Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клиническая оценка современных методов диагностики у больных ранними формами сифилиса (клинико-лабораторное исследование)

На правах рукописи

Дударева Людмила Анатольевна

КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ У БОЛЬНЫХ РАННИМИ ФОРМАМИ СИФИЛИСА (КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14 00 11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03060360

Москва-2007

003060360

Работа выполнена на базе Федерального Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», ГКБ №14 им В Г Короленко Департамента здравоохранения г Москвы и Федерального Государственного Учреждения Науки «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Научный консультант: кандидат биологических наук Официальные оппоненты*

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Наталия Владиславовна Фриш

Александр Евгеньевич Гущин

Ольга Казимировна Лосева Ольга Валентиновна Доля

Ведущее научное учреждение:

Российский Университет Дружбы Народов, г Москва

Защита состоится « 2007г в 12 часов на заседании

Диссертационного совета Д208 115 01 при ФГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росздрава» по адресу 107076, г Москва, ул Короленко дЗ стрб

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росздрава» (г Москва)

Автореферат разослан «_

п » _2007г

Учёный секретарь Диссертационного совета

Кандидат медицинских наук Наталья Константиновна Иванова

Актуальность проблемы

Несмотря на успехи, достигнутые в последние годы отечественной и зарубежной сифилидологией, проблема диагностики ранних форм сифилитической инфекции остается по-прежнему актуальной Это определяется эпидемиологическими особенностями распространения инфекции высокой контагиозностью специфических проявлений на коже и слизистых оболочках больных, опасностью заражения половых партнеров, возможностью развития врожденного сифилиса В связи с несвоевременным установлением диагноза на ранних стадиях инфекции отмечается рост заболеваемости поздними формами сифилиса, нейросифилисом Всё это не может не вызывать обеспокоенности, особенно если учитывать отрицательный прирост населения в Российской Федерации Следует особо отметить патоморфоз сифилитической инфекции, который в последние десятилетия коснулся не только клинических, но и серологических особенностей заболевания Данное обстоятельство вызывает необходимость разработки эффективных методов и алгоритмов диагностики сифилиса на ранних стадиях заболевания с учетом клинико-лабораторных данных (Островский А Г, 2003)

К проблемам диагностики ранних форм сифилитической инфекции на современном этапе относятся недостаточно высокая чувствительность темнопольной микроскопии (ТПМ), трудность дифференциации патогенных трепонем и трепонем-сапрофитов, наличие «серологического окна» при первичном сифичисе, когда классические серологические реакции дают отрицательный результат, ложноположительные и ложноотрицательные результаты серологических реакций при других ранних формах инфекции - вторичном, скрытом раннем сифилисе

Лабораторная диагностика сифилиса осуществляется путем применения прямых и непрямых методов исследования С целью решения вышеуказанных проблем создаются новые методы диагностики При этом среди прямых методов наибольшее развитие получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), а среди серологических методов - иммуноблоттинг (ИБ)

Диагностическая чувствительность ПЦР во многом зависит от клинического материала, взятого для исследования (кровь, спинномозговая жидкость, рейц-серум сифилидов и др) Наибольшая чувствительность достигается при исследовании отделяемого сифилидов ввиду большей концентрации возбудителя в материале дня исследования Специфичность метода во многом обусловлена правильным выбором мишени для амплификации Наиболее специфичными, по данным литературы, являются 47kDa, polA гены ДНК и 16s рибосомальный ген РНК Т pallidum Выявляя в исследуемом материале фрагмент ДНК, характерный только для данного возбудителя, что обеспечивается нуклеотидной

последовательностью праймеров, ПЦР-диагностикумы, в отличие от серологических методов, исключают проблемы, связанные с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность Вместе с тем, метод ПЦР при диагностике сифилиса пока носит исследовательский статус Работы, посвященные сравнительному изучению данного метода в сравнении с другими прямыми методами детекции возбудителя сифилиса, представляют в России значительную редкость (Шахматов ДА 1999, Петухова ИИ, 2002, Стрельченко ОВ, 2002), что не позволяет разработать рекомендации по применению ПЦР при диагностике ранних форм сифилиса

Несмотря на широкое применение прямых методов исследования, на первом месте по частоте использования в диагностике сифилиса продолжают оставаться непрямые (серологические) методы Итоговый результат, получаемый при постановке любой их серологических реакций на сифилис, зависит от содержания в испытуемой сыворотке крови специфических антител к антигенным детерминантам возбудителя сифилиса Вместе с тем не все из применяемых методов исследования являются достаточно чувствительными при диагностике ранних стадий заболевания, что влечет за собой ошибки диагностики и несвоевременное назначение лечения Это вызывает необходимость совершенствования диагностических методов и определения их роли среди общепринятых методов исследования

Одним из перспективных непрямых методов диагностики сифилитической инфекции является метод иммуноблоттинга (ИБ) Метод является одним из вариантов иммуноферментного анализа и заключается в одновременном выявлении антител к рекомбинантным антигенам бледной трепонемы, иммобилизованным на нейлоновых тест-полосках За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью (George R, 1998, Marangom А, 2000, Backhouse J L ,Nesteroff S 1, 2001, Sambn V et al, 2001, Hagedom HJ et al, 2002) При сравнении IgM и IgG диагностикумов большинство зарубежных авторов отдает предпочтение IgG-иммуноблотгингу как более высокочувствитечьному на всех стадиях заболевания сифилисом (Кувшинов MB с соавторами, 2006, Baker-ZanderS А, 1986, Sanchez PJ, 1988, Schmidt BL, 1994) Среди отечественных дерматовенерологов отношение к данному методу диагностики еще не сформировалось Не установлена диагностическая значимость метода иммуноблоттинга у больных ранними формами сифилитической инфекции, не разработаны клинические рекомендации для использования этого метода при первичном, вторичном, скрытом раннем сифилисе, а также у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом

Целью настоящего исследования явилась клиническая оценка значимости использования современных методов диагностики (полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга) у пациентов с ранними формами сифилиса

В задачи исследования входило

1 Изучить особенности клинического течения ранних манифестных форм сифилиса (первичного и вторичного) на современном этапе

2 Провести сравнительное изучение клинической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис)

3 Исследовать эффективность метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса (первичный, вторичный и скрытый ранний сифилис) и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом (ЛБПК)

4 Разработать рекомендации по применению полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга для диагностики ранних форм сифилиса

Научная новизна исследований

Впервые при диагностике ранних форм приобретенного сифилиса на большом клиническом материале показана высокая диагностическая эффективность полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга в сравнении с традиционными методами исследования темнопольной микроскопией (ТПМ) и традиционно применяемыми для диагностики сифилиса серологическими тестами (иммуноблоттинг)

Практическая значимость

Впервые в практике отечественной дерматовенерологии разработаны рекомендации по рациональному использованию методов ПЦР и иммуноблоттинга, позволяющие устанавливать диагноз при ранних формах сифилиса, что будет способствовать своевременному выявлению больных сифилисом и повышению уровня оказания медицинской помощи населению

Отмечены особенности современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса, что будет способствовать уменьшению диагностических ошибок и своевременному выявлению заболевания

Основные положения, выносимые на защиту

1 Клиническое течение ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в настоящее время имеет ряд особенностей в сравнении с данными дерматовенерологов конца XIX - первой половины XX века

2 Метод ПЦР с использованием в качестве мишени гена tpp47 Т pallidum является более чувствительным методом при исследовании райц-серума сифилидов больных первичным и вторичным сифилисом в сравнении с прямым методом - темнопольной микроскопией Специфичность метода ПЦР составляет 100%

3 Метод линейного иммуноблоттинга имеет высокую чувствительность при диагностике ранних форм приобретенного сифилиса, превышающую чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов (кроме РИФабс) при первичном сифилисе и чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов при скрытом раннем сифилисе Специфичность метода составляет 98%

4 Методы ПЦР и иммуноблоттинга могут быть рекомендованы к применению на ранних стадиях сифилитической инфекции (первичный, вторичный, скрытый ранний сифилис, у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом) в качестве дополнительных к регламентированным методам диагностики сифилиса

Аппобапия работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005, IX, XI и XII междисциплинарных симпозиумах «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве и гинекологии наука и практика», Москва, 2004,2006,2007гг Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 168 страницах машинописного текст, включает 5 таблиц и 19 рисунков Указатель литературы содержит 335 источников, из них 143 отечественных и 192 иностранных авторов

Содержание работы

Материалы и методы

1. Этапы выполнения работы, исследованный контингент и материалы В ходе проведения настоящей работы было обследовано 211 пациентов с ранними формами

сифилиса, в том числе 133 мужчины и 78 женщин в возрасте от 15 до 75 (средний возраст 28,9 лет)

На первом этапе исследования проводилось изучение особенностей современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса путем сопоставления частоты изучаемых признаков заболевания с данными литературы прошлых лет В этой же группе больных было проведено сравнительное изучение диагностических возможностей ПЦР по выявлению возбудителя сифилиса - бледной трепонемы - в сравнении с другим прямым методом диагностики - темнопольной микроскопией Клиническим материалом для проведения ПЦР и темнопольной микроскопии служил райц-серум сифилидов, полученный с одних и тех же высыпных элементов для исследования обоими методами

Для выполнения задач первого этапа на базе ГКБ №14 им В Г Короленко и ряда кожно-венерологических диспансеров г Москвы в период с января 2003 по февраль 2006 года был обследован 101 больной первичным и вторичным сифилисом, за исключением пациентов старше 75, моложе 15 лет и лиц с тяжелой сопутствующей соматической патологией, в том числе 28 женщин (27,7%) и 73 мужчины (72,3%) Диагноз первичного сифилиса был установлен у 19 человек (18,8%), в том числе у 14 мужчин и 5 женщин в возрасте от 15 до 52 лет, диагноз вторичного сифилиса - у 82 (81,2%) человек, в том числе у 58 мужчин и 24 женщин в возрасте от 15 до 75 лет Сопутствующая патология (заболевания желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой и дыхательной систем, болезни половой сферы, дерматозы) регистрировалась у 51 человека Сопутствующие, в том числе сочетанные ИППП (гонорея, трихомоноз, урогенитальный хламидиоз, ВИЧ-инфекция, бактериальный вагиноз, негонококковый уретрит) отмечены у 14-и человек Группу контроля составили 118 пациентов с высыпаниями несифилитической этиологии на гениталиях и в полости рта

На втором этапе исследования проводилось изучение диагностических возможностей иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса в сравнении с другими серологическими методами Для этого бьии исследованы сыворотки крови 210 пациентов, обследованных в ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава» в период с ноября 2003 по сентябрь 2005г г Часть из них (110 человек, у которых диагноз сифилиса был установлен на основании данных клинического и лабораторного обследования) составила опытную группу, в которую вошли больные первичным (46 человек), вторичным (25 человек) и скрытым ранним сифилисом (25 человек), а также лица, бывшие в половом контакте с больными заразными формами сифилиса (ЛБПК, 14 человек) Группу контроля (100 человек) составили лица, свободные от сифилитической инфекции 50 больных дерматозами и 50 доноров

В качестве клинического материала на втором этапе исследования были использованы сыворотки крови пациентов, полученные стандартным способом 2 Методы исследования

Прямые методы иселедовапия Для получения сравнительных данных диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии использовались стандартный метод темнопольной микроскопии и метод ПЦР При этом для выявления ДНК Т pallidum методом ПЦР использовался диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» (№ государственной регистрации J1C-000916 от 18 11 2005г) В качестве мишени для амплификации в данной тест-системе применен фрагмент гена поверхностного антигена бледной трепонемы - tpp47 (PCR tpp47), который отсутствует у других видов рода Treponema

В случае несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилось дополнительное тестирование образцов с помощью некоммерческой ПЦР-тест-системы, разработанной ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» с праймерами к lóS-рибосомальному гену микроорганизмов рода Treponema и последующей обратной транскрипцией, позволявшей на основе полученной РНК выявлять ДНК бледной трепонемы (PCR-/6S-DNA) Входящие в состав тест-системы олигонуклеотидные праймеры позволяли амплифицировать фрагмент ДНК не только бледной трепонемы, но и ДНК других видов трепонем В этой связи для видовой идентификации выявленных микроорганизмов определяли нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе выполнения PCR-16S-DNA Для этого был использован метод секвенирования, который осуществляли на секвенаторе Gene Analyzer ABI Pnzm 3100, производства Applied Biosystem с использованием реагентов согласно прилагаемому протоколу Полученные данные анализировались с помощью программного обеспечения BLAST и международной базы данных генетической информации GenBank, что позволяло установить вид микроорганизма

В целях установления причин несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилась также дифференциация сифилитической и герпетической этиологии эрозивно-язвенных высыпаний в области гениталий Для этого образцы райц-серума одновременно исследовались на предмет выявления ДНК вируса простого герпеса I и II типа (ВПГ-1 и ВПГ-2) Данное исследование осуществляли с помощью ПЦР-диагностикума «Амплисенс HSV1/2» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» Серологические исследования Использовались стандартные серологические методы диагностики, регламентированные Приказом № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» от 26 03 2001 года реакция микропреципитации (РМП), реакция

связывания комплемента (PCiC), иммуноферменшыи анализ (ИФА), реакция пассивной гемашп юти нации (РИГА), реакция и ммунофл юоресиениии с абсорбцией (РИФаос) Для постановки указанных реакций применялись зарегистрированные в Российской Федерации диагностлкумы, выпускаемые на Российских и зарубежных предприятиях. Для постановки РИФабс. кроме того, использовался трепонемный антиген, полученный из 7-Суточного орхита кролика (штамм Ииколье).

Метод н м иуно&лштн ига (И Fi) Для проведения исследований была применена зарегистрированная в Российской Федерации коммерческая тест-система «И1 Ü-Ю-Лиа Сифилис усовершенствованный» («INNO - Lia™ Syphilis Score» производства фирмы «¡NNOGENETICS N.V.», Бельгия), Основу тест-системы составляют нейлоновые тест-полоски (стрипы), фиксированные на подложке иЗ нейтрального пластика. На каждый стрип 8 виде дискретных линий нанесены антигенные детерминанты Treponema pallidum: три рекомбинантных белка (TpN47, TpN17 и TpN 15) и один синтетический пептид (ТшрА). Кроме этого, на каждом етрипе имеются четыре контрольные линий: одна аптн-стрептавидиновая - дли оценки корректности (валидности) проведения теста (при правильно проведенном исследований эта полоса не окрашивается) и три калибровочные линии, по интенсивности окрашивания соответствующие 3+, 1+, ± (ein oft"). Калибровочная линия, соответствующая 3+. содержит иммобилизованные антитела против IgG человека и одновременно служит контролем внесения образца биологического материала. Оценка результатов реакции проводится путем сравнения интенсивности окрашивания полос, полученного с образцом испытуемой сыворотки (плазмы) крови с окрашиванием грех калибровочных линий (рисунок !.).

Контроли

3+ 1+±

TpN47

TmpA

TpN17

TpN15

III III

Антигены

Рисунок 1 Расположение антигенов Т.pallidum в иммуноблоттинге (диагностику» INNO-LIA Syphilis Score)

Диагностикум дает возможность учитывать суммарный результат реакции по совокупности данных по всем детерминантам, а также (при необходимости изучить интенсивность иммунного ответа) проводить полуколичественную оценку результатов реакции по каждой антигенной детерминанте в отдельности

Методы статистики Расчет средних значений показателей (М) с определением ошибки (m), среднего квадратического отклонения (с), достоверности различий между показателями (t, р), частоты признаков (р) в выборке с вычислением ошибки (m) и достоверности различий между показателями проводился классическим методом с определением достоверности различий с помощью t-критерия Стьюдента и методом альтернативного варьирования Статистический анализ проведен с помощью коммерческих пакетов программ Excel (Microsoft Office 2000) на персональном компьютере Pentium IV

Результаты исследования 1 Особенности современного клипического течения первичного и вторичного сифилиса При изучении современных особенностей клинического течения ранних форм сифилиса у больных первичным сифилисом было отмечено некоторое преобладание эрозивных твердых шанкров (у 52,6% пациентов) над язвенными Однако, по данным настоящего исследования, эрозивные шанкры встречались значительно реже, чем в конце XIX века (по данным А Фурнье - в 8 случаев из 10 - 80%), что совпало с результатами современных авторов (В H Бугорского, 2003, А В Вислобокова, 2006), отметивших по результатам собственных наблюдений и по литературным данным значительное увеличение частоты регистрации язвенных шанкров у больных первичным сифилисом в течение последних десятилетий XX века (с 25% в 1992г до 66,7% к 2003г ),

У больных первичным сифилисом выявлен значительный процент множественных первичных сифилом (47,4%), что коррелировато с данными авторов второй половины XX -начала XXI века (Антоньев А А,1978 - 39,1%, О Г Калугина, 2003 г - 46,5%) и существенно отличалось от более низких показателей встречаемости множественных твердых шанкров, отмеченных дерматовенерологами конца XIX века (Ге А , 1895 - 13,6%, А Фурнье 1899 - 17,47%,) и дерматовенерологами первой половины XX века (Мещерский Г И, 1936 - 20%, Григорьев П Г, 1938 - 30%) Отмечена также высокая частота регистрации осложненных форм первичного сифилиса (фимоз, парафимоз), - у 31,6% пациентов, соответствующая данным, полученным П M Зориным (1974), О К Шапошниковым (1980) и А В Вислобоковым (2006)

Регионарный лимфаденит был выявлен у всех обследованных (100%), что отличалось от показателей, полученных в исследовании О Г Калугиной, 2003 (отсутствие регионарного лимфаденита у 2 2% пациентов), ПМ Зорина, 1974 (2,8%), ЮК

Скрипкина, 1975 (4,4%), А А Антоньева, 1978 (6,3%) и не позволяет считать отсутствие регионарного склераденита одним из признаков современного течения первичного сифилиса

Вместе с тем, сопутствующий лимфангит не был отмечен ни у одного из обследованных пациентов (0%) Анализ данных литературы показал существенное снижение частоты регистрации данного признака с 30% - 18,6% в конце XIX века (ВавБегеац, 1895, Фурнье А, 1899) до 1,7% в начале XXI века (О Г Калугина, 2003), что позволило расценить его отсутствие у наблюдавшихся нами пациентов как одну из особенностей современного течения первичного сифилиса

В результате проведенных исследований не отмечено каких-либо существенных отличий при сравнении клинических симптомов вторичного сифилиса с данными литературы прошлых лет Вместе с тем, установлено существенное увеличение частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах (47,6%) в сравнении с данными авторов конца XIX века (Ге А, 1895 - 4,5-6%,), 70-х годов XX века (Скрипкин ЮК, 1975 - 22,1%, Антоньев А А, 1978 - 20,7%), что коррелирует с данными, полученными О Г Калугиной (2003), А В Вислобоковым (2006) Отмечено увеличение частоты регистрации пустулезного сифилида (у 3,7% больных) в сравнении с данными авторов 60-70х годов XX века (Рахманов В А, 1967- 2,4%, Абдулаев АХ, 1972 - 0,572,1%, Антоньев А А,1978 - 1,3%) Выявлено значительное уменьшение частоты встречаемости сифилитической алопеции (у 13,4% больных) в сравнении с данными авторов конца XIX (Ок1ау, 1895 - 90%) и отсутствие существенных изменений в частоте встречаемости лейкодермы (3,7% по результатам настоящего исследования, 4% - по данным Фурнье А ,1899, 2,1% - по данным Аковбяна В А ,2002)

Таким образом, проведенные исследования позволили констатировать изменение клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в сравнении с данными дерматовенерологов конца XIX - первой половины XX века, что может быть расценено, как ее патоморфоз 2 Диагностическая значимость полнмеразнон цепной реакции в сравнении с темнополыюй микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис) Для удобства сопоставления результатов исследования клинических образцов, полученных от больных сифилисом, на присутствие бледной трепонемы методами ТПМ и ПЦР все больные были разделены на четыре группы А, В, С, Э (таблица 1 )

Таблица 1 Результаты сравнительного изучения образцов клинического материала больных первичным и вторичным сифилисом методами ТПМ и РСК-фр47

Группы Результаты обнаружения Тpallidum прямыми методами Больные первичным сифилисом Больные вторичным сифилисом Общее количество пациентов

А Обнаружена методами ТПМ и PCR -tpp47 13 42 55

В Обнаружена только методом PCR -tpp47 4 24 28

С Обнаружена только методом ТПМ 2 3 5

D Не обнаружена обоими методами 0 13 13

Общее количество обследованных методами ТПМ и PCR-tpp47 19 82 101

Как следует из представленной таблицы, у 55 пациентов (группа А, больные первичным и вторичным сифилисом) возбудитель сифилиса обнаруживался как с помощью ТПМ, так и методом РСЯ-1рр47 У 13 пациентов (группа Б, больные только вторичным сифилисом) бледная трепонема не обнаруживалась ни методом ТПМ, ни методом РСИ-I'рр47 Таким образом, совпадающие результаты обоих методов прямого выявления бледной трепонемы (ТПМ и ПЦР) были получены у 68 (67%) обследованных пациентов В обеих группах (А и О) результаты трепонемных и нетрепонемных серологических тестов были положительными

У 28 пациентов (больные первичным и вторичным сифилисом, группа В) в райц-серуме сифилидов методом РСЯ-1рр47 обнаруживалась ДНК бледной трепонемы, а темнопольная микроскопия давала отрицательный результат У 5 больных (группа С 2 больных с диагнозом первичного и 3 - вторичного сифилиса) бледная трепонема выявлялась методом темнопольной микроскопии, а ПЦР давала отрицательный результат Таким образом, несовпадение результатов прямого выявления бледной трепонемы методами ТПМ и РСЯ-1рр47 было установлено у 33 пациентов (33%)

Для выяснения причин расхождения результатов между РСЯ-1рр47 и ТПМ и подтверждения обнаружения бледной трепонемы в исследуемом клиническом материале у 33 пациентов (группы В и С) было проведено допопнительное исследование образцов на наличие 165-рибосомального гена трепонем Кроме этого, с целью видовой идентификации микроорганизма был проведен анализ нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов 165-рибосомального гена методом секвенирования Такой анализ в последние годы стал основным в создании современной таксономической

классификации микроорганизмов (Jill Е С, 2004) Полученные данные представлены в таблице 2

Таблица 2 Результаты проведения PCR-16SrDNA и секвенирования ДНК микроорганизмов в клинических образцах больных сифилисом с несовпадающими данными ТПМ и PCR-tpp47

Группа Число образцов PCR-lpp47 PCR-t6SrDNA Секвенирование

В 28 28 Обнаружена Treponema Обнаружена Т pallidum

С 2 0 Обнаружена Treponema Обнаружена Tputidum

С 3 0 Обнаружена Treponema Обнаружена Trefringens

Как следует из приведенных данных, во всех клинических образцах, полученных от 28 больных сифилисом, у которых бледная трепонема не обнаруживалась методом темнопольной микроскопии, но выявлялась ДНК бледной трепонемы методом PCR-tpp47 (группа В,), было подтверждено наличие ДНК микроорганизмов рода Treponema Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК обнаруженного микроорганизма, проведенный методом секвенирования, подтвердил его принадлежность к виду Тpallidum Возможной причиной расхождения результатов исследования образцов рейц-серума сифилидов от этих пациентов методами ТПМ и PCR-tpp47 следует считать более высокую аналитическую чувствительность метода ПЦР, а также влияние на результаты ТПМ приема системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, снижающих эффективность обнаружения бледной трепонемы, наличие сопутствующей инфекции (в особенности герпетической)

Во всех 5-ти образцах пациентов группы С, у которых метод ТПМ давал положительный результат, а результаты ПЦР-исследования оказались отрицательными, методом PCR-16S-rDNA было подтверждено наличие в клиническом материале трепонем Вместе с тем метод секвенирования позволил отнести эти трепонемы к другим видам Tputidum (у 2-х пациентов) и Trefrmgem (у 3-х обследованных), что говорило о возможности ошибок диагностики, допущенных врачами лабораторий при проведении темнопольной микроскопии

Эта группа была представлена двумя пациентами с диагнозом первичного сифилиса и тремя пациентами с диагнозом вторичного сифилиса При этом, если у больных вторичным сифилисом клинические данные подтверждались результатами серологического обследования на сифилис, то у пациентов с первичным сифичисом результаты как трепонемных, так и нетрепонемных серологических тестов были

отрицательными, а диагноз был устаношкн только на основании клинических данных и положительных результатов ТПМ Данные ПЦР и последующего секвенирования выделенных ДНК возбудителя подтвердили наличие в клинических образцах этих пациентов Treponema refrmgens, а не Тpallidum Кроме того, именно у этих двух пациентов из всех обследованных лиц в материале соскобов с высыпаний на коже была обнаружена ДНК вируса простого герпеса 2-го типа Возможно, на фоне клинической картины, характерной для сифилиса, мнение специалиста, проводившего микроскопию, о видовой принадлежности наблюдаемых спирохет склонилось в пользу Тpallidum, в то время как причиной эрозивно-язвенных поражений гениталий являлся ВПГ-2 Полученные результаты позволяют считать, что этим пациентам с эрозивно-язвенными проявлениями, вызванными ВПГ-2 и колонизированными сапрофитными трепонемами, на основе результатов ТПМ диагноз первичного сифилиса был поставлен ошибочно, те имела место гипердиагностика первичного сифилиса методом ТПМ

С учетом результатов исследования окончательная оценка диагностической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции осуществлялась на 99 больных сифилисом При этом чувствительность ПЦР у больных первичным сифилисом составила 100%±0% (чувствительность темнопольной микроскопии

- 76,5±10,6%, р<0,05), при вторичном сифилисе - 80,5±4,4% (темнопольной микроскопии -51,2±5,6%, р<0,001) Общая чувствительность метода ПЦР при диагностике первичного и вторичного и вторичного сифилиса составила 83,8±3,7% (темнопольной микроскопии -55,6±3,0%, р<0,001) Общее количество случаев гипердиагностики методом ТПМ составило 5% (5человек из 101)

Изучение специфичности метода ПЦР при диагностике сифилиса, проведенное на 118 пациентах группы контроля, позволило подтвердить высокую специфичность метода При этом результаты ПЦР оказались отрицательными у 116 пациентов и положительными

- у 2-х женщин, у которых клинический материал был получен из цервик&чьного канала и на момент обследования отсутствовачи клинические проявления сифилиса При динамическом наблюдении за данными пациентками была отмечена позитивация серологических реакций на сифилис и развились клинические признаки сифилиса Возможно, в момент обследования клинические проявления инфекции у этих пациенток локализовались в области шейки матки и не были замечены при обследовании Проведенные исследования позволили расценить специфичность метода ПЦР при обследовании на сифилис, как 100%

Таким образом, проведенное исследование показало, что результаты метода ПЦР при обследовании лиц с подозрением на сифилис позволяют более объективно по сравнению с микроскопическим методом оценивать как наличие, так и отсутствие возбудителя в исследуемом материале, обеспечивая точность поставленного диагноза Широкая оснащенность современных диагностических лабораторий оборудованием для проведения ПЦР-исследований и наличие зарегистрированных коммерческих диагностикумов позволяют ставить вопрос о целесообразности включения данного метода в алгоритм лабораторного обследования лиц с подозрением на первичный и вторичный сифилис В связи с этим следует считать целесообразным применять метод ПЦР при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической)

3 Эффективность метода иммуноблоттиига при диагностике ранних форм сифилиса и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом При обследовании больных первичным сифилисом стандартными серологическими методами наименее чувствительной оказалась РСК с кардиолипиновым антигеном (положительный результат получен в 65±7,6% случаев) (таблица 3 )

Таблица 3 Чувствительность стандартных серотогических методов и иммуноблотгинга на ранних стадиях сифилитической инфекции (М±ш, %)

Группы РМП РСКт РСКк РИФабс РПГА ИФА ИБ

пациентов

Сифилис первичный 88,6±4,9 87,5±5,3 65±7,6 100 97,4±2,6 97,7±2,3 100

(п=46) 39/44 35/40 26/40 40/40 37/38 42/43 46/46

Сифилис вторичный 100 100 100 100 100 100 100

(п=25) 25/25 25/25 25/25 25/25 25/25 25/25 25/25

Сифилис скрытый 92,0±5,5 96,0±4,0 92,0±5,5 96,0±4,0 96,0±4,0 96,0±4,0 100

ранний 23/25 24/25 23/25 24/25 24/25 24/25 25/25

(п=25)

ЛБПК 7±7,1 0 0 0 0 21±11,3 36±13,3

(п=14) 1/14 3/14 5/14

Несколько более чувствительными оказались другие реакции комплекса серологических реакций РСКт (87,5±5,3%) и РМП (88,6±4,9%) Наиболее чувствительными из серологических тестов оказачись трепонемные тесты РИФабс - 100% и ИФА 97,7±2,3 % РПГА давала положительный результат в 97,4±2,6% Чувствитепьность иммуноблотгинга

при первичном сифилисе первоначально была определена, как 97,8 % При этом у 1 пациента с отрицательным результатом ИБ был выявлен факт неправильного хранения материала пред исследованием, что не исключало возможности получения ложноотрицательного ответа При повторном обследовании больного с исследованием новой порции крови был получен положительный результат ИБ, что позволило сделать вывод о 100% чувствительности метода ИБ Положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у ряда пациентов с первичным сифилисом при отрицательных результатах РСКк, РМП или РСКт, а также ИФА и РПГА При этом чувствительность метода иммуноблоттинга достоверно превышала чувствительность РСКк (р<0,001), РМП (р<0,05) и РСКт (р<0,05)

Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных первичным сифилисом, превышающей чувствительность нетрепонемных (РСКк,, РМП) и трепонемных (кроме РИФабс) тестов

У больных вторичным сифилисом результаты всех серологических методов (РСК, РМП, РПГА, РИФабс, ИФА, а также иммуноблоттинга оказались положительными (100% чувствительность), что соответствовало современным представлениям о развитии на вторичной стадии сифилитической инфекции максимального иммунного ответа организма больных к Т pallidum и свидетельствовало о нецелесообразности использовать метод иммуноблоттинга для диагностики этой стадии инфекции, т к при вторичном сифилисе положительный результат регистрируется

При скрытом раннем сифилисе чувствительность РМП и РСКк составила 92,0±5,5%, РСКт -96,0±4,0 % Чувствительность РПГА, РИФабс и ИФА составила 96,0±4,0% При обследовании больных скрытым ранним сифилисом методом иммуноблоттинга положительные результаты были получены у всех пациентов (100% чувствительность) При этом положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у двух больных скрытым ранним сифилисом с разноречивыми данными классических серологических методов (РСКк и РМП - отрицательные, РСКт - положительная в низком титре), когда требовалось проведение дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами стандартных серологических реакций Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных скрытым ранним сифилисом, превышающей чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов

При обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, положительный результат в иммуноблоте был получен у 36 % пациентов (5 человек) Кроме ИБ, положительный результат был выявлен также в РМП (7% - 1 чел) и ИФА (21% - 3

чел), я то прем я как другие реакции (РСКТ РСКк РИФабс и РПГА) оказались отрицательными Таким образом, щмуноблоттянг оказался наиболее чувствительной реакцией, позволяющей устанавливать ннфшшрованность у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом.

При тестировании сывороток крови лиц без указаний на наличие сифилитической инфекции (100) псе 50 сывороток крови от больных кожными заболеваниями И 4& ййвороток крови, взятых от доноров крови, показал« отрицательные результаты. У двух доноров были зарегистрированы положительные результаты имуноблоттинга с невысокими уровнями позитивности реакции с отдельными рекомбииантнЫМи белками (на >ровне 1-2+) Последующее обследование этих пациентов с помощью иммуноблоттинга и других специфических реакций <ИФЛ. РИФабс), проведенное через 2 недели после первого Обследования, позволило установить ложный характер ссропозитавностн. Таким образом, специфичность линейноеЙ иммуноблоттинга при использовании ¡таагностикума «INNO-Lia™ Syphilis Score» составила 98%.

Метод иммуноблоттинга позволяет не только проводить диагностик)' сифилиса по суммарному результату реакции, но и. при необходимости, давать оценку вклада каждого из рекомбинантных белков ли агностикам а и образования к ним антител в формирование общего результата реакции.

4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 О

Примечание: по оси абсцисс - стадии сифилиса; но осп ординат - условные единицы измерения (по системе четырех «крестов»).

Рисунок 2. Средний уровень аЖнтелообразованщ к рекомбинантным белкам Т.раШйит у больных сифилисом.

ЛБПК

Сифилис первичный

Сифилис Сифилис вторичный ранний Скрыт Ь!Й

~TpN47 ■ TpN17 f> TpN15 TmpA

Проведенные исследования показали (рисунок 2), что антитела к отдельным рекомбинантным белкам Treponema pallidum (TpN17, TpN47, TpN15) регистрировались на самых ранних стадиях инфекции, начиная с периода инкубации (лица, контактные по сифилису, получающие превентивное лечение)

У этих пациентов максимальным было антителообразование по отношению к TpN17 (при количественном учете реакции по системе четырех «крестов» - на уровне 1,4 ± 0,01), однако образование антител по отношению к другим рекомбинантным антигенам бледной трепонемы (TpN47, TpN15, ТшрА) было незначительным (к TpN47 - 0,9±0,01, к TpN15 -0,8±0,005, к ТшрА - 0,8±0,06), что не позволило регистрировать положительный результат реакции у всех пациентов При первичном сифилисе отмечалось значительное (но не максимальное - в сравнении с вторичным сифилисом) усиление антителообразования по отношению ко всем используемым в ИБ антигенам (максимально - по отношению к TpN17 2,9±0,01, к TpN47 2,7±0,01, к TpN15 2,2±0,15, минимально - к ТшрА - 1,7±0,03), что сопровождалось возрастанием числа положительных результатов иммуноблотгинга до 100% за счет суммарного учета реакции на все рекомбинантные антигены

В период «разгара» инфекции (вторичный, скрытый ранний сифилис) интенсивность антителообразования являлась максимальной и проявлялась в иммуноблоте по отношению ко всем четырем рекомбинантным антнгенам Treponema pallidum (при вторичном сифилисе -к TpN17 - 3,8±0,003, к TpN47 - 3,7±0,005, к TpN15 - 3,8±0,003, к ТшрА - 3,1±0,005 , при скрытом раннем сифилисе кТрЫ17- 3,8±0,007, к TpN47 - 3,3±0,003, к TpN15 - 3,3±0,007, к ТшрА - 3,3±0,007), что обеспечивало 100% чувствительность реакции

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что метод иммуноблоттинга может быть удобным инструментом для ранней диагностики сифилиса Следует отметить высокую диагностическую эффективность иммуноблоттинга в возможном инкубационном периоде (что выявляется при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом) и при первичном сифилисе, а также в сложных диагностических ситуациях, когда этот метод может выполнять функции референс-метода, что особенно важно в плане возможной замены данным методом таких высокоспецифичных, но требующих наличия вивария и достаточно субъективных методов, как РИФ и, в особенности, РИТ Учитывая изложенное, следует считать целесообразным применение метода иммуноблотгинга на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, при обследовании пациентов с подозрением на первичный сифилис в случае отрицательных результатов стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом, для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости

проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис Вывозы

1 В результате проведенных исследований установлены особенности современного клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции в сравнении с данными дерматовенерологов конца XIX - первой половины XX века, которые заключаются в значительной частоте регистрации язвенных, множественных и осложненных твердых шанкров и отсутствии специфического лимфангита у больных первичным сифилисом и в увеличении частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах, значительной частоте регистрации пустулезных сифилидов, уменьшении частоты встречаемости специфической алопеции у больных вторичным сифитисом

2 В результате сравнительного изучения диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии при исследовании райц-серума сифилидов больных первичным и вторичным сифилисом установлена более высокая чувствительность метода ПЦР с использованием в качестве мишени гена tpp47 Т pallidum (диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum») при первичном сифилисе чувствительность ПЦР составила 100%, ТПМ - 76,5%, р<0,05, при вторичном сифилисе чувствительность ПЦР составила 80,5%, ТПМ -51,2%, р<0,001) Специфичность ПЦР составила 100%

3 При обследовании больных ранними формами сифилиса методом иммуноблоттинга и стандартными серологическими методами (РМП, РСК, ИФА, РПГА, РИФабс) выявлена высокая чувствительность линейного иммуноблоттинга (диагностикум «INNO-Lia™ Syphilis Score») при диагностике первичного (чувствительность 100%), вторичного (чувствительность 100%), скрытого раннего (чувствительность 100%) сифилиса, обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом (чувствительность - 36%), превышавшая чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов (кроме РИФабс) при первичном сифилисе и чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов при скрытом раннем сифилисе Специфичность метода составила 98%

4 Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать применение ПЦР и иммуноблоттинга на ранних стадиях сифилитической инфекции в качестве дополнения к общепринятым методам диагностики в следующих клинических ситуациях

Метод ПЦР - при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической) Метод имщ'нобюттинга - на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, при обследовании пациентов с подозрением на

первичный сифилис при отрицательных результатах стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом, для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис

Список работ, опубликовапиых по теме диссертации

1 Гущин А Е Выявление ДНК и РНК Тр pallidum в плазме крови при различных стадиях сифилиса / Гущин А Е, Родионова Е H, Шипулин Г А, Топоровский J1M , Николенко Ю А , Дударева J1 А // Вестник последипломного медицинского образования - 2003 - №2 - С 53

2 Родионова ЕН Выявление ДНК и РНК Тр pallidum в клиническом материале у пациентов с различными стадиями сифилиса / Родионова Е H, Гущин А Е, Шипулин Г А , Хлудова H А , Топоровский JI M , Николенко Ю А , Тома В С , Дударева Л А, Покровский В В // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2003 -№3 - С 43-50

3 Гущин А Е Сифилис проблемы диагностики и возможности молекулярно-биологических технологий / Гущин А Е, Родионова Е H , Шипулин Г А , Кубанова А А , Фриго H В, Лосева О К, Ротанов С В , Топоровский Л M, Дударева Л А , Воронова H Ю, Петрова Г А , Зорькина MB// Сборник трудов 5 Всероссийской Научно-практической Конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» Москва, 2004 -Т1 -С 24-27

4 Гущин А Е Возможности и перспективы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике ранних форм сифилиса / Гущин А Е, Баткаев Э А, Топоровский Л M, Чухриенко И Ю , Дударева Л А // Вестник последипломного медицинского образования -2005 -№1 -С 65

5 Дударева Л А Исследование эффективности метода иммуноблотгинга (тест-система линейного иммуноферментного анализа «Inno- Lia™ Syphilis Score») y больных первичным сифилисом и в период возможного инкубационного периода / Дударева Л А // Сборник «Частные вопросы дерматовенерологии» (материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием) Саратов изд-во Саратовского мед ун-та, 2006 - С 126-127

6 Кубанова А А Опыт использования метода иммуноблоттинга для диагностики сифилиса / Кубанова А А , Фриго H В , Ротанов С В, Нестеренко В Г , Ловенецкий А H , Дударева Л А // Вестник дерматологии и венерологии - 2006 -№2 - С 4-11

7 Фриго H В Результаты изучения диагностической эффективности новой тест-системы линейного иммуноферментного анализа «Inno- Lia™ Syphilis Score» / Фриго H В , Ротанов С В , Нестеренко В Г , Ловенецкий А H , Дударева Л А // Клиническая лабораторная диагностика -2006 -№3 -С 36-41

8 Фриго Н В Диагностическая эффективность иммуноблотгинга при обследовании больных первичным сифилисом и лиц, находящихся в возможном инкубационном периоде / Фриго Н В , Ротанов С В, Дударева J1 А, Иванов AM// Сборник тезисов «Первичная и вторичная профилактика социально-значимых заболеваний кожи и ИППП на современном этапе» III Международная конференция, Алматы, 2006 - С 218-220

Формат 60x84 1/16, Уел Печ Лист 1,5 Подписано в печать 14 05 07 г Тираж 100 экз Заказ № 1605 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www allapnnt ru

Актуальность. Несмотря на успехи, достигнутые в последние годы отечественной и зарубежной сифилидологией, проблема диагностики ранних форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного, раннего скрытого сифилиса) остается по-прежнему актуальной. Это определяется эпидемиологическими особенностями распространения инфекции при ранних формах сифилиса: высокой контагиозностью специфических проявлений на коже и слизистых оболочках больных, опасностью заражения половых партнеров, возможностью развития врожденного сифилиса. В связи с несвоевременным установлением диагноза на ранних стадиях инфекции отмечается рост заболеваемости поздними формами сифилиса, нейросифилисом. Следует отметить патоморфоз сифилитической инфекции, который в последние десятилетия коснулся не только клинических, но и серологических особенностей заболевания. Данное обстоятельство вызывает необходимость разработки эффективных алгоритмов диагностики сифилиса на ранних стадиях заболевания с учетом клинико-лабораторных данных (Островский А.Г., 2003).

К проблемам диагностики ранних форм сифилитической инфекции на современном этапе относятся: недостаточно высокая чувствительность темнопольной микроскопии (ТПМ), трудность дифференциации патогенных трепонем и трепонем-сапрофитов; наличие «серологического окна» при первичном сифилисе, когда классические серологические реакции дают отрицательный результат, ложно пол ожител ьн ы е и ложноотрицательные результаты серологических реакций на сифилис.

С целью решения вышеуказанных проблем создаются новые методы диагностики. При этом среди прямых методов наибольшее развитие получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), а среди серологических методов -иммуноблотгинг (ИБ).

Диагностическая чувствительность ПЦР во многом зависит от клинического материала, взятого для исследования (кровь, спинномозговая жидкость, рейц-серум сифилидов и др.)- Наибольшая чувствительность достигается при исследовании отделяемого сифилидов ввиду большей концентрации возбудителя в материале для исследования. Специфичность метода во многом обусловлена правильным выбором мишени для амплификации. Наиболее специфичными, по данным литературы, являются 47kDa, polA и 16s рибосо мальный ген РНК гены ДНК T.pallidum. Выявляя в исследуемом материале фрагмент ДНК, характерный только для данного возбудителя, что обеспечивается нуклеотидной последовательностью праймеров, ПЦР-диагноста кумы, в отличие от иммунологических методов, исключают проблемы, связанные с перекрестно-реагирующими антителами тем самым обеспечивая абсолютную специфичность. Вместе с тем, метод ПЦР при диагностике сифилиса пока носит исследовательский статус. Работы, посвященные сравнительному изучению данного метода в сравнении с другими прямыми методами детекции возбудителя сифилиса, представляют в России значительную редкость (Шахматов Д.А. 1999; Петухова И.И., 2002; Стрельченко О.В., 2002), что не позволяет разработать рекомендации по применению ПЦР при диагностике ранних форм сифилиса.

Несмотря на широкое применение прямых методов исследования, на первом месте по частоте использования в диагностике сифилиса продолжают оставаться непрямые (серологические) методы. Итоговый результат, получаемый при постановке любой их серологических реакций на сифилис, зависит от содержания в испытуемой сыворотке крови специфических антител к этим антигенным детерминантам возбудителя сифилиса. Вместе с тем, не все из применяемых методов исследования являются адекватными при диагностике ранних стадий заболевания, что влечет за собой ошибки диагностики и несвоевременное назначение лечения. Это вызывает необходимость совершенствования диагностических методов и определения их роли среди общепринятых методов исследования.

Одним из перспективных непрямых методов диагностики сифилитической инфекции является метод иммуноблотганга (ИБ). Метод является одним из вариантов иммуноферментного анализа и заключается в одновременном выявлении антител к рекомбинантным антигенам бледной трепонемы, иммобилизованным на нейлоновых тест-полосках. За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью (George R., 1998; Marangoni А., 2000, Backhouse J.L.,Nesteroff S.I., 2001; Sambri V. et al., 2001; Hagedorn HJ. et al., 2002). При сравнении IgM и IgG диагностикумов большинство зарубежных авторов отдает предпочтение IgG-иммуноблоттингу как более высокочувствительному на всех стадиях заболевания сифилисом (Кувшинов М.В. с соавторами, 2006; Baker-Zander S.A., 1986; Sanchez Р.J., 1988; Schmidt B.L., 1994). Среди отечественных дерматовенерологов отношение к данному методу диагностики еще не сформировалось. Не установлена диагностическая значимость метода иммуноблотганга у больных ранними формами сифилитической инфекции, не разработаны клинические рекомендации для использования этого метода при первичном, вторичном, скрытом раннем сифилисе, а также у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом.

Целью настоящего исследования явилась клиническая оценка значимости использования современных методов диагностики (полимеразной цепной реакции и иммуноблотганга) у пациентов с ранними формами сифилиса.

В задачи исследования входило: 1. Изучить особенности клинического течения ранних манифестных форм сифилиса (первичного и вторичного) на современном этапе.

2. Провести сравнительное изучение диагностической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис).

3. Исследовать эффективность метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса (первичный, вторичный и скрытый ранний сифилис) и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом (ЛБПК).

4. Разработать рекомендации по применению полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга для диагностики ранних форм сифилиса.

Научная новизна исследований:

Впервые на большом клиническом материале показана высокая диагностическая эффективность полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга в сравнении с общепринятыми методами исследования: темнопольной микроскопией (ПЦР) и регламентированными для диагностики сифилиса серологическими тестами (иммуноблотгинг) при диагностике ранних форм приобретенного сифилиса. Практическая значимость:

Впервые в практике отечественной дерматовенерологии разработаны рекомендации по рациональному использованию методов ПЦР и иммуноблоттинга, позволяющие устанавливать диагноз при ранних формах сифилиса, что будет способствовать своевременному выявлению больных сифилисом в сложных клинических ситуациях и повышению уровня оказания медицинской помощи населению.

Отмечены особенности современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса, что будет способствовать уменьшению диагностических ошибок и своевременному выявлению заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Клиническое течение ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в настоящее время имеет ряд особенностей в сравнении с данными дерматовенерологов конца XIX - первой половины XX века.

2. Метод ПЦР с использованием в качестве мишени гена tpp47 T.pallidum является более чувствительным методом при исследовании райц-серума сифилидов больных первичным и вторичным сифилисом в сравнении с прямым методом - темнопольной микроскопией. Специфичность метода ПЦР составляет 100%.

3. Метод линейного иммуноблоттинга имеет высокую чувствительность при диагностике ранних форм приобретенного сифилиса, превышающую чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов (кроме РИФабс) при первичном сифилисе и чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов при скрытом раннем сифилисе. Специфичность метода составляет 98%.

4. Методы ПЦР и иммуноблоттинга могут быть рекомендованы к применению на ранних стадиях сифилитической инфекции (первичный, вторичный, скрытый ранний сифилис, у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом) в качестве дополнительных к регламентированным методам диагностики сифилиса.

Апробация работы:

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005; IX, XI и XII междисциплинарных симпозиумах «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве и гинекологии: наука и практика», Москва, 2004,2006,2007гг. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц и 19 рисунков. Указатель литературы содержит 335 источников, из них 143 отечественных и 192 иностранных авторов.

Выводы:

1 .В результате проведенных исследований установлены особенности современного клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции в сравнении с данными дерматовенерологов конца XIX - первой половины XX века, которые заключаются в значительной частоте регистрации язвенных, множественных и осложненных твердых шанкров и отсутствии специфического лимфангита у больных первичным сифилисом и в увеличении частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах, значительной частоте регистрации пустулезных сифилидов, уменьшении частоты встречаемости специфической алопеции у больных вторичным сифилисом.

2. В результате сравнительного изучения диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии при исследовании райц-серума сифилидов больных первичным и вторичным сифилисом установлена более высокая чувствительность метода ПЦР с использованием в качестве мишени гена tpp47 T.pallidum (диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum»): при первичном сифилисе чувствительность ПЦР составила 100%, ТПМ - 76,5%, р<0,05; при вторичном сифилисе чувствительность ПЦР составила 80,5%, ТПМ - 51,2% , р<0,001). Специфичность ПЦР составила 100%.

З.При обследовании больных ранними формами сифилиса методом иммуноблоттинга и стандартными серологическими методами (РМП, РСК, ИФА, РПГА, РИФабс) выявлена высокая чувствительность линейного npw иммуноблоттинга (диагностикум «INNO-Lia Syphilis Score») при диагностике первичного (чувствительность 100%), вторичного (чувствительность 100%), скрытого раннего (чувствительность 100%) сифилиса, обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом (чувствительность — 36%), превышавшая чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов (кроме РИФабс) при первичном сифилисе и чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов при скрытом раннем сифилисе. Специфичность метода составила 98%.

4.Результаты проведенных исследовании позволяют рекомендовать применение ПЦР и иммуноблоттинга на ранних стадиях сифилитической инфекции в качестве дополнения к общепринятым методам диагностики в следующих клинических ситуациях:

Метод ПЦР - при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической).

Метод иммуноблоттинга - на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом; при обследовании пациентов с подозрением на первичный сифилис при отрицательных результатах стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом; для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис.

134

Заключение

Заболеваемость сифилитической инфекцией в Российской Федерации остается напряженной. В особенности опасным для населения страны в целом является высокий уровень заболеваемости ранними формами инфекции, имеющими большую медико-социальную значимость. Это обусловливает необходимость изучения особенностей клинического течения ранних форм сифилиса в современных условиях, необходимость поиска путей и методов раннего выявления сифилиса путем разработки и внедрения в практику новых, высокочувствительных и специфичных методов диагностики.

К числу таких методов исследования относятся полимеразная цепная реакция и иммуноблотгинг, имеющие в России пока исследовательский статус.

Целью настоящего исследования явилась клиническая оценка значимости использования современных методов диагностики (полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга) у пациентов с ранними формами сифилиса.

В задачи исследования входило:

1. Изучить особенности клинического течения ранних манифестных форм сифилиса (первичного и вторичного) на современном этапе.

2. Провести сравнительное изучение клинической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис).

3. Исследовать эффективность метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса (первичный, вторичный и скрытый ранний сифилис) и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом (ЛБГТК).

4. Разработать рекомендации по применению полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга для диагностики ранних форм сифилиса.

В ходе проведения настоящей работы было обследовано 211 пациентов с ранними формами сифилиса, в том числе 133 мужчины и 78 женщин в возрасте от 15 до 75 (средний возраст 28,9 лет).

На первом этапе исследования проводилось изучение особенностей современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса путем сопоставления частоты изучаемых признаков заболевания с данными литературы прошлых лет. В этой же группе больных было проведено сравнительное изучение диагностических возможностей ПЦР по выявлению возбудителя сифилиса - бледной трепонемы - в сравнении с другим прямым методом диагностики - темнопольной микроскопией. Клиническим материалом для проведения ПЦР и темнопольной микроскопии служил райц-серум сифилидов, полученный с одних и тех же высыпных элементов для исследования обоими методами.

Для выполнения задач первого этапа на базе ПСБ №14 им. В.Г. Короленко и ряда кожно-венерологических диспансеров г. Москвы в период с января 2003 по февраль 2006 года был обследован 101 больной первичным и вторичным сифилисом. Диагноз первичного сифилиса был установлен у 19 человек (18,8%), в том числе у 14 мужчин и 5 женщин в возрасте от 15 до 52 лет; диагноз вторичного сифилиса - у 82 (81,2%) человек, в том числе у 58 мужчин и 24 женщин в возрасте от 15 до 75 лет. Группу контроля составили 118 пациентов с высыпаниями несифилитической этиологии на гениталиях и в полости рта.

На втором этапе исследования проводилось изучение диагностических возможностей иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса в сравнении с другими серологическими методами. Для этого были исследованы сыворотки крови 210 пациентов, обследованных в ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава» в период с ноября. 2003 по сентябрь 2005г.г. Часть из них (110 человек), составила опытную группу, в которую вошли больные первичным (46 человек), вторичным (25 человек) и скрытым ранним сифилисом (25 человек), а также лица, бывшие в половом контакте с больными заразными формами сифилиса (ЛБПК, 14 человек). Группу контроля (100 человек) составили лица, свободные от сифилитической инфекции: 50 больных дерматозами и 50 доноров.

В качестве клинического материала на втором этапе исследования были использованы сыворотки крови пациентов, полученные стандартным способом.

Для получения сравнительных данных диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии использовались: стандартный метод темнопольной микроскопии и метод ПЦР. При этом для выявления ДНК Т. pallidum методом ПЦР использовался диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» (№ государственной регистрации JIC-000916 от 18.11.2005г.). В качестве мишени для амплификации в данной тест-системе применен фрагмент гена поверхностного антигена бледной трепонемы - tpp47 (PCR tpp47), который отсутствует у других видов рода Treponema.

В случае несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилось дополнительное тестирование образцов с помощью некоммерческой ПЦР-тест-системы, разработанной ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» с прайм ерами к 168-рибосомальному гену микроорганизмов рода Treponema и последующей обратной транскрипцией, позволявшей на основе полученной РНК выявлять ДНК бледной трепонемы (PCR-16S-DNA). Входящие в состав тест-системы олигонуклеотидные праймеры позволяли амплифицировать фрагмент ДНК не только бледной трепонемы, но и ДНК других видов трепонем. Для этого был использован метод секвенирования. Полученные данные анализировались с помощью программного обеспечения BLAST и международной базы данных генетической информации GenBank, что позволяло установить вид микроорганизма.

В целях установления причин несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилась также дифференциация сифилитической и герпетической этиологии эрозивно-язвенных высыпаний в области гениталий. Для этого образцы райц-серума одновременно исследовались на предмет выявления ДНК вируса простого герпеса I и II типа (ВПГ-1 и ВПГ-2).

При верификации диагноза серологическими методами использовались методы диагностики, регламентированные Приказом № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» от 26.03.2001 года: реакция микропреципитации (РМП), реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией (РИФабс). Для постановки указанных реакций применялись зарегистрированные в Российской Федерации диагностикумы, выпускаемые на Российских и зарубежных предприятиях. Для постановки РИФабс, кроме того, использовался трепонемный антиген, полученный из 7-суточного орхита кролика (штамм Ни колье).

Для клинической оценки значимости использования иммуноблоттинга у пациентов с ранними формами сифилиса.была применена зарегистрированная в Российской Федерации коммерческая тест-система «ИННО-Лиа Сифилис усовершенствованный» («INNO - Lia™ Syphilis Score» производства фирмы «INNOGENETICS N.V.», Бельгия). Диагностикум дает возможность учитывать суммарный результат реакции по совокупности данных по всем детерминантам, а также (при необходимости изучить интенсивность иммунного ответа) проводить полуколичественную оценку результатов реакции по каждой антигенной детерминанте в отдельности.

Расчет средних значений показателей (М) с определением ошибки (т), среднего квадратического отклонения (ст), достоверности различий между показателями (t; р), частоты признаков (р) в выборке с вычислением ошибки (т) и достоверности различий между показателями проводился классическим методом с определением достоверности различий с помощью t-критерия Стъюдента и методом альтернативного варьирования. Статистический анализ проведен с помощью коммерческих пакетов программ Excel (Microsoft Office 2000) на персональном компьютере Pentium IV.

При изучении клинической картины у больных первичным и вторичным сифилисом были выявлены некоторые особенности, в частности, склонность к осложненному течению сифилитической инфекции, что коррелировало с негативными социально-эпидемиологическими тенденциями, имеющими место в настоящее время (ухудшение питания, социально-бытовых условий проживания большой части населения России.).

Несмотря на установленное при обследовании пациентов с первичным сифилисом преобладание эрозивных твердых шанкров (у 52,6% пациентов) над язвенными., эрозивные шанкры встречались значительно реже, чем в конце XIX века (по данным А.Фурнье - в 8 случаев из 10 - 80%), что совпало с результатами современных авторов (В.Н.Бугорского, 2003; А.В. Вислобокова, 2006), отметивших по результатам собственных наблюдений и по литературным данным значительное увеличение частоты регистрации язвенных шанкров у больных первичным сифилисом в течение последних десятилетий XX века (с 25% в 1992г. до 66,7% к 2003г.),

У больных первичным сифилисом выявлен значительный процент множественных первичных сифилом (47,4%), что коррелировало с данными авторов второй половины XX - начала XXI века (Антоньев А.А.,1978 - 39,1%; О.Г.Калугина, 2003 г. - 46,5%) и существенно отличалось от более низких показателей встречаемости множественных твердых шанкров, отмеченных дерматовенерологами конца XIX века (Ге А., 1895 - 13,6%; А.Фурнье 1899 -17,47%;) и дерматовенерологами первой половины XX века (Мещерский Г.И.Д936 - 20%; Григорьев П.Г.,1938 - 30%). Отмечена также высокая частота регистрации осложненных форм первичного сифилиса (фимоз, парафимоз), -у 31,6% пациентов, соответствующая данным, полученным П.М. Зориным (1974), О.К Шапошниковым (1980) и А.В Вислобоковым. (2006).

Регионарный лимфаденит был выявлен нами у всех обследованных (100%), что несколько отличалось от показателей, полученных в исследовании О.Г.Калугиной, 2003, отметившей отсутствие регионарного лимфаденита у 2.,2% пациентов, а также от данных П.М. Зорина, 1974, Ю.К. Скрипкина, 1975, А.А. Антон ьева, 1978, которые регистрировали отсутствие регионарного лимфаденита у 2,8% - 6,3% больных первичным сифилисом. Полученные нами данные не позволяют считать отсутствие регионарного склераденита одним из существенных признаков современного течения первичного сифилиса.

Вместе с тем, сопутствующий лимфангит не был отмечен ни у одного из обследованных пациентов (0%). Анализ данных литературы показал существенное снижение частоты регистрации данного признака: с 30% -18,6% в конце XIX века (Bassereau, 1895; Фурнье А., 1899) до 1,7% в начале XXI века (О.Г.Калугина, 2003), что позволило расценить его отсутствие у наблюдавшихся нами пациентов как одну из особенностей современного течения первичного сифилиса.

В результате проведенных исследований не отмечено каких-либо существенных отличий при сравнении клинических симптомов вторичного сифилиса с данными литературы прошлых лет. Вместе с тем, установлено существенное увеличение частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах (47,6%) в сравнении с данными авторов конца XIX века (Те А., 1895 - 4,5-6%;), 70-х годов XX века. (Скрипкин Ю.К., 1975 - 22,1%; Антоньев А.А.Д978 - 20,7%), что коррелирует с данными, полученными О.Г.Калугиной (2003), А.В Вислобоковым. (2006). Отмечено также увеличение частоты регистрации пустулезного сифилида (у 3,7% больных) в сравнении с данными авторов 60-70х годов XX века (Рахманов В.А., 1967- 2,4%; Абдулаев А.Х., 1972 - 0,57-2,1%; Антоньев А.А.,1978 - 1,3%). Выявлено значительное уменьшение частоты встречаемости сифилитической алопеции (у 13,4% больных) в сравнении с данными авторов конца XIX (Diday, 1895 - 90%) и отсутствие существенных изменений в частоте встречаемости лейкодермы (3,7% по результатам настоящего исследования; 4% - по данным Фурнье А.Д899; 2,1% - по данным Аковбяна В.А., 2002).

Таким образом, полученные в данной работе результаты анализа историй болезни пациентов с ранними манифестными формами сифилиса во многом соответствовали негативным современным тенденциям течения сифилитической инфекции, отмеченным в недавних исследованиях Калугиной О.Г. (2003) и Бугорского В.Н. с соавторами (2004). Проведенные исследования позволили констатировать изменение клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в сравнении с данными дерматовенерологов конца XIX - первой половины XX века, что может быть расценено, как ее патоморфоз.

Учет особенностей течения сифилитической инфекции на современном этапе имеет большую практическую значимость, способствует уменьшению числа ошибок диагностики, допускаемых клиницистами при обследовании больных с подозрением на сифилис, раннему выявлению сифилиса.

Одной из задач настоящего исследования являлась оценка клинической значимости полимеразной цепной реакции при диагностике ранних форм сифилиса. Для этого проводилось сравнение эффективности данного метода с методом прямого выявления возбудителя сифилиса - темнопольной микроскопией.

Метод ПЦР в настоящее время не относится к регламентированным методам диагностики сифилиса и носит исследовательский статус. Вместе с тем, учитывая его высокую чувствительность и специфичность, следует рассматривать возможность применения данного метода для диагностики сифилиса, в особенности в сложных случаях, когда обычные методы детекции дают отрицательный результат, а клинико-анамнестические данные не позволяют исключить сифилитическую инфекцию.

При анализе результатов параллельного исследования клинических образцов, полученных от больных с диагнозами первичного и вторичного сифилиса методами ПЦР и ТПМ полное совпадение результатов было получено у 67% пациентов, у остальных 33% обследованных было выявлено расхождение результатов этих методов исследования.

Максимальное число совпадений положительных результатов ТПМ и ПЦР отмечалось у больных с диагнозом первичного сифилиса (у 68,4% пациентов), что соответствовало современным взглядам о размножении Т. pallidum в первичном аффекте, предшествующем этапу диссеминации возбудителя. Известно, что первичный аффект развивается при концентрации возбудителя не менее чем 10 (Wicher К, et al., 1992). Однако при длительном существовании очага поражения, предварительно проведенном лечении пациента количество трепонем может значительно уменьшаться. В связи с этим со вторичного периода сифилиса количество возбудителя в очагах заметно падает, аллергический компонент в очаге (первичная сифилома) преобладает над воспалительным. Поэтому закономерным и ожидаемым явилось уменьшение числа пациентов с синхронно положительными результатами ПЦР и ТПМ у больных вторичным сифилисом (у 41,1% пациентов), а также то, что только при вторичном сифилисе у ряда пациентов (13 человек) отмечались отрицательные результаты ТПМ и ПЦР.

Анализ несовпадений результатов ТПМ и ПЦР позволил разделить этих пациентов на две группы. При этом у части обследованных (28 человек) ТПМ давала отрицательный результат, но методом ПЦР-//?/?4 /обнаруживалась ДНК бледной трепонемы. Процент пациентов с отрицательными значениями ТПМ был несколько выше среди больных с диагнозом вторичного сифилиса (24/82, 29,2%; у пациентов с диагнозом первичного сифилиса - 4/19, 21%). Дополнительное исследование клинического материала этих пациентов на наличие ДНК трепонем методом ПЦР-MS с последующим секвенированием и филогенетическим анализом подтвердило наличие T.pallidum.

Возможной причиной расхождения результатов исследования образцов этих пациентов методами ТПМ и ПЦР-(р/>47следует считать более высокую аналитическую чувствительность метода ПЦР. Данное предположение подтверждается результатами работ зарубежных и отечественных исследователей. Так, в работах Orle КА (1996), Liu Н. (2001) было показано, что предел детекции методов на основе ПЦР позволяет обнаруживать возбудителя сифилиса при очень низких концентрациях - до 2x10 клеток/мл, в то время как для ТПМ предел обнаружения составляет примерно 105 клеток/мл (Liu Н., 2001).При разработке тест-системы «Амплисенс T.pallidum», выпускаемой ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора», удалось добиться аналитической чувствительности в пределах 4x10 клеток/мл (Родионова Е.Н., 2003). К этому следует добавить данные полуколичественной оценки концентрации ДНК T.pallidum в различном клиническом материале, показывающие, что образцы отделяемого эрозивно-язвенных высыпаний при сифилисе обычно содержат от

2.2х104-5.7х 106 микроорганизмов, что нередко выходит за пределы детекции метода темнопольной микроскопии (Liu Н., 2001). Дополнительной причиной отрицательных результатов ТПМ являлось применение пациентами наружных (раствор КМп04, синтомициновая эмульсия, гентамициновая мазь и другие) или системных (сумамед, нолицин, гентамицин, бисептол, цифран) антимикробных препаратов, которые, очевидно, уменьшали количество в очагах бледных трепонем, доступных для их определения методом темнопольной микроскопии.

Одной из возможных причин получения отрицательного результата ТПМ может также являться некачественная техника взятия образца или исследования материала, поэтому отрицательный результат ТПМ не является основанием для исключения диагноза сифилиса (Глазко И.И. с совторами, 2006).

Большой интерес при выяснении причин несовпадений результатов ТПМ и ПЦР представляла группа пациентов, у которых бледная трепонема обнаруживалась методом ТПМ, а результаты исследования клинических образцов методом ПЦР-tpp47 были отрицательными. Эта группа была представлена двумя пациентами с диагнозом первичного сифилиса и тремя пациентами с диагнозом вторичного сифилиса. Обращало на себя внимание, что именно у этих двух пациентов с диагнозом первичного сифилиса результаты как трепонемных, так и нетрепонемных серологических тестов в период обследования были отрицательными, а диагноз был установлен на основании данных клиники и положительных результатов темнопольной микроскопии. Дополнительное молекулярно-генетическое исследование клинического материала этих пациентов с филогенетическим анализом показало, что у двух больных вторичным сифилисом в образцах присутствует ДНК Treponema putidum - недавно охарактеризованный новый вид трепонем, обитающий в ротовой полости и генетически близкий Treponema denticola (Wyss С., 2004). У обоих пациентов с диагнозом первичного сифилиса и одного пациента с диагнозом вторичного сифилиса была обнаружена ДНК Treponema refringens. Treponema putidum может обнаруживаться в материале с зубных налетов, участвуя в развитии острого некротизирующего гингивита и периодонтита, а Т.refringens, как известно, является сапрофитом, колонизируя наружные половые органы. Имеющиеся протоколы лабораторного обследования свидетельствуют о том, что у пациентов, у которых вместо T.pallidum была обнаружена T.putidum, материал забирался как раз со слизистой ротовой полости, а у пациентов с выявленной Т. refringens - с высыпаний в области половых органов. При этом ни у одного из пациентов группы С не было обнаружено фрагментов 168-рибосомального гена, принадлежащих T.pallidum. На основании полученных результатов можно предположить, что в материале у данных пациентов спирохеты, наблюдаемые при микроскопическом исследовании, были ошибочно приняты за Treponema pallidum. Такой вывод находит поддержку со стороны данных как зарубежной, так и отечественной литературы. В обзоре Larsen S. (1995), посвященном, лабораторным методам диагностики сифилиса, указывается, что даже опытный специалист может испытывать большие трудности при дифференциации T.pallidum от сапрофитных трепонем, при этом наиболее часто при микроскопическом исследовании T.pallidum путают с T.refringens и T.denticola. В отечественных руководствах также указывается на трудности в видовой идентификации спирохет из-за того, что T.refringens, T.phagedenis, T.denticola морфологические сходны с T.pallidum (Байчурина А. 3., (1999); Родионов А.Н. (2000); Савичева А.М., (2004)). Распространенность же сапрофитных трепонем может быть достаточно высокой. Так, по данным Hook (1985), они были обнаружены у 23% (7 из 30) клинически здоровых лиц.

Если при подозрении на вторичный сифилис в лабораторном обследовании акцент делается на выявлении серологических маркеров, которые к этому периоду инфекции выявляются у подавляющего большинства инфицированных, то в первичном периоде сифилиса результаты серологических реакций могут оставаться отрицательными еще в течение 1-4 недель после развития клинических проявлений инфекции. В этом случае прямое обнаружение возбудителя имеет важнейшее значение для установления окончательного диагноза. Данное положение может быть проиллюстрировано результатами обследования двух пациентов с диагнозом первичного сифилиса. Как уже было отмечено, этим двум пациентам, у которых впоследствии с использованием двух методологий ПЦР и секвенирования было подтверждено наличие в клинических образцах Treponema refringens, а не T.pallidum. Диагноз первичного сифилиса был поставлен при отрицательных результатах серологического обследования на основании клинических признаков -высыпаний эрозивно-язвенного характера в области головки полового члена, наличия регионарного лимфаденита и положительных результатов ТПМ. Кроме того, именно у этих двух пациентов из всех обследованных лиц в материале соскобов с высыпаний на коже была обнаружена ДНК вируса простого герпеса 2-го типа. Возможно, на фоне клинической картины, характерной для сифилиса, мнение специалиста, проводившего микроскопию, о видовой принадлежности наблюдаемых спирохет склонилось в пользу T.pallidum, в то время как причиной эрозивно-язвенных поражений гениталий, по-видимому, являлся ВПГ-2. Полученные результаты позволяют считать, что этим двум пациентам с эрозивно-язвенными проявлениями, вызванными ВПГ-2 и колонизированными сапрофитными трепонемами, на основе результатов ТПМ диагноз первичного сифилиса был поставлен ошибочно.

Изучение специфичности метода ПЦР при диагностике сифилиса, проведенное на 118 пациентах группы контроля, позволило подтвердить высокую специфичность метода. При этом результаты ПЦР оказались отрицательными у 116 пациентов и положительными - у 2-х женщин, у которых клинический материал был получен из цервикального канала и на момент обследования отсутствовали клинические проявления сифилиса. При динамическом наблюдении за данными пациентками была отмечена позитивация серологических реакций на сифилис и развились клинические признаки сифилиса. Возможно, в момент обследования клинические проявления инфекции у этих пациенток локализовались в области шейки матки и не были замечены при обследовании. Известно, что у женщин в 8 — 12% случаев первичная сифилома локализуется на шейке матки и редко — на стенках влагалища (Родионов А Н., 2000). В связи с этим представляет интерес выявление ДНК T.pallidum при ПЦР-анализе мазков из цервикального канала при отсутствии у пациенток клинических проявлений сифилиса на момент взятия проб. Возможно, твердый шанкр шейки матки встречается значительно чаще, чем диагностируется. Использование в данном случаев ПЦР в качестве скринингового метода позволит улучшить своевременную диагностику сифилитической инфекции. Кроме того, применение ПЦР целесообразно для дифференциальной диагностики заболеваний, имеющих сходную клиническую картину, в частности, при эрозивных поражениях слизистых оболочек герпетической этиологии, при трихомонозе, мягком шанкре.

Общий процент случаев гипердиагностики сифилиса с выявлением «бледных трепонем» методом ТПМ составил 5% (5человек из 101), причем темнопольная микроскопия проводилась квалифицированными специалистами разных лечебных учреждений.

Таким образом, проведенное исследование показало, что результаты метода ПЦР при обследовании лиц с подозрением на сифилис позволяют более объективно по сравнению с микроскопическим методом оценивать наличие возбудителя в исследуемом материале, обеспечивая точность поставленного диагноза. Широкая оснащенность современных диагностических лабораторий оборудованием для проведения ПЦР-исследований и наличие зарегистрированных коммерческих тест-систем позволяют ставить вопрос о включении данного метода в алгоритм лабораторного обследования лиц с подозрением на первичный и вторичный сифилис. В связи с этим следует считать целесообразным применять метод ПЦР при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической).

На втором этапе исследования проводилось изучение эффективности метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом.

В зарубежной литературе последних лет все чаще стали появляться указания на использование для диагностики сифилиса метода иммуноблоттинга (Sambri V., et al, 2001; Ebel A., et al, 2000; Hagedom H.J., et al, 2002). Отмечаются преимущества этого метода, в особенности его рекомбинантного варианта, перед другими тестами, обусловленные высокой чувствительностью и специфичностью, превосходящей таковые общепринятых трепонемных тестов: FTA^, МНА-ТР, ТРРА {Marangoni A, et al, 1999), отсутствием необходимости в опасных манипуляциях, связанных с перевивкой штаммов патогенной бледной трепонемы (Paris-HamelinA., et al, 1999), возможностью применения теста для диагностики раннего врожденного сифилиса в варианте IgM-иммуноблоттинга (Sanchez PJ-, et al, 1989; Lewis L.L., et al, 1990), а также для дифференциальной диагностики БЛПР, в особенности при аутоиммунных заболеваниях: ревматизме, системной красной волчанке, когда классические трепонемные тесты (FTA^) часто дают ложноположитеяьный результат (Murphy F.T., et al, 1999).

Среди отечественных дерматовенерологов отношение к данному методу диагностики еще не сформировалось. Это послужило поводом для проведения данного раздела работы.и позволило подтвердить высокие диагностические потенции метода иммуноблоттинга с применением тест-системы INNO-Lia Syphilis Score, сконструированной в формате линейного ИФА, для диагностики ранних форм сифилиса.

Чувствительность иммуноблоттинга при первичном сифилисе первоначально была определена, как 97,8 %. При этом у 1 пациента с отрицательным результатом ИБ был выявлен факт неправильного хранения материала пред исследованием, что не исключало возможности получения ложноотр и дательного ответа. При повторном обследовании больного с исследованием новой порции крови был получен положительный результат ИБ, что позволило сделать вывод о 100% чувствительности метода ИБ. Положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у ряда пациентов с первичным сифилисом при отрицательных результатах РСКк, РМП или РСКт, а также ИФА и РПГА. При этом чувствительность метода иммуноблоттинга достоверно превышала чувствительность РСКк (р<0,001), РМП (р<0,05) и РСКт (р<0,05).

Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных первичным сифилисом, превышающей чувствительность нетрепонемных (РСКк; РМП) и трепонемных (кроме РИФабс) тестов.

У больных вторичным сифилисом положительными оказались результаты всех серологических методов (РСК, РМП, РПГА, РИФабс, ИФА, а также иммуноблоттинга (100% чувствительность), что соответствовало современным представлениям о развитии на вторичной стадии сифилитической инфекции максимального иммунного ответа организма больных к Т. pallidum и свидетельствовало о нецелесообразности использовать метод иммуноблоттинга для диагностики этой стадии инфекции.

При обследовании больных скрытым ранним сифилисом методом иммуноблоттинга положительные результаты были получены у всех пациентов (100% чувствительность). При этом положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у двух больных скрытым ранним сифилисом с разноречивыми данными классических серологических методов (РСКк и РМП - отрицательные, РСКт - положительная в низком титре), когда требовалось проведение дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами стандартных серологических реакций. Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных скрытым ранним сифилисом, превышающей чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов (Для сравнения: при скрытом раннем сифилисе чувствительность РМП и РСКк составила 92,0±5,5%, РСКт -96,0±4,0 %. Чувствительность РПГА, РИФабс и ИФА составила 96,0±4,0%.). Это подтвердило целесообразность применения данного метода серологической диагностики при необходимости подтверждения скрытого раннего сифилиса, в особенности при противоречивых результатах других методов исследования и необходимости проводить дифференциальную диагностику с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис.

Иммуноблоттинг оказался наиболее чувствительной реакцией, позволяющей устанавливать инфицированностъ у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом. При обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, положительный результат в иммуноблоте был получен у 36 % пациентов (5 человек), в то время как в РМП - у 7% обследованных, в ИФА - у 21%. Другие реакции (РСКТ, РСКк РИФабс и РПГА) у пациентов этой группы оказались отрицательными.

При изучении специфичности метода иммуноблоттинга, проведенного путем тестировании сывороток крови лиц без указаний на наличие сифилитической инфекции (100), все 50 сывороток крови от больных кожными заболеваниями и 48 сывороток крови, взятых от доноров крови, показали отрицательные результаты. У двух доноров были зарегистрированы положительные результаты им у нобл отти нга с невысокими уровнями позитивности реакции с отдельными рекомбинантными белками (на уровне 1-2+). Последующее обследование этих пациентов с помощью иммуноблоттинга и других специфических реакций (ИФА, РИФабс), проведенное через 2 недели после первого обследования, позволило установить ложный характер серопозитивности. Таким образом, специфичность линейного

TRjf иммуноблоттинга при использовании диагностикума «INNO-Lia Syphilis Score» составила 98%.

Метод иммуноблоттинга позволяет не только проводить диагностику сифилиса по суммарному результату реакции, но и, при необходимости, давать оценку вклада каждого из рекомбинантных белков диагностикума и образования к ним антител в формирование общего результата реакции.

Проведенные исследования показали, что антитела к отдельным рекомбинантным белкам Treponema pallidum (TpN17, TpN47, TpN15) регистрировались на самых ранних стадиях инфекции, начиная с периода инкубации (лица, контактные по сифилису, получающие превентивное лечение).

У этих пациентов максимальным было антителообразование по отношению к TpN17 (при количественном учете реакции по системе четырех «крестов» - на уровне 1,4 ± 0,01), однако образование антител по отношению к другим рекомбинантным антигенам бледной трепонемы (TpN47, TpN15, TmpA) было незначительным (к TpN47 - 0,9±0,01; к TpN15 - 0,8±0,005; к TmpA -0,8±0,06), что не позволило регистрировать положительный результат реакции у всех пациентов. При первичном сифилисе отмечалось значительное (но не максимальное - в сравнении с вторичным сифилисом) усиление антителообразования по отношению ко всем используемым в ИБ антигенам (максимально - по отношению к TpN17: 2,9±0,01; к TpN47: 2,7±0,01; к TpN15: 2,2±0,15, минимально - к TmpA - 1,7±0,03), что сопровождалось возрастанием числа положительных результатов иммуноблотганга до 100% за счет суммарного учета реакции на все рекомбинантные антигены.

В период «разгара» инфекции (вторичный, скрытый ранний сифилис) интенсивность антителообразования являлась максимальной и проявлялась в иммуноблоте по отношению ко всем четырем рекомбинантным антигенам Treponema pallidum (при вторичном сифилисе - к TpN17 - 3,8±0,003; к TpN47 -3,7±0,005; к TpN15 - 3,8±0,003; к TmpA - 3,1±0,005 ; при скрытом раннем сифилисе: к TpN17 - 3,8±0,007; к TpN47 - 3,3±0,003; к TpN15 - 3,3±0,007; к TmpA - 3,3±0,007), что обеспечивало 100% чувствительность реакции.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что метод иммуноблотгинга может быть удобным инструментом для ранней диагностики сифилиса. Наличие таких его преимуществ, как высокая чувствительность, специфичность, относительная простота постановки и интерпретации результатов; возможность автоматизации и документирования данных, изучения спектра антител сразу к нескольким антигенам Т. pallidum и оценки вклада в общую реакцию антител различной специфичности; применение высокоочищенных рекомбинантных и пептидных антигенов, снижающих до минимума неспецифическую реактивность сывороток, и возможности отказа от трудоемких и субъективных методов, связанных с опасными для исследователя манипуляциями (перевивка штаммов Т. pallidum, работа с патогенной бледной трепонемой при постановке реакции), — все это определяет предпочтение метода иммуноблоттинга перед другими трепонемными тестами для диагностики сифилиса, в частности РИФ и в особенности РИБТ. Следует отметить высокую диагностическую эффективность иммуноблоттинга в возможном инкубационном периоде (что выявляется при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом) и при первичном сифилисе, а также в сложных диагностических ситуациях, когда этот метод может выполнять функции референс-метода. Учитывая изложенное, следует считать целесообразным применение метода иммуноблоттинга на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом; при обследовании пациентов с подозрением на первичный сифилис в случае отрицательных результатов стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом; для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис.

Таким образом, полученные данные, позволившие на большом клиническом материале показать высокую диагностическую эффективность полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга в сравнении с традиционными методами исследования, послужили основанием для разработки рекомендаций по применению изученных методов в качестве дополнения к общепринятым методам диагностики в следующих клинических ситуациях: Метод ПЦР - при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической).

Метод иммуноблоттинга - на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом; при обследовании пациентов с подозрением на первичный сифилис при отрицательных результатах стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом; для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис. f

132