Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клиническая оценка нового подхода к иммунодиагностике сифилиса

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ПЕРВЫЙ ТАШКЕНТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК: 616.972-07-085

ГАРИБ НАРГИС ФИРУЗОВНА р г 5 0д

" 1 КОЯ 1399

КЛИНИЧЕСКАЯ СЦР№<А НОВОГО ПОДХ* +А К ИММУНОДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА

14.00.11 - Кожные и венерические болезни 14.00.12 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ташкент - 1999

Работа выполнена на кафедре кожных и венерических болезней Первого Ташкентского Государственного медицинского института, ЦНИЛ Ташкентского института усовершенствования врачей МЗ РУз.

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РУз, Доктор медицинских наук,

профессор Р.А. КАПКАЕВ

Доктор медицинских наук Г.А. ИСМАИЛОВА

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор Э.Г. КИМ

Доктор медицинских наук М.Д. УРАЗМЕТОВА

Ведущая организация: Ташкентский Государственный медицинский педиатрический институт

Защита состоится "¿Н^" 1999 г. в /У час. на заседании

Специализированного совета Д.0.87.01.02. при Первом ТашГосМИ (700003, Ташкент, ул. Хамзы, 103)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого ТашГосМИ. Автореферат разослан " ^ " , 1999 г

Ученый секретарь Специализировашюго совета, доктор медицинских наук

О.С.ИУЛДОШХОНОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последнее десятилетие во всем мире наблюдается значительный рост заболеваний, передающихся половым путем. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире ежегодно регистрируется 333 млн. новых случаев заболеваний, передающихся половым путем, из них 12 млн. приходится на сифилис (Адлер М.В.,1997)

Эпидемический характер приобретает заболеваемость сифилисом в странах СНГ. По данным VI съезда дерматовенерологов России, количество зарегистрированных случаев этого заболевания составило в 1995 году 177 человек на 100 ООО населения (Романеико Г.Ф. с соавт.,1996). В Казахстане этот показатель составил в 1997г. 123 на 100 ООО населения (Кешелева З.Б., Пшеничная Л.А., 1997), в Таджикистане, в г. Душанбе - 87,2 на 100 000 населения (Зоиров П.Т. с соавт.,1998). Вайсов А.Ш. с соавт. (1995), Маманов М.М. с соавт. (1999) приводят данные об ежегодном увеличении числа больных сифилисом в Узбекистане в 2 раза. На Украине уровень заболеваемости сифилисом по сравнению с 1985 г. за 10 лет повысился в 10 раз (Захаров В.К., Захаров С.В., 1998). Особую актуальность приобрели ассоциации болезней, передающихся половым путем, в частности, сифилиса и ВИЧ-инфекции, изменяющие традиционное течение заболеваний, что актуализирует проблему их своевременной диагностики.

Клинические методы диагностики сифилиса по-прежнему имеют большую ценность. Однако, в последние годы изменилось соотношение форм заболевания, в частности, увеличение числа больных скрытыми формами сифилитической инфекции (Бекмуратова Э.Э.и соавт., 1997), при которых клинические симптомы болезни практически отсутствуют, а поскольку выявление больных с указанной формой заболевания происходит, в основном, активным путем, больные длительное время представляют эпидемиологическую опасность для окружающих.

Несомненной остается ведущая роль серологических методов диагностики сифилиса с помощью микрореакций преципитации, реак-

ции связывания комплемента, иммунофлюоресценции и иммобилизации бледных трепонем. Однако, увеличение числа больных с лож-ноположительными и ложноотрицательными результатами указанных реакций снижает их диагностическую ценность. Остается высокой частота ложноположительных результатов при различных заболеваниях, микст-инфекциях и беременности, а также ложноотрицатель-ных результатов у лиц, находящихся в инкубационном периоде болезни и при первичном серонегативном сифилисе.

Проблема лабораторной диагностики осложняется также поздним наступлением серопозитивности и отсутствием возможности объективизировать и автоматизировать подсчет результатов основных тестов, применяемых в серодиагностике сифилиса. К сожалению, разработка новых методов определения антител при сифилисе с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблотинга не повышают диагностической ценности серореакций (Дмитриев Г.А., Бра-гина Е.Е.,1996).

Информативность микробиологических тестов, сводящихся к обнаружению бледной трепонемы в очагах поражения на коже, видимых слизистых оболочках и в пунктате лимфатических узлов, значительно ниже серологических (Овчинников Н.М. с соавт.,1987)

Следовательно, традиционно используемые методы клинической, серологической и микробиологической диагностики сифилиса в современных условиях недостаточно информативны, а проблема диагностики сифилиса остается актуальной.

Достижения клинической иммунологии позволяют с новых позиций подойти к проблеме иммунодиагностики инфекционных заболеваний. В частности, регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов в крови больных служит чувствительным индикатором развития хели-кобактериоза, гнойновоспалительных заболеваний, кишечных и др. инфекций (Гариб Ф.Ю., Гариб В.Ф., 1999)

Цель исследования

Оценить информативность существующих клинических, серологических и микробиологических методов диагностики сифилиса и разработать новые иммунодиашостические тесты на основе регистрации циркулирующих антигенсвязывающих лимфоцитов.

Задачи исследования

1. Изучить особенности клинического течения сифилиса в современных условиях.

2. Оценить Т-клеточное звено иммунитета у больных сифилисом с помощью моноклональных антител против кластеров дифференцировки лимфоцитов.

3. У больных сифилисом обнаружить пул циркулирующих антигенсвязывающих лимфоцитов, реагирующих с антигенами бледной трепонемы в реакции непрямого розетко-образования, определить их специфичность и изучить их субиопуляционный состав.

4. Сопоставить сроки регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов и антител в крови у кроликов, зараженных сифилисом.

5. Оценить клиническую значимость метода определения антигенсвязывающих лимфоцитов в тесте непрямого ро-зеткообразования у больных различными формами сифилиса в сравнении с известными методами диагностики.

6. Разработать количественный полуавтоматизированный метод регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов, реагирующих с антигенами бледной трепонемы, на основе им-муноферментного анализа и сопоставить его чувствительность с методом непрямого розеткообразования.

Научная новизна

В современных условиях отмечено преобладание вторичного рецидивного и скрытого раннего сифилиса.

При клиническом обследовании на сифилис кожно-слизистая симптоматика обнаруживается не более, чем у 3/4 больных, что связано с отсутствием клинических проявлений болезни и при скрытых формах.

Информативность серологических тестов по комплексу серологических реакций (КСР) составляет 89,9% (положительные и слабоположительные результаты). Ложноотрицательные результаты выявлены у больных с первичным серонегативным и скрытым ранним сифилисом в 10% случаев. Ложноположительные результаты зарегистрированы при беременности. Информативность микробиологических тестов составила 24,6% по отношению к общему числу больных сифилисом.

У больных сифилисом выявлен Т-клеточный иммунодефицит, в основном, за счет снижения Т-хелперов (С04+), что привело к снижению иммунорегуляторного индекса (Тх /Тс) до 1,3 (при норме 2,0).

В крови больных сифилисом впервые выявлены антигенсвязы-

вающие лимфоциты, специфически реагирующие с антигенами бледной трепонемы в реакции непрямого розеткообразования, в количестве от 4 до 20 %. Все антигенсвязывающие лимфоциты несут на своей поверхности специфические антигенсвязывающие рецепторы к антигенам бледной трепонемы , из них число лимфоцитов с маркерами Т-лимфоцитов (СБЗ+) составляют 76,2%, антигенспецифичес-ких Т-хелперов (СБ4+) - 50%, антигенсиецифических Т-супрессоров (СБ8+) - 26,2%, В-лимфоцитов (С019+) - 23%.

В крови кроликов, экспериментально зараженных сифилисом, обнаружено появление антигенсвязывающих лимфоцитов в ранние сроки - через одни сутки после введения бледных трепонем, т. е. в инкубационном периоде, в то время как диагностические титры антител регистрируются не ранее, чем через 14 суток.

Доказано, что диагностический уровень антигенсвязывающих лимфоцитов (АСЛ) регистрируется практически у всех больных сифилисом в первые дни поступления в стационар, причем у больных первичным серонегативным сифилисом при отрицательных результатах КСР, в 100% случаев обнаруживаются антигенсвязывающие лимфоциты, реагирующие с антигенами бледной трепонемы.

Установлено, что в крови лиц, находившихся в бытовом контакте с больными сифилисом, при отсутствии клинических и серологических признаков заболевания, антигенсвязывающие лимфоциты обнаружены в 43,8% случаев, ложноположительные результаты КСР у беременных дифференцируются, наряду с реакциями иммунофлюо-ресценции и иммобилизации бледных трепонем, на основе определения антигенсвязывающих лимфоцитов.

Регистрация АСЛ в крови больных сифилисом на основе разработанного метода иммуноферментного анализа коррелирует с методом непрямого розеткообразования и имеет преимущества перед ним в производительности, объективной оценке результатов, экспрессно-сти и возможности регистрации "антигенсвязывающего рецепторного поля" лимфоцитов.

Практическая ценность работы

1. Разработан простой, высокочувствительный и специфичный метод иммунодиагностики сифилиса, основанный на обнаружении в крови больных сифилисом антигенсвязывающих лимфоцитов, специфически реагирующих с антигенами бледной трепонемы в реакции непрямого розеткообразования.

2. Указанный метод позволяет диагностировать первичный

серонегативный сифилис, выявлять контактных лиц, зараженных сифилисом и исключать ложноположительные результаты КСР.

3. Разработан высокочувствительный, полуавтоматизированный метод оценки "антигенсвязывающего рецепторного поля", основагашш на использовании иммуноферментного анализа, обладающий высокой специфичностью к антигенам бледной трепонемы, экспрессностыо, возможностью объективной регистрации результатов и производительностью.

Положения, выносимые на защиту

1. В современных условиях отмечается преобладание таких форм сифилиса, как вторичный рецидивный и скрытый ранний сифилис.

При оценке диагностической значимости клинических методов выявления сифилиса кожно-слизистая симптоматика обнаруживается не более, чем у 3/4 части больных, что связано с отсутствием клинических проявлений болезни в при скрытых формах болезни.

Информативность серологических тестов по комплексу серологических реакций (КСР) составляет 89,9% (положительные и слабоположительные результаты). Ложноотицательные результаты выявлены у больных с первичным серонегативным и скрытым ранним сифилисом в 10% случаев. Ложноположительные результаты зарегистрированы при беременности. Информативность микробиологических тестов составила 24,6% по отношению к общему числу больных сифилисом. Информативность клинических, серологических (по КСР) и микробиологических методов диагностики сифилиса составляет 71,6%, 87,3%, 24,6% соответственно, что связано, с одной стороны, с изменением соотношения форм болезни с преобладанием вторичного рецидивного и скрытого раннего сифилиса, с другой стороны - отсутствием клинических проявлений и неинформативностью серореакций в инкубационный период заболевания, невозможностью диагностировать первичный серонегативный сифилис с помощью общепринятых серологических тестов.

2. Разработан новый метод иммунодиагностики сифилиса, основагашш на регистрации атигенсвязывающих лимфоцитов в реакции непрямого розеткообразования, специфически реагирующих с антигенами возбудителя, количественное определение которых позволяет провести диагностику сифилиса, включая первичный серонегативный сифилис, выявить зараженных среди контактных лиц и дифференцировать ложноположительные результаты КСР.

3. Разработан новый подход к иммунодиагностике сифилиса на основе определения антигенсвязывающих лимфоцитов, специфически реагирующих с антигенами бледной трепонемы на основе иммунофер-ментного анализа, обладающего высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, объективизацией результатов тестирования, экпрессностыо и производительностью.

Апробация работы

Основные материалы исследования докладывались на научно-практических семинарах для врачей медицинской службы железной дороги (ТашкентД998,1999), на научно-практическом семинаре кафедры кожных и венерических болезней 1 ТашГосМИ (Ташкент, 1999), на заседании Общества дерматовенерологов Ташкента и Ташкентской области (Ташкент,1999), научно-практическом семинаре кафедр кожных и венерических болезней, микробиологии с иммунологией и вирусологией, ЦНИИ 1 ТашГосМИ (Ташкент,1999), научном семинаре "Новые методы иммунодиагностики заболеваний человека" в ЦНИЛ ТашИУВ (Ташкент,1999), научном семинаре в УзНИИДиВ (ТашкентД999).

Внедрение результатов в практику

Разработанный метод определения антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции непрямого розеткообразования внедрен в работу клинических лабораторий Таш.обл.КВД и ДорКВД и УзНИИДиВ. Выпущены методические рекомендации "Лабораторная диагностика сифилиса" для врачей общей практики (Ташкент, 1999).

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи в журналах, получен 1 патент на изобретение РУз.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследований", трех глав собственных исследований, заключения, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 9 рисунками. Библиографический указатель включает 210 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика обследуемых

Клинические и серологические исследования выполнены на базе Таш.обл.КВД (глав.врач- к.м.н.,доц. С.С.Саипов).

Иммунологические исследования, включая эксперимент, проводились на базе ЦНИЛ ТашИУВ (зав. лаб .- к.м.н. В.Ф.Гариб).

Обследовано 305 человек, из них 229 больных различными формами сифилиса, 16 детей, находившихся в тесном бытовом контакте с больными сифилисом родителями, 20 беременных женщин со слабоположительными результатами КСР, 40 практически здоровых лиц. Под наблюдением находилось 149 лиц мужского (49%) и 156 женского пола (51 %) в возрасте от 16 до 53 лет, из них детей в возрасте от 2 мес. до 12 лет.

Из числа больных сифилисом 8 (3,5%) человек с первичным ссронегативным, 14 (6,1 %) - с первичным серопозитивным, 46 ( 20%) - со вторичным свежим, 96 (42%) - со вторичным рецидивным, 65 (28,3%) - со скрытым рашшм сифилисом.

Диагноз сифилиса был верифицирован на основе клинических признаков и результатов серологических реакций, микроскопического тестирования.

Методы исследования.

Использовались общепринятые клинические, серологические и микробиологические методы исследования в соответствии с Приказом МЗ РУ № 660 (1996). Серологическое обследование проводилось с помощью микрореакций преципитации (МР), реакции связывания комплемента с трепонемным и кардиолипиновым антигеном (РСК), реакции иммунофлюоресценции (РИФ-200 и РИФ-абс), реакции иммобилизации бледных трепонем (РИТ).

Иммунологические методы исследования включали:

- количественное определение циркулирующих в крови Т-лим-фоцитов, Т-хелперов, Т-супрессоров с помощью моноклопальных антител (Ф.Ю.Гариб с соавт., 1995);

- определение циркулирующих антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции непрямого розеткообразования (Ф.Ю.Гариб, Н.И.Гурарий, 1988) с коммерческим антигеном бледной тре-понемы.;

- определение специфичности антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции блокирования непрямого розеткообразования раст-

воримым антигеном (Н.И.Гурарий, 1995);

- определение принадлежности антигенсвязывающих лимфоци -тов к Т-, B-лимфоцитам, Т-хелперам, Т-супрессорам в реакции двойного розеткообразования на основе приведенных выше методов;

- регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов, реагирующих с антигенами бледной трепонемы, разработанным нами на основе иммуноферментного анализа (совместно с Салиховой Р.И., НПО "Нихол").

Экспериментальное моделирование сифилиса проведено на 6 кроликах-самцах возрастом 1,5-2 года, весом 2,5-3 кг. путем внутри-мошоночного введения патогенных Тг. pallidum штамма Никольса, полученного из недельного кроличего орхита (УзНИИДиВ).

Полученные результаты обработаны общепринятыми методами вариационной статистики с вычислением средних величин, их ошибок, t-критерия Стьюдента, корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

У больных с первичным серонегативным, первичным серопози-тивным, вторичным свежим, вторичным рецидивным, скрытым ран-1шм сифилисом клинические симптомы заболевания были зарегистрированы у 164 из 229 человек (71,6%). Среди больных с клиническими проявлениями сифилиса обильные высыпания выявлены у 137 больных (83%), скудные высыпания -у 24 (15%), проявления злокачественного сифилиса у 3 (2%). Моносимптомность сыпи выявлена у 65 больных (40%), сочетания высыпаний у 99 (60%). Наиболее частыми клиническими проявлениями у больных сифилисом явились папулезные высыпания на ладонях и подошвах (26%), розеолезная сыпь и широкие кондиломы (по 22,5%), твердый шанкр у 14,6%, лентикулярные папулы у 14,2%, гипертрофические папулы у 9,1%. Сифилитическая ангина наблюдалась в 4,3 % случаев, алопеция в 3%, лейкодерма в 2,4%, пустулезный сифилид- в 2% случаев (табл.1).

Следовательно, кожно-слизистая симптоматика у больных заразными формами сифилиса проявлялась в различных формах, была выражена неодинаково и обнаруживалась не более, чем у 3/4 обследованных. При скрытом сифилисе клинические проявления болезни отсутствовали

Важно отметить, что из общего числа больных сифилисом активно выявлено 79,5%, в основу которого положено массовое серологическое обследование людей с помощью КСР, поскольку инфор-

мативность клинических признаков сифилиса недостаточна.

Таблица 1 Клинические проявления у больных сифилисом

Клинические проявления Частота клинических проявлений (%)

Твердый шанкр 24 (14,6)

Розеолы 37 (22,5)

Лентикулярные папулы 23 (14,2)

Эрозивные папулы слизистой 15 (9,1)

оболочки полости рта

Ладонно-подошвенные папулы 42 (26)

Гипертрофические папулы 16 (9,8)

Широкие кондиломы 37 (22,5)

Сифилитическая ангина 7 (4,3)

Лейкодерма 4 (2,4)

Алопеция 5(3)

Сифилитические пустулы 2 (1,2)

Сифилитическое импетиго 1 (0,6)

Склераденит 29 (17,7)

Полиаденит 126 (76,8)

Из клинических форм наиболее часто диагностировались вто-ричньш рецидивный (42%) и скрытый ранний сифилис (28,3%), при которых длительность контакта с окружающими составляет не менее 4-6 мес., что создает эпидемиологическую опасность.

До настоящего времени основой верификации диагноза сифилиса являются серологические тесты и микробиологические исследования, которые в большинстве случаев достаточно надежны.

Как показали наши наблюдения, серопозитивными по КСР оказались 214 больных сифилисом (87,3%), со слабоположительными результатами - 7 (2,6%), серонегативными - 24 (9,1%), причем в 2,6% случаев были отмечены ложноотрицательные результаты серологических тестов, в 6,5% - ложноположительные. Микробиологические исследования положительны в 24,6%, отрицательны - в 75,4% случаев.

Следовательно, информативность только клинических методов диагностики сифилиса составляет 71,6%, серологических (по результатам КСР) - 87,3%.

Таким образом, клинические, серологические и микробиологические методы исследования являются недостаточно информативными для диагностики сифилиса, особенно его ранней серонегатив-ной, скрытой форм, у лиц, имевших половые и бытовые контакты у больных сифилисом, а также при дифференцировании ложноположи-тельных результатов серотестов.

Исходя из вышеизложенного становится понятным, что сифилидология испытывает потребность в разработке новых подходов к диагностике болезни.

Регистрация антител против антигенов возбудителя является важным диагностическим способом, ограничения которого связаны с отсроченным и слабым антительным ответом и неспецифическими результатами реакций.

Учитывая, что инфекционный процесс складывается из взаимоотношений хозяина и паразита, представляется важным оценить иммунный ответ хозяина на внедрение возбудителя не на гуморальном, а на клеточном уровне, поскольку клеточные иммунные реакции предшествуют образованию антител.

Клеточные иммунные реакции изучались в двух аспектах: важнейшие показатели неспецифических иммунных реакций (общий пул Т-лимфоцитов, содержание в крови иммунорегуляторных клеток Т-хел-перов и Т-супрессоров), а также специфическое звено- общий пул антигенсвязывающих лимфоцитов, несущих рецепторы к антигенам бледной трепонемы.

Изучение клеточных иммунных реакций у больных сифилисом показало, что в крови больных содержание Т-лимфоцитов (СБЗ+) снижено до 51,2± 0,5% по сравнению с 58,2±0,6% у здоровых (р< 0,001). Для определения частоты выявления иммунодефицита у больных сифилисом определены нормативные границы, ниже которых (55%) регистрируется иммунодефицит. По Т-лимфоцитам эта величина составила 73%.

Проводились расчеты глубины иммунодефицита (разность среди значений Т-лимфоцитов между здоровыми и больными), который составил 12%.

Отмечено наиболее значительное снижение числа циркулирующих Т-хелперов (СЭ4+) - до 19,9±0,9% против 37,0+0,4% контроля (р<0,001),т.е. в 1,9 раза. Частота выявления иммунодефицита по Т-хелперам

(ниже 36%) составила 100%. Глубина иммунодефицита по Т-хелпе-рам составила 50%.

Содержение в крови Т-супрессоров (СЮ8+) уменьшилось до 15,2±0,8% против нормы 18,6+0,5% (р<0,05). Частота выявления иммунодефицита по Т-супрессорам составила 68%. Глубина иммунодефицита по Т-супрес-сорам составила 183%.

Более значительное снижение Т-хелперов по сравнению с Т-суп-рессорами резко повлияло на снижение иммунорегуляторного шдекса (отношение Т-хелперов к Т-супрессорам) до 1,3 при норме 2,0 (р<0,001).

При анализе абсолютных значений Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров были получены аналогичные результаты, поскольку достоверных изменений в абсолютном содержании лимфоцитов не выявлено.

Необходимо признать, что определение количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций в крови не имеет диагностического значения, поскольку аналогичные изменения регистрируются при многих инфекционных заболеваниях.

Следующий этап работы основывался на данных о том, что внедрение возбудителя в организм сопровождается развитием на ранних этапах специфических клеточных иммунных реакций между антиген-специфическими Т-хелперами, В-лимфоцитами, Т-супрессорами, и единственным способом регистрации общего пула антигенсвязы-вающих лимфоцитов является метод непрямого розеткообразования, разработанный Ф.Ю.Гариб и Н.И.Гурарий (1988).Использование данного метода позволило впервые обнаружить в крови больных сифилисом антигенсвязывакяцие лимфоциты (АСЛ), реагирующие с антигенами бледной трепонемы.

В целом, на группу больных сифилисом (30 чел.) регистрировалось количество АСЛ 9,2±0,4% при нормативных значениях 1,5±0,2%, т.е. отмечено увеличение общего пула АСЛ в 6,1 раза.

Важно подчеркнуть, что повышенное содержание АСЛ (выше нормативной величины 3%) выявлено у всех больных.

Для определения специфичности взаимодействия антигенсвязы-вающих лимфоцитов с антигенами бледной трепонемы мы провели блокирование реакции непрямого розеткообразования растворимым антигеном. Было установлено, что при предварительном введении в систему растворимого антигена из бледной трепонемы количество АСЛ снижается с 15,4+0,6% до 1,0±0,2% (р<0,001). Это свидетельствует о том, что растворимый антиген блокирует реакцию непрямого розеткообразования на 91% и указывает на специфичность взаимо-

действия АСЛ с треионемным антигеном.

Учитывая, что нами впервые обнаружены в крови больных сифилисом антигенсвязывающие лимфоциты, реагирующие с антигенами бледной трепонемы, представлялось интересным изучение фенотипа этих клеток.

Принадлежность АСЛ к популяциям Т- или В-лимфоцитов определялось в реакции двойного розеткообразования с эритроцитами, нагруженными антигенами бледной трепонемы (для выявления АСЛ) и эритроцитами, нагруженными моноклональными антителами против СОЗ (маркер Т-лимфоцитов) или С019 (маркер В-лимфоцитов).

Исследования показали, что из числа АСЛ, выделенных из крови больных сифилисом, антигенспецифические Т-лимфоциты составляют 65%, антигенспецифические В-лимфоциты - 31%.

Принадлежность АСЛ к Т-хелперам и Т-супрессорам изучалась аналогичным способом с тем отличием, что были использованы эритроциты, нагруженные антигенами бледной трепонемы, и эритроциты, нагруженные моноклональными антителами против Т-хелперов (СЭ4+) или Т-супрессоров (СЭ8+). Было установлено, что антигенспецифические Т-хелперы составляют 42%, антигенспецифические Т-супрессоры 23% от общего пула АСЛ.

Следовательно, реакция циркулирующих антигенсвязывающих лимфоцитов специфична по отношению к антигенам возбудителя заболевания - бледной трепонемы. Пул АСЛ состоит из Т-лимфоци-тов, включая Т-хелперы и Т-супрессоры, и В-лимфоцитов.

С целью выявления преимуществ в регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов по отношению к антителам против бледной трепонемы, нами были сопоставлены сроки регистрации их появления в периферической крови кроликов, экспериментально зараженных сифилисом. Установлено, что если до заражения в крови кроликов АСЛ не выявлялись, то уже в первые сутки после заражения количество АСЛ, реагирующих с антигенами бледной трепонемы, выявлялось у всех животных и составило, в среднем 7,5+1,3%. На третьи и седьмые сутки их количество возросло до 15,5+1,2% и 15,5±0,7% соответственно, с дальнейшим нарастанием и выходом на плато на десятые сутки (17,5±1,3%).

Антитела против бледной трепонемы в микрореакции преципитации выявлялись на седьмые сутки у 2 из 6 кроликов, и лишь к 14 суткам результаты реакции стали положительными у всех животных.

Приведенные выше результаты по обнаружению АСЛ в крови больных и экспериментальных животных позволили высказать пред-

положение о диагностической ценности выявления указанной популяции лимфоцитов.

Для оценки диагностической значимости регистрации антиген-связывающих лимфоцитов больные сифилисом были распределены на группы по формам болезни, при которых определялось содержание в крови антигенсвязывающих лимфоцитов.

Было обследовано 139 человек мужского и женского пола, из них 103 больных с различными формами сифилиса, а также 16 детей, поступивших в стационар на превентивное лечение в связи с тесным бытовым контактом с больными сифилисом родителями, и 20 беременных женщин со слабоположительными результатами КСР, направленных из женских консультатций на обследование.

Возраст обследуемых был в пределах от 2 мес. до 53 лет. Параллельно велось клиническое, микробиологическое и серологическое обследование МР, РСК, РИФ, РИТ (табл.2).

Таблица 2

Диагностическая ценность определения АСЛ при сифилисе в реакции непрямого розеткообразования (АСЛ-РОК-ТР), %

Группа Кол-во больных АСЛ-РОК-ТР МР КСР РИФ РИТ Клин, методы Мик-роби- ол. методы

Больные

сифилисом 103 100 87 87,3 100* 100* 70,8 24,5

Контактные

лица 16 43,8 0 0 - - 0 0

Беременные 20 0 100 100 0 0 0 0

Примечание.* данные РИТ и РИФ получены при обследовании на скрытый сифилис.

Клинические проявления наблюдались у 73 обследуемых (52,3%), отсутствовали у 66 (47,5%) Частота положительных проб в серо-тестах у больных сифилисом составила: по КСР - 87,3%, по МР - 87%, РИТ и РИФ (при скрытых формах болезни) по 100%, обнаружение бледной трепонемы- 24,5%. Результаты серологических реакций КСР у контактных лиц были отрицательными, у беременных -слабополо-

жительными. В группе беременных результаты РИТ и РИФ дали отрицательные результаты.

Содержание АСЛ в крови обследуемых и частота положительных результатов были следующими: в группе больных первичным серо-негативным сифилисом количество АСЛ, специфически реагирующих с антигенами бледной трепонемы, составило 8,0±0,9 % с индивидуальными колебаниями от 4 до 11 % и 100%-ной частотой положительных проб.

В группе больных первичным серопозитивным сифилисом количество АСЛ составило 9,2+0,8 % с размахом индивидуальных показателей от 5 до 13%. Частота положительных проб составила 100%.

В группе больных вторичным свежим сифилисом количество АСЛ составило 9,8±0,4% . Размах индивидуальных значений колебался от 5 до 13 %. Частота положительных проб составила 100%.

В группе больных вторичным рецидивным сифилисом количество АСЛ составило 9,4±0,4% , при этом индивидуальные значения колебались в пределах от 5 до 14 %. Частота положительных проб - 100%.

В группе больных со скрытым ранним сифилисом АСЛ составили 10,6±0,4 % , индивидуальные показатели варьировали от 7 до 20%. Частота положительных проб - 100%.

Обследование группы детей, привлеченных к превентивному лечению в связи с тесным бытовым контактом с больными сифилисом родителями, методом АСЛ-РОК-ТР дало следующие результаты: у 7 (43,8%) детей реакция была положительная, количество АСЛ в среднем составило 7,4± 0,9% с индивидуальными колебаниями от 4 до 14%. У 9 детей (56,2%) количество АСЛ не превышало норму.

В группе беременных женщин со слабоположительными результатами КСР количество АСЛ, реагирующих с антигенами бледной трепонемы, составило 2,1±0,2 % с индивидуальными колебаниями от 0 до 3 %, что достоверно не отличалось от нормативных значений.

Следовательно, у всех больных сифилисом регистрируются ан-тигенсвязывающие лимфоциты, и что наиболее существенно, у больных со скрытыми формами болезни и с первичным серонегативным сифилисом - в 100% случаев. У контактных детей, предположительно находившихся в инкубационном периоде заболевания, АСЛ регистрировались в 43,8% случаев. У беременных женщин метод позволил, наряду с РИТ и РИФ, отдифференцировать ложноположительные результаты КСР.

Следовательно, регистрация АСЛ в крови больных сифилисом является специфическим диагностическим тестом, превосходящим по

своей чувствительности общепринятые клиническое обследование, серологические и микробиологические тесты. Определение ACJI в реакции непрямого розеткообразования является простым и доступным для клинических лабораторий методом.

В настоящее время предпочтение отдается полуавтоматизированным и автоматизированным методам исследования, когда регистрация результатов реакции производится с помощью приборов. Поэтому, для повышения чувствительности метода, его автоматизации, объективизации, нами был разработан второй метод регистрации ACJI, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА-АСЛ-ТР).

В процессе разработки ИФА-АСЛ-ТР были оценены несколько вариантов проведения теста: с использованием иммобилизированной антилимфоцитарной сыворотки, меченого стафилококкового белка "А", иммобилизированных и меченых антигенов бледной трепонемы.

Было установлено, что из трех вариантов только последний удовлетворяет поставленной задаче (рис.1). В указанном варианте антигены бледной трепонемы предварительно иммобилизировались на дно лунки 96-ти луночного планшета с плоским дном. После промывания в лунку вносили лимфоциты из крови больного сифилисом, при этом лимфоциты, несущие рецептор к антигенам бледной трепонемы, "заяко-ривались" на твердой фазе. Для их регистрации вносили в лунки меченый ферментом антиген трепонем, промывали и добавляли субстрат. Результаты оценки "антигенсвязывающего рецепторного поля" определяли фотометрически на аппарате "Multiskan".

Для оценки чувствительности метода ИФА-АСЛ-ТР была исследована кровь 50 больных сифилисом обоего пола с различными формами сифилиса в возрасте от 16 до 42 лет и 20 здоровых доноров обоего пола в возрасте от 18 до 36 лет.

Было установлено, что показатели реакции у здоровых лиц составляют, в среднем 0,077±0,2 усл.ед.. У больных сифилисом этот показатель возрастает, в среднем до 0,710, т. е. в 9 раз. Причем, у всех больных сифилисом результаты реакции были положительными, т.е. превышали 0,150 усл.ед..

В параллельных тестах определялось количество АСЛ в крови больных сифилисом в реакции непрямого розеткообразования.

Важно подчеркнуть, что результаты регистрации АСЛ в реакции непрямого розеткообразования и иммуноферментным методом имеют прямую полную корреляцию (г=0,98) (рис.2).

Следовательно, можно полагать, что определение АСЛ методом иммуноферментного анализа имеет равновысокую диагностическую

i f

I этап

присоединение антагенсвязывающего лимфоцита к иммобилизированным на дне лунки антигенам Т. раШб{ЦШ

+

Пэтал

присоединение кечеввнх ш-

тигенов Т. pallidum к юшоби-лизиро ванному на дне луихн комплексу антиген Т. pallidum - антигенсмзывающие лимфоциты

III этап

образование комплексов иммобилизи-роваииыВ антиген Т. pallidum - анта-геисмзыгающие лимфоциты - меченные антигены Т. pallidum

кмыобвлшованвые аитигсны Т. pallidum

г ипнгенаиоывающий

0/—< лякфоц кг с рецепторами кАГТР

4

печенный антиген TP

Рис.1 Схема варианта метода регистрации антгенсвязывающей способности лимфоцитов с использованием меченых и иммобили-зированных антигенов.

16% -

14%-

12%-

10% -

§ 8% -

§ 6% -

■ч 4% -

2% -

0%-

9 10 11 12

бсльяие

1,60 & 1,40

В 1,20 | 1,00 ^ 0,80 | 0,60 0,40 0,20 0,00

23456789

10 11 12

баттг*

Рис.2 Соотношение показателей антигенсвязываклцих лимфоцитов в методах АСЛ-РОК ТР и ИФА-АСЛ ТР.

ценность, как и определение АСЛ реакцией непрямого розеткооб-разования. Лимитирует использование того или иного способа только наличие соответствующего оборудования.

ВЫВОДЫ.

1. Комплекс общепринятых методов диагностики сифилиса (клинических, серологических, микробиологических) позволяет выявить заболевание практически у всех больных с манифестными формами. В то же время, вопрос о наличии или отсутствии болезни при обследовании контактных лиц и дифференцировании ложноположительных результатов КСР решить удается не всегда.

2. У больных сифилисом обнаруживается вторичный иммунодефицит на уровне циркулирующих Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-суп-рессоров с резким снижением иммунорегуляторного индекса до 1,3 против 2,0 у здоровых.

3. В крови больных сифилисом впервые обнаруживаются ан-тигенсвязывающие лимфоциты, специфически реагирующие с антигенами бледной трепонемы в количестве от 4 до 20 %. Фенотипически антигенсвязывающие лимфоциты идентифицированы как Т-лимфо-циты (65%), Т-хелперы (42%), Т-супрессоры (23%), В-лимфоциты (31%).

4. В крови у кроликов с экспериментально вызванным сифилитическим орхитом антигенсвязывающие лимфоциты, специфически реагирующие с антигенами бледной трепонемы, обнаруживаются через сутки после заражения, тогда как специфические антитела регистрируются у всех животных через 14 дней.

5. Разработан новый метод диагностики сифилиса на основе реакции непрямого розеткообразования для количественной регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов, специфически реагирующих с антигенами бледной трепонемы (АСЛ-РОК-ТР). Он высокочувствителен, специфичен, воспроизводим, дает положительные результаты у больных первичным, вторичным, скрытым ранним сифилисом в 100% случаев, у лиц, находившихся в тесном бытовом контакте с больными сифилисом- в 43,8% случаев. У беременных с ложнопо-ложительными результатами КСР содержание антигенсвязывающих лимфоцитов не превышало нормативных значений.

6. Разработан новый полуавтоматизированный метод регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов, специфически реагирующих с

антигенами бледной трепонемы на основе иммуноферментного анализа (ИФА-АСЛ-ТР), который прямо коррелирует с результатами определения АСЛ в тесте непрямого розеткообразования, позволяющий определить суммарное "антигенсвязывающее рецепторное поле" лимфоцитов, которое возрастает у больных сифилисом по сравнению со здоровыми в 9 раз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для диагностики всех форм сифилиса, обследования контактных лиц и при дифференцировании ложноположительных и ложноотри-цательных результатов КСР рекомендуем использовать разработанные нами методы количественной регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов, реагирующих с антигенами бледной трепонемы, на основе реакции непрямого розеткообразования (АСЛ-РОК-ТР) и иммуноферментного анализа (ИФА-АСЛ-ТР). Применение того или иного метода лимитируется оснащением лабораторий. Для выполнения анализа используется гепаршшзированная кровь обследуемых в объеме 1-2 мл. Срок выполнения анализа составляет 4 часа для реакции непрямого розеткообразования и 3 часа для выполнения ИФА.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Новые подходы к проблеме ранней диагностики сифилиса./ Р.А.Капкаев, Г.А.Исмаилова, Н.Ф.Гариб, Ф.Ю.Гариб, В.Ф.Гариб.// Новости дерматологии и венерологии.- 1998.-№2.-С.32-33

2. Гариб Н.Ф. Регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов как основа нового метода диагностики сифилиса. // Журнал теоретической и клинической медицины . -1999. -№1. -С.104-107.

3. ПП № РУ. Способ диагностики сифилиса. /Ф.Ю. Гариб, P.A. Капкаев, Г.А. Исмаилова, Н.Ф. Гариб, Т.А. Петрова, В.Ф. Гариб. // Заявка №IHDP 9800831.1. - Дата приоритета - 26.11.1998.

Н.Ф.Гарибнинг "Захм касаллиги иммунодиагностикасида клиник бахолашнинг янги йуллари" мавзуидаги диссертация ишининг

ХУЛОСАСИ

305 та одам текширилган, улардан: 229 таси захмнинг турли шакллари билан касалланган. Касаллик юк^ан 16 та бола, уларнинг ота-оналари захм билан касалланган, КСР кучсиз ижобий натижаларига эга 20 та хомладор аёллар; 40таси деярли соглом шахслар. Назорат ёши 16 дан 53гача булган 149 та эркак (49%) ва 156та аёл (51%), улардан ёши 2 ойдан 12 ешгача булган болалар устидан олиб борилган. Касалланганлар ора-сида 8таси (3,5%) бирламчи серонегативли, 14таси (6,1%) бирламчи серопозитивли, 46таси (20%) иккиламчи янги, 96 таси (42%) иккиламчи рецидивли, 65таси (28,3%) яширин эрта хол захм билан касалланганлар учрайди. Захмни аник^лаш учун умумий к;абул кдлинган усуллар комплекси (клиник, серологик, микробиологик) касалликни як,к,ол шакилларида этарли хомила беморларда хасталикни аник,ланишга имконият беради. Захм билан окриган беморларда кезувчи Т-лимфоцитлар, Т-хелперлар ва Т-супрессорлар даражасида иммунотаржибаловчи индекснинг 1,3 гача кескин пасайиши билан иккиламчи иммунодефицит аник,ланади. Захм билан окриган беморларнинг к,онида 4дан 20 % гача микдорида ок,иш трепонеманинг антигенларига сиецифик жавоб берувчи антигенбирик-тирувчи лимфоцитлар аникданди. Антигенбириктирувчи лимфоцитлар фенотипик жихатидан Т-лимфоцитлар (65%), Т-хелперлар (42%), Т-суи-рессорлар (23%), В-лимфоцитлвр (31%) каби идентификация к,илинган. Экспериментал шаронтида захм орхити к,узгатилган куёнлар к,онида ок,иш трепонема антигенларига сиецифик жавоб берувчи антигенбириктирувчи лимфоцитлар зарарлангандан кейин бир кун угиб аник,ланади, сиецифик антитаначалар эса к,амма хайвонларда 14 кундан кейин ашнутнади. Ок,иш трепонема антигенларига специфик жавоб берувчи антигенбириктирувчи лимфоцитларни сонини хисобга олиш учун нот1?ри розеткашакиллаш реакцияси асосида янги захм ташк,исини аницлаш услуби ишлаб чицилди (АСЛ-РОК-ТР) У юк,ори сезувчин, специфик, такрорланувчан, бирламчи, иккиламчи ва илк яширин захмда 100% мусбат булиб захм билан окриган беморлар билан як,ин маиший алок;ада булган шахсларда 43,8%, КСР сохта мусбат булган хомиладор аелларда эса антигенбириктирувчи лимфоцитларни сони меёри курсаткичлардан юуори булмади. Иммуно-фермант анализ асосида (ИФА-АСЛ-ТР) ок,иш трепонема антигенларига специфик жавоб берувчи янги яримавтоматлашган антигенбириктирувчи лимфоцитларни ана^лаш янги услуби ишлаб чик,илди. Ушбу услуб захм билан окриган беморларда 9 баробар лимфоцитлар усган.

RESUME

Three hundred and five people were examined; 229 of them were ill with different forms of syphilis, 16 children were in a close contact with parents suffering from the diseases; 20 pregnant women had slightly positive CSR-result, 40 persons were practically healthy. The group under study included 149 males (49%) and 159 females (51%) aged from 16 to 53 years, among them children from 2 months to 12 years.

The diagnosis of syphilis was verified on the basis of clinical symptoms, results of serological reactions and microbiological tests.

The complex of generally accepted methods of syphilis diagnostics (clinical, serologic, microbiologic) permits to reveal the disease practically in all the patients with manifested forms. At the same time, the presence or absence of the disease when examining, the persons being in a contact with patients and differentiation of pseudopositive CSR are sometimes questionable.

Patients with syphilis have secondary immunodeficiancy condition at the level of circulating T-lymphocytes, T-helpers, T-supressors with dramatic reduction of the immunoregulation index to 1,3 compared with 2,0 in healthy persons. The antigen-binding lymphocytes specifically reacting with antigens of Treponema pallidum in 4-20% were found out for the first time in the patients' blood. Phenotypically antigen-binding lymphocytes were identified as T-lymphocytes (65%), T-helpers (42%), T-supressors (23%), B-lymphocytes (31%).

Antigen-binding lymphocytes specifically reacting with antigens of Treponema were found in the blood of rabbits with experimentally induced syphilis in 24h after contamination while the specific antibodies are recorded in all the animals in 14 days.

A new method of diagnosing syphilis on the basis of indirect rassette-forma-tion reaction for quantitative registration of antigen-binding lymphocytes specifically reacting with Treponema pallidum has been developed.

It is sensitive, specific reproducible, gives positive results in patients with primary, secondary, latent early syphilis in 100% of cases, in persons being in a close contact with patients - in 43,8%, in pregnant women with pseudo-positive CSR-results the level of antigen-binding lymphocytes was within the normal values.

A new semi-automatic method of registration of antigen-binding lymphocytes specifically reacting with antigens of Treponema pallidum was developed on the basis of the immunoensyme analysis, which permits to establish the "total antigen-specific receptor field" of lymphocytes increasing in patients with syphilis 9 times as high as in healthy persons.