Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние цитомегаловирусной инфекции на клиническое течение рака предстательной железы

,писи

Андабеков Тимур Турдеевич

Влияние цитомегаловирусной инфекции на клиническое течение рака предстательной

железы

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

специальность 14.01.12-онкология

Санкт-Петербург 2010

2 6 АВГ 2010

004608806

Работа выполнена в ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» Научный руководитель:

Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор М.И. Карелин Научный консультант:

доктор биологических наук В.И. Евтушенко

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки, профессор,

доктор медицинских наук В.Л. Винокуров

Профессор, доктор медицинских наук E.H. Имянитов

Ведущее научное учреждение:

Защита диссертации состоится 29 сентября 2010 г. в на

заседании диссертационного совета Д 208.116.01 при ФГУ

«Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу 197758, г. Санкт-Петербург, п. Песочный, ул.Ленинградская, д.70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Автореферат разослан «_»__2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Мус Виктор Федорович

Актуальность проблемы. В Санкт-Петербурге рак предстательной железы (РПЖ) занимает третье место по заболеваемости среди всех злокачественных опухолей у мужчин (Мерабишвили В.М. 2006г.), а в динамике показателей смертности за последние 15 лет - первое (89,5%). В настоящее время, несмотря на снижающуюся численность населения Российской Федерации и среднюю продолжительность жизни мужчин 57-58 лет, заболеваемость РПЖ растет и в 2005 году составила 17,8 на 100 тыс. мужского населения (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. 2006).В США в 2009 году по заболеваемости РПЖ занимает первое место, а по причине смерти - второе.

Диагностика РПЖ, прогнозирование его течения и эффективности лечения ограничены генетической неоднородностью заболевания и целым рядом других причин, которые, по-видимому, сегодня неизвестны (Имянитов E.H., Хансон К.П. 2007). Течение заболевания может кардинально различаться у больных с одинаковой стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и способом лечением. В одном случае опухоль может оставаться латентной многие годы, а в других быстро прогрессирует в метастатическую стадию заболевания (Schalken J.А., 1997.) Возникновение и развитие опухоли предстательной железы является сложным процессом, на который влияет много факторов - генетическая предрасположенность, мутации в ключевых генах, отвечающих за процессы дифференцировки, пролиферации и гибели клеток, гормональный статус и общее старение организма, а также диета и образ жизни. Еще одной из возможных причин столь неясного течения заболевания является инфицированность клеток предстательной железы различными вирусами (Dejucq N., Je'Gou В., 2001). В последнее время появляется все больше данных о присутствии нетрансформирующих вирусов в опухолевых клетках и о их возможном участии в прогрессии онкологических заболеваний (Ganesh S. et al., 2004; Nelson W.G. et al., 2003). Появился термин «онкомодуляция», обозначающий возможность влияния вирусов на существующий опухолевый процесс. Данное взаимодействие характеризуется повышением агрессивности опухоли после заражения вирусом. До недавнего времени не было данных об участии цитомегаловируса (ЦМВ) в канцерогенезе. Вместе с тем, в литературе есть данные свидетельствующие в пользу того, что цитомегаловирусная инфекция может влиять на клеточный цикл раковых клеток (Speir Е., Modali R., Huang, E.S., 1994; Tsai, H.L., Kou G.H., Chen S.C., 1996) и их устойчивость к химиотерапевтическим препаратам (Cinatl J.Jr. et al., 1998), на метастазирование (Streblow D.N. et al., 1999; Scholz M. et al., 2000) и на усиление неоангиогенеза (Alcami J., Barzu Т., Michelson S., 1991; Cinatl J.Jr. et al., 2000). Онкомодуляция также может проявляться в подавлении иммунной системой и запрограмированной клеточной гибели (апоптоз). Инфицированность ткани предстательной железы ЦМВ может вызвать длительную (хроническую) воспалительную реакцию, которая считается многими авторами одним из факторов, способствующих возникновению РПЖ (Kundu S.D. et al., 2008; Ganesh S. et al,. 2004; Nelson

W.G. et al., 2003). В настоящее время в литературе нет данных о влияние цитомегаловирусной инфекции на клиническое течение РПЖ (in vivo). В контексте этого, изучение влияния цитомегаловируса на клиническое течение рака предстательной железы позволит оценить вклад этого вируса в канцерогенез рака предстательной железы и разработать новые подходы к лечению.

Целью настоящего исследования явилось оценка значения цитомегаловирусной инфекции предстательной железы в клиническом течении рака предстательной железы.

Задачи исследования:

1. Оценка взаимосвязи между инфицированностью цитомегаловирусом и степенью дифференцировки опухоли.

2. Определение связи цитомегаловирусной инфекции ткани предстательной железы и пятилетней безрецидивной выживаемостью у больных раком предстательной железы после радикальной простатэктомии.

3. Сопоставление средней продолжительности жизни умерших ЦМВ-положительных и ЦМВ-отрицательных больных после гормонолучевой терапии.

4. Изучение связи между инфицированностью ЦМВ и метастазированием рака предстательной железы.

5. Оптимизация метода выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из архивных парафинизированных тканей предстательной железы больных раком предстательной железы, пригодной для молекулярно-диагностических целей. Научная новизна исследования

1. Впервые на архивном материале изучена частота инфицированности предстательной железы цитомегаловирусом у больных РПЖ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Впервые оценена взаимосвязь инфицированности предстательной железы цитомегаловирусом и клинического течения РПЖ (степени злокачественности опухоли, характера метастазирования РПЖ, безрецидивного периода и продолжительности жизни).

3. Оптимизирован метод выделения ДНК из архивного гистологического материала (патент на изобретение: «Способ выделения ДНК» №2351652 от 03 июля 2007г.).

Положения, выносимые на защиту

1. Отмечается высокая (47%) инфицированность цитомегаловирусом ткани предстательной железы у больных (п=90) РПЖ по данным исследования архивных гистологических препаратов;

2. У ЦМВ-положительных больных РПЖ наблюдается худший прогноз течения заболевания, чем ЦМВ-отрицательных больных;

3. Применения разработанной методики выделения ДНК из архивных гистологических препаратов позволяет получать в достаточное количество качественной ДНК.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научной конференции молодых ученых «Современные технологии диагностики и лечения в клинической медицине» (Санкт-Петербург, 2006), Конференция молодых ученных СПбМАПО (Санкт-Петербург, 2006), на заседании Санкт-Петербургского общества урологов (Санкт-Петербург2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 публикации в изданиях, определенных перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа представлена на 94 машинописных страницах, иллюстрирована 13 рисунками и 13 таблицами. Состоит из введения, пяти глав, заключения, практических рекомендаций, и списка литературы, насчитывающего 123 источника (из них 11 отечественных, 112 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В исследования включены следующие группы больных:

• больные с диагнозом рак предстательной железы, которым

произведены трансуретральная резекция предстательной железы.

• больные с диагнозом рак предстательной железы после

радикальной простатэктомии.

Критерии включения: возможность ПЦР (наличие парафиновых блоков в патологоанатомическом отделении), цензурированный исход (рецидив заболевания, умер, жив), гистологическая структура опухоли- ацинарная аденокарцинома предстательной железы. Клиническое течение заболевание ретроспективно оценивалось по архивным историям болезни отобранной группы пациентов. Для того, чтобы изучить наличие вируса в ткани предстательной включены 90 больных с диагнозом РПЖ, которые получали лечение в ФГУ РНЦРХТ с 1996- 2006 год. Из них трансуретральная резекция предстательной железы с последующей гормонолучевой терапией выполнена 41 больному, а в 49 случаях выполнена радикальная простатэктомия по стандартной методике. Всем больным выполнялась РПЭ с удалением лимфатических узлов из запирательных ямок с двух сторон, накладывались "классические" шесть швов по Walsh на анастомоз. Все операции (ТУР и РПЭ) выполнялись одним и тем же хирургом по единой методике. При этом дистанционная конвенцальная лучевая терапия различалась по суммарным очаговым дозам (64-70 Гр) в исследуемой группе. Гормональная терапия проводилась непрерывно всем больным в объеме хирургическая кастрация в сочетании с антиадрогенами (андрогенная блокада). Применялись либо нестероидные антиадрогены (Флутамид по 250 мг 3 раза в день, Бикалутамид по 50 мг 1 раз в день), либо стероидный антиадроген (Андрокур-депо 300 мг 1 раз в неделю внутримышечно). В дальнейшем все больные (п=90) были

стратифицированы в зависимости от результатов ПЦР на 2 группы: больные, с выявленной цитомегаловирусной инфекцией предстательной железы, и больные у которых не определяется вирусная ДНК в ткани предстательной железы. Возраст больных в группе, инфицированных ЦМВ, варьировал от 45 до 81 года, а в группе ЦМВ-отрицательных больных от 51 до 86 лет. Средний возраст в группе ЦМВ-положительных больных 63,38±7,79, в у ЦМВ-отрицательных больных 64,96±6,45.

Разработка метода выделения ДНК. Нами апробированы все предложенные методики выделения ДНК из архивных тканей (Coombs J., Gough A.C., Primrose J., 1999). Максимальный результат (61,3% удачных выделений) был достигнут двухэтапным методом. Но даже такой результат оказался недостаточен (низкое качество и количество пригодной ДНК) для его рутинного использования. С целью улучшения выделения ДНК из парафиновых блоков внесены изменения в этот способ. Нами внесены следующие изменения в методику:

• Нагревание смеси с Tween 20 продлено опытным путем до 15 мин, что позволяет полностью расплавлять парафин, а значит увеличивать количество и качество ДНК, при этом дальнейшее удлинение временного промежутка не дает положительного результата.

• Нагревание смеси с протеиназой К продлено опытным путем до 15 мин и при более высокой температуре-100 °С, что приводило к полноценной денатурации протеиназы К и разрушения клеток, при этом дальнейшее удлинение временного промежутка и повышение температуры не дает положительного результата.

• Нагревание смеси с Tween 20 продлено опытным путем до 15 мин, что позволяет полностью расплавлять парафин, а значит увеличивать количество и качество ДНК, при этом дальнейшее удлинение временного промежутка не приводит к положительному результату.

• Определены опытным путем концентрация и объем реагентов Tris 0,5М Ph 8,0 и EDTA 1 Ph 8,0 по 5 мкл каждого; так как в прототипе не указываются эти данные.

• Уточнено время и температура охлаждения:-1 °С 3 мин; изменения позволяют избежать полного замораживания смеси и дает возможность удаления только парафина без используемого остатка.

• Добавлен этап осаждения ДНК: к супернатанту добавляют по 5 мкл 5М водного раствора хлористого натрия и 2,5 объема абсолютного этилового спирта, после чего смесь центрифугирют 10000 об/мин в течение 30 мин при температуре +4 °С, верхний слой удаляют оставляя «сухой остаток» ДНК, добавляя к нему 100 мл 80% этилового спиртаи вновь центрифугируют 10000 об/мин в течение 10 мин при температуре +4 "С, верхний слой удаляют оставляя «сухой остаток» ДНК, который сушат при температуре 65 °С в течении 10 мин, затем растворяют в 30 мкл бидистиллированной воды и используют для ПЦР;

данный этап позволил полноценно удалить посторонние вещества, которые ингибируют ПЦР, то есть повысилось качество; при этом, несмотря на теоретическую потерю ДНК при осаждении, практически выход увеличился в конечном этапе в 1,5- 2 раза. После получения ДНК из ткани предстательной железы исследуемых больных РПЖ, разработанным методом, измеряли ее количество на флюориметре Hoefer® DyNa Quant 200.

Для определения цитомегаловирусной инфекции в предстательной железе использован метод полимеразной цепной реакции. Качество выделенной ДНК проверяли в реакции ПЦР с праймерами к генам «домашнего хозяйства» человека EGFR (эндотелиальный фактор роста) и р16. Все реакции проводили с помощью коммерческого набора по протоколу компании «Литех»® в объёме 25 мкл в реакционном буфере с 200 нг исследуемой ДНК. В каждой серии проводимых реакций присутствовал положительный и отрицательный контроль для исключения ложноположительных и ложноотрицительных результатов. Для повышения надежности детекции цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) проводилась дополнительно гнездная полимеразная цепная реакция. Для этого после осуществления первой серии ПЦР с парой праймеров DNApol (для гена ДНК-полимеразы вируса). Проводили вторую ПЦР с парой внутренних праймеров CMVC1 и CMVC2 (для главного сверхраннего гена). Далее из каждой пробы ПЦР с парой внутренних праймеров CMVC1 и CMVC2 брали аликвоту 2,5 мкл реакционной смеси и вносили в гнёздную реакцию с парой праймеров CMVC3 и CMVC4 Все ПЦР с исследуемой ДНК проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems®). Результаты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,2% агарозном геле с бромистым этидием в буфере lxSB, использован маркер молекулярного веса фирмы Fermentas®. При наличие указанных цитомегаловирусных генов расценивали, как наличие ЦМВИ у исследуемого пациента. Фотодокументацию результатов электрофореза осуществляли с помощью цифровой системы и программного обеспечения EDAS 290 (Kodak Digital Science®).

Статистический анализ. Для статистического анализа были использованы стандартное программное обеспечение, пакет программ Microsoft Office 2003, программа SPSS версия 13.0 и STATISTICA версия 6.0. При проверке выборка не показала нормального распределения, и использовались непараметрические данные (критерий Колмогорова-Смирнова). Поэтому, чтобы сравнить средние значения двойных выборок пользовались непараметрическими критериями (Спирмена, Тау Кенделла). Для оценки продолжительности жизни и выживаемости использована регрессионная модель. Графическая демонстрация продолжительности жизни и 5-летней выживаемости выполнена с помощью кривых Каплана-Мейера. Результаты исследования и их обсуждение

Инфицированность ЦМВ больных РПЖ в зависимости от распространенности РПЖ показаны в таблице 1.

Таблица 1

Инфицированность ЦМВ у исследуемых больных в зависимости от

распространенности РПЖ

Больные РПЖ, п=90 Способ лечения Локализованный РПЖ Мсстнораспространснный РПЖ Метастатическ: РПЖ

цмв- РПЭ п=10 П=11 п=0

положительные Комбинирование с лечение п=2 N=3 п=16

цмв- РПЭ п=25 п=3 п=0

отрицательные Комбинированное лечение п=4 п=5 п=11

В сообщении отечественных авторов отмечено выявление ЦМВИ в нативной ткани предстательной железы у 60% больных. ЦМВИ подтверждалась методом гнездной ПЦР с ДНК, выделенной после РПЭ и ТУР предстательной железы (Клочкова Т.Г. и соавт., 2006).

По нашим данным, у 42(46,7%) из 90 больных была выявлена цитомегаловирусная инфекция ткани предстательной железы, а в 48(53,3%) случаях вирусная ДНК не определялась в предстательной железе. Возможной причиной является более низкая эффективность ПЦР на матрице ДНК, выделенной из архивного материала, и термическое воздействие во время операции:

• деградация ДНК,

• поперечные сшивки нуклеотидных оснований ДНК под действием формальдегида.

Полученные данные на архивном материале в настоящем исследовании подтверждают выводы о высокой инфицированности ЦМВ предстательной железы у больных РПЖ. Учитывая наши данные, можно говорить о повышенном уровне инфицированности ЦМВ ткани предстательной железы у больных РПЖ, и вероятно, не связанной с простой персистенцией вируса.

Частотное распределение больных в зависимости от суммы Глисона РПЖ и наличием ЦМВИ представлено в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что большинство ЦМВ-положительных больных имели низкодифференцированный РПЖ, тогда как у ЦМВ-отрицательных больных выявлялся преимущественно умереннодифференцированный рак. Для статистической обработки данных таблицы вычислена регрессионная модель по функции хи-квадрат, которая была высоко достоверна (р=0,001).

Таблица 2

Частотное распределение больных в зависимости от суммы Глисона РПЖ и наличием ЦМВИ

Сумма Глисона ЦМВ-положительные больные, п=42 ЦМВ-отрицательные больные, п=48

РПЭ Комбинированное лечение РПЭ Комбинированное лечение

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 4 0

6 5 0 21 2

7 6 7 3 13

8 6 9 1 4

9 0 8 0 0

10 1 0 0 0

Среднее значение суммы Глисона у ЦМВ-отрицательных пациентов и ЦМВ-положительных пациентов различалась, подобная тенденция отмечалась в этих исследуемых группах по категории С (таблица 3).

Таблица 3

Непараметрические критерии корреляции степени дифференцировки РПЖ и наличия ЦМВИ у исследуемых больных

Среднее значение суммы Глисона Критерий Спирмена Критерий Тау Кендалла

Группа пациентов инфицированных ЦМВ, (п=42) 7,69 0,35 р<0,02 0,4 р<0,006

Группа пациентов без ЦМВИ, (п=48) 6,46

Для оценки влияния ЦМВ на степень дифференцированности опухоли, было определено среднее значение и мода категории в и суммы Глисона у исследуемых больных в зависимости от наличия ЦМВИ (таблица 4).

Таблица 4

Среднее значение, мода суммы Глисона и категории в у исследуемых пациентов

Больные Среднее значение Мода в Среднее значение Мода

ЦМВ- положительные, (п=42) 7,69 8 сумма Глисона 3,45 4

ЦМВ- отрицательные, (п=48) 6,46 6 2,54 2

Как показано в таблице 4, в группе ЦМВ-положительных больных отмечалась тенденция к более высоким показателям категории в и суммы Глисона, чем у ЦМВ-отрицательных, то есть больные РПЖ, у которых присутствовал ЦМВ в ткани предстательной железы, имели тенденцию к более низкой дифференцировке опухоли, чем ЦМВ-отрицательные

пациенты. Экспериментальные исследования, которые раскрывают онкомодулирующее (влияние на неоангиогенез, инвазивность опухоли и т.д.) влияние ЦМВ и показывают, что наличие ЦМВИ приводит к повышению степени злокачественности опухолевых клеток, а значит и снижению степени дифференцировки. Вследствие чего, можно предположить наличие взаимосвязи между ЦМВИ предстательной железы у больных РПЖ и степенью злокачественности опухоли.

Как указывалось выше, всем пациентам было выполнено одно из хирургических вмешательств, либо трансуретральная резекция предстательной железы, либо радикальная простатэктомия. При этом больные, которым выполнялась ТУР предстательной железы имели преимущественно местнораспространенный или метастатический РПЖ, а больные прооперированные в объеме РПЭ имели локализованный, реже местнораспространенный РПЖ. Исходя из этого большинство больных, которым выполнен ТУР предстательной железы имели относительно короткий период жизни. Поэтому для оценки эффективности лечения этой группы больных выбран показатель продолжительность жизни, который определяется периодом времени с момента постановки диагноза до цензурированного исхода (смерть больного). Тогда как больным, которым была выполнена РПЭ по поводу локализованного РПЖ, и живущим до настоящего времени, более целесообразно применить такой показатель, как пятилетняя безрецидивная выживаемость.

Установлено, что средняя продолжительность жизни ЦМВ-положительных пациентов составляет 27,71 ± 3,5 мес. с момента постановки диагноза РПЖ, а у больных РПЖ, не имеющих ЦМВ в ткани предстательной железы, соответственно - 76,60 ± 7,0 мес. (р<0,05). Динамические характеристики продолжительности жизни больных в зависимости от ЦМВИ представлены в виде кривых Каплан-Мейера изображенных на рисунке 1.

хи-квадрат=22,7;с!£=5; р<0,02;

Рис. 1. Зависимость продолжительности жизни умерших больных (комбинированное лечение) РПЖ от наличия ЦМВИ.

№дианз продлжительности хизни

Рис. 2. Медиана продолжительности жизни в исследуемых группах больных в зависимости от наличия ЦМВИ.

Таблица 5.

Непараметрические критерии корреляции продолжительности жизни и наличия ЦМВИ у исследуемых больных

Больные Среднее значение суммы Глисона Критерий Спирмена Критерий Тау Кендалла

ЦМВ- положительные, (п=42) 27,71 0,3 р<0,05 0,4 р<0,05

ЦМВ- отрицательные, (п=48) 76,60

Из представленного рисунка 1 и таблицы 5 видно, что при сравнении ЦМВ-отрицательных больных и ЦМВ-положительных после

комбинированного лечения отмечалась тенденция к уменьшению средней продолжительности жизни у последних (р<0,02).

Выявлена тенденция к уменьшению 5-летней безрецидивной выживаемости у пациентов с ЦМВИ после радикальной простатэктомии, в сравнении с ЦМВ-отрицательными больными (рис.3).

_П ЦМВ+

цмв-

24,0 36,0 да.0 60,0 безрецидивный период, мес

хи-квадрат=5,589;df=1; р<0,02;

Рис. 3 . Зависимость 5-летней безрецидивной выживаемости у исследуемых больных после радикальной простатэктомии от наличия ЦМВИ.

В зависимости от проводимого лечения исследуемых больных были определены такие показатели эффективности лечения, как 5-летняя безрецидивная выживаемость и средняя продолжительность жизни. Выявлены различия в группе пациентов, получавших ТУР + гормонолучевую терапию: у ЦМВ-положительных больных средняя продолжительность жизни была 27,71 мес. ( n=21), а у ЦМВ-отрицательных 76,6 мес. ( п=20). В группе больных после радикальной простатэктомии (п=49), 5-летняя безрецидивная выживаемость была 38,1%(п=21) у ЦМВ-положительных больных и у 96,3%(п=28) ЦМВ-отрицательных.

Важно отметить, что переход локализованного РПЖ в местнораспространенный связан с инвазией опухоли за пределы капсулы предстательной железы (Fritz A. et al, 2002). Поэтому, инвазия опухолевых

клеток в капсулу предстательной железы является одним из факторов риска рецидива РПЖ после радикальной простатэктомии.

Получены данные в эксперименте о влияние ЦМВ на инвазивность линии опухолевых клеток нейробластомы (Blaheta R.A. et al., 2004). Так в указанной работе, определялась способность линии опухолевых клеток пенетрировать (осуществлять инвазию) монослой эндотелиальных клеток. Выяснилось, что опухолевые клетки, инфицированные ЦМВ, значительно интенсивнее проникали через слой эндотелиальных клеток, чем клетки контрольной группы (неинфицированные ЦМВ). Также в работе оценивалась адгезивная способность опухолевых клеток, как проявление одного из этапов инвазивного процесса, то есть, помимо проникновения опухоли через клеточный барьер (эндотелий, клетки стромы), для завершения инвазии необходимо прикрепление опухолевых клеток к межклеточному матриксу. Для оценки адгезивных характеристик в клеточных линиях (инфицированных и неинфицированных ЦМВ) нейробластомы измерялась экспрессия гена NCAM (neural cell adhesion molecule; CD56), продукт которого необходим для адгезии. Результаты этой работы, основанные на иммуногистохимическом исследовании, показали более высокую экспрессию гена NCAM в опухолевых клетках, зараженных ЦМВ, чем в контрольном образце. Изучен также другой этап инвазивного роста, такой как миграция клеток. Определено, что линия человеческих гладко-мышечных клеток после заражения ЦМВ приобретают свойство к перемещению (миграции). Это свойство появляется благодаря экспрессии вирусного белка - хемокиновый рецептор US28 (Streblow et al., 1999). В работе с нервными клетками, показана способность к миграции клеток, инфицированных nMB(Shinmura et al.,1999).

Исходя из результатов вышеуказанных экспериментальных работ, можно предположить, что одним из этиологических факторов инвазивного роста РПЖ является наличие ЦМВИ, и как следствие — возможной причиной ранних рецидивов РПЖ после РПЭ. То есть инфицированные цитомегаловирусом опухолевые клетки РПЖ возможно приобретают в раннем периоде заболевания способность инвазировать окружающие ткани (капсулу предстательной железы).

У больных же, подверженных ТУР предстательной железы, основным методом лечения РПЖ является гормонолучевая терапия и химиотерапия. Полученные результаты, также свидетельствует о наличии тенденции в уменьшении продолжительности жизни у ЦМВ-положительных больных, по сравнению с ЦМВ-отрицательными больными. Эффективность лечения РПЖ у этих пациентов зависит от ответа на гормональную и химиотерапию. В плане обсуждения, интересны экспериментальные работы по изучению чувствительности к противоопухолевым химиопрепаратам злокачественных клеток в зависимости от инфицированности ЦМВ. Так определена чувствительность человеческих фибробластов клеточной линии HeLa к химиопрепарату Доксорубицину, вызывающему апоптоз опухолевых клеток, которая снижается после заражения ЦМВ. В работе также исследована

экспрессия вирусных белков UL37, которые подавляют апоптоз, индуцируемый фактором некроза опухоли. Это позволило авторам предположить, что именно продуктивная ЦМВИ защищает раковые клетки от воздействия различных противоопухолевых химиопрепаратов (Goldmacher V.S. et al., 1999). В другом исследовании, но также экспериментальном изучена резистентность клеток нейробластомы линии UKF-NB-2, инфицированных ЦМВ, к противоопухолевым цитотоксическим агентам, таким как Цисплатин и Этопозид. Эти опухолевые клетки до заражения были чувствительны к этим химиопрепаратам, но инфицированные клетки приобретали лекарственную резистентность. Важен факт, что после проведенной антивирусной терапии препаратом Ганцикловир, инфицированных опухолевых клеток, и элиминации вируса, восстанавливалась чувствительность к Цисплатину и Этопозиду (Cinatl J.Jr. et al., 1998). Указанные работы дают основание предположить взаимосвязь между ЦМВИ и продолжительностью жизни больных ЦМВ, получающих цитотоксические химиопрепараты. Но отсутствие клинических исследований лечения ЦМВИ предстательной железы у больных распространенным РПЖ не дают возможность сделать окончательный вывод о целесообразности назначении противовирусной терапии с целью повышения чувствительности к цитотоксическим химиопрепаратам.

При статистической обработке материала в обеих группах значимых отличий локализации метастазов не выявлено (р>0,05). Но необходимо отметить, что у всех ЦМВ-отрицательных больных, имеющих метастатическое поражение РПЖ нескольких органов и систем, у всех присутствовали метастазы в костях и лимфатических узлах. В то время, как из 5 ЦМВ-положительных больных, имеющих метастатическое поражение РПЖ 3 больных имели метастазы в легких. Следует отметить, что метастатическое поражение легких при РПЖ бывает редко и, как правило в терминальном периоде заболевания.

Помимо этого, у ЦМВ-положительных больных выявлено большее число метастатических очагов (среднее число метастазов 13), чем у ЦМВ-отрицательных больных (5), однако статистических различий не выявлено (р>0,05).

Выводы

1. ЦМВ-положительные больные имели рак предстательной железы низкой степени дифференцировки (р<0,05).

2. У ЦМВ-положительных больных раком предстательной железы 5-летняя безрецидивная выживаемость после радикальной простатэктомии была ниже, чем у ЦМВ-отрицательных: 38,1% против 96,3% соответственно (р<0,05).

3. Средняя продолжительность жизни умерших больных раком предстательной железы в группе ЦМВ-положительных, подвергшихся комбинированному лечению была меньше, чем у ЦМВ-отрицательных больных: 27,71 и 76,6 мес., соответственно (р<0,05).

4. Различий в числе и локализации метастазов РПЖ в зависимости от ЦМВИ не выявлено (р>0,05).

5. Применение оптимизированного метода выделения ДНК из архивного парафинизированного материала позволяет в 100% случаях получать пригодную ДНК для проведения молекулярно-диагностических исследований.

Практические рекомендации

1. При отборе больных РПЖ для оперативного лечения (радикальная простатэктомия) необходимо учитывать наличие цитомегаловирусной инфекции, помимо основных критериев отбора, как фактор риска рецидива.

2. Разработанный нами метод выделения позволяет существенно повысить количество и качество ДНК, в связи с этим целесообразно использовать его для веделения с целью прогнозирования течения заболевания у больных РПЖ.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Андабеков Т.Т. Анализ инфицированное™ цитомегаловирусом ткани предстательной железы при РПЖ.// Тезисы докладов научно-практической конференции молодых ученных, СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2006.

2. Клочкова Т.Г., Андабеков Т.Т., Школьник М.И., Евтушенко В.И., Карелин М.И. Изучение инфицированности цитомегаловирусом ткани простаты и лейкоцитов крови у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы. -Материалы 4-го съезда онкологов и радиобиологов СНГ, Баку, 2006 г., с.207.

3. Андабеков Т.Т. Анализ инфицированности цитомегаловирусом ткани предстательной железы при ДГПЖ и РПЖ.// Тезисы докладов научно-практической конференции молодых ученных ЦНИРРИ, Санкт- Петербург, 2006.

4. Андабеков Т.Т., Клочкова Т.Г., Урбанский А.И., Школьник М.И., Карелин М.И., Евтушенко В.И. Анализ инфицированное™ ткани предстательной железы цитомегаловирусом и другими вирусами семейства Herpesviridae у брольных раком и доброкачественной гиперплазией простаты. - Материалы I конгресса Российского общества онкоурологов, Москва, 2006г., с.21.

5. Клочкова Т.Г., Андабеков Т.Т,, Школьник М.И., Карелин М.И., Евтушенко В.И. Анализ инфицированное™ ткани предстательной железы цитомегаловирусом и вирусом,Эпштейна-Барра у больных раком простаты. - Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье», 2006,т.10, N2, с. 19.

6. Клочкова Т.Г., Андабеков Т.Т., Самсонов Р.Б., Карелин М.И., ШкольникМ.И., Семёнов A.B., Випоградская Г.Р.,Евтушенко В.И. Анализ инфицированное™ предстательной железы цитомегаловирусом у больных раком и доброкачественной гиперплазией простаты. - Медицинский академический журнал -2008, т.8, N4, с. 64 -70.

7. Роль цитомегаловирусной инфекции при раке предстательной железы. Клочкова Т.Г., Андабеков Т.Т., Самсонов Р.Б., Школьник М.И., Карелин М.И. // Тезисы заседание Санкт-Петербургского общества урологов. Санкт-Петербург, 2008.

8. Андабеков Т.Т., Клочкова Т.Г., Урбанский А.И., Самсонов Р.Б., Школьник М.И., Евтушенко В.И., Карелин М.И. Более низкая степень дифференцировки рака предстательной железы может быть связана с цитомегаловирусной инфекцией ткани простаты. Вопросы онкологии - N2, 2009, с.183-186.

9. Влияние цитомегаловирусной инфекции на эффективность лечения рака предстательной железы. Андабеков Т.Т., Клочкова Т.Г.,

Самсонов Р.Б., Евтушенко В.И. Материалы VII съезда онкологов России, Москва, 29-30 октября 2009. том II, С. 88.

Ю.Андабеков Т.Т..Роль цитомегаловирусной инфекции в простате при раке предстательной железы.-Успехи современного естествознания -№4, 2010, С. 83

П.Самсонов Р.Б., Клочкова Т.Г., Андабеков Т.Т., Школьник М.И.,, Карелин М.И. Евтушенко В.И. Цитомегаловирусная инфекция ткани предстательной железы у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы. - Вопросы онкологии, т.56-2, Приложение, Тезисы 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии, 2010, с.39-40.

В США в 2009 году по заболеваемости РПЖ занимает первое место, а по причине смерти второе (см. рисунок 1).

Риквай* Ш2М m

LaBjiSt-snsfcu* «S090

ПШ

ШпиуШЙ!!»'

8»

Non тщшг lymfponu 5% fWNtlp«ft<* 31430 S%

-•Jcerra* мт Ш isna »

Йжчяя» ti№ »

M$itn яшм

JHr

8«мв1

U(»lt!« «0ф|* Nsfi-^Wsjto S^wpfwi»

U«tt--r.<»M di:(» »>« Tt^iwJ

Ktirwy < >*n*l e*Mt

Омку

Ш>Т8 Ш.Ш 11Ж nm ггш nxx 2'.ш

2М» ?«.»« n% m <■№%

4%

J* Ш 34 tm jr,tlfn*t»1 Oewhft

Feeieleb

UflstSKXKba «1900 m

Ркавам г? aw

Сокя* & 25 248 9%

PaWMS» !»ВЭ0 jnk«mm nm **

Ik* * ftfct dud Ш

11490 bSwfcfcf «ЫЮ s%

SUMtstsgki* tywft-em* am J4 * wsH 8-so «I

AH Sit»» иддлысмьи* 7G4W tax 4c m IS» um

5 «%

OW|r «же 5% we 44

9Ш utertfw Сочи* y.m S*

U* tr»«4««»c Ml tm J* ta<» mix» mmm sy*Sw* SJH 2%

All KM шлее MM

Рисунок 1. Онкологическая заболеваемость и смертность в США в 2009г.

Диагностика РПЖ, прогнозирование его течения и эффективности лечения ограничены генетической неоднородностью заболевания и целым рядом других причин, которые, по-видимому, сегодня неизвестны (Имянитов Е.Н., Хансон К.П. 2007).

Течение заболевания может кардинально различаться у больных с одинаковой стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и способом лечением. В одном случае опухоль может оставаться латентной многие годы, а в других быстро прогрессирует в метастатическую стадию заболевания (Schalken J.А. 1997.) Установлено, что РПЖ чаще страдают пожилые люди, но при аутопсии у трети мужчин между 30- 40 годами обнаруживаются фокусы аденокарциномы (Sakr W.A. et al. 1994).

Возникновение и. развитие опухоли предстательной железы* является сложным процессом, на который влияет много факторов — генетическая предрасположенность, мутации в ключевых генах, отвечающих за процессы дифференцировки, пролиферации и гибели клеток, гормональный статус и общее старение организма, а также диета и образ жизни.

Еще одной из возможных причин столь неясного течения заболевания является инфицированность клеток предстательной железы различными вирусами (Dejucq N., Je'Gou В. 2001).

Несмотря на длительный период с момента формулирования вирусной теории канцерогенеза отечественным ученым Зильбером JI.A. (1968), роль вирусов-в этиологии и развитии онкологических заболеваний остается не до конца выясненной.

В последние годы активно обсуждалась роль одного из ретровирусов-XMRV (xenotropic murine leukemia virus related virus). Данные исследования активно обсуждаются лишь по наличию вирусной последовательности в опухолевых клетках РПЖ, выявленной методом гибридизации in situ. Возможным механизмом патогенеза XMRV является повреждение гена RNase L, ответственного за врожденный противовирусный иммунитет (Fan Н. 2007). Не исключается и роль этого ретровируса в наследственном раке предстательной железы (Dong В. et al. 2007).

Наиболее* распространенны работы по изучению вирусного канцерогенеза1 РПЖ, связанные с папилломавирусами различного типа. Большинство исследований по изучению РПЖ и указанного семейства вирусов основаны на детекции дезоксирибонуютеиновой кислоты (ДНК) вирусов в опухолевой ткани (Terris М.К., Peehl D.M. 1997; Zambrano A., 2002; Serth J. 1999; Suzuki H, 1996; Saad F. 1999; Masood S. 1991). Но это не дает возможности установить этиологическую роль вируса, так как предстательная железа может быть простым резервуаром. При этом по мнению Dillner J. и соавторов (1998) связь канцерогенеза имеется только с папиломавирусами (HPV) 18- типа, но нет с HPV 33- типа; а по данным Adami и. соавторов (2003;) результаты абсолютно противоположны, то есть связь РПЖ установлена только с HPV 33- типа.

В работе Balis-V. и соавторов (2007) по выявлению ДНК полиомавирусов и папилломавирусов в клетках ткани рака предстательной железы методом ПЦР диагностирован полиомавирус (ВК-вирус) в 19% образцов. При этом в этих же образцах ткани ДНК папилломавирусов была обнаружена лишь в 4,8% образцов ткани РПЖ. Но среди обнаруженной,ДНК не было относящихся к папилломавирусам 11, 16, 18 и 33 типов, которым приписывают канцерогенные свойства^ Этими результатами авторы работы предполагают, что папилломавирусы не участвуют в канцерогенезе рака предстательной железы.

Существует мнение (Zambrano A. et al. 2002), что предстательная железа является только биологическим резервуаром для полиомавирусов и папилломавирусов. К такому мнению авторы пришли в связи с отсутствием последовательностей генома указанных вирусов по данным ПЦР и гибридизации in situ.

Изучается вопрос наличия в различных органах герпес вируса 8 типа (HHV-8) и его роли в канцерогенезе, в том числе и в предстательной железе.

Не исключается патогенетическая и этиологическая роль вируса в ряде случаев РПЖ, учитывая наличие вируса в части опухолевых клетках и экспрессии их антигенов, но к сожалению четких механизмов онкогенеза нет (Гурцевич В.Э. 2004, Велиев Е.И и соавт. 2007).

Для подтверждения вирусной этиологии опухолевого заболевания необходимо соблюсти парадигмы вирусного онкогенеза, установленные Henle W. в 1971 (модифицированные постулаты Коха):

1. Обнаружение вируса, вирусных антигенов, вирусных ДНК или РНК в опухоли человека.

2. Развитие опухоли у приматов после введения вируса.

3. Трансформация нормальных клеток in vitro.

4. Выявление повышенного титра антител к вирусным антигенам а больных по сравнению со здоровыми людьми.

Но определенные вирусы не отвечают этим постулатам, хотя обладают некоторыми онкогенными свойствами.

В последнее время появляется все больше данных о присутствии нетрансформирующих вирусов в опухолевых клетках и о их возможном t 1 участии в прогрессии онкологических заболеваний (Ganesh S. et al. 2004; Nelson W.G. et al. 2003). Появился термин онкомодуляция, обозначающий возможность влияния вирусов на существующий опухолевый процесс. Данное взаимодействие характеризуется повышением агрессивности опухоли после заражения вирусом. Увеличение агрессивности проявляется по нескольким показателям:

• инвазивность опухоли,

• метастатический потенциал,

• возможность дизрегулировать иммунную систему,

• активация неоангиогенеза,

• изменение чувствительности к различным лечебным воздействиям.

К таким вирусам могут быть отнесены семейства Herpesviridae.

У больных РПЖ обнаружены вирусы простого герпеса 1 и 2 типа (Dostal V., Fanta D., Reiss-Gutfreund R.J. 1977), 8 типа (Munker R. et al. 1997), вирус Эпштейна- Барра и цитомегаловирус (Клочкова Т.Г и соавт. 2006).

Изучается роль вируса Эпштейна- Барра, его потенции и характеристики, как инициатора онкогенеза. Определено наличие ДНК вируса Эпштейна- Барра в образцах ткани РПЖ, причем экспрессия вирусных антигенов находится на разном уровне в этих позитивных образцах. Интересен и факт наличие вируса в опухолевых клетках (Grinstein S. et al. 2002).

Данные о высокой (100%) инфицированности ЦМВ ткани РПЖ подтверждаются и другими исследователями, причем используются различные методы диагностики ЦМВ, такие как ПЦР, гибридизация in situ и иммуногистохимия (Samanta M.et al 2003).

Цитомегаловирусная инфекция остается одной из наиболее актуальных проблем инфектологии. Заболевания, вызываемые цитомегаловирусом относятся к антропонозным, широко распространены и характеризуются многообразием* клинических проявлений (от латентного течения-вирусоносительство до генерализованных форм с поражением нервной системы и внутренних органов). До недавнего времени не было данных об участии цитомегаловируса в канцерогенезе. Вместе с тем в литературе есть данные свидетельствующие в пользу того, что цитомегаловирусная инфекция может влиять на клеточный цикл раковых клеток (Speir Е., Modali R., Huang, E.S. 1994; Tsai, H.L., Kou G.H., Chen S.C., 1996 ) и их устойчивость к химиотерапевтическим препаратам (Cinatl J.Jr. et al. 1998), на метастазирование (Streblow D.N. et al. 1999; Scholz M. et al. 2000) и на усиление неоангиогенеза (Alcami J., Barzu Т., Michelson S. 1991; Cinatl J.Jr. et al. 2000).

Онкомодуляция также может проявляться в подавлении иммунной системой и запрограмированной клеточной гибели (апоптоз). Инфицированность ткани предстательной железы ЦМВ может вызвать длительную (хроническую) воспалительную реакцию, которая считается многими авторами одним из факторов, способствующих возникновению РПЖ (Kundu S.D. et al. 2008; Ganesh S. et al. 2004; Nelson W.G. et al. 2003).

Цитомегаловирус, также может оказывать влияние на структуру популяции иммунокомпетентных клеток, что с возрастом может приводить к ослаблению противоопухолевой функции иммунной системы (Pawelec G., Koch S., Gouttefangeas С., Wikby A. 2006). Кроме того, показано, что в инфицированных ЦМВ клетках происходит ингибирование экспрессии проапоптических генов и индукция иммуносупрессирующих цитокинов (IL-10) (Cinatl J. et al. 2004; Nordoy I. et al. 2003). Выявлено, что ЦМВ экспрессирует собственный вирусный гомолог интерлейкина-10 (Jenkins С., Abendroth A., Slobedman В. 2004).*

Вышеуказанные работы показывают либо наличие вирусов в ткани предстательной железы, либо влияние вирусных генов и их продуктов на канцерогенез in vitro.

Данных о влияние цитомегаловирусной инфекции на клиническое течение РПЖ (in vivo) в литературе в настоящее время нет.

В контексте этого, изучение влияния цитомегаловируса на клиническое течение рака предстательной железы, позволит оценить вклад этого вируса в канцерогенез рака предстательной железы и разработать новые подходы к лечению.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является определение значения инфицированности предстательной железы цитомегаловирусом у больных раком предстательной железы.

Задачи исследования

1. Оценена взаимосвязь между инфицированностью цитомегаловирусом и степенью дифференцировки опухоли;

2. Определена связь цитомегаловирусной инфекции ткани предстательной железы и пятилетней безрецидивной выживаемостью у больных РПЖ после радикальной позадилонной простатэктомии (РПЭ);

3. Сопоставлена средняя продолжительность жизни умерших ЦМВ-положительных и ЦМВ-отрицательных больных после гормонолучевой терапии;

4. Изучена связь между инфицированностью указанным вирусом и метастазированием рака предстательной железы;

5. Разработана методика выделения ДНК, пригодной для молекулярно- биологических исследований, из архивных тканей предстательной железы больных раком предстательной железы фиксированных в парафине.

Научная новизна исследования

1. Впервые на архивном материале изучена частота инфицированности цитомегаловирусом у больных раком предстательной железы методом

ПЦР.

2. Впервые оценена взаимосвязь инфицированности ЦМВ опухолевых клеток и клинического течения рака предстательной железы (степень злокачественности опухоли, характер метастазирования РПЖ, безрецидивный период и продолжительность жизни).

3. Оптимизирован метод выделения ДНК из архивного гистологического материала (На указанное изобретение получен патент: «Способ выделения ДНК» №2351652 от 03 июля 2007г.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Отмечается высокая (47%) инфицированность цитомегаловирусом ткани предстательной железы у больных (п=90) РПЖ по данным исследования архивных гистологических препаратов;

2. У ЦМВ-положительных больных РПЖ наблюдается худший прогноз течения заболевания, чем ЦМВ-отрицательных больных;

3. Применения разработанной методики выделения ДНК из архивных гистологических препаратов позволяет получать в достаточное количество качественной ДНК.

Апробация работы Результаты работы доложены на Научной конференции молодых ученых «Современные технологии диагностики и лечения в клинической медицине», (Санкт-Петербург, 2006). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа представлена на машинописных страницах, иллюстрирована 19 рисунками и таблицами. Состоит из введения, пяти глав, заключения, практических рекомендаций, и списка литературы, насчитывающего источника, из них отечественных, зарубежных.

Выводы.

1. Пациенты, у которых присутствовала ДНК цитомегаловируса в ткани предстательной железы имели тенденцию к низкой степени дифференцировки РПЖ (р<0,05).

2. У ЦМВ-положительных больных РПЖ 5-летняя безрецидивная выживаемость после радикальной простатэктомии была ниже, чем у ЦМВ-отрицательных 38,1% против 96,3% соответственно 0X0,05).

3. Средняя продолжительность жизни умерших больных РПЖ в группе ЦМВ-положительных, подвергшихся комбинированному лечению была меньше, в сравнении с ЦМВ-отрицательными больными: 27,71 и 76,6 месяцев, соответственно (р<0,05).

4. Различий в числе и локализации метастазов РПЖ в зависимости от ЦМВИ не выявлено (р>0,05).

5. Применение отработанной методики выделения ДНК из архивного материала позволяет в 100% случаях получать пригодную ДНК для молекулярно-биологических исследований.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При отборе больных РПЖ для оперативного лечения (РПЭ) необходимо учитывать наличие ЦМВИ, помимо основных критериев отбора, как фактор риска рецидива.

2. Разработанный нами метод выделения позволяет существенно повысить количество и качество ДНК, в связи с этим целесообразно использовать его для веделения с целью прогнозирования течения заболевания у больных РПЖ.