Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Возможности полимеразной цепной реакции в детекции бледной трепонемы у больных сифилисом

На правах рукописи

РГБ ОД

17 КЮН 2002

Петухова Ирина Ивановна

ВОЗМОЖНОСТИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ДЕТЕКЦИИ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ У БОЛЬНЫХ СИФИЛИСОМ

14.00.11.- кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в отделении сифилидологии Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт

Министерства здравоохранения Российской Федерации » и отделе генотехнологий Центрального научно-исследовательского института трансфузионной медицины и медицинской техники Академии медико-технических наук

Научные руководители:

Доктор медицинских наук О.К.Лосева

Доктор биологических наук, профессор Н.А.Федоров

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор В.В. Дубенский

Кандидат биологических наук М.И. Артемьев

Ведущее научное учреждение: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва

Защита диссертации состоится «М аШАтг года на заседании Диссертационного совета (Д 208.115.01.) Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д.З, корп.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-вснерологический институт Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Автореферат разослан /йЛ^и^Шг002 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.К.Иванова

- '/6 ,о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Несмотря на снижение показателей заболеваемости сифилисом в России за последние три года, эпидемиологическая ситуация остается весьма напряженной. На фоне эпидемии существенно увеличилась регистрация форм заболевания, почти не встречавшихся в предыдущие десятилетия, таких, как врожденный сифилис, ранний нейросифилис (Лосева O.K. и соавт.,1998; Тихонова Л.И. и соавт., 2001). Кроме того, современный этап характеризуется преобладанием скрытых форм и наметившимся учащением случаев поздних форм сифилиса (Шувалова Т.М и соавт., 1998). В связи с этим возрастает роль научных исследований, направленных на совершенствование методов диагностики данного заболевания.

В настоящее время ведущее место в лабораторной диагностике сифилиса занимают серологические методы. Так как ни одна из предложенных серологических реакций не обладает абсолютной чувствительностью и специфичностью, диагностика сифилиса основывается на комплексном использовании скрининговых и подтверждающих тестов (Приказ МЗ РФ № 87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»).

Особенности биологии бледной трепонемы - трудность культивирования, наличие атипичных форм (цист, гранул и L-форм), нахождение возбудителя в труднодоступных для исследования очагах, полимембранных фагосомах, внутриядерное паразитирование, - сужает возможности общепринятых методов диагностики, в связи с чем разработка новых высокочувствительных и высокоспецифичных методов, позволяющих поднять диагностику сифилиса на качественно новый уровень, представляет теоретический и практический интерес (Дмитриев Г.А., 1999; Фриго Н.В., 2001).

Одним из перспективных направлений в современной лабораторной диагностике сифилиса является разработка ДНК-методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР). На сегодняшний день в России и за

рубежом ведутся, но еще далеки от завершения исследования, касающиеся оптимального выбора праймеров, методов экстракции ДНК/РНК, определения сроков сохранности Д1Ж/РНК в клиническом материале, места ПЦР среди других лабораторных тестов, в связи с чем метод в настоящее время имеет только исследовательский статус.

Публикации, касающиеся анализа результатов применения ПЦР в контексте рассматриваемой темы, представляют значительную редкость, носят предварительный и часто противоречивый характер, что аргументировало проведение исследований в данном направлении. Цель исследования:

Оценить возможности метода полимеразной цепной реакции в детекции бледной трспопемы в биологических жидкостях больных сифилисом. Задачи исследования:

1. Определить оптимальные мишени и условия постановки ПЦР для обеспечения надежной детекции ДНК/РНК.

2. Определить оптимальные способы подготовки проб, позволяющие максимально эффективно и в короткое время экстрагировать ДНК и РНК из образцов клинического материала и проводить ПЦР-анализ в условиях клинической лаборатории в течение рабочего дня.

3. Определить возможные сроки сохранности ДНК и РНК Т.раШёиш.

4. Определить чувствительность ПЦР на препаратах очищенной ДНК и лизатах клеток патогенных спирохет, модельных образцах и клиническом материале.

5. Провести сравнительный анализ результатов регламентированных методов диагностики сифилиса и ПЦР-анализа на различных стадиях заболевания.

Научная новизна и практическая значимость исследования:

Впервые применен высокочувствительный вариант ПЦР с использованием обратной транскриптазы (РТ-ПЦР) на 168 рРНК Т.раШёит для исследования клинического материала от больных различными формами

ифилиса (решение о выдаче патента на изобретение «Способ выявления 'геропета раШс!шп у больных сифилисом» по заявке №2000133049.Приоритет 9.12.2000.).

Модифицированы и определены оптимальные методы экстракции ДНК и НК из клинических образцов для проведения анализа.

Полученные данные о сохранности амплифицируемых оследовательностей 16Б рРНК T.paШdum позволяют разработать адекватные ребования к транспортировке и хранению клинического материала.

Установлена более высокая чувствительность метода ПЦР при сследовании соскобов с эрозивных и язвенных сифилидов в сравнении с емнопольной микроскопией, что дает возможность использования ПЦР-нализа в диагностике первичного сифилиса.

Результаты исследования ликвора представляют базу для дальнейших сследований с целью определения места ПЦР в диагностике нейросифилиса.

)сновные положения, выносимые на защиту:

. Разработана высокочувствительная тест-система ПЦР с обратной транскрипцией на 16Э рРНК Т.ра1Нс1ит, позволяющая детектировать 1-0,1 микроорганизма в пробе. . Определена длительная (до 8 недель) сохранность амплифицируемой последовательности 16Б рРНК, что расширяет возможности применения данной методики в научно-исследовательских и диагностических целях. . Показана более высокая чувствительность ПЦР с обратной транскрипцией на 168 рРНК Т.раШсЬт по сравнению с темнополыюй микроскопией при исследовании соскобов с эрозивных и язвенных сифилидов. . Установлена необходимость предварительной подготовки клинического материала, что позволяет снизить влияние ингибиторов с одновременным повышением чувствительности ПЦР.

Апробация работы.

Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• 3 Всероссийской конференции «ПЦР-генодиагностика инфекционных заболеваний», г. Москва, 27-29 января 2000г.

• VIII Всероссийском съезде дерматологов и венерологов, г. Москва, 19-22 июня 2001г.

• Международном конгрессе по ИППП и ВИЧ, г. Берлин, 24-27 июня 2001 г.

• Научно-практической конференции ЦНИКВИ, г. Москва, 22 февраля 2002 г. Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Структура и объем работы.

Работа изложена на 87 стр. компьютерного текста, включает 9 таблиц и 11 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих изложение материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы (28 отечественных и 57 зарубежных источников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы исследования

1.Штаммы и ДНК T.paHidum

В экспериментах использовали взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса в физиологическом растворе, полученных из 7-дневных сифилитических орхитов кроликов. Для определения чувствительности тест-систем создавали модельные образцы путем последовательных 10-кратных разведений взвеси T.paHidum в физиологическом растворе, цельной крови, сыворотке, плазме, лейкоцитарной массе, спинномозговой жидкости. Для оценки специфичности применяли взвесь в физиологическом растворе культуральных бледных трепонем штамма Рейтера.

Для оценки и контроля лимита детекции ПЦР-тест-систем был использован препарат ДНК T.pallidum шт. Nichols с известной концентрацией, равной 1000 геном-эквивалентов в 1 мкл. Препарат ДНК был любезно предоставлен Dr.Sheila A.Lukehart (Медицинский центр университета им.Вашингтона, США). 2. Общая характеристика клинического материала:

В процессе выполнения работы проведено клинико-лабораторное обследование 120 пациентов с различными формами сифилиса, госпитализированных в венерологическое отделение ГКБ №14 для обследования и лечения. Диагноз устанавливался на основании клинических и лабораторных данных в соответствии с МКБ-10.

Все пациенты были подразделены на 2 группы. Клинические образцы (соскобы с эрозивных и язвенных сифилидов, кровь, ликвор) от первой группы исследовали методом ПЦР на 47 кДа антиген T.pallidum , образцы от второй группы пациентов - методом ПЦР на 16S рРНК T.pallidum с обратной транскрипцией (РТ-ПЦР).

Первую группу пациентов составили 36 человек, из них 9 (25%) мужчин и 27 (75%) женщин. В исследуемой группе больных был выявлен: первичный сифилис - у 2 (5,55%), вторичный сифилис - у 24(66,67%), скрытый ранний сифилис - у 8 (22,22%) человек. На лечении по поводу серорезистентиости в сочетании с асимптомным нейросифилисом находилась 1 (2,78%) больная, также 1 пациентка находилась на клинико-серологическом обследовании после перенесенного в 1998 г. асимптомного нейросифилиса.

Вторую группу составили 84 пациента, из них 26 (30,95%) мужчин и 58 (69,04%) женщин. В соответствии с клиническими формами больные распределялись следующим образом: сифилис первичный -3(3,57%), сифилис вторичный -45 (53,57%), скрытый сифилис - 22(26,19%) больных, из них скрытый ранний сифилис -20 (23,81%), скрытый поздний - 1 (1,19%), скрытый неуточненный - 1 (1,19%) больной. Серорезистентность наблюдалась у 11(13,1%)) пациентов. Асимптомный нейросифилис диагностирован у 8 (9,52%) пациентов данной группы, менинговаскулярный сифилис у 2 (2,3 8%) больных.

g

Для контрольной люмбальной пункции через 1 год после лечения по поводу асимптомного менингита была госпитализирована 1 пациентка. На клинико-серологическом обследовании находились 2 пациента.

Также методом РТ-ИЦР исследовано 220 образцов сыворотки крови больных различными формами сифилиса, любезно предоставленных нам ассистентом кафедры дерматовенерологии Астраханской государственной медицинской академии к.м.н. Алтуховым С.А.

Методы исследования

ПЦР на 47 кДа антиген T.pallidum

За основу были взяты условия детекции фрагмента ДНК T.pallidum длиной 208 пар оснований, расположенного в гене мембранного белка иммуногенности 47 кДа, описанные в работе Grabnitz et al.(1992 г.)

Выделение ДНК проводили однопробирочным методом, согласно инструкции к набору реагентов "Ген-Гем-Тест РНК/ДНК экстракция", производимому в Центральном научно-исследовательском институте трансфузионной медицины и медицинской техники АМТН.

Последовательность праймеров: kl - ggcgaa-aag-gtt-ctc-tcg-aa

k2 - ttc-ctc-gct-gtc-aac-cat-ga

РТ-ПЦР lia lôSpPHK T.pallidum

Метод отличается проведением дополнительной стадии обратной транскрипции и последующей амплификацией.

За основу РТ-ПЦР были взяты условия проведения РТ-ПЦР, описанные A.Centurion-Lara et al.(1997 г)

Выделение РНК/ДНК проводили фенол-хлороформным методом. Последовательности праймеров: TPI — ctc-ttt-gga-cgt-agg-tct-ttg-ag

ТР2 - cct-tac-gtg-tta-ccg-cgg-ctg. Проведение реакции амплификации и детекцию возбудителя с помощью горизонтального электрофореза осуществляли согласно стандартным методикам.

ПЦР-исследоиания проводились на базе ЦНИИТММТ АМТН и выполнены лично автором.

Методы темнопольной микроскопии, КСР, РИФ, РИБТ, РГ1ГА проводились по общепринятым методикам.

Результаты собственных исследований и обсуждение

На первом этапе работы проводилось изучение возможностей использования ПНР для детекции Т.раШс1ит у больных сифилисом с использованием тест-системы на 47 кДа антиген Т.раШёит, разработанной в ЦНИИТММТ.

Чувствительность тест-системы по стандартной ДНК Т.раШсклп составила 20-40 геном-эквивалентов в пробе, при исследовании модельных образцов сыворотки, плазмы, лейкоцитарной массы, ликвора предел детекции составил 500 клеток в пробе, что, возможно, обусловлено присутствием "балластной" ДНК клеток человека, ингибиторов реакции, неполным лизисом клеток, потерями ДНК при экстракции.

При апробации тест-системы на клиническом материале исследован 61 клинический образец от 36 больных различными формами заболевания.

При ПЦР-анализе 23 соскобов с эрозивных и язвенных сифилидов в 21 случае получен положительный результат, в 2 - отрицательный.

Совпадение положительных результатов ПЦР и темнопольной микроскопии наблюдали в 19 случаях, совпадение отрицательных результатов -в 1 случае.

Расхождение результатов наблюдали в 3 случаях: 2 образца были отрицательны при темнопольной микроскопии и положительны в ПЦР, 1 образец - положителен при микроскопии и отрицателен в ПЦР. Результаты исследований образцов соскобов методом ПЦР и темнопольной микроскопии представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты ПЦР-аиализа и темнополыюй микроскопии соскобов с эрозивных и язвенных элементов больных различными формами сифилиса.

Результаты темнопольной микроскопии Количество образцов (п = 23)

ПЦР - ПЦР - Всего положительные отрицательные

Положительный 19(82,6%) 1 (4,35%) 20 (86,95%)

Отрицательный 2 (8,7%) 1 (4,35%) 3 (13,05%)

Всего 21 (91,3%) 2 (8,7%) 23 (100%)

Таким образом, результаты ПЦР сравнимы с результатами темнопольной микроскопии. Чувствительность темнопольной микроскопии составила 86,95%, ПЦР-анализа - 91,3%.

Во всех исследуемых 35 образцах крови (анализировались плазма и лейкоцитарная масса) и 3 пробах спинномозговой жидкости получены отрицательные результаты ПЦР, что вероятно связано с недостаточной чувствительностью тест-системы для детекции Т.раШ(1ит в таких биологических жидкостях, как кровь и ликвор.

В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на повышение чувствительности реакции, определение эффективного способа удаления ингибиторов ПЦР и выделения ДНК и РНК.

Для повышения чувствительности мы обратились к мультикопийной матрице, т.е. генам рибосомальных РНК. Так как известно, что в одной бактериальной клетке содержится несколько тысяч рибосомальных 168 РНК частиц, в силу чего чувствительность реакции может быть на несколько порядков выше, то был оправдан переход на ПЦР с обратной транскрипцией на 16Б рРНК (РТ-ПЦР). Нами была сконструирована тест-система, важным отличием которой является стадия обратной транскрипции в пробирке с осадком нуклеиновых кислот без изолированного выделения РНК: полученный осадок растворяется в буфере, содержащем фермент обратную транскриптазу, и инкубируется при 42 °С в течение 30 минут для синтеза кДНК, которая в

этличие от ДНК является стабильной, и нет необходимости использовать дорогостоящий ингибитор РНКазы -RNAsiny

Переход на РТ-ПЦР позволил повысить- чувствительность реакции на 2-3 порядка в сравнении с ПЦР на 47 кДа антиген. На модельных образцах СМЖ и цельной крови чувствительность составила 0,1 T.pallidum в пробе и 1 микроорганизм в пробе соответственно. .

При исследовании методом РТ-ПЦР взвеси культуральных T.pallidum , образцов соскобов со слизистой полости рта, цельной крови здоровых доноров были получены отрицательные результаты. При исследовании модельных образцов крови, спинномозговой жидкости, содержащих известное количество спирохет, амплифицируемый фрагмент по размеру соответствовал фрагменту ДНК T.pallidum .

Проблема ложноотрицательных результатов за счет присутствия в клиническом материале ингибиторов была решена внесением в тест-систему внутреннего стандарта, отличающегося от;'ампликона своими размерами. Истинно отрицательными результатами считались только те, которые содержали сигнал амплификата от внутреннего стандарта.

Выделение ДНК и РНК является достаточно уязвимым этапом в ПЦР-диагностике. В процессе работы мы пришли к выводу о необходимости предварительной подготовки клинического материал для удаления ингибиторов путем центрифугирования при 14000 об/мин в течение 15 мин. Показана высокая эффективность данного приема. (Рисунок 1,2.)

На рисунке 1 представлены электрофореграммы результатов РТ-ПЦР (1-5 треки) и ПЦР на ДНК гена 16S рРНК (6-10 треки) десятикратных разведений взвеси T.pallidum в криоконсерванте (примерные концентрации от 105 до 101 клеток в пробе). Трек 11- отрицательный контроль, трек 12 - положительный контроль. Выделение РНК и ДНК проводили фенол-хлороформным методом без предварительной пробоподготовки. Наблюдается полное ингибирование реакции, за исключением 2 и 6 треков, сигналы внутреннего стандарта и ампликонов отсутствуют.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Рисунок!.

.т

К""'1-

* «

внутренний стандарт

ампликон

На рисунке 2 представлены результаты анализа тех же проб после предварительного центрифугирования при 14000 об/мин в течение 15 мин, суспендирования осадка в физиологическом растворе и последующей пробоподготовки. На данной электрофореграмме не наблюдается ингибирования ни в одной пробе, Т.раШ£1ип1 при РТ-ПЦР определяется во всех разведениях.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Рисунок 2.

( . '"£) „ ) ■ Ь- .«иЛЬ1?-

до ** «

у внутренний стандарт

ампликон

При предподготовке достигается также концентрирование Т.раШ(1ит в небольшом объеме, что крайне важно при низком содержании возбудителя в исследуемом клиническом материале.

Для оценки возможности практического использования тест-системы определяли сроки сохранности амшшфицируемых последовательностей 16Б рРНК при различных условиях хранения. Получены данные о возможной сохранности 16Б рРНК в течение 6-8 недель при -20 °С, +4 °С, а также при комнатной температуре, что позволяет исключить ложноотрицательные

результаты, связанные с транспортировкой и хранением биологического материала. ( Таблица 2).

Таблица 2.

Результаты ПЦР с обратной транскрипцией на 16Б рРНК Т.раШбиш в

цельной крови в процессе хранения при температуре +4С°.

Количество трепонем в пробе Результаты детекции Т.раШскнп в процессе хранения (нед.) 0 1 2 4 6 8

2х103 + + + + + +

2x104 + + + + + +

2x10' + + + + + -

2x102 + + + + - -

2x10' + + + - - -

2x10" + - + - - -

С целью определения диагностических возможностей РТ-ПЦР проведено исследование 374 клинических образцов от больных различными формами сифилиса.

В ходе исследования изучено 50 образцов соскобов с эрозивных и язвенных сифилидов, из них 3 образца от больных первичным сифилисом, 45 -вторичным сифилисом, 2 - скрытым ранним сифилисом. С элементов половых органов и перианальной области получено 25 образцов, с элементов слизистой полости рта также 25 образцов.

До лечения проанализировано 34 образца, в процессе лечения - 16.

При РТ-ПЦР-анализе соскобов до лечения получено 30 (88,2%) положительных результатов, при исследовании методом темнопольной микроскопии Т.раШс1ит обнаружена в 23 (67,6%) случаях. Совпадение положительных результатов РТ-ПЦР и темнопольной микроскопии наблюдали в 23 (67,6%) случаях, совпадение отрицательных результатов - в 4(11,8%). Расхождение отмечалось в 7 (20,6%) случаях - при отрицательных результатах темнопольной микроскопии получены положительные результаты РТ-ПЦР-анализа.

В соскобах (16 образцов) от больных, получавших специфическую терапию (цефтриаксон по 0,5 в/м 1 раз в сутки), при микроскопическом исследовании Т.раШс1ит выявлена в 4 (25%) образцах, положительные результаты при этом наблюдались в образцах, полученных не более чем через 8 часов от начала лечения (Рисунок 3).

Рисунок 3.

Выявляемость Т.раШ(1ит методом темнонольной микроскопии у больных вторичным сифилисом в процессе лечения

№п/п пациента

до лечения

7 • • О •

6 • • о о о

5 • • о о

4 • о о

3 • о

2 • • о

1 • О о о

7 8 9 10 12 13 (количество часов после начала терапии)

С помощью РТ-ПЦР-анализа Т.раШс1ит детектировали в 14 (87,5%) образцах в течение 7-12 часов от начала терапии (Рисунок 4.).

Рисунок 4.

Выявляемость Т.раШбит методом РТ-ПДР с соскобов сифилидов больных вторичным сифилисом в процессе лечения.

№п/п

больного

1 к

7 • о •

6 • • •

5 • • •

4 •

3 • •

2 • •

1 • • •

до

лечения 7 8 9

о

е - положительный результат О - отрицательный результат

О

7 8 9 10 12 13 (количество часов после начала терапии)

Этрицательные результаты темнополыгой микроскопии через 9 и более часов эт начала лечения, вероятно, свидетельствуют о снижении концентрации грепонем в исследуемом очаге ниже предела чувствительности темнопольной микроскопии в результате нарушения их морфологической целостности. Более зысокая и длительная выявляемость спирохет в РТ-ПЦР обусловлена высокой аналитической чувствительностью метода в сравнении с темнопольной микроскопией.

При исследовании 26 образцов СМЖ патологические изменения заблюдали у 11(42,3%) пациентов, из них в 2 случаях диагностирован менинговаскулярный сифилис, в 9 -асимтомный нейросифилис. Методом РТ-ПЦР Т.раПШит обнаружена в 2 (18,2%)пробах больных асимптомным менингитом. В 15(57,7%) случаях ликворологические показатели находились в пределах нормы, из них 3(20%) пробы дали положительный результат в РТ-ПЦР. Таким образом, показано отсутствие корреляции между показателями СМЖ и РТ-ПЦР.

С помощью РТ-ПЦР исследовано 80 образцов цельной крови и 220 эбразцов сыворотки.

Все образцы при первичном и скрытом сифилисе были ПЦР-этрицательны, что и ожидалось, поскольку при первичном сифилисе процесс носит преимущественно локальный характер, а при скрытом число возбудителя в организме заведомо невелико. Наибольшие надежды возлагались на эбнаружение трепонемы при вторичном рецидивном и вторичном свежем сифилисе, в частности, у пациентов с ярко выраженной симптоматикой. Но и в этих случаях, даже при достаточно высокой чувствительности тест-системы, мы не обнаружили возбудителя ни в одном образце. Полученные данные М01уг 5ыть объяснены крайне низким содержанием Т.раШс1ит в периферической крови, которая является для возбудителя сифилиса транспортной средой, а не привычной средой обитания. Возможно, практическую ценность при ПЦР-циагностике могут иметь такие биологические субстраты, как спинномозговая жидкость, тканевые субстраты, лимфа.

Выводы:

1. Применение ПЦР на 16Б рРНК Т.раШёит с обратной транскрипцией позволило повысить аналитическую чувствительность на 2-3 порядка в сравнении с апробированной в рамках данной работы ПЦР-тест-системой на 47 кДа антиген Т.раШёит

2. Разработанная ПЦР-тест-система на 168 рРНК с обратной транскрипцией позволяет детектировать 1-0,1 микроорганизмов в пробе, при этом ПЦР контролируется внутренним стандартом, что гарантирует достоверность отрицательного результата.

3. Получены новые данные о сохранности амплифицируемой последовательности 16Б рРНК Т.раШс1шп в биологических жидкостях (цельная кровь, ликвор) в течение 6-8 недель при комнатной температуре, +4 °С, - 20 °С, что позволяет исключить ошибки, связанные с транспортировкой и хранением клинического материала.

4. Разработанная методика предварительной подготовки образцов позволяет значительно снизить влияние ингибиторов ПЦР, а также обеспечить концентрирование микроорганизмов в малом объеме, что имеет большое значение в условиях низкого содержания возбудителей в клиническом материале.

5. Клиническая апробация тест-системы на 168 рРНК Т.раШёит показала, что ее чувствительность при исследовании соскобов сифилидов в 1,6 раза выше в сравнении с темнопольной микроскопией, что создает предпосылки к практическому использованию метода в качестве дифференциально-диагностического теста при наличии эрозивных и язвенных поражений в случаях отрицательных результатов серологических тестов и темнопольной микроскопии.

6. При исследовании 26 образцов спинномозговой жидкости показано отсутствие корреляции между ликворологическими показателями и результатами ПЦР. На основе полученных данных можно говорить о низком содержании Т.ра1Нс1шп в периферической крови. Возможно, что для

выявления возбудителя сифилиса требуются более совершенные условия постановки и методов пробоподготовки образцов.

!писок работ, опубликованных по теме диссертации:

. Федоров H.A., Лосева O.K., Дмитриев Г.А., Петухова И.И., Елов A.A. Необходимые условия для использования ПЦР - детекции T.pallidum в клиническом материале. // «Актуальные проблемы дерматологии и венерологии». - М., 2000. - С.83.

. Федоров H.A., Елов A.A., Лосева O.K., Петухова И.И., Александрова С.Г., Доля О.В., Дмитриев Г.А., Суханов Ю.С. ПЦР-детекция T.pallidum: калибровка чувствительности, способ подготовки исследуемого материала и опыт клинического применения. //' Тез.докл. III Всеросс. научно-практ. конференции «Генодиагностика в современной медицине». - М., 25-27 января 2000.-С.110.

. Петухова И.И. РНК-диагностика сифилиса и сохранность ПЦР-детектируемых специфических последовательностей 16S рРНК T.pallidum. // VIII Всеросс. съезд дерматовенерологов. Тез. научн.работ. 4.II. - М.,2001. — С. 49.

. Петухова И.И., Федоров H.A., Лосева O.K., Елов A.A., Дмитриев Г.А. Разработка РТ-ПЦР-тест-системы для детекции бледной трепонемы и предварительный опыт ее клинического применения. // VIII Всеросс. съезд дерматовенерологов. Тез. научн.работ. 4.II. - М.,2001. - С.171.

. Pctuhova I., Fedorov N., Loseva O, Yolov A., Dmitriev G. The stability of Treponema pallidum 16S rRNA is a basde for the wide usage of high sensitive RT-PCR in diagnostic, therapeutic and pathogenic investigations of syphilis. // IntJ. STD& AIDS. - 2001,- Vol. 12. - Suppl.2. - P.144.

, Федоров E.H., Петухова И.И., Елов А.А.,Федоров H.A. Минипул-РТ-ПЦР-детекция 16S рРНК Treponema pallidum в биаматериалах. // Вестник службы крови России. - 2001. - № 4. - С.9-10.

7. Федоров E.H., Петухова И.И., Елов A.A., Федоров H.A. РТ-ПЦР тестирование на 16S рРНК Treponema pallidum в серопозитивной на сифилис крови. // Материалы VIII съезда Всеросс. общ. эпидемиологов, микробиол. И паразитологов.- М., 2002. - С. 355-56.

8. Петухова И.И., Дмитриев Г.А., Лосева O.K. Подходы к молекулярной диагностике сифилиса. // ИППП. - 2002. -№ 1. - С.3-8.

9. Решение о выдаче патента на изобретение «Способ выявления Treponema pallidum у больных сифилисом» но заявке № 2000133049. Приоритет 29.12.2000 г. (соавт.: Кубанова A.A., Федоров H.A., Елов A.A., Суханов Ю.С., Лосева O.K., Дмитриев Г.А.)

Условные сокращения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК

РЖ - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная PIIK

РСК - реакция связывания комплемента

РИБТ - реакция иммобилизации бледных трепонем

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РПГА - реакция пассивной гемаггшотинации

ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction) РТ-ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией (reverse transcriptase PCR- RT-PCR) СМЖ -спинномозговая жидкость