Автореферат и диссертация по медицине (14.03.11) на тему:Восстановительное лечение слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта с применением ниосомального геля "Регенерин"

На правах рукописи

ГУКАСЯН АРАМ ЛАВРЕНТЬЕВИЧ

ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ЛЕЧЕНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА И КРАЕВОГО ПАРОДОНТА С ПРИМЕНЕНИЕМ НИОСОМАЛЬНОГО ГЕЛЯ «РЕГЕНЕРИН»

14.03.11- восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия Ы^гЗрРГ- стоматология

Ч.ф

АВТОРЕФЕРАТ

15 >;;:з 2015

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь 2015 005557122

005557122

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Базиков Игорь Александрович доктор медицинских наук, профессор Зеленский Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

Куликова Наталья Геннадьевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой физиотерапии факультета повышения квалификации медицинских работников Российского университета Дружбы Народов

Чижикова Татьяна Степановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры стоматологии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится «Ю» О/ 2015 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.015.01 при ФГБУ ПГНИИК ФМБА России по адресу: г. Пятигорск, пр. Кирова, 30

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ПГНИИК ФМБА России по адресу г. Пятигорск, пр. Кирова, 30 и на сайте

http://www.gniik.ru/index.php/dissert-sovet/zashiti-dissert-test/viewcategory/4.

Автореферат разослан [I 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук

Е.Н. Чалая

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Поражения слизистой. оболочки рта и краевого пародонта возникают в результате действия различных местных факторов (механических, физических, химических). В результате нарушается целостность эпителия, что служит входными воротами инфекции. После образования болезненных эрозий и язв нередко присоединение вторичной микрофлоры. Это усложняет развитие воспалительного процесса слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта, особенно в тех случаях, когда существует дисбактериоз.

Ведущая роль в развитии воспалительных заболеваний краевого пародонта принадлежит мягкому бактериальному налету, располагающемуся на минерализованной поверхности зубного камня, аккумулирующего эндотоксины и являющегося основанием для продолжения собственного роста.

Полученный и систематизированный за последние годы материал доказывает ведущую роль в формировании воспалительного процесса в полости рта резидентной облигатной анаэробной и микроаэрофильной микрофлоры. Из более 700 видов выделенного с помощью современных технологий генетического материала микроорганизмов, заселяющих полость рта при патологии краевого пародонта доказана роль только незначительного числа микроорганизмов.

Необходимость изучения корреляционных связей между степенью выраженности морфологических изменений и количественными параметрами резидентной и пародонтопатогенной микрофлоры с помощью микробиологического и молекулярно-генетического методов детекции продиктована повышением эффективности восстановительного лечения слизистой оболочки полости рта и сраевого пародонта.

Клеточные препараты в форме геля оказывают непосредственное шияние на заживление ран (Ross А., 1968), в частности, на их шителизацию (Coulomb В., et al., 1998). Многие факторы роста и шологически активные вещества, продуцируемые

шзкомолекулярными пептидами, выделенными из плацентарных слеток, стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных

кератиноцитов, ускоряя процессы регенерации и эпителизации поврежденных тканей. Использование низкомолекулярных пептидов в .форме геля является перспективным методом восстановления целостности эпителия слизистой оболочки рта и патологии пародонта для предупреждения образования рубцовых деформаций.

Необходимость разработки нанопрепаратов местного действия для лечения заболеваний пародонта, появилась в связи с новыми подходами к созданию носителей лекарственных веществ. Новая область наномедицины - применение системы доставки лекарств, с помощью наночастиц различной природы, открыла возможности использования инновационных подходов и для лечения ряда заболеваний пародонта. Принцип адресной доставки - сокращение общего количества вводимого препарата в сочетании с оптимизацией его активности, является перспективным и для лечения таких заболеваний, как повреждения слизистой оболочки полости рта и пародонтита.

Наиболее изученными переносчиками в области лекарственной терапии являются липосомы и ниосомы. С 1990-х годов, неионогенные везикулы ПАВ рассматриваются в качестве альтернативы липосомам как носители лекарств (Manconi et al.,2006). Преимущества ниосом включают 1) более высокую чистоту и стабильность неионногенных поверхностно-активных веществ по сравнению с фосфолипидами, (т.е.деградацию путём окисления и гидролиза) (Vora et al.,1998), 2) возможность массового производства без использования органических растворителей (Fang et al.,2001), 3) контроль скорости высвобождения лекарственных препаратов и адресация лекарств (Tabbakhian et al., 2006) путём модификации их состава или поверхности (Alsarra et al., 2005; Schreier and Boustra, 1994).

Таким образом, представляет интерес совершенствование лечения заболеваний пародонта и повреждений слизистой оболочки полости рта с применением разработанного ниосомального геля «Регенерин» при изучении микробиоценоза.

Результаты корреляционного анализа с помощью микробиологического и ПЦР-методов, как интегрального показателя микробиоценоза, позволят объективно оценить стоматологический

статус и обосновать целесообразность применения разработанного препарата.

Цель исследования - повышение эффективности восстановительного лечения слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта с помощью разработанного ниосомального геля «Регенерин».

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить основные пародонтопатогенные виды резидентной облигатной анаэробной и микроаэрофильной микрофлоры полости рта помощью микробиологического и ПЦР-методов.

2. Отработать оптимальные методы выделения низкомолекулярных пептидов из клеток плаценты.

3. Изучить размеры и стабильность ниосом кремнийорганической природы.

4. Разработать технологию получения ниосомального геля «Регенерин»

5. Изучить токсичность геля на лабораторных животных.

6. Оценить стимуляцию регенераторной способности слизистой оболочки рта после применения геля «Регенерин».

7. Изучить гистологические особенности патологии пародонта в эксперименте при применении геля «Регенерин».

8. Провести количественную оценку содержания пародонтопатогенной, а также резидентной микрофлоры в биоплёнке десневой борозды при восстановительном лечении разработанным гелем «Регенерин».

9. Оценить клиническую эффективность применения геля «Регенерин» у больных пародонтитом и повреждениями слизистой оболочки полости рта.

Научная новизна исследования.

1. Впервые применение молекулярно-генетических технологий в лабораторной диагностике, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью, позволило установить и идентифицировать патогенную микрофлору при достоверной и объективной оценке эффективности восстановительного лечения ниосомальным гелем «Регенерин».

2. Впервые в эксперименте отработаны оптимальные методы получения низкомолекулярных пептидов и разработана технология их инкапсулирования в кремнийорганические нановезикулы, а также дана оценка их свойств.

3. Впервые разработаны фазы приготовления и рецептура ниосомального геля «Регенерин» для восстановительного лечения повреждений слизистой оболочки рта и краевого парадонта различной этиологии.

4. Разработанные в эксперименте модели механической, химической и физической травм слизистой оболочки полости рта и пародонта для оценки эффективности разработанного геля, являются основой для дальнейших исследований особенностей течения патологических процессов в слизистой оболочке рта и способов их лечения с применением клеточных технологий.

5. Впервые в эксперименте и в клинических исследованиях продемонстрирован терапевтический эффект восстановительного лечения гелем «Регенерин» при заживлении различных поражений слизистой оболочки рта и краевого пародонта.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Отработана технология получения низкомолекулярных пептидов из клеток плаценты. На основании проведённых исследований разработана технология инкапсулирования полученных пептидов в кремнийорганические нановезикулы. Разработаны фазы приготовления и рецептура стоматологического ниосомального геля для восстановительного лечения различных поражений слизистой оболочки рта и заболеваний пародонта. Эффективность препарата изучена на больных. Результаты исследований внедрены в работу практического здравоохранения стоматологических учреждений Ставропольского и Краснодарского краев, а также используются в учебном процессе на кафедрах стоматологии СтГМУ. Разработаны технические условия (ТУ) для производства препарата на базе ООО НПО «Клеточные технологии», г. Ставрополь.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Адекватным показателем, отражающим интенсивность морфологических и функциональных нарушений при поражениях

слизистой полости рта и краевого пародонта является увеличение частоты выявления генетических маркеров наиболее вирулентных пародонтопатогенов (РогрИугошопаз gingivalis, Ва^екмёев ГогзуЛиз) в десневой жидкости.

2. Факторы роста и биологически активные вещества, продуцируемые низкомолекулярными пептидами, выделенными из плацентарных клеток, стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных кератиноцитов, ускоряя процессы регенерации и эпителизации поврежденных тканей. Эти свойства позволили использовать выделенные пептиды для получения ниосомального геля.

3. Разработанная технология иммобилизации низкомолекулярных пептидов в кремнийорганические нановезикулы позволила получить ниосомальный гель с высокой регенерирующей способностью.

4. Экспериментальные данные, полученные при изучении морфологических изменений после сравнительного восстановительного лечения поражений слизистой оболочки рта и краевого пародонта с использованием ниосомального геля «Регенерин», продемонстрировали ускорение регенерации, оптимизации процесса заживления и препятствие возникновению возможных осложнений.

5. Ниосомальный гель «Регенерин» не обладает токсичностью, а результаты проведенных клинических исследований свидетельствуют о его эффективности по сравнению с другими препаратами, предназначенными для восстановительного лечения поражений слизистой оболочки рта и краевого пародонта.

6. Существенное снижение диагностических показателей анаэробной пародонтопатогенной микрофлоры при наличии генетических маркеров пародонтопатогенов в десневой жидкости при лечении стоматологическим ниосомальным гелем «Регенерин» является информативным, диагностически значимым тестом в оценке эффективности восстановительного лечения слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта .

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на международных, всероссийских и региональных конференциях, конгрессах и симпозиумах: 8 итоговая конференция молодых учёных с международным участием, СтГМА, Ставрополь, 2010 г.; 17-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья. 19-21 сентября 2013 г.; II международная конференция «Инновационные разработки молодых ученых - развитию агропромышленного комплекса», Ставрополь 2021 сентября 2013г.; V Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 6 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 132 страницах компьютерного текста и включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 113 отечественных и 121 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 45 рисунками и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Объем, материалы и методы исследования:

Работа выполнялась в течение 2010-2014 гг. на кафедрах микробиологии (заведующий - профессор И.А. Базиков), общей стоматологии (заведующий - профессор В.А.Зеленский) и научно-образовательного центра медико-биологических проблем

Ставропольского государственного медицинского университета. Разработка технологии стоматологического ниосомального геля «Регенерин» проводилась на базе НПО «Клеточные технологии», Ставрополь.

Исследование проводилось в три основных этапа. На первом -применялись микробиологические и молекулярно-генетические технологии для установления и идентификации патогенной микрофлоры полости рта.

Второй этап включал создание стоматологического ниосомального геля. На третьем этапе работы оценивалась его эффективность и безопасность.

Материалом лабораторно-диагностических исследований служил экссудат зубодесневой борозды, полученный при обследовании 108 пациентов, обратившихся на кафедру стоматологии общей практики СтГМУ, имеющих повреждения слизистой оболочки полости рта и заболевания пародонта (средний показатель индекса РМА - 12±0,9%), из которых были сформированы контрольная и две группы наблюдений. Контрольную группу составили 24 пациента, находящихся на диспансерном наблюдении без патологии. Первая группа с повреждениями слизистой оболочки полости рта. Вторая группа с заболеваниями пародонта. Контроль гигиенического состояния полости рта проводился с помощью гигиенического индекса [Green J.C, Vermillion J.K., 1964], рекомендуемого ВОЗ (1971) в перечне основных клинических методов стоматологических исследований.

Методика бактериологического исследования с применением техники анаэробного культивирования.

Проводился количественный секторальный посев на среды, предназначенные для культивирования бактерий полости рта. В анаэробных условиях чистые культуры факультативно- и облигатно-анаэробных бактерий получены с использованием 5% кровяного гемин-агара, приготовленного на основе Brain-Heart Infusion фирмы «Difco» с добавлением гемина (5 мкг/мл) и менадиона (0,1 мкг/мл), с обязательным помещением посевов в анаэростаты с бескислородной газовой смесью (состав: 80% азота, 10% углекислого газа, 10% водорода). Результаты количественного исследования микрофлоры

рассчитывались в колониеобразующих единицах - КОЕ/мл (CFU) и lg CFU.

Молекулярно-генетический метод, основанный на ПЦР с последующей обратной ДНК - гибридизацией с праГтерами пародонтопатогенных бактерий.

ПЦР была проведена с использованием тест-набора «МультиДент» (ООО НПФ «ГенЛаб», РФ). Тест-набор «МультиДент» является высокоспецифичным молекулярно-биологическим диагностическим способом идентификации пяти маркерных пародонтопатогенов: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis и Prevotella intermedia. Для выделения ДНК из полученного материала использован метод ускоренной пробоподготовки с помощью набора реагентов: «Экстраген» (суспензия смеси гранул ионообменников -10 мл); «Энзимикс» (протеолитический комплекс - 1 пробирка с лиофилизированным содержимым); растворитель «Энзимикса» - 100 мкл. Амплификацию выделенного генетического материала проводили в термоциклере «Терцик МС- 2» («ДНК-Технология», Москва) с компьютерной программой для осуществления мультиплексной ПЦР, рекомендованной фирмой-изготовителем. Клонированные образцы ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1,6% агарозе после окрашивания бромистым этидием (медицинская технология ФС-2006/043-У).

Методы выделения низкомолекулярных пептидов

Технология выделения низкомолекулярных пептидов включала 3 этапа. На 1 этапе трипсинизировали плацентарную ткань на магнитной мешалке в течение 3 часов при 18-20 С или 50-60 минут при 37 С, с последующим добавлением равного объёма холодного (4 С) раствора Хэнкса. На втором этапе происходило разделение системы твердая фаза - раствор путем осаждения, центрифугирования и фильтрации. На заключительном этапе воздействовали ультразвуком для извлечения низкомолекулярных пептидов

Технология конструирования ниосомального геля

При конструировании ниосомального геля, отрабатывалась

технология получения ниосом и инкапсулирование выделенных низкомолекулярных пептидов. Оболочка полученных ниосом создавалась из ПЭГ-12 Диметикона по оригинальной технологии [Базиков И.А. Способ доставки биологически активных веществ с помощью ниосом / И.А. Базиков, П.А. Омельянчук. Патент РФ N° 2320323 от 27.03.2008]. Технология создания ниосом была основана на образовании мембраны на поверхности неорганической матрицы размером 30-80 нанометров. Кремнийорганические микрокапсулы состояли из ПЭГ-12 диметикона, обладающего амфифильными свойствами, позволяющими ориентироваться в дисперсии водорастворимой частью (полиэтиленгликолем) в воду и жирорастворимой частью (диметиконом) - в липиды. При обработке ультразвуком мультиламелярные микрокапсулы обретали моноламмелярную структуру, иммобилизируя низкомолекулярные пептиды.

Физико-химическая оценка ниосом.

Изучали размеры и стабильность ниосом определением светопропускания и измерением дзета-потенциала. Измерения ниосом проводили методами динамического светорассеивания и растровой электронной микроскопией. Определение светопропускания проводили на спектрофотометре Agilent 8453 (Германия) с использованием программы HP UV Visible ChemStation при длине волны 660 нм. Размер ниосом определяли на многофункциональном растровом электронном микроскопе с интегрированной системой фокусированного ионного пучка -Quanta 3D FEG. Электростатическую устойчивость (стабильность) ниосом определяли путём измерения дзета-потенциала образцов эмульсий с помощью системы для характеристики наночастиц Malvern Zetasizer Nano ZS.

Экспериментальные методы исследования при изучении токсичности и гистологических изменений.

Токсичность исследуемого препарата определяли в соответствии с методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ [Daoud, S.S., Juliano, R.L., 1986]. Токсичность была изучена на 60 белых нелинейных крысах обоего пола весом 180-220 г и на 15 кроликах обоего пола весом 2,1-2,3 кг. Для определения проникающей

способности ниосом в ниосомальном геле проводили гистологические исследования биоптатов кожи на 40 крысах, разделённых на 4 группы. 1% раствор трипанового синего инкапсулировали в ниосомы, а также использовали в интактной форме для изучения пенетрирующей способности.

Модель пародонта на животных получали путём нанесения травмы для последующей гистологической оценки воспалительного процесса.

Изучались морфологические изменения в пародонте при экспериментальном пародонтите в 3 группах животных: первая контрольная группа крыс без лечения, вторая группа животных с гелем метрагил-гента и третья экспериментальная группа с использованием ниосомального геля «Регенерин». Все эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами защиты позвоночных животных, используемых в научных целях (Руководства и рекомендации для Европейских независимых комитетов по вопросам этики, 1995, 1997; Рекомендации по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований, 2000).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных статистических программ «81а1§гарЫсз» с использованием электронных таблиц Мгспбой Ехе1 5.0 (параметрическая статистика, корреляционный анализ), реализованные на 1ВМ РС АТ. Межгрупповые различия оценивались с помощью ^критерия Фишера-Стьюдента на уровне вероятностей р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

Микробиологический статус у больных с повреждениями слизистых и заболеваниями пародонта с помощью молекулярно-генетических методов исследования.

В результате проведённых лабораторно-диагностических исследований установлено, что у пациентов контрольной группы частота выявления носительства пародонтопатогенных видов составила 37,5%, при этом у 62,5% лиц не было выявлено ни одного вида пародонтопатогенной микрофлоры (рис. 1А). При анализе структуры маркеров, выделенных из проб у пациентов контрольной

группы, установлено, что наиболее часто (24,8%) были выявлены маркеры Р, gingivalis, в 21,3 % случаев - В. forsythus, в 13,8% случаев - А. actinomycetemcomitans, в 13,3% случаев - Р. intermedia, в 7,1% случаев - Т. denticola (рис. 1Б).

Частота выявления пзродонтопатогенов, (%)

V

РисЛА. Количество Рис. 1Б. Частота выявления

пародонтопатогенов в биопленке у пародонтопатогенов в биопленке у пациентов контрольной группы пациентов контрольной группы

Результат проведённых лабораторно-диагностических исследований позволяет установить, что у пациентов 1-й группы с повреждениямии слизистой оболочки полости рта частота выявления носительства пародонтопатогенных видов составила 46,4%, при этом у 53,6% лиц не было выявлено ни одного вида пародонтопатогенной микрофлоры (рис. 2А). При анализе структуры маркеров, выделенных из проб у пациентов 2-й группы, установлено, что наиболее часто (25,9%) были выявлены маркеры Р. gingivalis, в 22,1% случаев - В. forsythus, в 14,2% случаев - А. actinomycetemcomitans, в 13,9% случаев - Р. intermedia, в 7,5% случаев - Т. denticola (рис. 2Б).

в Три вида

Количество пародонтопатогенов

8 Отсутствует в Один вид вДеи вида

Количество пародонтопатогенов

Частота выявления пэродонгопзтогенов, (%)

Е Отсутствует ш Один вид Щ Два вида ■ Три вида

Рис.2А. Количество

Рис.2Б. Частота выявления

пародонтопатогенов в биопленке ЗДБ пародонтопатогенов в биопленке ЗДБ

у пациентов второй группы

у пациентов второй группы

Анализ лабораторно-диагностических исследований позволяет утверждать, что у пациентов 2-й группы с патологией пародонта частота выявления носительства пародонтопатогенных видов составила 48,1%, при этом у 51,9% лиц не было выявлено ни одного вида пародонтопатогенной микрофлоры (рис. ЗА). При анализе структуры маркеров, выделенных из проб у пациентов 3-й группы, установлено, что наиболее часто (27,1%) были выявлены маркеры Р. gingivalis, в 22,7 % случаев - В. forsythus, в 14,9% случаев - А. actinomycetemcomitans, в 14,6% случаев - Р. intermedia, в 7,8% случаев - Т. denticola (рис. ЗБ).

Количество пародонтопатогенов

Частота выявления пародонтопатогенов, {%)

в Отсутствует в Один вид ¡8 Два вида ■ Три вида

I 22,

й j I 1 Н9 14,6

Ь; | 1 7JB

Р III PI

Ви* Iii

J? / / ' / .,/ /

У

Рис.ЗА. Количество пародонтопатогенов в биопленке у пациентов второй группы

Рис.ЗБ. Частота выявления пародонтопатогенов в биопленке у пациентов второй группы

При дефектах слизистой полости рта и патологии краевого пародонта ухудшается гигиеническое состояние полости рта в связи с наличием микробной колонизации, а также возрастанием количества микрофлоры и продуктов её жизнедеятельности. Можно предположить, что такое присутствие пародонтопатогенной микрофлоры инициирует развитие метаболических, морфологических, а также функциональных изменений в зубочелюстной системе, утяжеляя течение существующих воспалительных процессов.

Оценка размеров и стабильности ниосом

кремнийорганической природы, используемых для

инкапсулирования низкомолекулярных пептидов.

Технология получения везикул кремнийорганической природы определила их преимущества - повышенную стабильность во времени, резистентность к окислению и сверхэластичность. Изучение микрофотографий, полученных при проведении растровой электронной микроскопии позволили определить размер ниосом, составляющий диапазон от 20 до 100 нм (рис.4).

Рис. 4. Микрофотография ниосом (растровая электронная микроскопия)

Результаты исследований методом динамического светорассеяния также подтвердили размер ниосом, колеблющийся в пределах от 20 до 100 нм. Электростатическая устойчивость частиц кремнийорганических эмульсий обусловлена значением дзета-потенциала больше, чем +30 Мв или ниже -30 Мв. Протоколы исследований величины дзета-потенциалов с различными образцами ниосом составили диапазон от 49,4 Мв до 54,6 Мв. Также, следует

отметить, что в форме геля ниосомы разделены между собой «пространственной сеткой» полимера (гелеобразователя), что дополнительно усиливает стабильность ниосом при хранении.

Биотехнология приготовления ниосомального геля «Регенерин».

Включение пептидов в кремнийорганические везикулы (ниосомы) и последующая обработка эмульсии на гомогенизаторе высокого давления АПВ гомогенизаторе, обеспечивала эффективную пролонгированную дозированную доставку активных субстанций в клетки тканей, не нарушая их целостности.

Изучение стимуляции регенераторной способности слизистой оболочки полости рта после химической, ожоговой и механической травмы.

При механической травме рубец при воздействии геля «Регенерин» на рану, образуется значительно раньше, чем в контрольной группе кроликов и консистенция его значительно мягче. ' Появление грануляционной ткани и краевая эпителизация наступают значительно быстрее. При термических и химических ожогах, при ! обработке гелем «Регенерин» стабилизация общего состояния животных наступала в среднем на сутки - двое раньше, чем у животных контрольной группы. При термических, и особенно при химических ожогах, увеличение ран в размерах не было столь значительным. Раны подсыхали скорее, чем в контрольной группе, намокание их было не столь значительным. При химических ожогах поверхность раны была более мягкой, чем в контрольной группе.

Результаты гистологического исследования патологии пародонта в эксперименте при применении ниосомального геля «Регенерин».

Изучались морфологические изменения в пародонте при экспериментальном пародонтите в 3 группах животных: первая контрольная группа крыс без лечения, вторая группа животных при лечении гелем «Метрагил-гента» и третья экспериментальная группа при лечении ниосомальным гелем «Регенерин». I

В отличие от первых двух групп, при ежедневном применении геля «Регенерин» в пародонте обнаружена частичное повреждение многослойного плоского эпителия с образованием поверхностного дефекта (рис.5).

Рис. 5. Поверхностный дефект пародонта. Окраска: гематоксилином и эозином.х200.

Базальная мембрана многослойного плоского эпителия местами сохранена, а местами разрушена. В дне поверхностного дефекта видна узкая прерывистая полоска фибриноидного некроза. В подлежащих тканях отмечается умеренно выраженный отек, : умеренная выраженная сосудистая реакция (рис.6).

-Т ^ ■

Рис. 6. Умеренная сосудистая реакция и отек соединительной ткани пародонта. Окраска: гематоксилином и эозином.х200.

В соединительной ткани пародонта определяются небольшие воспалительные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоцитов с небольшой примесью макрофагов и гистиоцитов (рис. 7).

(

Рис. 7. Умеренная лимфоцитарная инфильтрация соединительной ткани пародонта. Окраска : гематоксилином и эозином.Х400.

Таким образом, при ежедневном применении «Регенерина» в пародонте крыс развивается серозный пародонтит, что свидетельствует о значительном противовоспалительном эффекте «Регенерина» по сравнению с метрагил- дента.

Помимо противовоспалительного эффекта при воздействии «Регенерина» в многослойном плоском эпителии у краев дефекта отмечается усиленная пролиферация базальных клеток, повышение их митотической активности. В строме пародонта вокруг сосудов определяется очаговая пролиферация фибробластов, которые синтезируют коллаген. Отмечается усиление фибриллогенеза с формированием молодой соединительной ткани (рис. 9).

Описанная гистологическая картина характерна для серозного пародонтита (рис. 8).

Рис. 8. Серозный пародонтит (регенерин). Окраска эозином.Х200.

гематоксилином и

- -• •

Рис. 9. Очаговая пролиферация фибробластов в пародонте. Окраска : гематоксилином и эозином.х400.

Таким образом, анализ результатов проведенного гистологического исследования показал, что в эксперименте при повреждении пародонта без лечения на 7-е сутки развивается картина диффузного гнойного пародонтита с тяжелыми деструктивными изменениями и формированием глубокого дефекта. При лечении метрагил-дента развивается очаговое гнойное воспаление вокруг очага повреждения. Деструктивные изменения с формированием неглубокого дефекта. При восстановительном лечении «Регенерином» в пародонте развивается серозный пародонтит, а также отмечается усиление репаративных процессов.

Изучение токсичности ниосомального геля «Регенерин» на экспериментальных животных.

Результаты исследований геля на разных группах животных с использованием общепринятых методических подходов, свидетельствовали об отсутствии токсичности. Полученные данные исследования позволили разработать схему рациональных испытаний геля в условиях клиники, повысить их безопасность.

Микробиологический статус у больных с повреждениями слизистых и заболеваниями пародонта с помощью молекулярно-генетических методов исследования после восстановительного лечения гелем «Регенерин».

Анализ лабораторно-диагностических исследований позволяет утверждать, что у пациентов с повреждениями слизистых и заболеваниями пародонта после лечения гелем «Регенерин», частота выявления носительства пародонтопатогенных видов составила 37,8%, при этом у 62,2% лиц не было выявлено ни одного вида пародонтопатогенной микрофлоры (рис. 10А).

При анализе структуры маркеров, выделенных из проб у пациентов 1-й группы, установлено, что наиболее часто (25,3%) были выявлены маркеры Р. gingivalis, в 21,7 % случаев - В. forsythus, в 14,1% случаев - А. actinomycetemcomitans, в 13,5% случаев - Р. intermedia, в 7,2% случаев - Т. denticola (рис. 10Б).

Частота выявления пародонтопатогенов, {%)

Количество пародонтопатогенов

30 25 20 15 10 5 0

ьд 21,7

р

§р ЮЩ 7 7

щ. ЁЁ р1 Щ

ЕЭ КЗ «В» / ■

Рис.ЮА. Количество пародонтопатогенов в биопленке ЗДБ у пациентов первой группы

У

РисЛОБ. Частота выявления пародонтопатогенов в биопленке ЗДБ у пациентов первой группы

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о значительном снижении резидентной, и пародонтопатогенной микрофлоры в биоплёнке десневой борозды при восстановительном лечении ниосомальным гелем «Регенерин».

Выводы:

1. Показателем, отражающим интенсивность морфологических и функциональных нарушений, является увеличение содержания генетических маркеров пародонтопатогенов в десневой жидкости РогрЬуготопаз gingivalis, АсйпоЬасШш ас1тотусе1етсотйаш и Ва^егс^еБ бэгзу&ш.

2. Выделение пептидов и их иммобилизация в кремнийорганические везикулы (ниосомы) с использованием ультразвуковой дезинтеграции и последующей обработки эмульсии на гомогенизаторе высокого давления, позволило получить стоматологический гель, обеспечивающий эффективную пролонгированную дозированную доставку активных субстанций в клетки повреждённых тканей.

3. Результаты гистологического исследования патологии пародонта в эксперименте при применении ниосомального геля «Регенерин» выявили усиление репаративных процессов. В строме пародонта вокруг сосудов определяется очаговая пролиферация фибробластов, которые синтезируют коллаген. Отмечается усиление фибриллогенеза с формированием молодой соединительной ткани.

4. Результаты исследований безопасности полученного ниосомального геля на разных группах животных, свидетельствовали об отсутствии его токсичности.

5. Применение ниосомального геля «Регенерин» с низкомолекулярными пептидами с повреждениями полости рта и патологией пародонта позволило значительно снизить содержание резидентной, а также пародонтопатогенной микрофлоры в биоплёнке десневой борозды.

Практические рекомендации:

1. У больных с патологией слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта для адекватной и полноценной диагностики заболеваний целесообразно проводить исследование резидентной, а также пародонтопатогенной микрофлоры в биоплёнке десневой борозды.

2. Учитывая растущую распространенность патологии слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта, комплексное лечение этих заболеваний должно включать применение регенеративных наружных препаратов.

3. Для повышения эффективности восстановительного лечения патологии слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта, необходимо применение разработанного ниосомального геля «Регенерин» не менее одного раза в день в течение 10 дней.

4. При разработке технологии конструирования лечебных наружных препаратов для восстановления слизистой оболочки полости рта и пародонта, необходимо использовать принципы адресной доставки регенерирующих веществ.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Базиков, И.А. Трипсинизация плацентарной ткани животного происхождения для получения культуры клеток, используемой при лечении заболеваний пародонта /И.А. Базиков, A.JI. Гукасян, В.А. Зеленский// Медицинский вестник Северного Кавказа,- 2011 -Т 22 -№2,-С. 59-60.

2. Конструирование и сравнительная характеристика новых питательных сред для культивирования легионелл / JI.C. Катунина, Т.В. Таран, И.А. Базиков, A.B. Таран, Э.М Хатков., A.JI. Гукасян// Медицинский вестник Северного Кавказа.- 2011. -Т. 23.- № 3 - С 6061.

3. Изучение нанокапсул кремнийорганической природы, используемых для трансдермальной доставки активных субстанций / И.А. Базиков, П.А. Омельянчук, Э.М. Хатков, АЛ. Гукасян, З.А. Сеираниду// Вестник Российской Академии Естественных наук-2012.-№ 1,- С.81-83.

4. Оценка размеров и стабильности везикул кремнийорганической природы, используемых для трансдермальной доставки активных субстанций / И.А. Базиков, В.А. Аксененко, Э.М. Хатков, A.JI. Гукасян, З.А. Сеираниду// Медицинский вестник Северного Кавказа,- 2012. -Т. 25,- № 1.- С. 81-82.

5. Разработка и изготовление регенерирующих субстанций из экстракта клеток плаценты животного происхождения / И.А. Базиков, И.В. Климанович, Т.А. Авакова, Э.М. Хатков, A.JI. Гукасян// 17-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья: Сб. научн. статей. -Ставрополь, 2013. - С. 203-205.

6. Изучение острой токсичности разработанного регенеративного наружного средства /И.А. Базиков, Э.В. Бейер, И.В. Климанович, Т.А. Авакова, Э.М. Хатков, A.JI. Гукасян. Ф.И. Базиков// 17-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья: Сб. научн. статей. -Ставрополь, 2013. - С. 205-209.

7. Исследование безопасности нанокапсул кремнийорганической природы (НИОСОМ), используемых для трансдермальной доставки активных субстанций /И.А. Базиков, Э.В. Бейер, М.М. Магонов, И.В. Климанович, Н.И. Пенькова, Т.А. Авакова, Э.М. Хатков, A.JI. Гукасян. З.А. Сеираниду, Ф.И. Базиков//

17-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья: Сб. научн. статей. -Ставрополь, 2013.-С. 141-142.

8. Применение клеточных и нанотехнологий для разработки новых препаратов / И.А. Базиков, И.В. Климанович, Н.И. Пенькова, М.М. Магонов, Т.А. Авакова, Л.В. Лысогора, Э.М. Хатков, З.а' Сеираниду, А.Л. Гукасян, М.А. Деряженцева, Н.И. Калинкина, Ф.И. Базиков// Медицинский вестник Северного Кавказа.- 2013 -Т 29 -№ 3.-С. 14-18.

9. Изучение стимуляции регенераторной способности кожи после механической и ожоговой травмы в результате применения препарата «Регенерин» /И.А. Базиков, О.Б. Сумкина, B.C. Боташева, И.В. Климанович, Н.И. Пенькова, Е.В. Чекрыгина, А.Л.Гукасян, М.А. Деряженцева, Н.И. Калинкина, Ф.И. Базиков// Медицинский вестник Северного Кавказа. -2013.- Т. 8.- № 4. -С. 9-13.

Подписано в печать 17.10.2014г. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №770 Усл.печ. л. 1.5.