Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Влияние вирусов гепатитов B и C на течение и прогноз гепатоцеллюлярной карциномы

На правах рукописи

ГЕТТУЕВЛ Ансурат Ахматовна

/

ВЛИЯНИЕ ВИРУСОВ ГЕПАТИТОВ В И С НА ТЕЧЕНИЕ И ПРОГНОЗ ГЕПАТОЦЕЛШОЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ

14.01.04 - внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2012

2 Р ДПР 20-2

005019302

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшгго профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени H.H. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный руководитель:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Сторожаков Геннадий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

ведущий научный сотрудник Орёл Надежда Федоровна

ГУ Российский Онкологический Научный Центр имени H.H. Блохина РАМН, ведущий научный сотрудник отделения химиотерапии опухолей

доктор медицинских наук, профессор Фомин Виктор Викторович

ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова, профессор кафедры терапии и профболезней

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «_»_ 2012 г. в - часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.01 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н И. Пирогова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Потешкина Н.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Заболеваемость гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) имеет неизменную тенденцию к росту в течение последних лет. Это определяется, прежде всего, распространением и неуклонным ростом заболеваемости вирусными гепатитами, высоким уровнем их хронизации с исходом в цирроз печени (ЦП) и ГЦК.

В структуре онкологических заболеваний ГЦК занимает 5 место, а среди причин летальности стоит на 3 месте [Bosch F., 2004]. Ежегодно в мире регистрируется более 600 ООО случаев рака печени [Murray Т, 2005]. России с диагнозом ГЦК ежегодно регистрируется порядка 6000 пациентов [М.И. Давыдов, Е.М. Аксель, 2008] Распространенность опухоли зависит от эпидемиологической обстановки в регионах.

В этиологии ГЦК ведущей теорией является теория вирусного онкогенеза, которая представляет собой сложный и многоступенчатый процесс. Более 75 % случаев ГЦК в мире обусловлены вирусным гепатитом В и С. Хронический вирусный гепатит В или С повышают риск развития ГЦК примерно в 20 раз [Donato F, 1998].

Вирусная инфекция гепатитами С и В является важной и актуальной проблемой современной медицины. Около 180 миллионов людей, около 3% всего населения планеты, заражены вирусом гепатита С, из них 130 миллионов являются хроническими носителями вируса гепатита С и подвергаются риску возникновения цирроза и/или рака печени. В связи с высокой степенью хронизации ожидается 4-кратное увеличение числа лиц с хронической HCV инфекцией к 2015 году. Гепатит С ответственен за 50-76% общей заболеваемости раком печени и за две трети всех операций по трансплантации печени в развитом мире. Среди пациентов, инфицированных вирусом гепатита С, ежегодно ГЦК заболевают до 2% больных [Schuppan D, 2003].

В настоящее время в мире насчитывается 300 млн. человек с гепатитом В, у которых инфекция протекает в хронической форме [El-Serag Н., 2007]. Одна треть больных с HBV инфекцией умирает от причин, напрямую связанных с ней, таких как ЦП и ГЦК. Риск развития ГЦК у носителей HBV в 100 раз выше, чем в общей популяции, а исход хронического гепатита В (ХГВ) в цирроз печени повышает риск развития ГЦК в 1000 раз [Llovet J.M., 2003].

Всё многообразие этиологических факторов, воздействующих на гепатоциты, приводят к одинаковому результату ■— их злокачественной трансформации и развитию ГЦК. Существует проблема этиологического подхода к лечению злокачественных опухолей, в том числе ГЦК, который зависит от знания особенностей течения этих заболеваний

[Г.И.Сторожаков, И.Г.Никитин и др., 2005]. В доступной литературе внимание в основном привлечено к изучению молекулярно-биологических механизмов становления и развития ГЦК у больных, инфицированных вирусами гепатита В и С. Механизмы гепатоканцерогенеза в настоящее время активно изучаются. Все больше появляется доказательств того, что кодируемые вирусом белки участвуют в патогенезе гепатоцеллюлярной карциномы. Однако молекулярные механизмы злокачественной трансформации при НС V - и НВУ - инфекции в настоящее время все еще остаются неясными. Не уделяется должного внимания особенностям клинического течения, ответу на терапию и прогнозу у этих больных. Важными этапами для решения проблемы эффективного лечения больных ГЦК, инфицированных вирусами гепатита С и В являются их своевременная и качественная диагностика. Актуален поиск новых диагностических критериев и методов профилактики ГЦК у пациентов, инфицированных вирусами гепатита В и С, позволяющих практическому врачу обоснованно строить дальнейшую лечебную тактику в данной популяции больных.

Цель исследования Оценить влияние хронического вирусного гепатита В и С на течение и прогноз гепатоцеллюлярной карциномы.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать медико-социальную значимость ГЦК на фоне хронического вирусного гепатита В и С.

2. Изучить клиническую картину и морфологические особенности ГЦК у больных, инфицированных ВГВ и ВГС при сравнении с пациентами без маркеров вирусного гепатита.

3. Разработать программу комплексного клинико-инструментального обследования пациентов с ГЦК на фоне хронического вирусного гепатита В и С.

4. Выявить предикторы летального исхода в раннем послеоперационном периоде у больных с ГЦК.

5. С учетом полученных результатов оценить клинические, морфологические и лабораторные предикторы рецидива ГЦК на фоне вирусного гепатита В и С в отдаленном периоде после резекции печени.

Научная новизна

Впервые среди отечественных работ проведено комплексное клинико-лабораторное и морфологическое обследование больных ГЦК на фоне вирусного гепатита В и С. Изучены и

охарактеризованы основные клинико-морфологические характеристики ГЦК у пациентов, инфицированных вирусным гепатитом В и С. Разработан рациональный алгоритм диагностики хронического гепатита В и С у больных ГЦК. Оценена роль и влияние вирусов гепатитов В и С на многоступенчатый этиопатогенетический механизм развития ГЦК. Даны рекомендации по первичной и вторичной профилактике НВУ - и НСУ - ассоциированной ГЦК.

Практическая значимость

Уточнен оптимальный объем обследования больных гепатоцеллюлярной карциномой как до резекции печени, так и после её проведения, что будет способствовать более раннему выявлению и своевременному лечению вирусной инфекции В и С у больных с ГЦК, а также первичной и вторичной профилактике после радикального лечения (резекции печени) ГЦК, инфицированных вирусами гепатитов С и В.

Положения, выносимые на защиту

• ГЦК у больных с маркерами ВГВ и ВГС развивается не только на фоне цирроза печени, но и на фоне гепатита.

• Проведение рутинных экспресс - методов для выявления маркеров вирусного гепатита В и С у больных ГЦК является недостаточным информативным.

• Для диагностики скрытого течения вирусного гепатита В и С должно проводиться определение ДНК ВГВ и РНК ВГС в ткани печени, а также использование иммуногистохимического исследования с целью обнаружения вирусных белков в опухолевой ткани печени.

• Хронический вирусный гепатит В и С оказывает существенное влияние на частоту рецидивирования и продолжительность жизни после радикального хирургического лечения (резекции печени).

Внедрение результатов исследования Результаты, полученные в ходе данной работы, могут быть полезны и в дальнейшем использованы для выработки врачебной тактики в отношении профилактики и лечения гепатоцеллюлярной карциномы у больных, инфицированных вирусами гепатитов В и С.

Апробация диссертации Материалы диссертационной работы представлены на 21-ой и 22-ой конференцях азиатской Тихоокеанской Ассоциации по изучению печени (АРАБЬ) (г. Бангкок, 2011 г., Тайвань, 2012 г.).

Основные положения диссертации представлены на совместном заседании сотрудников кафедры госпитальной терапии № 2 ГБОУ ВПО «Российский национальный

исследовательский медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ» и ФГУ ГКБ № 12 Департамента здравоохранения г. Москвы 29 февраля 2012 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 - в рецензируемом издании.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, построена по традиционному плану, состоит из введения, четырех глав, в которых представлены данные литературы, описания материалов и методов исследования, результаты собственных наблюдений, обсуждение полученных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 10 рисунками. Список использованной литературы включает в себя ссылки на 34 отечественных и 129 зарубежных источника.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работу вошли результаты обследований 130 больных гепатоцеллюлярной карциномой, прошедшие обследование и лечение в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в период с 2000 по 2011гг. Для сравнения была сформирована контрольная группа больных, куда вошли 51 больной с ГЦК без вирусных маркеров.

Из 130 больных ГЦК 39 имели маркеры ВГС (1-ая группа) и 40 больных имели маркеры ВГВ (2-ая группа). Больные в 1-ой группе имели положительные данные иммуноферментного анализа на наличие суммарных антител к ВГС и/или положительные значения ПЦР на РНК ВГС в сыворотке крови и/или положительные значения ПЦР на РНК ВГС в опухолевой ткани. У больных 2-ой группы выявлялся HBsAg и/или определялись дополнительные антигены, антитела к ВГВ, положительные значения ПЦР на ДНК ВГВ в сыворотке крови и/или положительные значения ПЦР на ДНК ВГВ в опухолевой ткани. В контрольную группу вошли 51 пациент с ГЦК, у которых серологические маркеры к вирусным гепатитам были отрицательными (3-я группа) (рис. 1)..

Рисунок 1. Распределение больных ГЦК по группам

60 50 -40 ■ 30 20 10 0 4

1 группа (с маркерами 2 группа (с маркерами 3 группа (без маркеров ВГС) ВГВ) ВГ)

Средний возраст больных ГЦК с маркерами ВГС составил 56+14 лет, группа состояла из 17 (44%) женщин и 22 (56%) мужчин.

Средний возраст больных ГЦК с маркерами ВГВ составил 57+12лет, группа состояла из 7 (17,5%) женщин и 33 (82,5%) мужчин.

Средний возраст больных контрольной группы (ГЦК без маркеров вирусных гепатитов) составил 49±19 лет, группа состояла из 16 (31%) женщин и 35 (69%) мужчин.

Для верификации диагноза ГЦК у всех больных использовались инструментальные методы исследования, серологический, цитологический, гистологический и иммуногистохимический методы исследования опухолевой ткани. Всем пациентам был проведен комплекс обязательных обследований, уточняющих степень распространения заболевания. Одновременно все больные ГЦК проходили исследования по единой, разработанной для верификации хронических вирусных гепатитов, схеме.

Клиническое обследование включало в себя оценку жалоб и данные физикального обследования. По возможности жалобы пациентов группировались в клинические синдромы, а дополнительно полученные данные лабораторно-инструментальных методов обследования при их сопоставлении с клиническими данными позволили нам выделить клинико-лабораторные синдромы.

После клинического обследования всем больным проводился ряд дополнительных обследований, уточняющих степень распространения заболевания:

1. Ультрасонографическое исследование.

2. Компьютерная томография брюшной полости и/или магнитно-резонансная томография с внутривенным контрастированием, как основной метод постановки диагноза ГЦК.

3. Рентгенологическое исследование органов грудной клетки.

4. На диагностическом этапе обследования производилась тонкоигольная пункционная биопсия образования в печени под контролем ультразвуковой томографии или компьютерной томографии.

5. По показаниям выполнялись: эзофагогастородуоденоскопия, фиброколоноскопия, фиброларингоскопию, бронхоскопия, компьютерная томография и/или магнитно-резонансная томография головного мозга, радиоизотопное исследование костной системы с обязательным рентгенологическим контролем подозрительных очагов.

Стадия ГЦК устанавливалась в соответствии с международной классификацией по системе TNM и Барселонской клинической классификацией рака печени (Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) staging classification). Гистологический вариант опухоли и степень дифференцировки определялись в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей №20 (Гистологическая классификация опухолей печени, желчных путей и поджелудочной железы) Всемирной организации здравоохранения.

Всем пациентам проводили общий анализ крови, общий анализ мочи. В биохимическом анализе крови определяли уровень альфа-фетопротеина (АФП), активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминатрансферазы (ACT), гамма глутамилтранспептидазы (ГТТП), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозы, билирубин и его фракции, протромбиновый индекс (ПТИ), фибриноген, параметры стандартной коагулограммы, креатинин, общий белок, белковые фракции.

Одновременно, все больные ГЦК проходили исследования по единой, разработанной для верификации хронических вирусных гепатитов схеме. В сыворотке крови исследовали маркеры вирусов гепатитов В, С, D. Методом полимеразной цепной реакции проводили качественное и количественное определение ДНК ВГВ и РНК ВГС в сыворотке крови, качественное определение ДНК ВГВ и РНК ВГС в опухолевой ткани печени. Определение генотипа вируса гепатита С проводилось у 10 больных. С целью выявлении экспрессии структурного белка Е2 ВГС и HBsAg ВГВ проводилось иммуногистиохимическое исследование (ИГХ) опухолевой и окружающей печеночной ткани (парафиновые срезы) с мечеными антителами.

Для оценки эффективности отдаленных результатов лечения использовались показатели общей и безрецидивной выживаемости.

Статистическая обработка данных осуществлялась на компьютере с помощью программ Excel 7,0 и Statistica 7,0. Для каждой серии результатов вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (ш). В таблицах и графиках результаты представлены в виде М±т.

Сравнение двух независимых выборок (опыт-контроль) проводилось с помощью теста Манна-Уитни и использовался непараметрический критерий - метод Фишера. Для оценки корреляции были использованы непараметрические методы, в частности, корреляционный анализ Спирмена. За уровень достоверности статистических показателей принято р<0,05. С целью выявления факторов, имеющих независимое значение, был применен многофакторный логистический регрессионный анализ Кокса. Выживаемость пациентов оценивали с помощью построения кривых Каплана - Майера. Анализ влияния отдельных признаков на выживаемость проведен с помощью критерия Кокс - Мантеля.

Результаты исследования

В литературе накоплено большое количество данных о течении гепатоцеллюлярной карциномы. Однако развитие и течение этого заболевания у больных, инфицированных вирусами гепатитов В и С, остается малоизученной проблемой.

ГЦК была диагностирована преимущественно у мужчин - 90 (69%) человек, количество женщин было значительно ниже и составило 40 (31%) человек, что совпадает с данными литературы. Следует отметить, что при сравнительном анализе по группам, число мужчин значительно преобладает над числом женщин у пациентов с ГЦК на фоне ХГВ, в отличие от относительно высокой частоты развития ГЦК у женщин на фоне ХГС, что так же совпадает с данными литературы (р<0,05) (табл.1).

Таблица 1

Распределение больных по полу и возрасту

Пол Возраст

мужчины женщины Границы колебания М±т

I группа п=39 22(56%) 17(44%) 16-76 56+14**

11 группа п=40 33(82,5%)* 7(17,5%) 16-78 57±12**

III группа п=51 35 (69%) 16(31%) 13-76 49+19

Общая п=130 90 (69%) 40(31%) 13-78

* 1-2 р<0,05, ** 1-3, 2-3 р<0,05

При анализе возрастного состава по группам, больше половины всех пациентов приходится на возраст от 50 до 69 лет (61%, 75% и 51 % соответственно) (рис. 2). Частота

выявления ГЦК в общей группе увеличивалась прямо пропорционально возрасту (р<0.05). Эти данные совпадает с данными литературы о частоте распространения ГЦК в разных возрастных группах, согласно которым, неблагоприятным фактором риска развития ГЦК является возраст и основную часть больных ГЦК составляют лица в возрасте 50 - 60 лет. В группе больных ГЦК на фоне ВГВ (II группа) пациентов в возрастной группе от 50 до 60 лет было 40% (16/40), что достоверно выше, чем в группе больных ГЦК на фоне ВГС и в группе ГЦК без вирусного гепатита (I и III группы) - 23% (9/39) и 20% (10/51) больных соответственно (р<0,05), что совпадает с данными литературы. Так ГЦК на фоне ХГС обнаруживается в более позднем возрасте, около 60 лет, в то время как на фоне ХГВ ГЦК развивается на 10 лет раньше.

Рисунок 2. Анализ возрастного состава по группам

120% 100% 80% 60% 40% 20% 0%

р<0,05 Г

20%

21%

т

12%

10%

18%

ив

23%

ш

38%

□ III группа [1II группа

□ I группа

1Ж

до 29 лет 30 - 39 40 - 49 50 - 59 60 - 69 старше 70

лет

Клиническая картина гепатоцеллюлярной карциномы на фоне хронического гепатита В и С представлена зачастую неспецифическими симптомами, не получающими, как правило, должной диагностической интерпретации в течение долгого времени. Сложность в интерпретации клинических и лабораторных синдромов у больных ГЦК и ВГ состоит в том, что и при вирусном поражении и при гепатоцеллюлярной карциноме имеется сходная клиническая симптоматика. Наиболее частыми жалобами являлись боль в правом подреберье - в 67% случаев и астенический синдром - в 61%. Реже возникали жалобы на фебрильную лихорадку, похудание. Редкими жалобами были кожный зуд и пальпируемое опухолевое образование в эпигастрапьной области. Кожный зуд и повышение температуры тела не встречались как единственные симптомы заболевания, а возникали вместе с другими жалобами. В сравниваемых группах достоверно чаще выявлялся болевой синдром в группе

ГЦК без ХВГ, а астенический синдром - в группе ГЦК на фоне ХВГ (р<0,05). Болевой синдром был обусловлен как гепатомегалией, так и опухолевым поражением печени. На втором месте, по частоте выявления, был астенический синдром, который, скорее всего, имел смешанный генез и был связан как с опухолевой прогрессией и интоксикацией, так и вирусной инфекцией. Эти данные демонстрируют важность целенаправленного клинического обследования больных с вирусными гепатитами и указывают на необходимость «настороженности» в отношении гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с такими клиническими синдромами как астенический и болевой.

ГЦК развилась на фоне цирротической печени у 53% (69/130) больных общей группы. Достоверно больше больных с ЦП было на фоне ВГС и ВГВ - 64 % (25/39) и 78% (31/40) случаев соответственно (р<0,0001). Полученные данные, согласуются с зарубежными исследованиями и свидетельствуют о том, что длительная персистенция вирусной инфекции с трансформацией в ЦП играет отрицательную роль в многоступенчатом этиопатогенезе ГЦК. Однако следует отметить, что у 36% (14/39) больных на фоне ВГС - и у 22% (9/40) больных на фоне ВГВ ГЦК развилась без сопутствующего цирроза печени, что подтверждает непосредственное влияние ВГВ и ВГС на многоступенчатый этиопатогенетический процесс развития ГЦК (рис. 3). Полученные нами данные согласуются с данными литературы. Так, в западных странах ГЦК обычно развивается на фоне ЦП, и только в 30% ГЦК развивается в «нормальной» печени. Однако в настоящее время эта группа пациентов не охарактеризована достаточно ясно, а точные эпидемиологические данные отсутствуют [V. Grando - Lemaire, 1999]. У подавляющего большинства больных с ГЦК был цирроз печени класса А по Чайлд-Пыо - 69% (48/69). Следует отметить, что в группе ГЦК на фоне ВГС и ВГВ достоверно больше больных было с ЦП класса А по Чайлд-Пью, чем в группе ГЦК без ХВГ (р<0,001).

Рисунок 3. Частота развития ГЦК на фоне цирроза печени

При анализе объема резекции по группам, обширная резекция печени была выполнена 22/39 (56%) больным в группе ГЦК на фоне ВГС, 21/40 (52,5%) - в группе ГЦК на фоне ВГВ и 42/51 (82%) пациентам в группе ГЦК без ХВГ. Обширная резекция печени выполнялась достоверно чаще больным с ГЦК без ХВГ (р<0,05), так как функциональное состояние оставшейся печени способно обеспечивать метаболические потребности организма в послеоперационном периоде. Экономная резекция печени была выполнена в 35% случаев; пациентам с солитарными очагами, размеры которых не превышали 5 см, а так же с сопутствующим ЦП, с целью максимально минимализировать риск развития фатальной печеночной недостаточности в послеоперационным периоде. Экономная резекция печени наиболее часто выполнялась в I и 11 группах - 17/39 (44%) и 19/40 (47,5%) соответственно, так как у больных с хроническим вирусным гепатитом В и С наиболее часто сопутствующим фоном был ЦП. Характер операции не оказывал влияния на общую и безрецидивную выживаемость.

К моменту постановки диагноза ГЦК поздняя (ИЫУ) стадия заболевания была у 53% больных в соответствии с международной классификацией по системе ТОМ и у 26% -в соответствии с ВСЬС, причем среди них преобладали больные из группы ГЦК без ХВГ (рис. 4).

Рисунок 4. Распределение больных ГЦК в соответствии с Барселонской клинической классификацией рака печени (ВСЬС)

60% 54%

В I группа □ II группа ■ III группа

стадия А стадия В стадия С стадия Д

При гистологическом исследовании в 46% (60/130) случаев был смешанный вариант опухоли, однако, преобладал трабекулярный вариант строения - у 79% (102/130) больных. На втором месте, по частоте выявления был солидный вариант - у 25% (33/130). Остальные типы опухолей встречались с частотой не более 10%. Достоверных различий по группам

получено не было. Следует отметить, что фиброламеллярный вариант опухоли диагностировался только в группе больных с ГЦК безмаркеров вирусного гепатита (р<0,05).

Среди радикально оперированных пациентов с ГЦК у половины больных было опухолевое поражение правой доли печени - 67 (52%); у 35 (27%) больных - поражение левой доли печени. Билобарное поражение было у 28 (21%) пациентов с ГЦК. Достоверных различий по группам получено не было (рис. 5).

Рисунок 5. Распределение больных в зависимости от локализации опухолевых узлов в печени

При распределении больных в зависимости от количества узлов в печени, у 87/130 (67%) больных с ГЦК был солитарный очаг, у 22/130 (17%) - два очага и у 21/130 (16%) пациента - 3 и более опухолевых очага. Достоверных различий по группам получено не было.

Диаметр наибольшего опухолевого узла менее 5 см был у 25/130 (19%) больных. Во всех группах преобладали больные с диаметром опухолевого узла более 5 см - 27/39 (69%), 35/40 (87,5%) и 43/51 (84%) пациента соответственно. Достоверных различий по группам не выявлено.

Метастазы в лимфатические узлы ворот печени были выявлены у 27/130 (21%) пациентов, из них у 7/39 (18%) пациентов в группе ГЦК на фоне ВГС, у 3/40 (8%) - в группе ГЦК на фоне ВГВ и у 17/51 (33%) больных с ГЦК без вирусного гепатита В и С. При анализе по группам у больных ГЦК без хронического вирусного гепатита достоверно чаще выявлялись метастазы в лимфатические узлы ворот печени при сравнении со II группой (ГЦК с маркерами ВГВ) (р<0,05).

В среднем значения АЛТ в группе больных ГЦК на фоне ВГС находились в пределах от 12 до 146 ед/л (медиана 68 ед/л); в группе больных ГЦК на фоне ВГВ уровни АЛТ находились в пределах от 10 до 357 ед/л (медиана 51 ед/л); в группе больных ГЦК без ХВГ-от 23 до 214 ед/л (медиана 35 ед/л). Уровни АСТ в первой группе составили от 22 до 171 ед/л (медиана 57 ед/л), во второй группе - от 18 до 271 (медиана 56 ед/л), а в контрольной группе - от 15 до 146 ед/л (медиана 38 ед/л). В таблице 2 представлены данные показателей цитолитического синдрома у больных ГЦК.

Таблица 2

Сравнительный анализ значений трансаминаз у больных ГЦК

Показатель I группа п=39 II группа п=40 III группа п=51 Р

М±ш Медиана М±ш Медиана М±т Медиана

ACT (ед/л) 72± 9,3 57 76 ± 10,6 56 46± 4,0 38 1-3,2-3 р<0,05

АЛТ (ед/л) 68±10,4 68 73 ± 9,9 51 48± 4,8 35 1-3,2-3 р<0,05

Анализируя показатели цитолитического синдрома, мы выявили достоверно более высокие значения уровня АЛТ и ACT у пациентов I и II группы по сравнению с III группой (р< 0,05). Причиной более выраженного повышения уровня ACT и АЛТ у больных ХВГ и ГЦК может быть «фоновое» вирусное поражения печени и сочетанное действие двух разных механизмов реализации патологического влияния на печеночную клетку: возможный прямой цитопатический эффект вируса гепатита С, иммуноопосредованное повреждение печени вирусом гепатита В и С, а также опухолевая инфильтрация с нарушением микроциркуляции паренхимы печени.

Повышение уровня альфафетопротеина (АФП) выше нормы было выявлено у 74/130 (57%) больных (табл. 3). Среднее значение уровня АФП (при норме 0-10) в группе ГЦК на фоне ВГС составляло 1099±728; у больных с ГЦК на фоне ВГВ - 7968±5896; в группе ГЦК без ХВГ - 4374±2057. Уровень АФП достоверно не отличался в сравниваемых группах. По нашим данным не было отмечено зависимости между уровнем АФП, стадией ГЦК и безрецидивной выживаемостью. Однако была получена прямая корреляционная связь между уровнем АФП и метастазами в лимфатические узлы (г = 0,407; р<0,05); АФП и ЩФ / ACT / АЛТ (г = 0,306; р<0,05).

Сравнительный анализ значений АФП у больных ГЦК

Общее

Уровень АФП количество I группа II группа III группа

(ед/мл) пациентов п=39 п=40 п= 51

п=130

абс.ч % абс.ч % абс.ч % абс.ч %

до 10 56 43 14 35 14 36 28 54

от 10 до 50 20 15 7 18 8 19 5 10

от 50 до 90 4 3 2 6 2 6 0 0

от 90 и более 50 39 16 41 16 39 18 36

По данным литературы средняя послеоперационная летальность после резекции печени составляет 12%. По нашим данным, в раннем послеоперационном периоде умерло 11 (8,5%) больных. У 10/11 (91%) больных ГЦК, умерших в раннем послеоперационном периоде, был сопутствующий ХВГ: у 5 - ХГВ и у 5 - ХГС. У 10 (10/11; 91%) пациентов был ЦП: у 7 ( 7/10; 70%) больных - ЦП класса А по Чайлд-Пью и у 3 ( 3/10; 30%) пациентов -цирроз печени класса В по Чайлд-Пью. Основной причиной летального исхода в раннем послеоперационном периоде была медикаментозно некорректируемая печеночно-клеточная недостаточность, приводящая к полиорганной недостаточности с летальным исходом - у 8 (72%) больных. Другими причинами были массивная интраоперационная кровопотеря с последующим развитием ДВС-синдрома - 3 (27%) и инфекционно-воспалительные осложнения с исходом в сепсис - 1 (9%).

При анализе клинико-лабораторных данных, пациенты с летальным исходом в раннем послеоперационном периоде имели достоверно более высокий уровень общего и прямого билирубина, АЛТ и ACT. В раннем послеоперационном периоде у них был достоверно более высокий уровень общего и прямого билирубина, АЛТ и ACT, креатинина, MHO и более низкий уровень альбумина, тромбоцитов, фибриногена, ПТИ при сравнении с пациентами, выжившими в раннем послеоперационном периоде (табл. 4). Таким образом, на первый план выходит цитолитический синдром, обусловленный вирусным поражением печени; синдромы гипокоагуляции и белково-синтетический дисфункции, обусловленные циррозом печени в исходе вирусной инфекции в данной когорте пациентов.

Сравнительные данные лабораторных показателей больных ГЦК с летальным исходом

в раннем послеоперационном периоде

Больные ГЦК с Больные ГЦК без

летальным исходом в летального исхода в

раннем раннем

послеоперационном послеоперационном

Показатель периоде периоде

п=11 п=119 Р

М±т Медиана М±т Медиана

Общий билирубин * 26, 5±4,2 13 16,3 ±0,9 13 р<0,007

Прямой билирубин1* 7,13 ±3,0 3 2,2 ±0,4 1 р<0,007

АЛТ* 102 ±8,5 97 57,8 ±5,1 44 р<0,00003

ACT* 108 ±8,6 58 58,7 ±4,9 43 р<0,00003

Альбумин* 35,8 ±1,5 37 40,1 ±0,7 41 р>0,05

ЩФ* 369 ±30,1 352 375 ±38,8 275 р>0,05

Тромбоциты* 162 ±29,5 122 223 ±10,7 204 р>0,05

Фибриноген* 299 ±38,8 229 411 ±17,4 363 р>0,05

Протромбин* 78 ±6,4 81 80 ±2,6 87 р>0,05

MHO* 1,3 ±0,1 1,35 1,1 ±0,1 1,09 р>0,05

Креатинин** 180±35,7 189 74,4±2,06 71 р<0,00001

Общий билирубин ** 127±45,6 66 16,1 ±1,09 13 р<0,00001

Прямой билирубин** 84,2 ±29,8 40 3,1 ±0,7 1 р<0,00001

АЛТ** 253 ±129 135 59,4 ±5,0 42 р<0,00001

ACT** 278 ±115 114 71,3 ±8,5 44 р<0,00001

Альбумин** 22,2 ±2,1 23 30,8 ±0,66 31 1X0,001.

ЩФ** 305 ±108 205 411 ±28,0 308 р>0,05

Тромбоциты** 91 ±22,0 105 235 ±11,6 208 р<0,002

Фибриноген** 156 ±20,5 143 323 ±14,6 301 р<0,00001

Протромбин** 36 ±3,1 36 62,5 ±2,1 63 р<0,00001

MHO** 2,4 ±0,24 2,1 1,5 ±0,07 1,45 р<0,0001

* - лабораторные показатели до операции, ** - лабораторные показатели в раннем послеоперационном периоде.

Можно сделать предположение о существовании вирус-ассоциированной гепатоцеллюлярной карциномы. Но чтобы говорить уверенно о вирус-ассоциированном заболевании необходимо это доказать, в частности с помощью определения маркеров вирусов гепатита в опухолевой ткани.

В нашем исследовании продемонстрировано, что из 39 пациентов 1-ой группы (ГЦК с маркерами ВГС) суммарные антитела к ВГС выявлялись у 85% больных (33/39) (рис. 6). Из них РНК ВГС в сыворотке крови определяли 21/39 (60%) пациенту. У всех больных были получены положительные результаты на наличие РНК ВГС в сыворотке крови. У 80 %

(12/15) определялась РНК ВГС в опухолевой ткани печени. Следует отметить, что больным, в опухолевой ткани которых РНК ВГС не определялась (п=3), за 2 месяца до оперативного лечения была назначена противовирусная терапия, и у двух из них был достигнут ранний вирусологический ответ. В 13% случаев суммарные анти - ПСУ в крови не определялись. Диагноз ХГС был поставлен на основании обнаружения РНК ВГС в опухолевой ткани печени и подтвержден определением экспрессии структурного белка Е2 ВГС в опухолевой и окружающей печеночной ткани печени иммуногистиохимическим методом.

Рисунок 6. Результаты обследования больных ГЦК с целью верификации хронического гепатита С (п=39)

ГЦК на фоне ВГС п=39

Анализ больных 2-ой группы (ГЦК с маркерами ВГВ) показал, что у 39 больных ГЦК определялся HBsAg (рис. 7). Из них ДНК ВГВ в сыворотке крови определяли 14 больным, и в 100% случаев были получены положительные результаты. Обнаружение ДНК ВГВ в опухолевой ткани печени было в 90% случаев. У одной больной НВбАз в сыворотке крови не определялся. Однако у нее была обнаружена ДНК ВГВ в опухолевой ткани.

Рисунок 7. Результаты обследования больных ГЦК с целью верификации хронического гепатита В (п=40)

Настоящее исследование показывает, что проведение рутинных экспресс - методов для выявления маркеров вирусного гепатита В и С у больных ГЦК, является недостаточным. В данной ситуации большую информативность имеет использование полимеразной цепной реакции для выявления генетического материала вируса в сыворотке крови и в опухолевой ткани печени.

Анализируя полученные результаты диагностики хронического гепатита С и В у больных ГЦК, мы можем представить следующий алгоритм их обследования: определение уровня AJ1T сыворотки крови => раздельное определение антител к антигенным детерминантам ВГС / определение HBsAg и анти-HBcor M/G класса ВГВ => проведение ПЦР (внутренне стандартизированной) в сыворотке крови с обнаружением РНК ВГС и ДНК ВГВ => морфологическое исследование биоптата ткани печени и опухолевого узла с определением в нем РНК ВГС и ДНК ВГВ.

Нами было проведено так же иммуногистиохимическое исследование с моноклональными AT (МКА) к структурному белку Е2 ВГС и к HBsAg ВГВ. Белок Е2 ВГС ответственен за тропизм и проникновение вируса в клетку и возможно, способен инициировать пролиферацию гепатоцитов. Кроме диагностического значения, эти исследования представляют интерес, так как облегчают изучение взаимодействия хозяин -вирус на клеточном уровне.

Всего было исследовано 37 больных ГЦК: 17 больных с ГЦК на фоне ВГС, 10 - с ГЦК на фоне ВГВ и 10 - с ГЦК без ХВГ. Оболочечный белок Е2 был обнаружен в 15 (15/17; 88%) образцах опухолевой и в окружающей ткани печени больных ГЦК на фоне ВГС. HBsAg был обнаружен в 9 образцах опухолевой и окружающей ткани печени (9/10; 90%). При этом доля антиген-позитивных опухолевых клеток составляла практически 100%. Следует отметить, что отрицательные результаты были получены в образцах опухолевой ткани у 2/17 (12%) больных ГЦК на фоне ХГС и у 1/10 (10%) пациента с ГЦК на фоне ХГВ. Необходимо отметить, что специфическое окрашивание с обнаружением оболочечного белка Е2 в опухолевой ткани печени было выявлено у 6 пациентов I группы, в сыворотке крови которых суммарные анти - HCV методом ИФА обнаружены не были. Диагноз ХГС этим больным был поставлен на основании обнаружения в опухолевой ткани РНК ВГС, и подтвержден обнаружением структурного Е2 белка ВГС в опухолевой ткани печени у всех 6 пациентов. В данной группе больных - у 11/17 (59%) не было цирроза печени, а при гистологическом исследовании стадия фиброза по METAVIR была F0-F1. В то время как у 7/10 пациентов (70%) с ГЦК на фоне ВГВ был цирроз печени. Таким образом, наши данные подтверждают наличие латентного течения ВГВ и ВГВ в данной когорте пациентов и непосредственную роль вируса гепатитов В и С на многоступенчатый этиопатогенетический процесс развития ГЦК.

По нашим данным обширная резекция ухудшает жизненный прогноз в связи с нарастанием явлений печеночно-клеточной недостаточности в раннем послеоперационном периоде и не влияет на общую выживаемость больных с ГЦК. В связи с этим, мы

предполагаем, что целесообразно всем больным перед оперативным лечением проводить пункционную биопсию печени с иммуногистиохимическим исследованием опухолевой и окружающей печеночной ткани для решения вопроса об объеме оперативного вмешательства. При выявлении тотальной экспрессии Е2 белка ВГС и HBsAg ВГВ в печеночной ткани, нецелесообразно проводить обширную резекцию, так как сохраняется плацдарм для развития ГЦК в окружающей печеночной ткани, а риск развития печеночной недостаточности с летальным исходом в раннем послеоперационном периоде остается высоким. В данной ситуации с целью уменьшения риска развития печеночно-клеточной недостаточности в раннем послеоперационном периоде, и как следствие летального исхода, рекомендовано проведение экономной резекции печени. Если доля антиген - позитивных клеток незначительная, то проведение расширенной резекции возможно при достаточных функциональных резервах печени.

Несмотря на успехи хирургического лечения, частота рецидива опухоли после резекции печени, ограничивающая общую выживаемость больных, остается все еще высокой

- у 70% в течение 5 лет. Известно, что рецидив опухоли после радикального лечения может быть ранний (до 12 месяцев), и поздний (после 12 месяцев с момента радикального лечения)

- так называемый рецидив de novo. Поздний рецидив, по данным литературы, обусловлен прогрессированием фиброза в печеночной ткани и возможно персистенцией HCV - и HBV -инфекции в печеночной ткани и ассоциированной с ней гепатоканцерогенезом.

Анализ выживаемости больных ГЦК после проведенного радикального лечения, позволил нам выявить особенности ГЦК на фоне вирусной инфекции. В нашей работе продемонстрирована не достоверная разница в показателях общей выживаемости для больных ГЦК, инфицированных вирусами гепатита, в сравнении с больными ГЦК без вирусных маркеров (рис. 8).

Рисунок 8 . Общая выживаемость больных ГЦК после резекции печени

Общая яыжм*а*1««сть

Complete

О

0.0

О

5 10 19 го 25 ЗО 35

- Шгруппа

.....I и И группы

р>0,05 Сох - Mantel

Однако, если сравнить выживаемость больных, переживших 12 и 18 месяцев после резекции печени, были получены достоверные различия (р<0,02). Так общая выживаемость больных с ГЦК на фоне ВГВ и ВГС была достоверно меньше, чем в группе ГЦК без ХВГ (рис. 9).

Рисунок 9. Общая выживаемость пациентов, переживших 12 и 18 месяцев после

резекции печени

в CcoipJete * Centavo

в Complete ♦ Centered

'О М 30 40 50 50 70 6) 90 100 вр«мн (месяцы)

— Я группе

8 Ю 20 ЗЭ 40 SO 60 70 М 90 100 НО... IИ П группы 6р*мя {и«сяцы)

р<0,03 Сох - Mantel р<0,03 Сох - Mantel

Вероятнее всего, это подтверждает непосредственное влияние ХГВ и ХГС на сложный механизм гепатоканцерогенеза и непосредственную роль ВГВ и ВГС на рецидив ГЦК de novo после радикального лечения.

В нашем исследовании мы сравнили выживаемость в группе ГЦК на фоне ВГВ и ВГС (рис. 10). Общая выживаемость в группе ГЦК на фоне ВГС была достоверно больше. Возможно, это обусловлено тем, что в группе ГЦК на фоне ВГВ было больше больных с циррозом печени и поздними стадиями ГЦК, при сравнеии с 1-ой группой (ГЦК с маркерами ВГС).

Рисунок 10. Общая выживаемость пациентов, переживших 18 месяцев в группе больных ГЦК на фоне вирусного гепатита В и С после резекции печени

jo so ео Время {месяцы)

р<0,03 Сох - Mantel

Проведенный нами регрессионной анализ Кокса показал, что общая выживаемость больных, которым была выполнена резекция печени, зависит от наличия вирусного гепатита (р<0,01), цирроза печени (р<0,002), спонтанного некроза опухоли (р<0,0004), стадии опухолевого процесса по международной классификации TNM (р<0,01), безрецидивной выживаемости (р<0,00001), уровня общего белка, MHO до операции (р<0,001) и уровня AJ1T, ГГТ в раннем послеоперационном периоде (р<0,05).

В группе больных с ГЦК на фоне вирусного гепатита В и С безрецидивная выживаемость была достоверно меньше (рис. 11).

Рисунок 11. Безрецидивная выживаемость в группе ГЦК на фоне ВГВ, ВГС и в группе ГЦК без маркеров вирусного гепатита.

о complete + Censored

р<0,03 Сох - Mantel

На безрецидивную выживаемость по нашим данным влияют такие факторы, как возраст, вирусный гепатит В и С, клинические проявления раковой интоксикации, форма роста, наличие цирроза печени, количество опухолевых узлов, степень дифференцировки опухоли, стадия опухолевого процесса и метастазы в лимфатические узлы ворот печени. Из лабораторных признаков на безрецидивную выживаемость влияют такие показатели, как уровни AJIT и ACT, билирубин, ЩФ, фибриноген (таблица 5). По данным некоторых зарубежных исследований на безрецидивную выживаемость влияет уровень АФП [J. С. Wu, 2009]. Однако в нашем исследовании корреляционной связи между уровнем АФП и безрецидивной выживаемостью получено не было.

Таблица 5

Корреляционные признаки безрецидивной выживаемости по Спирману

Признак Безрецидивная выживаемость Р

Возраст -0,168 р<0,05

Вирусный гепатит -0,334 р<0,05

Кахексия -0,309 р<0,05

Цирроз -0,217 р<0,05

Стадия опухоли по международной классификации ТЫМ -0,255 р<0,05

Стадия опухоли по ВСЬС -0,316 р<0,05

Количество узлов в печени -0,316 р<0,05

Дифференцировка опухоли -0,280 р<0,05

Форма роста -0,219 р<0,05

Внутрипеченочные метастазы -0,257 р<0,05

Внепеченочные метастазы -0,254 р<0,05

Метастазы в лимфатические узлы -0,250 р<0,05

Общий билирубин -0,273 р<0,05

АЛТ -0,395 р<0,05

АСТ -0,329 р<0,05

ШФ -0,325 р<0,05

Фибриноген 0,197 р<0,05

Полученные результаты отражают худший прогноз у больных ГЦК с маркерами вирусных гепатитов. Течение ГЦК на фоне ХВГ характеризуется склонностью к быстрой генерализации опухолевого процесса. HCV - и HBV - инфекция играют непосредственную роль в генезе ГЦК и рецидиве опухоли после радикального лечения, и обуславливают крайне неблагоприятный прогноз и высокую летальность больных как в раннем послеоперационном периоде от печеночно-клеточной недостаточности, так и в отдаленном периоде от прогрессирования опухоли при сравнении с контрольной группой.

Полученные результаты, на наш взгляд, должны обязательно учитываться при определении тактики ведения больных ГЦК на фоне HBV- и HCV-инфекции. Можно предположить, что проведение этиопатогенетической терапии ХГВ и ХГС, сможет снизить число частоту развития ГЦК и рецидива в данной группе больных. Таким образом, пациентам с ГЦК на фоне ХВГ с целью уменьшения воспалении в ткани печени, прогрессирования фиброза печени и подавления HCV - и HBV - ассоциированных механизмов канцерогенеза, и как следствие снижение риска рецидива опухоли de novo, целесообразно назначать противовирусную терапию. Наши предположения подтверждают ряд зарубежных исследователей: так у пациентов, получающих противовирусную терапию после резекции

печени, достоверно реже был поздний рецидив опухоли с УВО при сравнении с контрольной группой (не получающих противовирусную терапию).

ВЫВОДЫ

1. У подавляющего большинства больных, инфицированных вирусами гепатитов В и С, ГЦК развивается на фоне цирроза печени (81%); однако у 19% пациентов фоном для развития ГЦК был гепатит, что подтверждает непосредственное влияние вирусов гепатитов В и С на канцерогенез и служит основанием для проведения противовирусной терапии.

2. Хронический вирусный гепатит В и С оказывает существенное влияние на частоту рецидивирования и продолжительность жизни после радикального хирургического лечения (резекции печени).

3. Проведение ИФА для детекции вирусного гепатита В и С является недостаточно информативным. Для выявления генетического материала вируса необходимо использовать полимеразную цепную реакцию сыворотки крови и опухолевой ткани печени.

4. В раннем послеоперационном периоде после резекции печени худшая выживаемость отмечается у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В и С, циррозом печени, обширной резекцией печени, более высоким уровнем трансаминаз, общего и прямого билирубина до оперативного лечения (резекции печени); в раннем послеоперационном периоде у них отмечается более высокий уровень трансаминаз, общего и прямого билирубина, креатинина, более выраженная гипоальбуминемия, тромбоцитопения, коагулопатия (р<0,001).

5. Вирусный гепатит В и С, цирроз печени, количество опухолевых узлов в печени, стадия опухолевого процесса, форма роста и дифференцировки опухоли, симптомы раковой интоксикации, уровень ACT, AJIT, ЩФ и фибриногена являются предикторами рецидива ГЦК после резекции печени (р<0,05).

6. У пациентов с хроническим гепатитом В и С, проживших после операции более 12 месяцев, продолжительность жизни была статистически значимо меньше, чем у больных без маркеров вирусного гепатита В и С.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения диагностики латентной вирусной инфекции необходимо использовать ПЦР-диагностику сыворотки крови как на первичном этапе обследования больных с гепатоцеллюлярной карциномой, так и в опухолевой ткани печени. Иммуноферментный анализ и ПЦР-диагностика не взаимоисключающие, а дополняющие друг друга методы обследования.

2. Для решения вопроса о дальнейшей тактики ведения пациента перед радикальным лечением необходимо использовать биопсию печени больных гепатоцеллюлярной карциномой, инфицированных вирусами гепатита В и С с целью выявления и количественного определения экспрессии вирусных белков гепатита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Геттуева, A.A. Синхронное развитие неходжкинской лимфомы и гепатоцеллюлярной карциномы у больного хроническим гепатитом С / Г.И. Сторожаков, С.В. Лепков, A.A. Геттуева и др. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. -2008г. - №8 - С.110-114.

2. Геттуева, A.A. Влияние вирусов гепатитов В и С на течение и прогноз гепатоцеллюлярной карциномы / A.A. Геттуева, Г.И. Сторожаков, С.В. Лепков и др. // Лечебное дело. - 2012г. - №2 - С. 61-65.

3. Gettueva, A.A. The Case of the Death from Acute Hepatitis С (AHCV) of Patient after Bone Marrow Transplantation (BMT) / S.V. Lepkov, G.I. Storogacov, A.A. Gettueva et al. // Hepatology international, Vol. 5,2011, P. 63.

4. Gettueva, A.A. Hepatic Toxicity in Patient with Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL) with Hepatitis С Virus RNA Undergoing Chemotherapy with Rituximab / G.l. Storogacov, S.V. Lepkov, A.A. Gettueva et al. // Hepatology international, Vol. 5, 2011, P. 267.

5. Gettueva, A.A. Primary Malignant Melanoma of the Liver: The Description of Treatment of a Case Report / G.I. Storogacov, S.V. Lepkov, A.A. Gettueva et al. // Hepatology international, Vol. 5, 2011, P. 395.

6. Gettueva, A.A. Hepatocellular carcinoma in patients with and without hepatitis С / A.A. Gettueva, S.V. Lepkov, G.I. Storogacov et al. // Hepatology international, Vol. 6, 2012, P. 226.

7. Gettueva, A.A. Hepatocellular carcinoma in patients with and without hepatitis В / A.A. Gettueva, G.I. Storogacov, S.V. Lepkov et al. // Hepatology international, Vol. 6, 2012, P. 240.

8. Gettueva, A.A. Increased hepatitis C viral load and reactivation of liver disease in HCV RNA - positive patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL) disease undergoing chemotherapy / S.V. Lepkov, G.I. Storogacov, A.A. Gettueva et al. // Hepatology international, Vol. 6,2012, P. 176.

9. Gettueva, A.A. Complete remission hepatitis C and chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL) conserved after antiviral therapy / S.V. Lepkov, G.I. Storogacov, A.A. Gettueva et al. // Hepatology international, Vol. 6,2012, P. 169.

10. Gettueva, A.A. Primary extranodal lymphomas of liver: clinical, diagnostics and treatment / A.A. Gettueva, S.V. Lepkov, G.I. Storogacov et al. // Annals of oncology, Vol. 22, Sup. 4, 2011:468.

Подписано в печать:

09.04.2012

Заказ № 7107 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru