом отмечено более раннее (начиная с 6-месячного

возраста) снижение удельной площади стромальных клеток (фенотипа ОХ-62+) и более позднее (начиная с 9-месячною возраста) - лимфоидных клеток (фенотипа CD90+, CD45RC+, CD8+)

5 Уровень спонтанной пролиферации лимфоидных клеток, по данным иммуногистохимического окрашивания на PCNA, как в Т-, так и в В-зонах селезенки, возрастающий от рождения до преювенильного периода, с момента достижения половой зрелости является относительно стабильным показателем, оказываясь менее чувствительным к иммуномодулирующему действию возраста в стареющем организме экспериментальных животных

6 Основным механизмом гипоцеллюлярности ПАЛВ в среднем возрасте является уменьшение траффика С090+иммунореактивных лимфоцитов клеток в селезенку, сопровождающееся параллельным снижением CD45RC+ (наивных Т-лимфоцитов), а также снижением удельной площади СЭ8+клеток, при этом изменению удельной площади лимфоидных клеток предшествует сокращение доли стромальных клеток (фенотипа ОХ-62+)

7 Ведущим механизмом гипоплазии лимфоидных фолликулов в среднем возрасте является усиление апоптоза лимфоидных клеток, при этом сокращению удельной площади лимфоидных клеток (фенотипа CD20+, CD45RC+) у стареющих крыс предшествует начинающееся в молодом возрасте уменьшение содержания стромальных клеток (фенотипа белок S100+)

Практические рекомендации

1 Для дифференцировки физиологических (возрастных) и патологических иммуномодуляционных сдвигов в периферическом звене иммунной системы наиболее пригодными являются иммуногистохимические реакции на ED1, CD8+, CD90+, белок S100+, CD20+, выявляющие различные популяции лимфоидных и стромальных клеток

2 Показатель удельной площади иммунореактивных лимфоидных клеток в имидж - анализе является наиболее чувствительным и воспроизводимым параметром иммуиомодуляционных сдвигов в селезенке в силу особенностей ее клеточного состава

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Развитие селезенки в раннем постнатальном онтогенезе // Вестник ВолГМУ 2007, №4 (24), с 56-58* (соавторы Капитонова М Ю, Краюшкин А И , Рябикина А И , Нестерова А А )

2 Возрастная гистофизиология белой пульпы селезенки в раннем постнатальном онтогенезе // Успехи современного естествознания, 2008, №1, с 93-94 (соавторы Капитонова М Ю , Краюшкин А И , Демидович И Л , Шараевская М В , Нестерова А А )

3 Иммуногистохимическая характеристика стромальных элементов Т-зон периферических органов иммунной защиты в раннем постнатальном онтогенезе // Успехи современного естествознания, 2008, №1, с 95-96 (соавторы Краюшкина Н Г , Хлебников В В , Чернов Д А , Капитонова М Ю , Нестерова А А)

4 Гистофизиология Т-клеточных компартментов белой пульпы селезенки в возрастном аспекте // Современные наукоёмкие технологии, 2008, №2, с 5152 (соавторы Капитонова М Ю , Краюшкин А И , Шараевская М В , Нестерова А А , Мураева НА)

5 Динамика недавних тимусных иммигрантов в белой пульпе селезенки в различные возрастные периоды постнатального онтогенеза Фундаментальные исследования, 2008, №1, с 96 // (соавторы Краюшкин А И , Рябикина А И , Нестерова А А , Мураева Н А , Шараевская MB).

6 Онтогенетические аспекты стромально-паренхиматозных взаимоотношений в селезенке // Морфология, 2008, Т132, N2, с 58* (соавторы Капитонова М Ю , Нестерова А А , Морозова 3 Ч , Иванаускене Н Ю, Хлебников В В , Шараевская MB)

• - издания, рекомендованные ВАК РФ для опубликования материалов докторских диссертаций

Рябикина Александра Ивановна

ВОЗРАСТНАЯ ИММУНОАРХИТЕКТОНИКА СЕЛЕЗЕНКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

14.00.02 анатомия человека

03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Бумага офсетная №65 гарнитура «Тайме» Тираж 100 экз Заказ №2187

Отпечатано с готового оригинал-макета

в ООО «Бланк» Лиц №3550 400131, г Волгоград ул Скосырева, 2а

Актуальность исследования. Иммунная система отличается очень динамичным развитием как в пренатальном, так и в постнатальном онтогенезе. Несмотря на относительно раннее достижение функциональной зрелости иммунной системой по сравнению с другими системами организма, она достаточно долго остается чрезвычайно чувствительной к действию инфекций и довольно быстро начинает претерпевать возрастную инволюцию, которая отрицательно сказывается на качестве иммунного ответа. Среди иммунных органов тимус первым претерпевает возрастную* инволюцию, которая достаточно подробно описана в литературе как у человека, так и у экспериментальных животных [М.Р.Сапин, и« Б.Ю.Никитюк, 2000; МЛЮ.Капитонова и С.Л.Кузнецов, 2007; A.Shanker, 2004; T.T.Marinova, 2005; X.Zhu et al., 2007]. Возрастная инволюция тимуса резко меняет условия функционирования» периферических лимфоидных органов: селезенки и лимфатических узлов, которые для обеспечения эффективного иммунного ответа вынуждены приспосабливаться к ослаблению функциональной роли вилочковой железы. Это обстоятельство приводит к развитию сложных перестроек морфологии периферических иммунных органов, не нашедших достаточного отражения в литературе. Вместе с тем, четкое понимание гистофизиологических особенностей периферических иммунных органов и, прежде всего, селезенки как крупнейшего из них, позволит разработать методы эффективного контроля иммунного ответа при развитии инфекций, неоплазм, при стрессе или необходимости трансплантаций органов и тканей в каждый конкретный возрастной период, характеризующийся четко ограниченными морфо-функциональными параметрами различных структур лимфоидных органов, до сих пор не достаточно освещенными в литературе, а с применением современных методов количественной иммуногистохимии - практически не изученными [О.В.Федорова, 2005; J.F.Sheridan et al., 1998; I.G. Luzina et al., 2001; A.R.Resendes, et al., 2004; P.M. Dammers et al., 2005; M. Faldyna et al., 2005; T.Karaca et al., 2006].

Селезенка как самый крупный вторичный орган иммуногенеза ответственна за эффективность клеточного и гуморального иммунного ответа, как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Она отличается очень сложной зональностью и высокой специфичностью каждой своей зоны, определяющейся уникальным взаимодействием лимфоидных клеток и клеток стромы, создающих особое микроокружение на территории каждой из зон селезенки и обеспечивающих формирование адекватного иммунного ответа. Недостаток исследований иммуноархитектоники лимфоидных органов затрудняет понимание закономерностей эволюции иммунного ответа в постнатальном онтогенезе [К.А.Гарунова и др., 2004; А.А. Нестерова, 2007; BlSteiniger et al., 2001; P.Korkusuz et al., 2002; T. Tada et al., 2006].

Основным проявлением модулированных возрастом сдвигов в иммунных органах, в частности в селезенке как наиболее ' сложно. компартментализованном, является модификация ее зональности и изменение клеточности каждой из зон, среди причин которой указывают возрастное изменение миграции иммуноцитов, изменение масштабов и скорости гибели и пролиферации лимфоидных клеток, а также нарушение сигнальных взаимодействий между ними. Известно, что значение каждого из перечисленных механизмов иммуномодуляции имеет различное значение в разные возрастные периоды. Однако до последнего времени возрастная иммуномодуляция в лимфоидных органах, включая селезенку, изучалась преимущественно с использованием методов культуры клеток или иммунологических методов, не учитывающих особенностей микроиммуноархитектоники различных зон на территории селезенки. Особую актуальность данная проблема приобретает в связи с совершенствованием технологий трансплантации органов и тканей, что вызывает необходимость модулирования иммунного ответа не только со знаком плюс, но и со знаком минус, поскольку трансплантационный иммунитет может препятствовать приживлению пересаженных органов, что заставляет проводить иммуносупрессивное лечение, выбор которого, включая спленэктомию, необходимо проводить с учетом возрастных иммуномодуляционных изменений в лимфоидных органах, и, прежде всего — в селезенке [Н.А.Мураева, 2006;. T.Fukumoto et al., 2006; H.Stepanova et al., 2007].

С учетом выше сказанного нами была предпринята попытка выяснить характер, выраженность и направленность возрастных иммуномодуляционных изменений в селезенке по данным иммуноцитохимических методов исследования, позволяющих оценить их иммуномикроархитектонику и гистофизиологию.

Целью настоящего исследования является изучение закономерностей возрастной динамики морфо-функциональных особенностей селезенки экспериментальных животных в различные возрастные периоды постнатального онтогенеза.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить структурные и иммуноцитохимические изменения, развивающиеся в селезенке до наступления половой зрелости, в молодом и среднем возрасте.

2. Определить соотношение паренхиматозных и стромальных элементов селезенки в Т- и В-клеточных зонах на разных этапах постнатального онтогенеза.

3. Установить динамику различных популяций лимфоидных клеток селезенки в период развития и возрастной инволюции лимфоидной ткани селезенки.

Материалы и методы исследования.

Объектом исследования послужили 88 белых крыс-самцов породы Sprague Dawley в возрасте от рождения до 1 года, относящиеся к следующим возрастным периодам: препубертатный период, период полового созревания, период молодого и среднего возраста [T.B.Poole, 1987]. Для количественных исследований использовалось 72 животных трех возрастных групп, по 24 особи в каждой: 1-я группа - грудного возраста (подгруппы в возрасте 0,10, 20 дней), 2-я группа - молодого возраста (подгруппы в возрасте 30, 60, 90 дней) и 3-я группа - среднего возраста (подгруппы в возрасте 180, 270, 360 дней), в каждой возрастной подгруппе было по 8 животных. Кроме того, для качественных гистологических исследований использовались находящиеся на грудном вскармливании животные в возрасте 2,4,7,9,12,14,19 дней, а также животные инфантного периода в возрасте 25 дней от роду - по 2 крысы на каждый возраст.

Гистологические срезы селезенки окрашивались рутинными гистологическими методами и иммуногистохимически на маркеры лимфоидных и стромальных клеток, а также маркеры пролиферации и апоптоза. Количественный анализ иммуногистохимически окрашенных срезов с использованием имидж-анализа. Статистическая обработка полученных цифровых данных включала расчет средней арифметической, среднеквадратического отклонения, ошибки репрезентативности, коэффициента корреляции, необходимого числа объектов наблюдения, t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования

Проведенное исследование позволило выявить основные периоды в постнатальном развитии селезенки: период качественных эволютивных изменений (от рождения до конца периода перехода на самостоятельное питание), количественных эволютивных изменений (молодой возраст) и период количественных инволютивных изменений (средний возраст). С применением иммуногистохимических методов исследования была охарактеризована возрастная динамика популяций стромальных (ОХ-62, белок S100, СЭ68-иммунореактивных клеток) и лимфоидных клеток (CD3, CD8, CD20, CD45RC, CD90). С помощью окрашивания на PCNA и каспазу-3 охарактеризованы механизмы развития и инволюции Т- и В-зон селезенки в различные возрастные периоды постнатального онтогенеза.

Научная новизна исследования. Впервые с применением панели иммуногистохимических методов исследования и имидж-анализа определена возрастная перестройка стромально-паренхиматозных взаимоотношений, в различных компартментах селезенки экспериментальных животных (крыс) от рождения до позднего среднего возраста и возрастная-динамика важнейших клеточных популяций в Т- и В-зонах органа.

Теоретическое значение работы заключается в выяснении механизмов иммуномодуляционных изменений в периферическом звене иммунной системы в различные возрастные периода постнатального онтогенеза.

Практическая значимость работы в выделении возрастных периодов наиболее существенных качественных и количественных перестроек в периферической иммунной системе, которые определяют иммунный статус организма и его чувствительность к действию патологических иммуномодулирующих факторов.

Внедрение в практику: полученные научные данные используются в курсах анатомии человека и иммунологии и аллергологии на соответствующих кафедрах ВолГМУ.

Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», о.Пхукет (Тайланд), декабрь 2007 года; заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов, декабрь, 2007; VII научной международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология», Хургада (Египет), февраль 2008 года; V научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайа (Тайланд), февраль 2008' года, а также включены в повестку 8-го Конгресса международной ассоциации морфологов (Бухара, май 2008 года).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммуномодуляционные сдвиги гемопоэтического и стромального генеза в селезенке у крыс имеют различные соотношения в разные возрастные периоды экспериментальных животных.

2. Возрастная динамика клеточных популяций иммуноцитов в различных зонах селезенки у крыс характеризуется различными показателями и механизмами на разных этапах постнатального онтогенеза, соответствующих периоду качественных иммуномодуляционных изменений (период грудного вскармливания), количественных эволютивных изменений (преювенильный, ювенильный и молодой возраст) и количественных инволютивных изменений (средний возраст).

Практические рекомендации

1.Для дифференцировки физиологических (возрастных) и патологических иммуномодуляционных сдвигов в периферическом звене иммунной системы наиболее пригодными являются иммуногистохимические реакции на EDI, CD8+, CD90+, белок S100+, CD20+, выявляющие различные популяции лимфоидных и стромальных клеток.

2.Показатель удельной площади иммунореактивных лимфоидных клеток в имидж - анализе является наиболее чувствительным и воспроизводимым параметром иммуномодуляционных сдвигов в селезенке в силу особенностей ее клеточного состава.

1. Качественные иммуномодуляционные изменения в селезенке белых крыс породы Sprague-Dawley завершаются, по данным иммуногистохимического исследования, появлением вторичных лимфоидных узелков на 20-ый дней после рождения, соответствующий концу периода перехода на самостоятельное питание.2. Количественные иммуномодуляционные изменения, характерные для преювенильного, ювенильного и молодого возраста у крыс, проявляются увеличением объема и клеточности белой пульпы последовательно в ее Т зонах (популяции лимфоидных клеток фенотипа CD90+, CD45RC+, CD3+, CD8+, и стромальных клеток фенотипа ОХ-62+ и CD68+), маргинальной зоне (популяции лимфоидных клеток фенотипа CD20+, CD3+, CD45RC и CD8+) и В-зонах (популяции лимфоидных клеток фенотипа CD20+ и стромальных клеток фенотипа белок S100+).3. В среднем возрасте у крыс иммуномодуляционные сдвиги в селезенке носят инволютивный характер, затрагивают последовательно ПАЛВ, лимфоидные фолликулы и маргинальную зону и проявляются гипоплазией и гипоцеллюлярностью белой пульпы.4. Редукция Т-клеточных компартментов в среднем возрасте характеризуется уменьшением удельной площади как лимфоидных, так и стромальных клеток, при этом отмечено более раннее (начиная с 6-месячного

возраста) снижение удельной площади стромальных клеток (фенотипа ОХ 62+) и более позднее (начиная с 9-месячного возраста) - лимфоидных клеток (фенотипа CD90+, CD45RC+, CD8+).5. Уровень спонтанной пролиферации лимфоидных клеток, по данным иммуногистохимического окрашивания на PCNA, как в Т-, так и в В зонах селезенки, возрастающий от рождения до преювенильного периода, с момента достижения половой зрелости является относительно стабильным показателем, оказываясь менее чувствительным к иммуномодулирующему действию возраста в стареющем организме экспериментальных животных.6. Основным механизмом гипоцеллюлярности ПАЛВ в среднем возрасте является уменьшение траффика СО90+иммунореактивных лимфоцитов клеток в селезенку, сопровождающееся параллельным снижением CD45RC+ (наивных Т-лимфоцитов), а также снижением удельной площади СББ+клеток, при этом изменению удельной площади лимфоидных клеток предшествует сокращение доли стромальных клеток (фенотипа ОХ 62+).7. Ведущим механизмом гипоплазии лимфоидных фолликулов в среднем возрасте является усиление апоптоза лимфоидных клеток; при этом сокращению удельной площади лимфоидных клеток (фенотипа CD20+, CD45RC+) у стареющих крыс предшествует начинающееся в молодом возрасте уменьшение содержания стромальных клеток (фенотипа белок