Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:ВОЗМОЖНОСТЬ ТРАНСОВАРИАЛЬНОЙ ПЕРЕДАЧИ БОРРЕЛИЙ У ТАЕЖНОГО КЛЕЩА (IXODESPERSULCATUS SCHULZE) В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ

Л'23SiO

На правах рукописи

НЕФЁДОВА Вмеегш Валерьевна ВОЗМОЖНОСТЬ ТРАНСОВАРИАЛЬНОЙ ПЕРЕДАЧИ БОРРЕЛИЙ

у таёжного клеща {іхооЕБ РБКБиьсл тих всниьгЕ) В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ

14.00.30 - эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работ* мнипоп л ГУ 1Ьучя«-аммдютлимм пешуп:

I ючелпго шоинмпс* Н.Ф. Гишдм РАМН

до лор биологических наук, профессор ЭЛ Карюберг

доктор ыедшщвскнх мук, профессор В.В. Т«р»сов

Вздувая вргамжмашя:

ГУ Научно-носледоввгельскнй институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоятсд « ^А» января 2004 г. в 1» часов ва заседании диссертационного совета Д 001.007.02 в ГУ НИИЭМ нм. Н.Ф. Гамалеи РАМН (12309«, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18)

С диссертацией можно очнахомнтс* в библиотеке ГУ НИИЭМ як. Н.Ф. Гвыален РАМН

Автореферат разослан декабрт 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета до*тор меднцннсгих ваук, профессор

У 11 Г)'пгт

»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Патогенные для человека виды боррелнй — Borrelia burgdorferi sensu lato, передающиеся иксодовыми клещами, вызывают самостоятельные заболевания, выделенные в группу юссодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) или инфекций группы Лайм-боррелиоза (Э.И. Коренберг, 1993, 1996). Это классические облигатно-трансмиссивные природно-очаговыс инфекции с острым и/или хроническим течением, при которых возможны поражения кожи, нервной, сердечно-сосудистой системы, печени, опорно-двигательиого аппарата. По уровню заболеваемости ИКБ занимают в России одно из ведущих мест среди прнродно-очаговых зоонозов. За четыре последних года (1999-2002 гт.) было зарегистрировано 31902 случая 11КБ, что составило в интенсивных показателях от 5.1 до 5.8 на 100 тыс. человек.

Эколого-эиидемические и таксономические связи боррелнй с иксодовыми клешами имеют две существенные особенности. Во-первых, тесную экологическую и коэяолюциоиную связь с определенной сравнительно небольшой таксономической группой иксодовых клещей рода Ixodes iW. Burgdorfer et al, 1983; H. Hoogstraal, 1986; J.F. Anderson, 1989; W. Burgdorfer, S.F. Hayes, 1989; H.A. Филиппова, 1990; NA Filippova, 1991; J.B. Keirans et al., 1992), -группой Ixodes persulcatus (или комплексом !,{]•) ricinui/persulcatus). Во-вторых - отсутствие . специфических связей разных геновидов боррелнй с определенным видом переносчика и возможность ммкетинфшифовання последних (Э.И. Коренберг, 1999; НА. Филиппова, 1999).

На бояыпей части лесной зоны Евразии основной эпидемически значимый переносчик Borrelia burgdorferi sensu lato - таежный клещ (Ixodes persulcatus Schulze), причем яа людей нападают, главным образом, взрослые особи (Е. I. Rotenberg et al., 2001, 2002). Уровень их заражеиности борреяиямн - это один из главных показателей эпизоотического состояния природного очага н его потенпзальвой-впндеыической опасности (Э.И. Коренберг, Ю.В.

Ковалевский, 2000; Е. I. Korcnberg et aL, 2002). Он определяется процессами горизонтальной (между резервуарными хозяевами) и вертикальной (трансфазовой) и, возможно, трансовариальной) передачи спирохет.

По имеющимся немногочисленным фрагментарным данным частота трансовариальной передачи боррелвй у клеша / persulcatus варьирует от 0% до 100% (Du Yong et aL, 1990; M. Nakao, К. Miyamoto, 1992; Ю.С Балашов, JI.A. Григорьева, 1997; Ю.С Балашов и др., 1998; Л.Л. Григорьева, К.А. Третьяков, 199S; H.V. Dubbtna, 2000). На этом основании высказаны самые разные, порой взаимоисключающие мнения: от отрицания возможности трансовариальной передачи боррелий (М. Nakao, К. Miyamoto, 1992) до придания этому феномену очень важного значения (Ю.С, Балашов, Л А. Григорьева, 1997; Ю.С. Балашов и др., 1998; JI.A. Григорьева, ЮЛ. Третьяков, 1998). Изоляты боррелий были получены в очень редких случаях от голодных личинок 1 ricinus, собранных в Северной Африке (Н. Younsi et aL, 2001), АтЫуотта americamtm в США (T.L. Schulze et aL, 1986), I. persulcatus в России (Н.Б. Горелова, не опубликованные данные). Также единичные изоляты были получены из Сяоїггатов или крови лабораторных животных, на которых кормили личинок 1. ricinus, собранных в природных очагах (О. Stanek et aL, 1986, В. Hammer et al,, 2002) или от напитавшихся личинок, происходивших от инфицированных в лаборатории клешей (Н.Е. Krampitz, 1986). Методами темнонольной микроскопии живые борредш были обнаружены у голодных личинок следующих вилов: 1. scapularis (ЕЛІ, Bosler et aL, 1983, J. Piesman et aL,

*

1936), A. amerfeamtm (T.L. Schübe et aL, 1986), I. Heims (Z. Hubalek, J. Haloirzka, 1998), 7. persulcatus (Ю.С. Балашов, JIA. Григорьева, 1997; Ю.С. Балашов и др., 1998). Эти данные плохо сопоставимы и не поддаются количественной оценке. В палом значимость трансовариальной передачи боррелвй как одного из факторов, определяющих уровень зараженности взрослых клешей и, следовательно, влияющего на риск зараженности человека и интенсивность эпидемического проявлення природных очагов ИКБ, оставалась слабо изученной. Это определило цель и задачи диссертационной работы.

Цель работы

Изучить возможность трансовариальной передачи боррелий у нх важнейшего переносчика в Евразии - клеша /, persulcatus, в опенить частоту этого феномена у естественно зараженных клетей в природных очагах.

Зждачн исследования

1. Провести сравнительную опенку результативности индикации боррелий у естественно зараженных клешей традиционным методом темнопольной микроскопии и методом полимеразкой цепной реакцией (ПЦР) с прайм ерами, специфичными в отношении хонсервативньи последовательностей Ä burgdorferi 16S рРНК гена;

2. Оценить вероятность присутствия боррелий в яйцах, полученных от спонтанно зараженных клешей I persulcatusr,

3. Оценить результативность трансовариальной передачи пут£м индюсацни СоррслиЙ в голодных личинках дочернего поколения, полученных из яйцекладок спонтанно зараженных самок I. persuicatus;

4. Проанализировать значение трансовариальной передачи боррелий у тавжного клеша как одного из факторов, способных влиять на интенсивность эпизоотического процесса и эпидемического проявления природных очагов И КБ в нашей стране,

Научная новизна:

- впервые на репрезентативном материале показана эффективность применения метода ПЦР для изучения трансовариальной передачи боррелий у нх основного переносчика - клеша I. pcr$uicatus\

- получены данные, подтверждающие наличие геномной ДНК В. burgdorferi sensu lato в яйцах спонтанно инфицированных самок клеша I. persuicatus, что свидетельствует о способности зараженных самок инфицировать свои яйцекладки;

* впервые на репрезентативном материале оценена степень результативности трансовариальноЙ передачи боррелий спонтанно зараженными самками / репи1сапа голодным личинкам дочернего поколения;

- проанализировано значение вертикальной передачи борреяий у таёжного клеша лдя их циркуляции в природных очагах И КБ в России.

Практически« значимость. Показано, что при определении уровня зараженности клещей I. репи!саш боррслиями более дорогой и сложный метод ПЦР по своей результативности не имеет существенных преимуществ перед темнопольной микроскопией витальных препаратов. Поэтому в практической работе санэпидслужбы при осуществлении мониторинга за состоянием природных очагов 11КБ массовые исследования клещей с згой целью могут осуществляться методом темнопольной микроскопии витальных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 11 Интернациональных курсах по биологии переносчиков инфекций (Чехия, Чешские Буде4виие, нюнь 2001 г.), межрегиональной научно-практической конференции ко яриродно-очаговым инфекциям, посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, октябрь 2001 г.). Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по иксодовым клешевым боррелиозам (Ижевск, ноябрь 2002 г.) и на VII Интернациональном Потсдамском симпозиуме по клешевым инфекциям (Германия, Берлин, март 2003 г.).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела приро дно-очаговых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 15 октября 2003 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем работы. Диссертационная работа состоит щ введення, двух глав обзора литературы, собственных исследований, включающих описание материалов и методов, результаты и нх обсуждения, заключения и выводов н списка литературы, включающего 333 источника, го них 272 зарубежных. Работа издожена на ] 19 страницах, иллюстрировала 8 таблицами, 1 б рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа основана на результатах исследований разными методами голодных и напитавшихся самок I. persukatus> яиц и голодных личинок дочернего поколения го нх кладок. Сравнительный анализ результативности индикации Я burgdorferi sensu lato методами темно польной микроскопией и ПЦР выполнен на голодных самках I. perstilcatus собранных в природе. Дія изучения феномена вертикальної! передачи боррелий использовали потомство спонтанно инфицированных особей таЕжного клеща.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеши. Голодные взрослые клещи /, persuicatus собраны с растительности на флаг в мае-июне 1999 г. в период сезонного максимума их численности в Чусовеком районе Пермской области, на территории, где циркулируют Borrelia garínil и А феііі По данным многолетних исследование общий уровень зараженности голодных имаго по результатам темнопольноб микроскопии составляет здесь в разные годы 29,5*60,8% (ЕЛ. Rotenberg et ai, 1999).

Живых клешей разного пола помешали в отдельные пробирки, и некоторое время содержали при температуре +4 'С. Из них для работы были отобраны три группы клешей (табл. 1;рис. 1).

Первая группа - голодные самки / рекиїсапа, которых исследовал? методом микроскопии фиксированных мазков яа присутствие боррелий в яичниках.

Вторая группа - голодные самки, параллельно тестированные методами темнополшой микроскопии и ІІЦР на зараженность боррелиями.

Третья группа - напитавшиеся самки, отобранные для экспериментального изучения феномена трансовариальной передачи боррелий; клешей содержали в лабораторных условиях в отдельных проборках с дифференцированной влажностью по методике Е.Н. Нельзяной (1951).

В обшей сложности, от 20 напитавшихся и завершивших яйцекладку самок І. репиісааа были получены 19 яйцекладок, 17 из которых яали вылинявших личинок. Яйца и голодных личинок, отобранных из разных частей каждой кладки, исследовали параллельно несколькими методами: посевом на среду В5К Н, ПЦР и микроскопией фиксированных мазков.

Таблям* І. млтїрялл

ИССЛЬДОВАНО МЕТОДЫ

ПОСМ НА СРЕДУ ВХК II лиг МИКРОСКОПИЯ ФИКСИРОВАННЫХ МАЗКОВ ТЬМНОПОДЬПЛЯ МИКРОСКОПИЯ ВСЕМИ МЕТОДАМИ

голодных САМОК - 105 » 205 Зої

НАПИТАВШИХСЯ САМОК - 20 - • 10

япц 660 7719 16« - »мз

ГОЛОДНЫХ личинок «00 781 141« 2797

Рвеумо* 1. ОБЩАЯ С*£ЧА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

в

В качестве отрицательных контролен при микросхошш фиксированных мазков и ПЦР использована cauta 1. ricinus, полученная из лабораторной колонии иеззраженных клешей Института Зоологии, Швейцария, а также яйца и личинки из ей кяадки.

Лабораторные жипотпые. Кормление клещей для получения яйцекладок производили на беспородных белых мышах разного пола, 2-4 месячного возраста.

Измяты. Специфичность ПЦР оценивалась иа панели образцов ДНК разных видов спирохет из музе« боррелий лаборатории переносчиков инфекций НИИ эпидемиология и микробиологии км. Н.Ф. Гамалея РАМН:

а) группы & burgdorferi sensu lato - Borrelia afzelil (типовой штамм Ip-21, выделен В Л. Крючечкиковым от взрослого клеща I. persulcants в 1987 г. из Ленинградской области); Borrelia garinii (изоляг Ipt-4906, выделен HS. Гореловой от напитавшейся личинки / penulcmus в 2000 г. из Пермской области); В. burgdorferi sensu stricto (типовой штамм B3I АТСС 352! О, вшелеииый от клеща Ixodes dammini в 1982 г. в США, предоставленный Dr. А. ВагЪоиг, и штамм TxGW, изолированный от больного человека в 1986 г. в США, предоставленный Dr. R. Johnson); Borrelia valaislana (изолят Ir-4804, выделен HJ>. Гореловой от клеша Ixodes ricinus в 2000 т. га Краснодарского края);

. б) группы возвратных клещевых лихорадок - Borrelia persica (штамм Ьатыр НТ-20, выделен ЕЛ. Резник в 1988 г. от клетей Ormthodoros papülipes из Узбекистана); Borrelia recurrerals (кровь мышей, инфицированных культурой, предоставленной Prof J. Chalupsky, Чехия); Borrelia hermsü, серотиц С (изолят, выделен из крови больного в 1990 г. в США, предоставлен Dr. А ВагЪоиг);

в) лептоспнр - Leptospira ЬЩеха серовар patoc Patoe / (га музея лаборатории дептосгшрозов НИИ эпидемиологии и мшфобиологин им. Н.Ф, Гамалеи РАМН).

Доя контроля и правильной интерпретации результатов ПЦР использована ДНК Д afzelil типового штамма 1р-21.

Темыопольпяя микроскопия. Витальные препараты нз голодных самок готовили по описанному раннее способу (Ю.В. Ковалевский и др., 1990) с использованием обезжиренных предметных стекол не более \2 мы толщиной и покровных стекол 1$ х 18 мм. Материал (содержимое средней кишки) равномерно распределили по плошада 0.7-0.8 см1. Препараты просматривали под общим увеличением 600х, с иммергируемым дистиллированной водой темнооояшым конденсором ОИ -ІЗ. В каждом препарате просматривали 250 полей зрения при общем увеличении хбОО.

Микроскопия фиксированных мазков. Содержимое яйца, раздавленного препаровальной иглой, накосили на предметное стекло. Препараты из голодных личинок и яичников голодных самок готовили по описанному ранее методу (МЛ. Левин и др., 1993). Мазки высушивали, фиксировали над пламенем спиртовки и затем окрашивали по Романовскоыу-Гимга с докраской 1% раствором кристаллического фиолетового в течение 30 мин. В каждом препарат« просматривали 250 полей зрения при обшем увеличении хбОО.

Концентрацию боррелий и витальных и фиксированных препаратах выражали средним количеством микробных клеток на 100 полей зрения, используя количественные статистически обоснованные градации (Ю.В. Ковалевский и др., 1991).

КулыуральпыП метод. Яйца и голодных личинок исследовали группами: яйца - по 50 экземпляров в каждой, а личинок - по 10 экземпляров в каждой. Перед посевом их промывали в стерильных чашках Петри в 70° этаноле, стерильной дистиллированной воде и 0,9% NaCL Посевы материала яиц проводили внесением их суспензии, полученной после измельчения в гомогенизаторе, в 200 мкл среды или путем прокалывания оболочки яиц, находившихся в культуральной пробирке, препаровальной иглой. У личинок под бинокуляром асептически удаляли гнатосому и конечносте, а тело клеша переносили непосредственно в пробирку со средой (Н.Б. Горелова и др., 1996). Посев материала проводили на среду BSK. II без антибиотиков. Для культивирования использовали стерилыше полистириновые пробирки с герметически завинчивающимися крышками,

объемом 2 мл, на 3/4 заполненные средой. Посевы инкубировали при 32 °С в течение 2 мес. Наличие боррелий а них контролировали еженедельным просмотром 100 полей зрения под микроскопом с темвопольным конденсором при обшем увеличении хбОО.

Метод ПОР.

Подготовка проб. Предназначенные для исследования образцы, промытые в 70° этаноле и дистиллированной воле, высушивали на фильтровальной бумаге н помешали в 1,5 мл пробирки типа "Eppendorf, которые хранили яря -70° до момента исследования. Выделение геномной ДНК боррелий из биологических образцов проводили с помощью гуанидинтиопнаяата и фенола/хлороформа по методике А.Е. Гущина, Э.М. Халнлова (1996). При необходимости пробы хранили при -20 °С.

Амплификация. Полимеразную ценную реакцию проводили в четырехканальном термошіклере Терцик" НПО «ДНК-Технология» (Россия, Москва). Реакционная смесь объемом 25 мкл включала реаншо кный буфер (67 мМ Трис-HCl, pH 8,6; 16,6 мМ (NHi^SO«; 2,5 мМ MgClj! 0,001% Тритон Х-100; 0,12 мг/мл БСА), дезоксирибоиуклеопиприфосфаты (JATP, JCTP, dGTP, dTTP) в конечной концентрации 0,2 мМ, 15 рпю! каждого прайм ера, 1,5 ел. фермента Taq-полимеразы и 10 мкл исходной ДНК-матрнкы. На поверхность смеси наносили 15 мкл стерильного вазелинового масла. Использованы консервативные праймеры (ВВІ tt ВВ2), фланкирующие фрагмент Borrelia burgdorferi 16S рРНК гена размером 244 нары нуклеотидов (Т. Adam et al, 1990). Олиюнуклеотиды синтезированы амндофосфишым методом в ЗАО «Синтол» (Россия, Москва). Амплифнкашю ДНК осуществляли по J.A. Salinas-Melandez et al. (1995) с некоторыми коррективами. Программа ПЦР доя В. burgdorferi sensu tato включала: 5 циклов при 94 °С - 1 мин., 40 "С - 1 мин., 72 "С - 1 мня., затем 30 циклов в режиме 94 °С - 1 мин, 50 °С - 1 мин., 72 ®С - 1 мин. Специфичность метода составила 100%. Чувствительность - 100 боррелий в анализируемой пробе.

Анализ ампяифицщкманпой ДНК проводили методом горизонтального электрофореза в 1-2% агорозяом геле в присутствии бромистого этндня и трис-ацетатвого буфера при

напряжении 165 В. Для анализа агарозных гелей использована видеосистема "DNA Analyser** с программами "Gel-lmager" и "Gel-analysis" версии 1.0.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Для определения различий между количественными признакам» двух групп использовался критерий Стьюдента. При р<0,05 различия считались достоверно значимыми. Для определения различий по количественным признакам использовался метод Фишера, критерий хн-квадрат.

Для расчета возможной индивидуальной зараженности яиц в кладках напитавшихся самок тавжного клеша применена формула В.Н. Беклемишева (1963):

Pv-e", A/=-W„, где Л - указанная вероятность; е - основание натуральных логарифмов; М - среднее число зараженных клещей (яин) на одну партию во всем материале.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение результативности методов ишшкшин боррелий темиопмымй микроскопией и полчмерязной цеппой реакцией (ПЦР)

Для опенки целесообразности применения метода ПЦР с целью изучения трансоварнальноЭ передачи В. burgdorferi seosu lato была исследована его результативность в сравнении с обычным методом выявления боррелий темнопольной микроскопии.

Результаты обоих сравниваемых методов нндикацни боррелий свидетельствовали о высоком уровне зараженности клешей (48,8% и 61,0%), однако, методом ПЦР было выявлено примерно на 10% больше инфицированных особей, чем темнопольной микроскопией (табл. 2). При этом различия показателей зараженности клешей, полученных разными методами, вполне достоверны (критерий Стьюдента

ТМмщ t, ОБЩИЕ югльпты исследования игтщкюго мтлмив ГОЛОДНЫХ КЛЕШЕЙ IXODES

м RSU1CAT1.S методами темнооолымя! мякгоскошш н пцр

МЕТОД ИССЛВДОВАНО клешей Ю НИХ ЗАРАЖЕНО ЧИСЛО ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛСШЕВ, RE ВЫЯВЛЕННЫХ (ТА ВНИЯАЕМЫМ МЕТОДОМ

две. АБС.

ТЕМпоиолыия мшооскопня I« too 4S,8*7,0 5

nur 203 115 ЗЛ

В большинстве случаев (около 70% исследованных особей) оба метода показали идентичные результаты, но, данные в обшей сложности по 35 клешам ю 205 (2б.9±7.8%) не совпали. Главным образом это произошло из-за того, тп> методом ПЦР удалось обнаружить возбудителя у 30 клешей, у которых он не был выявлен темнополыгой микроскопией. Вместе с тем 5 проб, подготовленных из достоверно зараженных клешей, оказались негативными в ПЦР.

Результаты исследования клещей методом ПЦР при разном уровне их индивидуальной зараженности, выявленной темпопльной микроскопией, показывают, что этот метод позволил выявить СоррелиЙ у 28,6% клешей, которые были отнесены к числу незаряженных на основании просмотра 250 полей зрения в каждом аз соответствующих витальных препаратов. Вместе с тем ПЦР не выявил в обпей сложности примерно 8% клетей, содержавших борредий в достаточной концентрация (более 10 на 100 полей зрения). Несомненно, ПЦР дает лучшие результаты по сравнению с темнопольной микроскопией витальных препаратов, когда образец содержит очень небольшую концентрацию бактериальных клеток. Высокий уровень зараженности клещей, выявленный методом ПЦР, основан на обнаружении возбудителе у особей, содержащих единичные спирохеты. В природных очагах ИКБ переносчики, содержащие большое количество возбудителя.

составляют лишь незначительную часть зараженных клешей; преобладают особи, содержащие минимальное количество боррелий (Ю,В. Ковалевский н др., 1991, 2001; Yu.V. Kovafevsky, Ei, Koren^erg, 1995). В целом, наши данные показывают, что ори выявлении зараженности клешей борреладми, метод ПЦР, несмотря на несколько болыпую чувствительность, не имеет существенных преимуществ перед теыяопольной микроскопией.

Вероятность присутствия боррелий » ийши, полученных от смоитшшо зараженных клепиЙ /. pmulcatus

В соответствии с предложением W. Burgdorfer, M.G.R. Vanna (1967), мы оценивали уровень траясовариаяьной передачи и ей интенсивность двумя показателями: 1) процентом самок передавших агент своему потомству и 2) процентом инфицированного потомства происходившего от инфицированной самки.

В яичниках 3 голодных самок из 96 исследованных (около 3%) методом микроскопии фиксированных мазков была выявлены спирохеты. ДНК боррелий обнаружена также у 16 (80,0*17,9%) напитавшихся самок из 20 исследованных, что свидетельствовало о потенциальной возможности их трансовариальиой передачи.

Всего от самок получено 19 яйцекладок. ДНК боррелий выявлена примерно в пятой части Пулов по 10 яиц и в трети пулов по 20 яиц, полученных от напитавшихся самок. Способность зараженных самок передавать боррелий трацеовариолыю подтверждается выявлением ДНК боррелий в 65 пробах (Зб.5*7,2%> из 178по20яицнв81 пробе (21,4*4,2%) из 378 по 10 яиц. Возможная индивидуальная зараженность яиц в кладке, рассчитанная по формуле В.Н. Беклемишева, по результатам исследования пулов по 10 яиц составила 0,5 - 23,0%, а по данным исследования пулов по 20 яиц - 0,4 - 8,0%. Тем не менее; средние значения индивидуальной зараженности яиц из этих кладок составили 2,4 и 2,2%, соответственно (рее. 2).

Р)і(у>№КІ [)(»ка14гтии»ГЛЖГИН0СТНЯИЦ, IICcmiOSAHHUX гру n новы м cvc і інпионнм м мггодоч в разных кдляках (рлссчотлно по формуле b.ii. беклемишева, 1мі)

□дня пулов по 10 яиц

□для пулов по 20 яиц

КраСкц, полученные am напитавшихся сеиок bodes petsuicelus

Однако в 370 яйнах, исследованных индивидуально методом ПЦР, ДНК боррелий не обнаружена. Микроскопия 1683 фиксированных мазков, приготовленных из яиц и попытки изолировать Я burgdorferi sensu lato путем посева на среду BSK II яиц, также не дали положительных результатов.

Частота (вероятность) присутствие боррслий в голодны! лнишкат

Боррелии выявлены только в нескольких препаратах личинок, происходивших из одной и той же кладки. Самка, отложившая эту кладку, была единственной (из 16 инфицированных), передавшей боррелии через яйца личинкам дочернего поколения. Уровень зараженности личинок, вылинявших из яиц этой кладки, составил всего 7%, а степень их индивидуальной инфшшрованности была очень низка: 0.4-0.8 боррелий на 100 полей -зрения, У голодных

IS

личинок, вылинявших из инфицированных яйцекладок, ДНК боррелий ив обнаружена. Негативными оказались также и посевы.

Полученные данные свидетельствуют о присутствии геномной ДНК боррелий в яйцах, полученных от спонтанно зараженных самок /. penulcalus и, следовательно, о принципиальной возможности трансовариальной передачи ими этих спирохет. Однако, у личинок, вылинявших из этих яиц, ДНК боррелий отсутствовала или, возможно, была в чрезвычайно низкой концентрации. Это свидетельствует об уменьшении числа яии, инфицированных боррелиями или о потере возбудителя на этапе развития яиц и вылиниваноя личинок. Нельзя исключить также возможность гибели боррелий в процессе овогенеза, что подтверждается малым количеством их в яйцах и личинках.

Реализация трансовариальной передачи возбудителей, как известно, зависит от частоты генерализованной инфекции в материнском организме переносчиков и возможности проникновения инфицирующего агента в генеративные органы членистоногих до окончания формирования наружной кутикулярной оболочки яиц, причем концентрация агента должна быть достаточной для преодоления "яйцевого барьера" (A. Aeschlimann, 1958; W. Burgdorfer, M.G.R. Varma, 1967).

Для боррелий группы ИКБ кишечник клеша (W. Burgdorfer et al, 1988; W. Burgdorfer, S.F. Hayes, 1989; Э.И, Коренберг, 1996), по всей видимости, является нормальной средой их обитания и репродукции, а гемолимфа не является для этих спирохет средой, в полной мере отвечающей их жизненным потребностям (J.L. Bettach et al., 1987; R.S. Lane, W, Burgdorfer, 1987; W. Burgdorfer et al, 1988; W. Burgdorfer, S.F, Hayes, 1989). Генерализованная инфекция у клешей рода Ixodes явление заметно более редкое, чем у клешей рода Or-nithodoros - переносчиков аргасовых клещевых боррелиозов. По данным Г.Г, Москвипшой и др. (1995) генерализованная инфекция выявлена у 12,9% особей I. persulcatus. В нашем исследовании, боррелии присутствовали в яичниках у 3 голодных самок таежного клеша из 96 исследованных (примерно 3%), или 11,5% от общего числа инфицированных самок.

Поэтому, как показывают ваши данные, вертикальная передача спирохет В. burgdorferi sensu lato иксодовыьш клещами I. perstdcatus происходит реже, чем возбудителей АКБ, у которых она обычно наблюдается более чем в половине случаев (А.Н. Скрыиник, 1954; А. АежЫшшт, 1958; В.В. Слесаренко, К .А. Дунаевский, 1964; W, Burgdorfer, M.G.R. Varma, 1967; M.S. Gaber et aL, 1984).

По вашим данным процент спонтанно зараженных самок 1. perstdcatus, передавших боррелнй трапсовариально личинкам дочернего поколения, составил 6,2%. Процент личинок, получивших спирохеты через яйца — 0,5%. Это свидетельствует о том, что траноовариальная передача боррелнй своему потомству редко осуществляется зараженной самкой /. perstdcatus. В тех случаях, когда она имеет место, не все личинки в её кладке могут быть заражены спирохетами.

Итак, судя по полученным нами данным, трансовариальная передача боррелнй у клеша /. perstdcatus возможна, но ев вероятность очень мала. На функционирование природных очагов ИКЕ в России, решающее воздействие, по всей видимости, оказывают процессы горизонтальной и трансфазовой передачи возбудителя, причем определяющее влияние на уровень зараженности голодных взрослых клешей /. perstdeatm, очевидно, оказывают показатели инфшшроваяаости напитавшихся нимф. По данным многолетних исследований обший уровень зараженности личинок по результатам посева на среду BSK II составляет в разные года для голодных 0-2ДЇ4, для снятых со зверьков - 8,3-59,1%. Изучение многолетней динамики эпизоотической активности природных очагов, проведенное нами в составе эшщотрада лаборатории переносчиков инфеший, выявило тесную корреляцию уровня зараженности взрослых клешей боррелиями с многолетними колебаниями численности лесных полевок рода Clethrionomys (рис. 3).

Снсумк Л МНОГОЛЕТНЯЯ ЛИПАМIIКл ЧИСЛЕННОСТИ РЕ1ЕРВУЛРИЫК ХШЯЕВИ УРОВНЯ ЗЛРЛЖеМНОСТИ |111!НФ Н IIЧЛГО ¡\ODES КЯЗЧ1.С* ТИ$ БОРГСЛПЯМН

140 120 100 во 60 | 40 I 20 ^

8

1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Годы

| ' Зараженность нимф I" 111 Зараженность имаго

—Численность резервуарных хозяев

Коэффициент корреляции (г) между уровнем зараженности (слешей боррелнями и обилием этих зверьков в предшествующем году составил для нимф 0.73, а для имаго 0,84. Подобная динамика эпизоотической активности природных очагов ИКБ в Приуралье, в конечном счете, определяет многолетнюю динамику их эпидемического проявления.

ВЫВОДЫ

], Результаты впервые проведенного параллельного исследования голодных самок 1х(к1е5 репи1саш, собранных в природе, на зараженность боррелигми методами темнопольной микроскопии и ПЦР с праймерамн, специфичными в отношении

консервативных последовательностей В. burgdorferi 16S рРНК гена, показали, что метод ПЦР как более чувствительный может быть применен для изучения трансоварвальной передачи боррелий. Этим методом боррелии выявлены примерно у 30% самок, у которых их не удается обнаружить при микроскопии 250 полей зрения в каждом витальном препарате. Вместе с тем для массовых исследований клешей 1. persulcants из природных очагов на зараженность борреяиями более дорогой и сложный метод ПЦР ие имеет существенных преимуществ перед темнопольвой микроскопией витальных препаратов.

2. Показано, что спонтанно инфицированные самки таежного клеща, как правило, способны передавать боррелии трансоварнально: яйца из их кладок содержат ДНК В burgdorferi sensu lato. Однако индивидуальная зараженность яиц в кладках незначительна и составляет в среднем менее 2,5%.

3. Впервые установлено, что дальнейшая вертикальная передача боррелий от яиц личинкам дочернего поколения происходит избирательно и крайне редко: ДНК боррелий не выявлена при исследовании методом ПЦР более 750 личинок из кладок зараженных самок. Микроскопией фиксированных препаратов типичные боррелии выявлены только у 7% личинок в потомстве одной инфицированной самки; по данным, полученным этим методом, доля личинок, получавших боррелии от инфицированных самок, составляет во всех их кладках примерно 1,4%. Индивидуальная ннфшшрованность этих личинок была очень низкой и составила 0.4-0.8 боррелий на 100 полей зрения.

4. Впервые показано, что трансоваряальпая передача BorrelUt burgdorferi sensu lato у их важнейшего в Евразии переносчика — таежного клеща /. persulcatus, практически не имеет заметного значения для поддержания циркуляции этих спирохет, формирования показателей зараженности взрослых клешей следующей генерации, и, следовательно, слабо влияет на эпидемическое проявление природных очагов ИКБ.

СПИСОК ГАВОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TFA1E ДИССЕРТАЦИИ

1. Нефедова В.В., Коренберг Э,И„ Нестеренко JLH., Гинцбург АЛ., Ко&алевский Ю.В., Горелова Н.Б. Сравнительная опенка результативностн индикации боррелий в иксодобых клешах (Ixodidae) методами темно польной микроскопии и полимеразной иешгой реакции (ПЦР)//Паразитология. -2001. -Т. 31,вып. 1.-С.З-8;

2. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Шашина Н.И., Нестеренко J1.H. Индикация Borrelia burgdorferi sensu lato в яйцах спонтанно зараженных клешей Ixodes persulcatus // В кн.: Актуальные аспекты природно-очаговых болезней. Омск, 2001. - С. 116-117;

3. Нефїдова B.D., Коренберг Э.Н., Горелова Н.Б., Москвитниа Г.Г., Шашнна Н.И. Результаты изучения вертикальной передачи боррелий спонтанно инфицированными самками таежного клеша// В кн.: Клетевые боррелнозы. Ижевск, 2002. - С. 210-212;

4. Ковалевский Ю.В., Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., НефСпова BJJ. Многолетняя динамика эпизоотической активности природных очагов И КБ Западного Урала // В кн.: Клещевые боррелнозы. Ижевск, 2002.-С 149-151;

5. Ковалевский Ю.В., Горелова Н.Б., Нефедова В.В. Уровень зараженности и степень инфкцнро ванвостн борреяиями голодных клешей Ixodes persulcatus разного пола // В кн.: Актуальные аспекты природно-очаговых болезней. Омск, 2001. - С. 118-119;

6. Москвптина Г.Г., Коренберг Э.И., Нефёдова В.В., Ковалевский Ю.В., Горелова Н.Б. Динамика содержания боррелий в спонтанно зараженных голодных имаго таежного клеща // В кн.: Клешевые боррелнозы. Ижевск, 2002. - С 205-207;

7. Nefedova V.V., Korenberg ПЛ., Gorelova N.B., Kovalevskii Y.V, Studies on the transovarial transmission of Borrelia burgdorferi sensu lato in the Ixodes persulcatus tick // VII International Potsdam Symposium on Tick-Bome Diseases (1 PS-VII) - Berlin, 2003. - С 14;

8. Нефедова В.В. Индикация Borrelia burgdorferi sensu lato в личинках таежного клеща, полученных от спонтанно инфицированных самок // Мед. паразитол. - 2003. - №3. - С

18-20.

Принято к исполнению 25/12/2003 Исполнено 26/12/2003

Заказ №481 Тираж; 100 эю.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www. autoreferal ,m

It -2 674