Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Комплексный иммуногенетический принцип прогнозирования быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию у больных хроническим гепатитом С

На правах рукописи

Наталия Владимировна

ФЕДОСЕЕВА

КОМПЛЕКСНЫЙ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПРИНЦИП ПРОГНОЗИРОВАНИЯ БЫСТРОГО ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА ПРОТИВОВИРУСНУЮ ТЕРАПИЮ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С

14.01.09 - инфекционные болезни 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г я ноя гшз

005540656

Москва-2013

005540656

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования - «Московском государственном медико-стоматологическом университете имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научпые руководители:

д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ им. А.И.Евдокимова

д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ им. А.И.Евдокимова

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней МГМУ им. И.М. Сеченова

зноико

Ольга Олеговна

БАЛМАСОВА Ирина Петровна

ВОЛЧКОВА Елена Васильевна

д.м.н., профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии МГМУ им. И.М. Сеченова

КАЛЮЖИН Олег Витальевич

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

со

Защита диссертации состоится «/о» А^МьР/1 2013г. в « /3 » часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, Д.16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России.

Автореферат разослан «1*1» НодБРЛ 2013г. / \ У

Ученый секретарь диссертационного совета, Ч^^Л--^

д.м.н. Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Вирусные гепатиты продолжают оставаться одной из актуальнейших и сложнейших проблем мирового здравоохранения. По оценкам ВОЗ вирусом гепатита С (HCV) инфицировано около 180-200 миллионов человек, что составляет приблизительно 3% общемировой популяции [Ford N., Kirby С., Singh К. et al., 2012]. Острый гепатит С, наиболее часто протекающий бессимптомно, у 20% - 40% инфицированных заканчивается эрадикацией вируса и выздоровлением, у остальных 80% - 60% развивается хронический гепатит С, который у 20% больных приводит к формированию цирроза печени и в 1-5% случаев развивается гепатоцеллюлярная карцинома [Afdhal N.H., 2004]. Отсутствие эффективной вакцины, нередко бессимптомное течение острого гепатита С, высокая частота хронизации инфекции обуславливают повсеместное распространение заболевания, а возможность прогрессирования с развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы возводят гепатит С в ранг медицинской, социальной и экономической проблемы.

Хронический гепатит С является примером «успешной» инфекции, при которой вирус путем собственной изменчивости и влияния на иммунный ответ способен долго существовать в организме хозяина [Rehermann В., 2009]. Изучение иммунореагирования организма человека при остром гепатите С представляет интерес в связи с высоким процентом хронизации заболевания, отсутствием четко сформулированных критериев реконвалесценции и показаний к началу противовирусной терапии, основанных на динамике результатов выявления РНК вируса в крови.

Известно, что способность вируса гепатита С длительно персистировать в организме, приводящая к развитию неблагоприятных исходов гепатита в виде цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы, обусловлена феноменом ускользания от иммунного ответа с участием

механизмов врожденного и адаптивного иммунитета [Neumann-Haefelin С., Blum Н.Е., Chisari F.V. et al., 2005]. Появление новых противовирусных препаратов и их использование в сочетании со стандартными схемами терапии пока не способно полностью решить проблему гепатита С и связанных с ним осложнений.

В настоящее время не прекращаются попытки поиска новых предикторов успеха противовирусной терапии ХГС, как стандартной, так и с включением новых противовирусных препаратов (ингибиторы вирусной протеазы и полимеразы). Описаны «благоприятные» и «неблагоприятные» аллельные варианты полиморфизмов гена ИЛ-28В человека, механизмы реализации влияния которых только изучаются, однако, показано, что наличие «благоприятных» вариантов генотипа человека практически в 2 раза повышает вероятность развития устойчивого вирусологического ответа (УВО) при лечении пегилированными интерферонами и рибавирином [Ridruejo Е., Solano A., Marciano S. et al., 2011].

Считается, что определение варианта полиморфизма гена ИЛ-28В человека может быть полезно для определения прогностической вероятности успеха терапии пегилированным интерфероном и рибавирином, однако, индивидуальное предсказательное значение генотипа человека не абсолютно, поскольку УВО может достичь пациент и с неблагоприятным генотипом. Кроме того, известен ряд факторов, которые могут модифицировать влияние генотипа человека на эффективность противовирусной терапии [Darling J.M., Aerssens J., Fanning G. et al., 2011]. При этом считается, что наступление быстрого вирусологического ответа (БВО) является надежным предиктором устойчивого вирусологического ответа. Поиск дополнительных, иммунологических критериев успешности проводимой терапии обоснован и представляет несомненный интерес не только для научных, но и для практических целей.

Цель исследования:

Разработать комплексный клинико-лабораторный и

иммуногенетический принцип прогнозирования быстрого вирусологического ответа на стандартную терапию пегиллированным интерфероном а. и рибавирином у больных хроническим гепатитом С на основании углубленного изучения функционального состояния лимфоцитов при различных видах инфекционного процесса.

Задачи исследования:

1. Дать эпидемиологическую и клинико-лабораторную характеристику группе больных хроническим гепатитом С.

2. Выявить иммунологические особенности у больных хроническим гепатитом С на основании базовых иммунограмм и углубленного изучения функционального состояния лимфоцитов и сопоставить с аналогичными параметрами больных острым гепатитом С на 12 неделе заболевания на фоне авиремии.

3. Оценить влияние генотипа вируса гепатита С и варианта полиморфизма гена ИЛ-28В человека на клинико-иммунологические параметры больных ХГС.

4. Разработать иммунологические критерии, способствующие реализации генетически «благоприятного» прогноза развития быстрого вирусологического ответа на терапию пегиллированным интерфероном а и рибавирином.

5. Разработать иммунологические критерии, препятствующие реализации генетически «неблагоприятного» прогноза развития быстрого вирусологического ответа на терапию пегиллированным интерфероном а и рибавирином.

Научная новизна работы

В процессе настоящего исследования впервые:

- Установлено значение пролиферативной активности и состояния гиперактивации лимфоцитов для характеристики иммунного статуса у больных хроническим гепатитом С.

- Показано, что характеристика пролиферативной активности Т-лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С должна дополняться изучением пролиферации естественных киллеров.

- Определение функционального состояния лимфоцитов у больных острым гепатитом С на 12 неделе заболевания позволяет предполагать возможность выделения группы риска по развитию хронического гепатита С на основе иммунологических критериев.

- Показано, что генотип вируса гепатита С оказывает влияние на функциональное состояние лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С, но особенно информативен в качестве предиктора быстрого вирусологического ответа в сочетании с аллельными вариантами гена ИЛ-28В.

- Продемонстрирована взаимосвязь между генетическими (вариант полиморфизма гена ИЛ-28В) и иммунологическими предикторами быстрого вирусологического ответа у больных хроническим гепатитом С.

- Определены иммунологические критерии, соответствующие развитию быстрого вирусологического ответа на стандартную терапию пегиллированными интерферонами и рибавирином у больных хроническим гепатитом С.

Практическая значимость работы

Проведенные исследования показали, что предсказательное значение полиморфизмов гена ИЛ-28В в отношении развития быстрого вирусологического ответа на терапию пегилированным интерфероном а и рибавирином не абсолютно и нуждается в дополнительном сопоставлении с функциональным состоянием лимфоцитов.

Использование иммунологических данных для предикции быстрого вирусологического ответа на стандарную терапию пегилированным интерфероном а и рибавирином требует их углубленной оценки с использованием пролиферативного теста и определением экспрессии маркеров активации и числа регуляторных Т-клеток. Такой подход поможет принять оптимальное решение, какую терапию выбрать - стандартную или с включением новых противовирусных препаратов, особенно при 1 генотипе вируса.

Были установлены особенности иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С при сопоставлении результатов углубленной оценки функционального состояния лимфоцитов по сравнению со здоровыми людьми, больными острым гепатитом С. Эти отличия свидетельствуют о возможности прогнозирования хронизации инфекции у больного острым гепатитом С, что требует раннего начала лечения.

Было показано особое диагностическое значение пролиферативной активности естественных киллеров в предикции быстрого вирусологического ответа на терапию пегилированным интерфероном а и риб.авирином.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Исходные клинико-лабораторные особенности течения хронического гепатита С, включающие уровень вирусной нагрузки, стадию фиброза печени, аллельный вариант гена ИЛ-28В человека и параметры базовой иммунограммы, оцениваемые изолированно друг от друга, не позволяют прогнозировать быстрый вирусологический ответ на противовирусную терапию пегилированным ИФНа и рибавирином.

2. Показатели функционального состояния лимфоцитов, включающие 36 уникальных параметров, в отличие от базовых иммунограмм, информативны для выявления особенностей иммунного реагирования у больных острым и хроническим гепатитом С.

3. В связи с ограниченной возможностью индивидуального прогноза развития БВО на основе аллелыюго варианта полиморфизма гена ИЛ-28В человека, методической основой прогноза развития БВО на противовирусную терапию пегилированным ИФНа и рибавирином у больных ХГС может служить комплексный иммуногенетический подход с учетом анализа дополнительных показателей иммунологического статуса.

4. Отдельные показатели функционального состояния лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С могут входить в число предикторов быстрого вирусологического ответа в комплексе с генетическими факторами.

Внедрение результатов работы

Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе ГБОУ ВПО МГМСУ им.А.И. Евдокимова Минздрава России по подготовке интернов, клинических ординаторов, врачей — слушателей курсов на факультете последипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий.

Полученные в ходе исследования данные используются в научно-методической деятельности лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ М ГМСУ им.А.И.Евдокимова, а также в клинической практике Инфекционной клинической больницы №1 и Инфекционной клинической больницы №2 г. Москвы.

Апробация результатов исследования и публикации

Основные положения работы заслушаны и обсуждены на VIII Ежегодной конференции Сети Визби по гепатиту С (Вильнюс, 2011); IX Ежегодной конференции Сети Визби по гепатиту С (Санкт-Петербург, 2012); XIX Международном симпозиуме по гепатиту С и родственным вирусам (Венеция, 2012); X Ежегодной конференции Сети Визби по гепатиту С (Рига, 2013); XII Конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013); XVIII Международном конгрессе по

реабилитации и иммунореабилитации в медицине (Лондон, 2013); на заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ им. А.И.Евдокимова (Москва, 2013, протокол №132).

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе, в центральной печати и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, — 6.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 202 страницах (156 страниц без списка литературы и приложений) и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 42 таблицами, 47 рисунками. Список литературы содержит 232 источника, из которых 8 отечественных и 224 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

" Работа выполнена в 2011-2012 гг. на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И.Евдокимова. В настоящее исследование было включено 3 группы обследуемых: пациенты с хроническим гепатитом С (120 человек), в том числе обследованные до начала лечения (30 человек) и на 4 неделе от начала стандартной противовирусной терапии (18 человек) — точка оценки наличия БВО; больные острым гепатитом С (7 человек), обследованные на 12 неделе от начала заболевания и здоровые неконтактные по НСУ лица - группа контроля (9 человек).

Половые и возрастные характеристики пациентов и обследованных групп контроля и сопоставления достоверно не различались.

Всем больным и лицам группы контроля проводилось клинико-эпидемиологическое обследование (опрос, сбор анамнеза, анкетирование, осмотр), а также комплексное лабораторное обследование, включающее клинический анализ крови, биохимический анализ крови, определение серологических маркеров вирусных гепатитов проводилось на базе лабораторий ИКБ №1 и ИКБ №2 г. Москвы методом ИФА, определение генетических маркеров (РНК/ДНК) вирусов гепатитов А, В, С в лаборатории ЗАО НПФ «ДНК-Технология» - научное подразделение Института иммунологии МЗ РФ (руководитель - к.б.н. Трофимов Д.Ю.). Для контроля развития быстрого вирусологического ответа (БВО) использовалось количественное определение РНК ВГС в плазме крови (тест система Нойшап-Ьа-ЯосЬе, чувствительность 15МЕ/мл, линейный диапазон 44-69x10*6 МЕ/мл), до и через 4 недели от начала противовирусной терапии.

Группе пациентов с хроническим гепатитом С после подписания информированного согласия выполнено генетическое тестирование -определение аллельного варианта полиморфизмов гэ12979860 (генотипы СС, СТ или ТТ) и ге8099917 (генотипы ТТ, Тв или (Ю) гена ИЛ-28В с помощью метода генотипирования, представляющего собой модифицированный метод «примыкающих проб» и выявляющий однонуклеотидные замены в генах.

Иммунологическое исследование предусматривало определение клеточного состава лимфоцитов, включающее: общее число Т-лимфоцитов, число основных субпопуляций Т-лимфоцитов (С04+Т-хелперов, СБ8+цитотоксических Т-лимфоцитов, РохрЗ+регуляторных Т-клеток), число активированных Т-лимфоцитов (СБ25+ и СБ25Ы§Ь), число естественных киллеров (СБ56+СВЗ-). Для общего числа Т-лимфоцитов, числа Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллеров определялась пролиферативная активность этих клеток по наличию маркера пролиферирующих клеток - 1а67 - в интактной тест-системе, при инкубировании в присутствии фитогемаглютинина, антигенов ВГС генотипа

lb (смесь антигенов кора и неструктурного белка - NS4, «БИОСЕРВИС», Боровск, Россия), генотипов 2а и За (смесь антигенов неструктурного белка-NS4, «БИОСЕРВИС», Боровск, Россия). Иммунологические исследования осуществлялись в лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ (зав. лабораторией - д.м.н. профессор И.П.Балмасова; исполнители - Н.В.Федосеева, к.м.н. Е.В.Шмелева, О.С.Капитонова).

Для статистической обработки данных применялись методы дискриптивной статистики, сравнение величин осуществлялось приемами непараметрической статистики с использованием критерия Манна-Уитни и критерия %2 в соответствии с распределением данных, определялись 95% доверительные интервалы, осуществлялось построение ROC-кривой и регрессионный анализ.

Математическая обработка данных проводилась на основе пакета статистических программ SPSS 17.0 (допустимая ошибка Е=5%).

Результаты исследования и их обсуждение

Первой задачей исследования была эпидемиологическая и клинико-лабораторная характеристика больных хроническим гепатитом С.

Все 120 больных ХГС, в том числе 30 больных основной группы, бессимптомно перенесли в прошлом острый гепатит С с последующей хронизацией; среди вероятных факторов риска присутствовали указания на татуаж, употребление в\в наркотиков, переливание крови, полостные операции, однако, у 33,3% не удалось определить никаких факторов риска по данным анкетирования; у 70% пациентов группы ХГС давность установленного диагноза составила от 1 до 20 лет, результаты рутинных лабораторных исследований полностью соответствовали диагнозу хронического гепатита С. Лечение получали 18 пациентов из 30. После 4 недель терапии у 10 человек (55,6%) достигнут БВО, у 8 человек (44,4%) не

было БВО. У всех достигших БВО был зафиксирован ранний вирусологический ответ (РВО), из 8 человек без БВО РВО достигли 4 человека.

В группе больных, получавших ПВТ в течение 4 недель и достигших БВО (средний возраст 30,5±9,71 лет), 1Ь генотип был у 5 человек (50%), генотип 2а-3а у 5 (50%). Фиброз 3-4 в данной группе не регистрировался, высокий уровень виремии более 400000МЕ у 4 человек (40%). Аллельный вариант ИЛ-28В ге 12979860 СС был у 6 человек (60%), вариант ИЛ-28В ге8099917 ТТ был у 7 человек (70%), в совокупности благоприятный вариант СС-ТТ был у 60%.

В группе больных, получавших противовирусную терапию (ПВТ) в течение 4 недель и с отсутствием БВО (средний возраст 38,3±6,25 лет) генотип 1Ь выявлен у 7 человек (87,5%), генотип За - у 1 человека (12,5%). Дополнительными факторами неблагоприятного прогноза были фиброз 3-4 у 50% и высокий уровень виремии более 400000МЕ у 50%. Аллельный вариант ИЛ-28В ге12979860 СС определялся у 4 человек (50%), вариант ИЛ-28В «8099917 ТТ был у 5 человек (62,5%), в совокупности благоприятный вариант СС-ТТ был у 50%.

При этом группы с наличием БВО и отсутствием БВО не отличались друг от друга по возрасту (р=0,104, критерий Манн-Уитни), уровням АЛТ (р=0,897, критерий Манн-Уитни) и АСТ (р=0,093, критерий Манн-Уитни) до лечения и после 4 недель терапии (р=0,897 и р=0,438 соответственно, критерий Манн-Уитни). Также группы не отличались по соотношению благоприятных/неблагоприятных аллелей ИЛ-28В (р=0,389, критерий х2)> соотношению генотипов вируса Уне 1 генотип (р=0,729, критерий %2), по стадиям фиброза 1-2-3-4 (р=0,096, критерий -¿) по давности постановки диагноза (р=0,445, критерий х2) и уровню высокой (>400000 МЕ) виремии (р=0,592, критерий х2)-

Таким образом, для прогнозирования БВО у основной группы обследованных больных ХГС клиническо-лабораторных данных было недостаточно, поскольку указанные признаки имели недостоверное индивидуальное предсказательное значение, что требовало углубленного изучения дополнительных особенностей данной группы.

Вторая задача исследования предусматривала развернутую иммунологическую характеристику группы больных ХГС и сравнение ее с таковой для группы больных ОГС на 12 неделе от начала заболевания на основании базовых иммунограмм и углубленного изучения функционального состояния лимфоцитов.

При иммунологическом обследовании больных ХГС по субпопуляционному составу базовой иммунограммы, по содержанию активированных и регуляторных клеток нами не было обнаружено отличий по сравнению со здоровыми людьми. При исследовании пролиферативной активности лимфоцитов оказалось, что лимфоциты больных ХГС отличаются исходной повышенной пролиферативной активностью хелперной субпопуляции при сопоставлении с показателями здоровых лиц. В настоящем исследовании дополнительно определялось функциональное состояние лимфоцитов и ЕК по реакции клеток на добавление в культуру ФГА, а также на инкубацию с вирусными антигенами (специфическая стимуляция, моделирование ситуации взаимодействия с вирусом), наблюдаемые отличия представлены в таблице 1. Оказалось, что инкубация лимфоцитов в присутствии неспецифического митогена фитогемагглютинина приводила к достоверному падению числа активированных (СБЗ+/С025+), высоко активированных (СОЗ+/СБ25Ы§11) и регуляторных Т-клеток (СОЗ+/РохРЗ+); в присутствии антигенов Соге+К84 вируса гепатита С 1Ь — к достоверному падению числа высоко активированных Т-клеток (СБЗ+/С0251^11); а в присутствии антигенов ВГС N84 2а+3а генотипов — к достоверному падению числа клеток с фенотипами CDЗ+/CD25high и СБЗ+/С025+/ЕохРЗ+ у больных

ХГС по сравнению с контролем на уровне, имеющем дифференциально-диагностическое значение. В настоящей работе впервые удалось выявить феномен функционального истощения ЕК. Нами показано, что ЕК больных ХГС теряют способность адекватно пролиферировать под влиянием неспецифического индуктора (ФГА), что выражалось в достоверном падении числа С056+/Кл-67+ клеток по сравнению со здоровыми людьми.

Таблица 1. Иммунологические отклонения, сопутствующие развитию ХГС, по сравнению с аналогичными параметрами здоровых лиц

Условия изучения иммунного статуса у больных ХГС Информативные показатели иммунного статуса Диагностически значимые диапазоны величин Интепретация результатов

Интакшая тест- система (пролифератив-ныйтесг) Относительное число СОЗ+/Кл67+ клеток >0,8% Наличие ВГС в организме способствует развитию адаптивного иммунного ответа и стимулирует Т-хелперную субпопуляцию лимфоцитов к пролиферации

Относительное число СОЗ+/СБ4+.Кл67+ клеток >1%

Инкубирование с ФГА Относительное число СБ 16+/СБ5б+/К1б7+ клеток <5% Истощение способности ЕК как фактора врожденного иммунного ответа к пролиферации

Относительное число СГ)3+/СШ5+ клеток <50% Падение способности Т-лимфоцитов к неспецифической и специфической активации из-за сниженной экспрессии CD25 (а-цепи рецептора к ИЛ-2) —> отсутствие вне обострения условий для перепрограммирования CD3+/CD25high клеток в регуляторные (FoxP3+) Т-клетки

Относительное число С03+/С025ЫёЬ клеток <30%

Инкубирование с Соге+Ш4 1Ь Относительное число СОЗ+/СШ5ЫвЬ клеток <0,3%

Инкубирование с N54 2а+3а Относительное число СБЗ+/С025Ы^ клеток <0,5%

В данную задачу исследования входило также определение особенностей иммунного статуса больных хроническим гепатитом С в сравнении с пациентами, перенесшими острый гепатит С, после нормализации клинико-лабораторных параметров на 12 неделе от начала заболевания. Дифференциально-значимые иммунологические признаки при сравнении этих групп представлены в таблице 2.

Таблица 2. Иммунологические отклонения, сопутствующие развитию ХГС, по сравнению с больными ОГС

Условия изучения иммунного статуса у больных ХГС Информативные показатели иммунного статуса Диагностически значимые диапазоны величин Интепретация результатов

Интактная тест-система Относительное число СБ 19+ клеток >15% Отсутствие элиминации ВГС из организма при хронизации процесса поддерживает адаптивный гуморальный иммунный ответ на относительно высоком уровне и стимулирует ЕК к пролиферации

Относительное число СШ6+/С056+/Ы67+ клеток >0,8%

Инкубирование с ФГА Относительное число СОЗ+/СШ5+ клеток <50% Сниженная способность Т-лимфоцитов к активации, падение специфической (на ВГС 1Ь) пролиферации Т-хелпе-ров на фоне повышения числа регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью в ответ на ВГС 2а-3а

Инкубироваиие с Соге+№4 1Ь Относительное число С03+/С04+/Ы-67+ клеток <0,3%

Инкубирование с N84 2а+3а Относительное число СЮ+/С025+/ТохРЗ+ клеток >0,3%

При сопоставительном анализе исходных иммунных статусов больных ХГС и ОГС оказалось, что эти группы демонстрировали незначительные различия по субпопуляционному базовому и активационному составам иммунограмм, заключавшиеся в большем содержании В-лимфоцитов в группе ХГС. Также в группе ХГС была выше исходная пролиферативная активность ЕК. Подобные наблюдения очень важны с практической точки зрения, поскольку демонстрируют минимальные отличия ХГС от ОГС на 12 неделе и могут служить иммунологической базой обоснования ранней терапии ОГС (ранее 12 недели).

Лимфоциты больных ХГС хуже отвечают на неспецифическую стимуляцию (ФГА) по сравнению с ответом при ОГС, то есть при ХГС в меньшей степени проявляется способность к активации, выраженная в содержании активированных Т-клеток (СОЗ+/СБ25+); кроме того, у больных ХГС повышена способность лимфоцитов-хелперов пролиферировать в ответ

на вирусные белки (Соге+Ы84 вируса гепатита С 1Ь), по сравнению с лимфоцитами от пациентов с острой инфекцией.

Третьей задачей было определение влияния генотипа вируса гепатита С и аллельных вариантов полиморфизма гена ИЛ-28В на иммунный статус больных хроническим гепатитом С. Оказалось, что генотипы вируса гепатита С влияют на иммунологические характеристики, хотя такое влияние выражено примерно в той же степени, что и в группе больных ХГС в целом. Так инфицирование вирусами гепатита С 2а и За генотипов у обследованных нами пациентов приводило к увеличению абсолютного количества Т-хелперов по сравнению со здоровыми лицами. По функциональной активности (реакция лимфоцитов на ФГА) лимфоциты больных ХГС отличались угнетенной пролиферативной активностью ЕК по сравнению со здоровыми, но в случае инфицирования 1Ь генотипом вируса такое угнетение было достоверно менее выражено по сравнению с 2а и За генотипами. Инкубация лимфоцитов больных разных генотипов с антигенами вируса выявила незначительные и однонаправленные сдвиги популяции высоко активированных Т-клеток. Популяция ЕК от пациентов, инфицированных 1Ь генотипом вируса, при добавлении белков N84 2а и За генотипов активно пролиферировала, что регистрировалось не только по сравнению со здоровыми, но и с группой пациентов, инфицированных 2а и За генотипами вируса. Тогда как добавление «одноименного» антигена в культуру клеток от пациентов, инфицированных 2а и За генотипами НСУ, приводило к угнетению пролиферации ЕК, как в сравнении со здоровыми, так и больными ХГС с 1 генотипом вируса.

При разделении основной группы ХГС на подгруппы по вариантам гена ИЛ-28В были выявлены минимальные различия. Так, в случае «благоприятного» (СС-ТТ) генотипа содержание высоко активированных Т-клеток было достоверно выше и при стимуляции лимфоцитов смесью N84-соге ВГС 1Ь генотипа содержание регуляторных клеток также достоверно

повышалось в данной группе по сравнению с группой «неблагоприятного» (СТ-ТТ, СТ-ТС и ТТ-ТС) генотипа.

Наконец, задачами исследования предусматривалось установить взаимосвязь между клинико-лабораторными, генетическими и иммунологическими предикторами быстрого вирусологического ответа у больных хроническим гепатитом С, а также разработать иммунологические критерии способствующие реализации генетически «благоприятного» и «неблагоприятного» прогноза развития быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию.

По нашим данным прогнозирование успеха терапии пегилированным ИФНа и рибавирином на основе варианта полиморфизма гена ИЛ-28В и клинико-лабораторным параметрам не является абсолютным и требует дополнительных критериев. В нашем исследовании было показано, что эти критерии могут быть получены на основе иммунологических показателей, и они различны для благоприятных и неблагоприятных аллелей гена ИЛ-28В.

Для аллели СС-ТТ, оцениваемой в литературе как благоприятная для развития БВО, иммунологические критерии включают ряд показателей типовой иммунограммы (абсолютное содержание в крови СОЗ+, СБЗ+/С04+, СЭЗ+/С08+. СВ19+ клеток), которые при использовании специальной формулы, построенной на основе уравнения линейной регресии, и с учетом критериальных значений коэффициента иммунопрогнозирования КИП/СС-ТТ, расчитанного по этой формуле, позволяют с очень высокой точностью прогнозировать развитие БВО (около 100%), как это представлено на рисунке 1.

Для неблагоприятных аллелей «не СС-ТТ» (СТ-ТТ, СТ-'ГС, ТТ-Тв) иммунологические критерии совершенно иные - это относительное число пролиферирующих ЕК (СВ16+/С056+Ла-67+), высоко активированных Т-клеток (СБЗ+/С025Ы^), регуляторных Т-клеток (СОЗ+/С025Ь^И/РохРЗ+)-

Рисунок 1. 95% доверительные интервалы для КИП 1 в группах с разными вариантами ИЛ-28В и наличием/отсутствием БВО

Б) КИП 1

Примечание: группа 1 - пациенты с БВО, СС-ТТ; группа 2 - пациенты без БВО, СС-ТТ; группа 3 - пациенты с БВО, другие аллели ИЛ-28В; группа 4 - пациенты без БВО, другие аллели ИЛ-28В.

Группы 1

Специфичность

А) 95% ДИ

Рисунок 2.95% доверительные интервалы для КИП 2 в группах с разными вариантами ИЛ-28В и наличием/отсутствием БВО.

Группы 1 2 3 4 Специфичность

Примечание: группа 1 - пациенты с БВО, СС-ТТ; группа 2 - пациенты без БВО, СС-ТТ; группа 3 - пациенты с БВО, другие аллели ИЛ-28В; группа 4 - пациенты без БВО, другие аллели ИЛ-28В.

На основе уровнения линейной регрессии для соответствующего коэффициента иммунопрогнозирования - КИП/не СС-ТТ - также было получена специальная формула и определены диапазоны критериальных значений успеха/неуспеха БВО (рисунок 2).

Полученные в процессе регрессионного анализа формулы для вычисления коэффициентов иммунопрогнозирования для «благоприятных» (КИП1) и «неблагоприятных» (КИП2) аллелей полиморфного гена ИЛ-28В имеют вид формул 1 и 2.

Формула 1

КИП1 = 2,774 - 0,833 * [СБЗ+] - 0,016 * [СБ4+] - 0,063 * [СБ8+] -0,525 * [СБ 19+], где [СЭЗ+] - абсолютное содержание СОЗ+ клеток в 1 л крови, \С04+) - абсолютное содержание СЭЗ+/С04+ клеток в 1 л крови, [СБ8+] - абсолютное содержание СПЗ+/С08+ клеток в 1 л крови, [СБ 19+] -абсолютное содержание СО 19+ клеток в 1 л крови.

При значениях КИП1 ниже 1,5 делают вывод о высокой вероятности развития быстрого вирусологического ответа, а при значениях коэффициента выше 1,5—о высокой вероятности отсутствия быстрого вирусологического ответа.

Формула 2

КИП2 = 3,994 + 0,014 * [СБ56+/1а-67+] - 0,408 * [СБ25Ы] - 0,69 * [СВ25Ы/РохРЗ+], где |СВ56+/1а-67+] - процент СБ16+/С056+/к>67+ клеток среди лимфоцитов крови, [СБ25Ы] - процент С03т/СГ)25Ы£Ь клеток среди лимфоцитов крови, [С025ЫД;охРЗ+] - процент СВЗ+/СЭ251^Ь/РохРЗ+ клеток среди лимфоцитов крови.

При значениях КИП2 ниже 3,0 делают вывод о высокой вероятности развития быстрого вирусологического ответа, а при значениях коэффициента выше 3,0 - о высокой вероятности отсутствия быстрого вирусологического ответа.

Таким образом, полученные данные позволяют полагать, что предсказательное значение полиморфизмов гена Ш1-28В занчительно

возрастает при дополнении его индивидуальными иммунологическими характеристиками больных на основе расширения спектра тестированных клеток иммунограмм и использования пролиферативного теста, что позволило разработать на этой основе коэффициенты иммунопрогнозирования для благоприятных и неблаприятпых для БВО аллелей.

По результатам проведенных исследований можно предложить следующий алгоритм обследования больного хроническим гепатитом С для прогнозирования БВО на стандартную терапию (рисунок 3).

Рисунок 3. Алгоритм диагностического исследования для прогноза БВО на противовирусную терапию при хроническом гепатите С

Больной ХГС

СС-ТТ

тг

ж

Определение варианта гена ИЛ-28В

иф

Не СС-ТТ

Определение абсолютного числа СБЗ+, С04+, СБ8+, СШ9+ лимфоцитов

Определение содержания С056+/Ы67+, С025ЫЙЬ, С025+/РохрЗ+

Г Расчет КИП1

Л

Расчет КИТО

>1,5

<1,5

Ж

>3

< 3

Отсутствие БВО

Наличие БВО

Отсутствие БВО

Наличие БВО

Выводы

1. В группе больных ХГС в 63,3% случаев определялся 1 генотип вируса, благоприятная для ответа на противовирусную терапию комбинация генотипов по аллельным вариантам полиморфизма гена ИЛ-28В человека (ге12979860/ге8099917) СС-ТТ выявлена в 48,3% случаев. У пациентов, инфицированных генотипом 1 НСУ благоприятный генотип СС-ТТ гена ИЛ-28В человека выявлен в 23,3% случаев.

2. В группах больных ХГС, инфицированных различными генотипами вируса гепатита С, выделенных по наличию и отсутствию БВО на противовирусную терапию, не выявлено различий по базовым клинико-лабораторным параметрам перед началом противовирусной терапии, включающим уровень вирусной нагрузки, стадию фиброза печени, вариант гена ИЛ-28В человека и показатели базовой иммунограммы.

3. Особенностями функционального состояния лимфоцитов у больных ХГС по сравнению с группой больных ОГС на 12 неделе от начала болезни являются: достоверно большее содержание числа В-лимфоцитов (выше 15%) и числа пролиферирующих ЕК (выше 0,8%) в отсутствии инкубации с митогеном и антигенами ПСУ, а при стимуляции ФГА -снижение способности к экспрессии С025 активированными Т-клетками ниже 50%.

4. У больных ХГС, инфицированных генотипом 1Ь НСУ, развитие быстрого вирусологического ответа на терапию пегилированным ИФНа и рибавирином ассоциировано с ростом числа регуляторных Т-клеток (С025ЫвЬ/РохрЗ+), а инфицированных 2а-3а генотипами НСУ - со снижением пролиферативной активности цитотоксических Т-клеток.

5. «Благоприятному» аллельному варианту полиморфизма гена ИЛ-28В человека (^12979860/^8099917, генотип СС-ТТ), соответствуют, более высокие чем при «неблагоприятных» (СТ-ТТ, СТ-ТО, ТТ-ТО) аллельных вариантах исходное содержание С0251%11 Т-клеток, а также регуляторных Т-

лимфоцитов (CD25high/Foxp3+) при стимуляции комплексом белков NS4-coreHCV lb.

6. У носителей благоприятной аллели (СС-ТТ) гена ИЛ-28В быстрый вирусологический ответ на терапию пегилированным ИФНа и рибавирином развивается только при значениях ниже 1,5 коэффициента иммунопрогнозирования, расчитанного с учетом абсолютного числа CD3+, CD4+, CD8+, CD 19+ лимфоцитов.

7. У носителей неблагоприятных аллелей (СТ-ТТ, CT-TG, TT-TG) гена ИЛ-28В человека БВО в ответ на терапию пегилированным ИФНа и рибавирином развивается только при значениях ниже 3,0 коэффициента иммунопрогнозирования, расчитанного с учетом процента пролиферирующих ЕК, CD25high и CD25high/FoxP3+ лимфоцитов.

Практические рекомендации

1. При прогнозировании быстрого вирусологического ответа больных ХГС на терапию пегилированным ИФНа и рибавирином определение аллельного варианта гена ИЛ-28В целесообразно дополнять иммунологическими тестами.

2. В случае носительства аллели rsl2979860 CCI rs8099917 ТТ у больного ХГС рекомендуется определение в крови абсолютного числа CD3+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD19+ лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии и расчет коэффициента иммунопрогнозирования (КИП/СС-ТТ) по формуле:

КИП/СС-ТТ = 2,774 - 0,833 * [CD3+] - 0,016 * [CD4+] - 0,063 * [CD8+] -0,525 * [CD 19+],

где [CD3+] - абсолютное содержание CD3+ клеток в 1 л крови, [CD4+] -абсолютное содержание CD3+/CD4+ клеток в 1 л крови, [CD8+] -абсолютное содержание CD3+/CD8+ клеток в 1 л крови, [CD 19+] -абсолютное содержание CD19+ клеток в 1 л крови.

При значениях КИП/СС-ТТ ниже 1,5 делают вывод о высокой вероятности развития быстрого вирусологического ответа, а при значениях коэффициента выше 1,5 - о высокой вероятности отсутствия быстрого вирусологического ответа.

3. В случае носительства аллелей гб12979860 СТ/ ге8099917 ТТ, гэ 12979860 СТ/ гб8099917 ТО, ге12979860 ТТ/ гз8099917 ТСт у больного ХГС рекомендуется определение процента СВ16+/С056+Ла-67+, СВЗ+/СВ25ЫзЬ, СОЗ+/СВ25Ы§Ь/РохРЗ+ клеток среди лимфоцитов крови и расчет коэффициента иммунопрогнозирования (КИП/неСС-ТТ) по формуле: КИП/не СС-ТТ = 3,994 + 0,014 * [С056+/й-67+] - 0,408 * [С025Ы] -0,69 * [СБ25Ы/РохРЗ+],

где [СБ56+/к1-67+] - процент С016+/СБ56+/к1-67+ клеток среди лимфоцитов крови, [СБ25Ы] - процент CDЗ+/CD25high клеток среди лимфоцитов крови, [СВ25Ы/РохРЗ+] - процент СОЗ+/С025ЫдМ7охРЗ+ клеток среди лимфоцитов крови.

При значениях КИП/неСС-ТТ ниже 3,0 делают вывод о высокой вероятности развития быстрого вирусологического ответа, а при значениях коэффициента выше 3,0 - о высокой вероятности отсутствия быстрого вирусологического ответа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балмасова И.П., Знойко О.О., Дудина K.P., Федосеева Н.В. и др. Иммуногснетичсский подход к прогнозированию быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию при хроническом гепатите С // Российский аллергологический журнал. - 2013. - №2. - С. 26-28.

2. Балмасова И.П., Федосеева Н.В., Нагаева О.С., Шмелева Е.В. и др. Особенности иммунного ответа на антигены вируса гепатита С у медицинских работников // Труды национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология - практическому здравоохранению». Российский аллергологический журнал. - 2012. - №1. -С.28-29.

3. Балмасова И.П., Ющук Н.Д., Знойко О.О., Дудина K.P., Федосеева Н.В. и др. Пролиферативная активность лимфоцитов как кофактор полиморфизма гена ИЛ-28В в прогнозировании быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию у больных хроническим гепатитом С // Аллергология и иммунология. - 2012. - №4 (13). - С.296-305.

4. Федосеева Н.В., Знойко О.О., Исагулянц М.Г. Особенности иммунного реагирования у лиц, контактирующих с вирусом гепатита С, но без маркеров персистирующей ВГС-инфекции // Здоровье населения и среда обитания. - 2011. - №6 (219). - С.30-34.

5. Федосеева Н.В., Знойко О.О., Ющук Н.Д. Иммуногенетические факторы взаимодействия вируса гепатита С и человека и возможности выработки терапевтической тактики // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2013. - №3. - С. 97-103.

6. Федосеева Н.В., Шмелева Е.В., Капитонова О.С., Балмасова И.П. и др. Особенности пролиферативного ответа Т-клеток на антигены вируса гепатита С у здоровых лиц, контактирующих с этим вирусом // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2013. - №3. — С. 38-44.

7. Ющук Н.Д., Знойко О.О., Балмасова И.П., Федосеева Н.В. и др. Иммуногенетические предикторы быстрого вирусологического ответа на

противовирусную терапию больных хроническим гепатитом С // Терапевтический архив. — 2012. - №11. - С.11-17.

8. Ющук Н.Д., Шмелева Е.В., Капитонова О.С., Федосеева Н.В. и др. Пролиферативный ответ лимфоцитов крови у больных хроническим гепатитом С с различными генотипами возбудителя // Иммунология. - 2012. -№.33(5). - С. 264-267.

9. Fedoseeva N., Shmeleva Е., Balmasova I., Znoiko О. et al. Features of immune status and immune response to HCV in healthy medical personal // Abstract book "19th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses". Venice. - 2012. - P.146.

10. Shmeleva E., Fedoseeva N., Kapitonova O., Balmasova I. et al. Results and influences of combination antiviral treatment on immune cell proliferative activity in HCV patients // Abstract book "19th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses". Venice. - 2012. - P.156.

11. Balmasova I., Znoiko O., Dudina K., Fedoseeva N. et al. Immunogenetic approach to predicting of rapid virologic response to antiviral therapy in chronic hepatitis С II International journal on immunorehabilitation. -2013.-№1(15).-P.37.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза ACT — аспартатаминотрансфераза ВГС - вирусный гепатит С

оценки соотношения

чувствительность/специфичность

метода

ДИ — доверительный интервал ИЛ-28В - интерлейкин 28В

CD - кластеры дифференцировки Core - белок сердцевины вируса гепатита С

ИФН/INF - интерферон

ОГС — острый гепатит С

HCV - вирус гепатита С

РНК — рибонуклеиновая кислота ФГА — фитогемагглютшшн

ПЦР— полимеразная цепная реакция

AUROC - площадь области под ROC кривой, используемая для

ROC - кривая, показывающая зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров

От всей души выражаю самую искреннюю благодарность научным руководителям: д.м.н., профессору Ольге Олеговне Знойко, д.м.н., профессору Ирине Петровне Балмасовой за оказанную помощь, сердечность и поддержку при выполнении диссертационного исследования.

Выражаю огромную благодарность и восхищение к.х.н., ведущему научному сотруднику ФБГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, Марии Георгиевне Исагулянц за вдохновение, поддержку и неоценимую помощь в работе.

Также искренне благодарю научных сотрудников к.м.н. Евгению Васильевну Шмелеву и Ольгу Сергеевну Капитонову и всех сотрудников лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ за бескорыстную практическую, методическую и консультативную помощь при выполнении работы.

Подписано в печать:

07.10.2013

Заказ № 8823 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru