Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Использование пептидов донорской печени и селезенки для коррекции восстановительных процессов в поврежденной печени

Р Г Б ОД

1 5 Ьий к 3

На правах рукописи

Копатикова Ирина Игоревна

Использование пептидов донорской нечени и селезенки для коррекции восстановительных процессов в поврежденной печени (Экспериментальное исследова ние)

(14.00.41 - трансплантология и искусственные органы)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1999

Работа выполнена в НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (директор - академик РАН и РАМН В.И. Шумаков)

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор H.A. Онищенко

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор B.IL Блюмкин

Официальные оппоненты:

Член корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор И.Д. Кирпатовский;

Доктор биологических наук И.В. Урываева.

Ведущая организация; НИИ Физико-химической медицины МЗ РФ.

Защита состоится 25 октября 1999 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д.074.34.01. при НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Автореферат разослан (£j^///<^p)up[999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Е.А. Селезнева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Разработка новых более эффективных и доступных методов лечения острой и хропической печеночной недостаточности (ПН) по-прежнему остается одной из актуальных проблем современной медицины, так как смертность и нетрудоспособность при заболеваниях печени (П) занимает одно из первых мест и не имеет тенденции к снижению.

По данным ВОЗ за 1994 г. среди причин летальности ПН занимает пятое место в мире среди других патологий и восьмое место среди причин нетрудоспособности. Смертность от острой ПН, сопровождающейся обширным некрозом паренхимы, по-прежнему колеблется от 50 до 70-80% и более (В.И. Шумаков, H.A. Онищенко, 1994; С.А. Лепехова и др., 1998; Damen, Reesing, 1995). Анализ показателей смертности в России при заболеваниях органов пищеварения за период 1988-1992 гг. показал, что смертность при заболеваниях П занимает второе место среди заболеваний других органов этой системы и из года в год увеличивается (А.И. Хазанов и др., 1996). Клинический опыт показывает, что медикаментозная терапия (Б.П. Солопаев, 1990; О.Ю. Абакумова и др. 1996; А.Г. Глоба и др. 1996; Lieber et al., 1994) и аппаратные эфферентные методы не утратили своего значения при лечении ПН (JI.A. Андрейман, 1988; H.A. Лопаткин, Ю.М. Лопухин, 1989). Однако этим методам отводится лить вспомогательная роль при крайне тяжелых поражениях П. В то же время, трансплантация П, которая признана одним из самых эффективных методов лечения необратимо тяжелых поражений П, имеет существенные ограничения для использования в широкой клинической практике, и это связано, главным образом, с возрастающей во всем мире нехваткой донорских органов.

В последние 10-15 лет во всем мире стали разрабатываться новые методы лечения ПН, основанные на применении современных клеточных технологий. Эти новые биотехнологии ставят своей задачей не "лечение" старых тяжело поврежденных клеток в органе, а своевременное их обновление jm6o путем трансплантации пула изолированных донорских гепатоцитов (Г) (Strom, 1997), либо путем стимуляции собственного резерва регенерации поврежденной П с помощью систем биоискусственпой поддержки П (БПП), в экстракорпоральном контуре которых производится культивация донорских Г (М.С. Маргулис и др., 1987; В.И. Шумаков и др., 1990; И.И. Шиманко, С.Г. Мусселиус 1993; В.И. Шумаков, RA. Онищенко, 1994;

Ю.Н. Лебедева, 1996; Г.И. Строжаков н др., 1997; H.A. Ошпценко и др. 1999; Hoffman et al, 1994; Demetriou et al., 1995; Chen et al., 1996; Patzcr et al., 1999). Развитие лечебного эффекта от применения этих новых клеточных технологий связывают (Г.Т. Сухих, 1998; B.C. Репин, 1998; Nakamura et al., 1999) с осуществлением доставки к клеткам поврежденной П необходимого спектра регенерационггых факторов, которые продуцируют донорские Г, наделенные высокой митотичеекой активностью (используют Г, выделенные из фетальной, неонатальной П или П молодых доноров).

Между тем, определенные организационные и технологические проблемы, связанные с заготовкой, хранением и применением аллогешшх и ксеногешшх изолированных Г (ИГ), оказались тормозом на пути внедрения клеточных технологий в широкую клиническую практику. Эти ограничения стимулировали разработку другого, более доступного метода биорегуляции 11 с помощью факторов пептидной и белковой природы, выделенных из донорской П и других органов, системно с ней связанных (селезенка).

К настоящему времени в литературе уже имеются единичные работы по изучению свойств регуляторных пептидов П телят с молекулярной массой до 10-12 кД (C.B. Оковвгшый, 1995; В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон, 1996). Между тем, известно (Н.Г. Арцимович и др., 1991), что наиболее выраженной пролифератавной активностью обладают пептиды П с молекулярной массой более 15 кД. Однако пептиды П с такой молекулярной массой для стимуляции восстановительных процессов в П не применялись. В литературе также полностью отсутствуют сведения о возможности более эффективной регуляции восстановительных процессов в П с помощью биологически активных пептидов селсзенки - органа, который сам по себе, но особенно в сочетании с донорскими Г, усиливает восстановительные процессы в паренхиме П (Т.Р. Мамхегова, 1998; Э.И. Первакова, 1998). Кроме того, для обоснования эффективности и целесообразности применения регуляторных пептидов для лечения I1H необходим сравнительный анализ результатов применения выделенных тканевых пептидов и методов клеточной терапии. Однако таких исследований проведено не было.

Отсутствие в доступной нам литературе ответов на вопросы, связанных с совершенствованием методов пептидной биорегуляции восстановительных процессов в пораженной П, явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Целью настоящего исследования явилось:

обоснование эффективности и целесообразности использования пептидных препаратов из ткани донорской печени и селезепки с молекулярной массой более 10-12 хД для расширения возможностей применения клеточных биотехнологий при лечении печеночной недостаточности.

Доя достижения поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать модель для изучения дипамики восстановительных процессов в гепатоцитах токсически поврсжденпой печени при их инкубации в опытах in vitro.

2. Изучить динамику восстановительных процессов в токсически поврежденных гепатоцитах, используя очищенные регуляторные пептиды из ткани натшиюй печени животных различных возрастных групп и селезенки.

3. Сравнить эффективность регулирующего воздействия на поврежденные гепатоциты питательных сред, содержащих регуляторные пептиды печени и селезенки, а также питательных сред, предварительно кондиционированных фрагментами ткани донорской печени и селезенки (модель клеточной терапии).

4. Сравнить степень активации гранулоцитов (клеток мопощггарно-макрофагалыюй системы) - стромальных участников регенераторного процесса в паренхиме печени - при использовании сред, содержащих очшденпые регуляторные пептиды печени и селезенки.

5. Изучить возможность повышения регуляторной активности пептидов печени взрослых животных путем предварительной стимуляции этих животных пептидами селезепки.

6. В опытах на животных с моделью токсического гепатита изучить особенность стимуляции восстановительпых процессов в печени при однократном внутрибрюшинном введении фрагментов ткани печени и селезенки взрослого животного, а также очищенных регуяяторных пептидов, выделенных из такого же количества ткани соответствующего органа.

Научная новизна.

Создана модель для изучения в опытах in vitro эффективности различных гуморальных регулягорных воздействий на жизнеспособность и функциональную активность Г поврежденной П в процессе их инкубации. При пасыщении среды инкубации регуляторными пептидами путем добавления в нее лиофшшзироваппых

очищенных экстрактов тканевых полипептидных комплексов (препарат Спленопид, с молекулярной массой до 40 кД; экстракт неонатальной П с молекулярной массой до 27 кД; экстракт П взрослого животного с молекулярной массой до 12 кД) или путем предварительного кондиционирования ее фрагментами ткани П и селезенки было установлено, что используемые тканевые факторы пролонгируют жизнеспособность и повышают функциональную активность Г, но выраженность этих эффектов у разных биоматериалов различная. Наиболее выраженный регуляторный эффект оказался присущ фрагментам ткани селезенки, препарату Спленопид и пептидам из неопатальной П; у фрагментов ткани П и экстракта пептидов, приготовленных из П взрослых животных, регуляторная активность была слабовыраженной. Было показано, что биорегуляторпые пептиды селезенки оказывают стимулирующее воздействие лишь на поврежденные (но не па интактные) Г и при непосредственном контакте с ними. Было подтверждено, что для приготовления экстрактов биорегуляторных пептидов следует использовать органы, клетки которых обладают высокой пролиферативпой активностью: ткань селезенки взрослого животного и ткань П неонатальных (или растущих) животных. В опытах на крысах с токсическим гепатитом подтверждено, что введение фрагментов селезенки, а также нептидов из ткани селезенки (Спленопид) и неонатальной П, обеспечивает более выраженную стимуляцию восстановительных процессов в пораженной П. Морфологически активация процессов внутриклеточной регенерации Г выражалась в более быстром снижепии количества Г с признаками жировой дистрофии цитоплазмы, в более резком первоначальном снижении и в более быстром темпе последующего восстановления количества двуядерных Г, в более быстром темпе нарастания и снижения количества полиплоидных Г, а также в более быстром темпе повышения и снижения количества Г с внутриядерными липидными включениями. Кроме того, под влиянием регуляторных нептидов наступала выраженная гиперплазия эндоплазматического ретикулума и гипертрофия митохондрий; функционально это выражалось в более быстром темпе восстановления детоксицирующей функции (уровень билирубина) П и более быстром темпе снижения показателей цитолиза (АлАт и АсАт).

Было показано, что полипептидные комплексы оказывают регуляторное воздействие не только на Г, по и на клетки макрофагально-моноцитарного ряда стромы П, которые являются непременными участниками регенераторного процесса в поврежденной П.

Было высказано предположение, что стимуляция восстановительных процессов в токсически давреждениой П наступает в результате не только митогепетического, но и трофического влияния регуляториых пептидов селезенки и неопатальной II на процессы внутриклеточной регенерации Г.

Практическая значимость работы:

Предложена модель инкубации Г, выделенных из поврежденной П, для изучения гуморальной регуляции восстановительных процессов в них путем подбора адекватных корригирующих факторов. Показано, что для стимуляции процессов регенерации паренхимы П наряду с имплантацией клеток П и селезенки целесообразно осуществлять введение в организм очищенных полипептидных комплексов, полученных из тканей тех же органов. Показано, что, используя пептидные экстракты с молекулярной массой более 10 кД (Спленопид - до 40 кД, пептиды нсонатальной П - до 27 кД), можно достигнуть эффекта биорегуляции, аналогичного воздействию трансплантированных клеточных взвесей (фрагменты ткани селезепки и П).

Показано, что пептидные комплексы, полученные из органов с высокой пролиферативной активностью (селезенка, неонатальная П), представляют собой наилучший биоматериал для выделения пептидов с высокой биорегулирукяцей активностью. Установлено, что II взрослых животных пе следует использовать для выделения регуляториых пептидов, так как П взрослых животных имеет крайне низкий уровень митотической активности (митотической пролиферации и митотической полиплоидизации) и низкий уровень продукции ростовых факторов.

Основные положения, выносимые па защиту:

Полнпептмдные экстракты из ткани неонатальной П и селезенки взрослых животных (препарат Спленопид), подобно фрагментам ткани селезенки, обладают способностью к стимуляции восстановительных процессов в поврежденной П. Пептиды, выделенные из П взрослых животных, такими свойствами не обладают. Для приготовления препаратов с высокой биорегуляторпой активностью должны использоваться ткапи селезенки и пеонаталыгой П, которые стимулируют восстановительные процессы в Г, а также активизируют клетки макрофагально-моноцитарпого ряда, инфильтрирующих строму П при повреждении.

П взрослых животных не пригодна для получения активных биорегуляторпых пептидов даже после предварительного воздействия на нее пептидов селезенки (препарат Спленопид).

Пептиды с высокой биорегуляторной активностью сокращают период прогрессировали! ПН за счет ускорения адаптации, а также стимуляции процессов репаративной регенерации Г.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на XXXIII Международном Конгрессе по физиологическим наукам (г. Санкт-Петербург, 1997); на ХХШ Европейском Конгрессе по искусственным органам (г. Варшава, 1996); на XXTV Европейском Конгрессе по искусственным органам (г. Будапешт, 1997); на 218 заседании общества трансплантологов г. Москвы и Московской области, ноябрь 1997; па 17 Всероссийском конгрессе физиологов (г. Ростов-па-Дону, сентябрь 1998).

Публикации

Материалы выполненных исследований отражены в 8 публикациях и 1 методических рекомендациях.

Объем и структура диссертации:

Работа изложена па 153 стр. машинописного текста и состоит из введения, 5 глав (глава I - обзор литературы, глава П - материалы и методы исследования, глава III и IV - результаты собственных исследований, главы V - обсуждение полученных результатов), выводов и указателя литературы, содержащего 93 отечественных и 67 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 32 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач нами было выполнено 193 эксперимента на 191 беспородных белых крысах-самцах, весом 150-200 г (таблица 1). Животные содержались на стандартной диете вивария. Дня экспериментов использовали животных, как правило, в утренние часы (10-11 ч утра) для исключения влияния суточных ритмов митотической активности в Г.

Таблица 1. Общий объем выполненных исследований.

Раздел работы Группы опытов Количество экспериментов

I. Исследование биологической активности регуляторных пептидов в опытах с инкубацией ИГ (опыты in vitro). 1. Исследование жизнеспособности и функционального состояния икгактпых и поврежденных ИГ в процессе инкубации их в питательных средах. 25 (крысы)

2. Исследование жизнеспособности и функционального состоят« поврежденных ИГ" при. инкубации в средах, кондиционированных фрагментами ткани П и селезенки взрослых животных. 20 (крысы)

3. Изучение динамики изменения жизнеспособности и функциональной активности поврежденных ИГ при инкубации в средах с добавлением пептидов го ткани селезенки (препарат Спленопид), неонаталыюй П и П взрослого животного. 30 (крысы)

4. Исследование динамики изменения жизнеспособности и функциональной активности поврежденных ИГ при ипкубации в средах, кондиционированных фрагментами ткани П взрослого животнот, предварительно стимулированного пептидами селезенки (in vivo). 10 (крысы)

5. Исследование воздействия регуляторных пептидов П и селезенки на активацию донорских нейтрофшюв (НСТ-тссг). 2 (допоры крови)

П. Исследование влияния регушггорных пептидов иа процессы регенерации в токсически поврежденной П (опыты in vivo). 1. Исследование спонтанной регенерации 11 при токсическом гепатите. 16 (крысы)

2. Исследование динамики восстановительных процессов в поврежденной П на фоне внутрибрюшшного введения фрагментов ткали П и селезенки взрослых животных. 32 (крысы)

3. Исследование динамики восстановэтеяышх процессов в поврежденной П на фоне внугрибргопгонно!*) введения пептидов селезенки (препарат Спленопид). 16 (крысы)

4. Исследование динамики восстановительных процессов в поврежденной П на фоне внутрибрюшиппого введения пептидов неонаталыюй П. 16 (крысы)

5. Исследование динамики восстановительных процессов в поврежденной II па фоне виутрибрюпшнного введепия пептидов II взрослого животного. 16 (крыси)

б. Контроль структуры и функционального состояния II интакгных крыс. 4 (крысы)

ВСЕГО: 193

Работа состоит го 2 разделов. В I разделе работы, включающем 5 групп модельных опытов in vitro с инкубацией ИГ из токсически поврежденной П, в которых была изучена способность пептидов из ткани донорской П и селезенки регулировать восстановительные процессы в этих клетках при инкубации (модель пептидной терапии). Контролем регул игорной активности пептидов служили опыты с инкубацией токсически поврежденных ИГ в средах, предварительно кондиционированных фрагментами ткани П и селезенки взрослых животных (модель клеточной терапии). Оценку биологической активности применяемых пептидов я фрагментов ткани П и селезепки в этих опытах осуществляли по показателям жизнеспособности и функциональной активпости ИГ в процессе их инкубации.

Для получения суспензии ИГ из П крыс с токсическим гепатитом предварительно моделировали токсическое повреждение П крыс курсовым введением четыреххлористого углерода (CCU) по методу И.Ф. Колпащиковой (1979) в нашей модификации. После развития клиники токсического гепатита ИГ выделяли по методу Berry и Friend (1969) в модификации Seglen et al. (1976). Соотношение ИГ и питательной среды при ипкубации составляло 106 клеток на 2 мл среды. Пептидные экстракты добавляли в питательную среду в количестве, соответствующем их содержанию в 0,4-0,5 г ткани донорского органа на 10 мл среды. При приготовлении сред, кондиционированных фрагментами ткани П и селезенки, проводили предварительную инкубацию этих тканей в питательной среде из расчета 0,4-0,5 г ткани на 10 мл среды в течение 7-9 ч, так как по данным О.Ю. Абакумовой и др. (1989) этот срок является достаточным для обогащения среды биорегуляторными пептидами соответствующих органов.

В своей работе мы исследовали пептиды из П пеопатальных кроликов и из П взрослых свиней (8-10 мес. возраста), а также пептиды из селезенки взрослых свиней (10-12 мес. возраста) (препарат Спленопид). Пептидные препараты были выделены из этих тилей, очищены и лиофилизированы в ПИИТ и ИО МЗ РФ под руководством д.м.н., профессора А.Б. Цыпина (зав. лабораторией д.м.н., профессор H.A. Онищенко). Методом гель-фильтрации (JI.A. Остреман, 1985) был изучен пептидный профиль тканевых экстрактов. Было установлено, что препарат Спленопид содержит спектр белков с молекулярной массой до 40 кД, пептидный экстракт из неонаталыюй П содержит белки с молекулярной массой до 27 кД, а пептидный экстракт из П взрослых животных содержит белки с молекулярной массой до 12 кД.

Так как наши модельные опыты подтвердили крайне низкий уровень регуляторной активности пептидов из II взрослых животных, в отдельной группе опытов была предпринята попытка повышения их биорсо'ляторной активности путем предварительной стимуляции П пептидами селезенки. Для этого интакгаым животным внутрибрюшинно вводили препарат Спленопид в количестве, соответствующем его содержанию в 0,4-0,5 г ткани; через 24 ч животных забивали, а II использовали для приготовления кондиционированных сред по вышеописанной методике.

В отдельной группе опытов нами исследовалась связь между способностью регуляторных пептидов П и селезенки активировать восстановительные процессы в паренхиматозных клетках и их способностью повышать функциональную активность клеток макрофагально-мопоцитарпой системы, являющихся участниками

регенераторных процессов в П. Для этого нами была проведена тест-реакция НСТ (Д.В. Новиков, 1998) с ипкубацией донорских нейтрофилов в питательной среде, в среде, кондиционированной ИГ, в среде с добавлением регуляторных пептидов и в среде, кондициопировашюй ИГ с добавлением пептидных препаратов.

Во И разделе работы было проведено сравнительное изучеиие акгивпости восстановительных процессов в токсически поврежденпой II крыс с помощью регуляторных пептидов селезенки (препарат Сплетопид), пеонатальной П и II взрослых животных после однократной впутрибрюшинной инъекции этих пептидов через 1 день после прекращения затравки крыс CCI4. Вводимая доза пептидов соответствовала их содержанию в 0,4-0,5 г ткани донорского органа на одну крысу. Контролем служили опыты с внутрибрюшиппой имплантацией фрагментов ткани II или селезенки в количестве 5-8*107 клеток или 0,8 мл густой взвеси на одну крысу (около 0,4-0,5 г ткани). Биорс1уляторную активность используемых пептидных экстрактов и фрагментов ткани П и селезенки в опытах in vivo оценивали по биохимическим и морфологическим показателям.

Жизнеспособность Г в опытах in vitro оцепивали методом прижизненной окраски ядер Г 0,2% раствором трипанового синего (Baur et al., 1975).

Состояние энергозависимых синтетических процессов в Г оценивали по уровню концентрации мочевины в культуре Г путем индукции синтеза мочевины добавлением в среду инкубации, содержащей 2*106 клеток, - хлорида аммония и орнитина по 2 мМ и глютамата 20 мМ (B.IO. Тощаков, 1990). Детоксикационнуго функцию Г исследовали по антинириновому тесту (Н.М. Коренман, 1975). Функциональное состояние здоровой и поврежденной П оценивали по уровпю общего билирубина и активности цитолитических ферментов (АлАт и АсАт) в крови подопытных животных при помощи тест-наборов Bio-la-test фирмы Lachema (Чехия).

Морфологическое состояние П оценивали с помощью световой и электронной микроскопии. Для гистологического исследования кусочки П фиксировали в 10% нейтральном формалине, а затем заливали парафином. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. На гистологических препаратах в 200 полях зрения подсчитывали общее количество печеночных клеток с одновременным подсчетом количества двуядерных Г, полиплоидных Г, а также Г с внутриядерными линвдпыми включениями. Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали в глютаровом альдегиде; после дегидратации проводку осуществляли по

стандартной методике. Ультратонкие срезы исследовали на микроскопе JEM 100В (Япония).

Статистическая обработка полученных результатов начиналась с предварительного кодирования всех исследуемых показателей. Из этих показателей были составлены формализованные карты для ввода в электронную таблицу компьютера Pentium-200MMX.

Сравнение частот количественных показателей с целью определения достоверности различий проводилось с помощью критерия t-Стьюдепта, считая значения показателей статистически значимыми при Р<0,05.

Считаю необходимым отметить, что морфологические исследования были проведены при непосредственном участии старшего научного сотрудника лаборатории клинической патоморфологтш к.м.н. В.В. Северина (зав. лаборатории д.м.н. И.М.Ильипский) и сотрудника сектора трансплантационной иммунологии к.м.н. В.А.Зайденова (зав. лаборатории иммунологии к.м.н. Ф.С. Баранова); исследование влияния пептидных препаратов на развитие тест-реакции HCT проводилось при непосредственном участии ординатора сектора имму! го коррекции гнойно-септических осложнений A.A. Тимнова (зав. сектором длл.н. B.C. Сускова, зав. лаборатории иммунологии - км.п. Ф.С. Баранова); разработка методов выделения ИГ, получения кондиционированных сред, а также разработка модели токсического повреждения П были проведены совместно с к.м.н. Т.Р. Мамхеговой и к.м.н. Э-ИЛерваковой; пептидные пренараты были предоставлены нам для изучения д.м.н. проф. А-Б.Цыпиным и инженером И.М. Ивановым; определение спектра белков в пептидных препаратах селезенки и П методом гель-фильтрации проводилось при непосредственном участии старшего научного сотрудника к.м.н. С.Д. Артамонова (лаб. биолерфузии и консервирующих сред, зав. лаборатории д.м.н. проф. H.A. Оншцепко).

Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Влияние сред, кондиционированных пептидами ткани селезенки, неонатальной П и Пвзрослых животных, на состояние ИГ из токсически поврежденной П.

Для сравнительной оценки регуляторной активности изучаемых пептидов па восстановительные процессы в токсически поврежденных ИГ во время инкубации нам

необходимо было, прежде всего, дать характеристику повреждения Г, вызванного гелатотропиым ядом.

Контролем степени повреждения Г служили Г, выделенные из П интахтных крыс. Сравнительный анализ жизнеспособности, синтетической и детоксикагдаонной функций поврежденных и иптактных Г при их инкубации в питательной среде (табл. 2) показал, что в течение первых 5 ч инкубации достоверные различия в состоянии жизнеспособности иптактных и токсически поврежденных Г отсутствовали. Однако, пачипая с 6 часа инкубации уровень жизнеспособности Г, выделенных из П крыс с токсическим гепатитом, начинал более резко снижаться, и к 8 ч количество жизнеспособных Г из поврежденной П составило 53±2,9%, тогда как количество жизнеспособных Г из интактной П составило к этому сроку 79±3,8% (Р<0,05). При исследовании функционального состояния Г из поврежденной и интактной П мы установили, что скорость индуцированного синтеза мочевины и метаболизации антипирина в обеих группах опытов были снижены в течение всего срока инкубации. Причем, в первые 2-3 ч инкубации у Г из поврежденной П эти показатели были достоверно ниже, чем в контроле (Г из интактной печени), затем в процессе инкубации Г из поврежденной печени улучшали свою синтетическую и детоксикационную функцию (различия с контролем становились не достоверными). Однако, к 7-8 ч инкубации различия с контролем снова становились достоверными, что свидетельствовало о сниженном резерве устойчивости Г из поврежденной П, о несовершенстве внутриклеточных восстановительных процессов в этих клетках в процессе инкубации, а также об отсутствии в среде инкубации факторов, способных активизировать процессы внутриклеточной репаративной регенерации.

Убедившись в адекватности созданной модели клеточного повреждения, мы приступили к изучению способности пептидов селезенки (препарат Спленопид) восстанавливать функциональную активность и пролонгировать жизнеспособность поврежденных ИГ. Одновременно с изучением биорегуляторной активности пептидов селезенки па поврежденные ИГ нами проводилось сравнительное изучение регулирующего влияния на эти клетки сред, кондиционированных фрагментами ткани П и селезенки (модель клеточной терапии). Результаты этих исследований представлены в таблице 3. Из таблицы видпо, что добавление Спленопида к питательпой среде более выражено пролонгирует жизнеспособность и более отчетливо повышает функциональную активность ИГ, чем среды, кондиционированные фрагментами ткани П и селезенки.

Таблица 2. Сравнительная оценка жизнеспособности и функциональной активности гепагоцитов, выделенных из печени ингактных крыс и крыс с токсическим гепатитом в процессе инкубации в питательной среде.

Жизнеспособность, %

Время ипкубации (час) 1 2 3 4 5 6 7 8

Гепатоциты из интактной печени (п=15) 88 ±3,4 88 ±4,5 87 ±2,8 86 ±4,5 84 ±5,6 82 ±2,2 80 ±3,9 79 ±3,8

Гепатоциты из поврежденной печени (п=20) 80 ±3,2 80 ±2,6 79 ±4,8 76 ±3,8 71 ±5,9 68* ±3,9 61* ±4,1 53* ±2,9

Индуцированный синтез мочевины, мг/2х 106 кл/60 мин

Время инкубации (час) 1 2 3 4 5 6 7 8

Гепатоциты из интактной печени (п=15) 20,8 ±0,9 на ±1,5 21,9 ±1,2 22,5 ±1,0 23,7 ±0,7 24,4 ±1,2 23,1 ±0,2 22,8 ±1,31

Гепатоциты из поврежденной печени (п=20) 14,8* ±1,32 16,9* ±1,21 17,7 ±2,5 18,2 ±2,9 18,9 ±2,7 19,7 ±2,6 17,8* ±1,2 14,3* ±1,13

Детоксикационный (антипириновый) тест, мкг/мл

Время инкубации (час) 1 2 3 4 5 6 7 8

Гепатоциты из 2,9 2,7 2,3 1,9 1,6 1,4 1Д 0,9

иптакгной печени

(п=15) ±0,21 ±0,21 ±0,1 +0,48 ±0,48 ±0,6 ±0,34 ±0,23

Гепатоциты из повреждепной печени (п=20) 4,12* ±0,19 3,88* ±0,17 3,57* ±0,14 3,19 ±0,59 2,68 ±0,54 2,43 ±0,85 2,39 ±0,85 2,28* ±0,31

* - Р< 0,05 по сравнению с гепаггоцитами из интактной печени.

Таблица 3. Сравнительная характеристика состояния жизнеспособности и функциональной активности поврежденных гепатоцитов при инкубации в питательной среде с добавлением пептидов сеяезенки (препарат Спленопид) и в питательных средах, кондиционированных фрагментами ткани селезенки и печени взрослых животных.

Жизнеспособность, %______

Время культивации Г, час 1 2 3 4 5 6 7

В питательной среде (контроль), 11=20 80+ 3,2 80+ 2,6 79+ 4,8 76+ 3,8 71+ 5,9 68+ 3,9 61+ 4,1

В питательной среде со Сшенопвдом, п=10 82+ 4,5 82+ 1,3 82+ 1,8 80± 2,2 78± 1,3 75+ 2,4 70+ 1,5*

В среде, кондиционировапной фрагментами теави селезенки, п=10 80± 4,1 80+ 5,8 79+ 3,2 791 1,8 75+ 2,3 70+ 7,1 70+ 1,4*

В среде, кондиционированной фрагментами ткани печени, п-10 804: зд 79+ 4,1 79+ 2,2 7 9± 1,4 76+ зд 73+ 4,2 68+ 1,3

Индуцированный синтез мочевины, мг/2*106кл/60мин

Врем» культивации Г, час 1 2 3 4 5 6 7

В питательной срезде (кошролъ), п=20 14,8± 0,6 16,9+ 0,8 17,7+ 1,0 18,2± 0,8 18,9+ 0,1 19,7± 0,8 17,8± 0,51

В питательной феде со Сштенопидом, п=5 18,0+ 1,51* 19,2+ 2,3 20,5+ 1,15* 22,4+ 1,4* 22, 8+ 1,3* 23,1+ 0,58* 20,2+ 0,43*

В среде, кондиционированной фрашентами ткани селезенки, п=5 17,8+ 0,75* 18,5+ 0,7 19,9+ 0,21 20,7+ 0,38* 21,4± 0,25* 22,3+ 0,31* 22,9+ 1,07*

В среде, кондиционированной фрагментами ткаии печени, п=5 15,9± 0,44 17,7+ 0,67 18,5+ 0,39 19,4 1,1 20,3± 0,88 21,2+ 0,91 21,3+ 0,68*

Детоксикационшдй (адтшшриновый) тест, мкг/мл

Время культивации Г, час 1 2 3 4 5 в 7

В питательной среде (контроль), п=20 4,12+ 0,03 3,88± 0,11 3,57+ 0,03 3,19± 0,03 2,68± 0,04 2,43+ 0,07 2,39+ 0,08

В питательной среде со Спленопияом, п=5 3,0+ 0,21* 2,8± 0,25* 2,5+ 0,24* 1,8+ 0,4* 1,6+ 0,21*»* 1,4+ 0,21*»* 1,3+ 0,12*»*

В среде, кондиционированной фрагментами ткани селезенки, ц=5 3,51 ± 0,29* 3,19+ 0,19* 2,81+ 0,25* 2,42+ 0,28* 2,12+ 0,14* 1,94+ 0,16* 1,65± 0,14*

В среде, кондиционированной фрагментами ткани печени, п=5 3,74+ 0,27 3,22+ 0,23* 3,01+ 0,29 2,94+ 0,24 2,46± оа 2,15+ 0,21 1,82+ 0,21*

* - Р<0,05 по отношению к питательной среде;

* - Р<0,05 по отношению к питательной среде, кондиционированной фрагментами ткани селезенки;

* - Р<0,05 по отношению к питательной среде, кондиционировапной фрагментами ткани печени.

Примечательно, что регулирующая роль среды, кондиционированной фрагментами П, была наименее выраженной.

Так, оценивая синтетическую функцию поврежденных Г, было установлено, что при добавлении препарата Сплепопид отмечается тендепция к активации синтеза мочевины по сравнению со средами, кондиционированными фрагментами ткани П и селезенки. При оценке детоксикациошюй функции поврежденных Г мы нашли, что использование препарата Спленопид способствует более выраженному снижению концентрации антипирина, чем среды, кондиционированной фрагментами ткани П и селезенки, и эта разница становится достоверной, начиная с 5 ч наблюдения (к 7 ч наблюдения эти различия составили 1,3±0,12 против 1,82±0,21 мкг/мл - при использовании фрагментов ткани П и 1,3±0,12 против 1,65±0,14 мкг/мл - при использовании фрагментов ткани селезенки, при Р<0,05).

Более выраженную регуляторную активность пептидов селезенки (препарат Сплепопид) по сравнению с факторами, выделяемыми фрагментами ткани селезенки в среду инкубации, мы объясняем тем, что технология приготовления препарата Спленопид предусматривает экстракцию из ткани селезенки более полного спектра регуляторных пептидов, включая и те, которые в процессе жизнедеятельности клеток не диффундируют через клеточную мембрану во внеклеточную среду.

Для изучения возможности повышения биорегуляторной активности фрагментов ткани П взрослых животных мы предприняли попытку предварительной стимуляции ее активпости пептидными комплексами (препарат Спленопид). Результаты проведенных экспериментов показали, что фрагменты ткани П взрослых животных даже после предварительной стимуляции их препаратом Спленопид существспно пе повышали своего регулирующего влияния па состояние восстановительных процессов в поврежденных Г. Это выражалось в том, что жизнеспособность поврежденных Г в этой серии опытов достоверно улучшалась только к 7 ч наблюдения, по сравнению с контролем (инкубация ИГ в питательной среде). При оценке скорости синтеза мочевины различия с контролем были достоверными только к 5 ч наблюдения (23,2±1,2 мг/2*106кл/60мин против 18,9±0,1 мг/2* 106кл/60мин в контроле, Р<0,05); по детоксикациошюй активности различия с контролем были достоверны па 3-4 и 7 ч культивации. Проведя сопоставление влияния фрагментов ткани П взрослых животных и фрагментов т кани П взрослых животных, активированных препаратом Спленопид, на восстановительные процессы в поврежденных Г, мы пришли к заключению, что дополнительная активация П

пептидами селезенки не приводит к существенному повышению регулирующего воздействия фрагментов ткали П взрослых животных. Это выражалось в том, что в течение всего времени наблюдения мы не обнаружили достоверных различий между этими группами опытов.

Эти результаты позволили нам заключить, что с помощью ряуляторных пептидов селезенки нельзя рассчитывать па дополнительное усилите выработки биологически активных пептидов в клетках интшегной П взрослых животных. Поскольку П взрослых животных имеет низкий уровень пролиферативной активности то, очевидно, этим и может быть обусловлена наиболее низкая регуляторная активность факторов, выделяемых фрагментами ткани П при их инкубации.

Для получепия пептидов П с высокой биорегуляторной активностью мы использовали в качестве источника таких пептидов ткань П неонатальных животных и провели сравнительное исследование влияния этих пептидов на состояние поврежденных Г при инкубации. Контролем служили опыты по инкубации поврежденных Г в питательной среде без добавления регуляторных пептидов, а также в среде, кондиционированной фрашептами ткани П. Параллельно нами были поставлены опыты с инкубацией поврежденных Г в питательной среде с добавлением пептидов из И взрослых животных. Результаты всех этих наблюдений представлены в таблице 4. Паши данные показали, что влияние пептидов из П взрослого животного на состояние поврежденных Г было аналогично влиянию среды, кондиционировашюй фрагментами ткани П. Это выражалось в том, что уровень жизнеспособности Г при использовании пептидов из П взрослого животного во все сроки наблюдения не имел достоверных различий с контролем, а при опенке синтетической и детоксикационпой функции Г достоверные различия выявлялись только к 7 ч ипкубации. В то же время, при использовании пептидов из неонатальной П мы имели достоверпое повыгаепие уровня жизнеспособности уже к 6 ч инкубации, а повышение функциональных показателей происходило почти во все сроки наблюдения по сравнению с контролем. При сопоставлении регуляторной активности пептидов неонатальной П с регуляторной активностью пептидов П взрослого животного и среды, кондиционированной фрагментами ткани П, мы отметили достоверное повышение детоксикационпой активности Г в среде с добавлением пептидов из неонатальной П на 1 и 4-6 ч наблюдения.

Таблица 4. Характеристика жизнеспособности и функциональной активности поврежденных гелатоцитов, при инкубации в среде с добавлением пептидного комплекса из неонатальной печени, из печем взрослого животного и в среде, кондиционированной фрагментами ткани печени.

Жизнеспособность, %

Время культивации Г, час 1 2 3 4 5 6 7

В питательной среде (кошрапь), п=20 80+ 3,2 80± 2,6 79+ 4,8 764 3,8 71± 5,9 68+ 3,9 61± 4,1

В среде с добавлением пептидов ю неонатальной П, п=10 83+ 3,2 80± 5,2 80) 2,3 804 6,7 794 6,1 77+ 2,8* 72+ 3,1*

В среде с добавлением пептидов из П взрослого животного, п=10 824 1,56 804 2,1 794 3,1 75+ 3,4 70+ 2,6 68* 2,14 65± !,12

В среде, кондиционированной фрагментами ткани П,п Ч0 804 за 79+ 4,1 79+ 2,2 794 1,4 764 за 734 4а 68± 1,3

Индуцированный синтез мочевины, мг/2* 1О6кл/60мин

Время культивации Г, час 1 2 3 4 5 6 7

В питательной среде (контроль), п=20 14,И 0,6 16,9± 0,8 17,7± 1,0 18,21 0,8 18,9+ 0,1 19,7± 0,8 17,8± 0,51

В среде с добавлением пептидов ш ноонатальной П, п=10 16,2+ 0,3 18,4± 2,3 20,4-Ь 0,2* 20,9+ 2,51 22,2± 0,02* 23,44 0,13* 20,9+ 0,5*

В среде с добавлением пептидов из П взрослого животного, п=10 15,4+ 0,51 17,0+ 0,9 18,44 1,02 19,0± 1,1 20,6± 0,8 21,4+ 0,94 22,1+ 0,57*

Вереде, кондиционированной фрагментами ткани П, п=10 15,94 0,44 17,7± 0,67 18,5+ 0,39 19,4± 1,1 20,3+ 0,88 21,2* 0,91 21,3+ 0,68*

Детоксикациошшй (адтшшриновый) тест, мкг/мл

Время культивации Г, час 1 2 3 4 5 в 7

В питательной среде (контроль), п=20 4,12± 0,03 3,88+ 0,11 3,57± 0,03 3,19± 0,03 2,68 ±0,04 2,43+ 0,07 2,39± 0,08

В среде с добавлением пептвдов из неонатальной П, п=10 3,18+ 0,11*»* 3,2+ 0,12* 2,9+ 0,14* 2,4* 0,05*»* 2,0+ 0,09*4* 1,6+ 0,054* 1,4+ о а*

В среде с добавлением пептидов из П взрослого животного, п=10 3,74 0Д2 3,5+ 0,17 3,2+ 0,2 2,8а 0,27 2,4± 0,12 2,1+ 0,15 1,8+ 0,12*

Вереде, кондацвонировапной фрагментами ткани П, п=10 3,74± 0,27 3,22+ 0,23* 3,01± 0,29 2,944 0,24 2,46+ оа 2,15+ 0,21 1,824 0,21*

* Р<0,05 по отношению к питательной среде.

* Р<0,05 по отношению к среде, кондиционированной фрагментами ткани нечени;

* Р<0,05 по отношению к сред с добавлением пептидов из печени взрослого животного.

Таким образом, паши эксперименты подтвердили, что пептиды из неонатальной П обладают выражеппой регуляторпой активностью и способствуют улучшению морфо-функционального состояния инкубируемых поврежденных Г, следствием чего и является повышение резистентности и функциональной активности Г в процессе инкубации. Отсутствие выражетюго эффекта при использовании среды, кондиционированной фрагментами ткани П, и, особенно, пептидов из П взрослого животного, очевидно, связано с низкой пролиферативной активностью ткани П взрослых животных и с преобладанием в составе пептидов пе факторов активации пролиферации, а факторов ингибиции. Последнее становится особенно явпым при использовании пептидного комплекса из псани П взрослого животного, технология приготовления которого допускает появление в составе экстракта различных внутриклеточных регуляторных веществ, в том числе и с ингибирующей активностью.

Сравнительный анализ ре1уляторной активности препарата Спленопид и пептидов неонатальной П по показателям жизнеспособности и функциональной активности поврежденных Г при их инкубации позволил нам установить отсутствие достоверных различий в активности этих пептидов между собой на исследуемые показатели. На основании полученных данных мы пришли к заключению, что пептидные экстракты из ткали селезенки я ткани неонатальной П в одинаковой степени пригодны для осуществления регуляции восстановительных процессов в поврежденных Г.

В отдельной группе опытов для установления связи регулирующего влияпия пептидов на восстановительпые процессы в Г с активностью клепок макрофагальпо-моноцитарного ряда, которые принимают непосредственное участие в процессах регенерации П (И.В. Попова, 1975; Д.С. Саркисов, 1977; JI.E. Панип и др., 1991), нами была проведена тест-реакция HCT, характеризующая степень активации нейтрофилов. Наше исследование спонтанной и индуцировапной HCT реакции показало, что активация донорских нейтрофилов под влиянием пептидов неонатальной П и селезенки (препарат Спленопид) была существенно более выраженной, чем активация нейтрофилов в питательной среде (контроль) или в среде, кондиционированной ИГ.

Модельные опыты на клеточных взвесях позволили установить, что пептиды с высокой ретуляторной активностью оказывают свое действие пе только иа Г, но н на клеточные элементы стромы. Вовлечение в регенераторный процесс различных клеток П должно, несомненно, повысить его эффективность под воздействием регуляторных

пептидов, что и было изучено нами на крысах с экспериментальным токсическим гепатитом.

2. Влияние пептидных экстрактов из ткани селезенки, неонатальной П и П взрослых животных на восстановительные процессы в токсически поврежденной П.

Для оценки эффективности воздействия регуляторных пептидов, выделенных из ткани селезенки, неонатальной П и П взрослых животных, на процессы репаративной регенерации П мы провели опыты на крысах с моделированием токсического гепатита. Влияние пептидных препаратов на восстановительные процессы в П мы сравнивали с результатами воздействия клеточной терапии, которая моделировалась применением фрагментов ткани П и селезенки.

Для оценки результатов проводимого лечения нам необходимо было дать объективную характеристику токсического повреждения П, а также ее спонтанной регенерации путем сопоставления этих данных с показателями у интактных крыс. Наши исследования показали, что после прекращения курсового введения CCL) появлялись выраженные морфологические признаки токсического повреждения паренхимы П, выражающиеся, прежде всего, в интенсивной жировой дистрофии, очаги локализации которой имеют векторный характер распределения. Наиболее поврежденными оказались периферические участки в перипортальной зоне печеночных долек, однако, по мере приближения к центральной вене интенсивность жировой дистрофии снижалась. В центральной части долек можно было выявить участки, запятые Г, с практически не поврежденной структурой, за счет, которых, очевидно, и происходит восстановление остальных Г в печеночной дольке. При оценке цитологических показателей мы отметили, что после прекращения затравки крыс ССЦ происходило достоверное снижение количества двуядерных Г с 54,8±7,2%о до 39,0±5,096о и повышение содержания полиплоидных Г с 43,7±5,3%о до 60,8±7,2%о (Р<0,05). Эта динамика сохранялась на протяжении всего срока наблюдения (21 дет.). Одновременно в ткапи П были выявлены единичные Г с внутриядерными включениями, лшшдная природа которых была подтверждена нами электронно-микроскопическими исследованиями. В П интактных крыс такие Г пе были обнаружены. В основном, Г с внугриядерными липидными включениями были выявлены в переходных зонах между очагами, занятыми Г, находящимися в процессе линидной деструкции и группами Г с неповрежденной структурой, т.е. в местах, где,

вероятно, идет восстановление паренхимы П после жировой дистрофии. Количество Г с внутриядерными липидными включениями увеличивалось вплоть до 14 дня наблюдения на фоне снижения жировой дистрофии Г в П. Эта одновременная и разнонаправленная динамика изменения состояния цитоплазмы и ядра во время спонтанной регенерации позволила нам предположить, что ядра Г принимают участие не только в активации процессов регенерации Г, но и в активации процессов их адаптации (путем захвата липидяых капель из цитоплазмы), для ускоренного восстановления наиболее важной - детоксикационной функции П.

В процессе спонтанной регенерация имеет место постепенная нормализация гистологической структуры П и ее функциональных показателей, хотя к 21 суткам наблюдения все еще сохраняется достоверно более высокий уровень показателей клеточного цитолиза. Полученные данные свидетельствуют о том, что спонтанная регенерация токсически поврежденной П, наблюдаемая нами в течение 21 суток, пе привела к окончательному восстановлению всех функциональных и морфологических показателей.

Для выяснения регенераторной активности препарата Спленопид, пептидов неонатальной II и П взрослых животных мы провели сравнительное исследование тех же морфологических и функциональных показателей у крыс с токсическим гепатитом, на фоне введения не только указанных пептидов, но и фрагментов ткани II и селезенки (модель клеточной терапии). При изучении морфологических показателей регенерации II под влиянием препарата Спленопид мы нашли, что подобно опытам с прнмепеписм фрагментов ткани селезенки, при использовании препарата Спленопид, начиная с 14 суток происходило увеличение количества двуядерных Г, которое оказывалось достоверным по сравнению с контролем к 21 суткам наблюдения (табл. 5): 44,5±5,8%о вместо 27,7±2,6%о (Р<0,05). При подсчете количества полиплоидных Г динамика фазного изменения этого показателя при использовании Спленопида была более выраженной, чем при использовании фрагментов ткани П и селезенки. На 5 сутки наблюдения под влиянием Спленопида происходило более резкое повышение содержание полиплоидных Г, чем в других опытных группах, и это повышение было достоверным по сравнению с контролем (спонтанная регенерация): 81,5±4,6%о вместо б4,5±4,6%о (Р<0,05). Примечательно, что резко выраженное различие в размерах ядер Г на 5 сутки наблюдения совпадала со значительным усилением лимфогистиоцятарной инфильтрации П, которая, по современным представлениям обеспечивает интеграцию и координацию внутритканевых (печеночных) взаимодействий, а сами активированные

Таблица 5. Цитологическая характеристика печени крыс с токсическим гепатитом без и на фоне внутрибрюшинного введспия препарата Сплешшид, а также фрагментов ткани печени и селезенки.

ПОКАЗАТЕЛИ Сутки после прекращения введения сси Количество двуядерных гепатоцитов,%о Полиплоидные гепатощггы, %о Гепатоцигы с внутриядерными липидными включениями, %о

У шпакшыхкрыс 54,8+7,2 43,7*5,3 0

У крыс с токсическим гепатитом (исходный уровень) 1 39,0*5,0* 60,817,2* 2*0,3*

Контрольная группа 2 38,81-4,5 62,&±3,5 12,1*2,4

5 35,7±2,7 64,5*4,6 28,8*3,2

14 29,5±3,3 69,3*4,2 34,3*3,2

21 27,7±2,6 67,5*4,1 10,8*2,1

Введение пептидов сенезепки (препарат Спленопвд) 2 30,1*7,3 71,3±7,2 19,0*0,1

5 26,0*5,2 81,51-4,6* 32,5*4,2

14 32,0±4,1 70,4*5,1 15,7*2,4*»

21 44,5±5,8Ч 54,0*3,7* 4,9*1,5*

Введение фрагментов ткани селезенки 2 30,8±4,3 68,6x8,2 18,9*1,1

5 26,243,1* 73,6*4,7 25,7*1,2

14 30,8±4,7 70,8*3,2 16,5*3,2**

21 39,3±2,5* 58,5*2,8* 5,9*1,1*

Введение фрагментов ткани печени 2 32,«±4,2 64Д±4,1 14,6*2,4

5 28,84 7,2 70,8*4,6 30,5*3,1

14 29,1±2,4 72,318,1 23,8*2,3*

21 32,7*3,2 61,2*6,7 6,2*1,2

*- Р<0,05 по сравнению с контрольной группой в те же сроки; ♦ - Р<0,05 по сравнению с впутрибрюшинным введением фрагментов ткани печени.

Таблица 6. Характеристика основных показателей функции печени у крыс с токсическим гепатитом без и на фоне внутрибрюпшнного введения препарата Сплепопид и фрагментов ткани печени и селезенки.

ПОКАЗАТЕЛИ Сутки после прекращения введения СО, Общий билирубин, мкМоль/л ALT сьгйорогки крови, мккат/л AST сыкоротки крови, мккат/л

У иитакгыых крыс 7,7±0,2 0,38±0,04 0,4±0,15

У крыс с токсическим гепатитом (исходный уровень) 1 15,2; 0,8* 1,92±0,01* 2,0+0,03*

Контрольная группа 2 15,2±0,9 2,0810,04 2,0+0,04

5 13,9±0,9 1,99±0,03 1,51±0,05

14 9,110,4 1,22±0,03 0,954),3

21 7,3±0,3 1,01 АО,03 0,75+0,02

Введение пептидов селезенки (препарат Сплевопвд) 2 14,0±0,5 1,9+0,01 2,0+0,08

5 9,1±1,8 0,83±0,04«Ч 1,2+0,3

14 5Д±0,9* 0,56±0,2*» 0,41 ±0,1**

21 4,8i0,28* 0,4±0,1* 0,21+0,09*

Введение фрагментов ткани селезенки 2 1бД±0,8 1,94 И),02 2,05*0,02

5 12,3±0,3 1,1=1.0,02 1,38+0,03*»

14 8,0±0,3 0,S±0,02 0,64:0,02»

21 5,8-Ю,2* 0,410,02*» 0,35+0,02*

Введете фрагментов ткани печени 2 14,640,3 2,00+0,02 2,00±0,03

5 10,06±0,81 1,8+0,04 1,5 НО,02

14 9,3±0,2 0,91±0,03 0,8 i 0,03

21 5,210,4» 0,69+0,01* 0,44*0,09*

* - Р<0,05 по сравнению с контрольной группой;

♦ - Р<0,05 по сравнению с внутрибрюшинным введением фрагментов ткани печени.

лимфоциты принимают участие в восстановительных процессах Г (И.В. Попова, 1975 Д.С. Саркисов, 1977; А.Г. Бабаева, 1985, 1995; М.С. Бляхер и др. 1996).

К 21 суткам наблюдения количество полиплоидных Г под влиянием Спленопида оказывается на достоверно более низком уровне, чем в контроле: 54,0±3,7%о против 67,5±4,1%о (Р<0,05). При использовании фрагментов ткани селезенки и П, хотя и имело место снижение количества полиплоидных Г к 21 суткам наблюдения, одпако, это снижение было не достоверным. Мы отметили так же, что к 14 и 21 суткам наблюдения происходило более резкое снижение содержание Г с внутриядерными липидными включениями по сравнению с контролем, подобно тому, как это имело место при использовании фрагментов ткани селезенки.

При оценке функционального состояния П крыс с токсическим гепатитом под воздействием пептидного препарата Спленопид (табл. 6) мы отметили ускоренное восстановление детоксикационной функции и более быструю нормализацию показателей цитолиза по сравнению с трансплантацией фрагментов ткани П и селезенки: восстановление функций происходило к 14 суткам наблюдения.

Таким образом, исследование регенераторных процессов в поврежденной П под влиянием Спленопида показало, что пептнды селезенки способствуют стимуляции восстановительных процессов в П подобно методам клеточно-тканевой терапии, но выраженность регуляториого воздействия у Спленопида выше, особенно по сравнению с опытами, где использовались фрагменты ткани II.

Сопоставление регуляторной активности пептидного экстракта из неонатальной П и из П взрослого животного с активностью фрагментов ткали П показало, что пептиды неонатальной П достоверно более активно способствует восстановлению морфологических и функциональных показателей при токсическом повреждении П по сравнению с контролем (табл. 7, 8). Наименее выраженная регуляторная активность была присуща пептидам из II взрослого животного, так как достоверные различия с контрольной группой (спонтанная регенерация П) нами не были обнаружены ни по одному из исследуемых показателей. Более того, по сравнению с пептидами из неопатальной Г!, регуляторный эффект пептидов из П взрослого животного был достоверно менее выраженным, и эта разница выявлялась к 14 суткам наблюдения при исследовании уровня активности цитолитических ферментов в крови подопытных животных. На фоне введения фрагментов ткани П уровень цитолитических ферментов по сравнению с группой, где использовались пептиды неонатальной П, был достоверно выше к 14 и 21 суткам для АлАт и к 14 суткам наблюдения для АсАт. Наименее

Таблица 7. Цитологическая характеристика печени крыс с токсическим гепатитом без и на фоне внутрибрюшинного введения пептидов из неонатальной печени, из печени взрослого животного и фрагментов ткани печени.

ПОКАЗАТЕЛИ Сутки после прекращения введения CCU Количество двуадериых гепатоцитов, 56« Полиплоидные гепатоциты, %о Гепатоциты с внутриядерными лвдидными включениями, %о

У внтактных крыс 54,8+7,2 43,7+5,3 0

У крыс с токсическим гепатитом (исходный уровень) 1 39,0+5,0* 60,8+7,2* 2+0,3*

Контрольная группа 2 38,8+4,5 62,8+3,5 12,1+2,4

5 35,7+2,7 64,5+4,6 28,8+3,2

14 29,5+3,3 69,3+4,2 34,3+3,2

21 27,7+2,6 67,5+4,1 10,8+2,1

Введение пептидного комплекса из неонатальной печени 2 29,6+5,4 67,3+2,7 17,4+2,1

5 24,3*7,2 74,6+5,3 28,6+2,7

14 33,0+4,2 65,0+7,2 16+2,9*

21 46,0)6,8* 53,4+4,6* 4,К (2,5*

Введение пептидного комплекса из печени взрослого животного 2 34,4+3,7 60,7+6,2 14,0+2,3

5 32,7+5,1 68,4+5,3 31,7+3,3

14 29,3+4,7 73,0+6,1 27,5+4,1

21 33,5+4,1 64,4+5,8 6,9+1,0

Введение фрагментов ткани печени 2 32,8+4,2 64,2+4,1 14,6+2,4

5 28,8+7,2 70,8+4,6 30,5+3,1

14 29,1+2,4 72,3+8,1 23,8+2,3*

21 32,7+3,2 61,2+6,7 6,2+1,2

*- Р<0,05 по сравнению с контрольной группой в те же сроки.

Таблица 8. Характеристика основных показателей функции печени у крыс с токсическим гепатитом без и на фоне внутрибрюншнного введения пептидов из неонатальной печени, из печени взрослого животного и фрагментов ткани печени.

ПОКАЗАТЕЛИ Сутки после прекращения введения ССЦ Общий билирубин, мкМоль/л ALT сыворотки крови, мюсат/л AST сыворотки крови, мккат/л

У шпактпых крыс 7,7*0,2 0,38*0,04 0,4*0,15

У крыс с токсическим гепатитом (исходами уровень) 1 15,2*0,8* 1,92*0,01* 2,0*0,03 *

Контрольная группа 2 15,2(0,9 2,08*0,04 2,0*0,04

5 13,9*0,9 1,99*0,03 1,51*0,05

14 9,1*0,4 1,22*0,03 0,95*0,3

21 7,3*0,3 1,01*0,03 0,75*0,02

Введение иешидного комплекса из неонатальной печени 2 13,810,6 2,0*0,03 2,00*0,05

5 10,2*0,7 1,5*0,22 1,3*0,18

14 5,1*0,2* 0,5*0,1* 0,4*0,03*

21 4,0*0,9* 0,3*0,02* 0,3*0,08*

Введение пептидного комплекса из печени взрослого животного 2 14,8*0,8 2,03*0,05 2,00*0,09

5 11,2*0,4 1,8*0,2 1,8*0,05

14 8,2*0,4 1,3*0,08» 0,9*0,3»

21 6,8*0,6 0,8*0,2 0,6*0,2

Введение фрагментов ткани печени 2 14,6*0,3 2,00*0,02 2,00*0,03

5 10,06*0,81 1,8*0,04 1,51*0,02

14 9,3*0,2 0,91*0,03» 0,8*0,03»

21 5,2*0,4* 0,69*0,01*4 0,44*0,09*

* - Р<0,05 по сравнению с контрольной группой;

♦ -Р<0,05 по сравнению с внутрибрюшинным введением пептидов из неонатальной печени.

выраженную стимуляцию восстановительных процессов в поврежденной П при использовании пептидов П взрослого животного мы также объясняем тем, что с этими пептидами вводятся пе ростовые факторы, т.е. не факторы митотической активности, а, по-видимому, ингибирующие факторы, поскольку пептидный экстракт из П взрослого животного может содержать эти вещества, в норме не выходящие за пределы клеток.

Подтверждением слабой регуляторной активности или даже ингибиругощей активности пептидов из П взрослого животного могут служить морфологические данные об отсутствии восстановления процессов балочной структуры печеночных долек и сохранении очагов мелкокапельной жировой дистрофии Г в П даже к 21 суткам наблюдения.

При исследовании гистологического материала в группах опытов с коррекцией токсического гепатита пептидными экстрактами из неонатальной П и селезенки мы обратили внимание, что уже через 5 дней после прекращения затравки крыс в междольковой соединительной ткани выявляются обширные очаги лимфогистиоцитарной инфильтрации, что говорит об активации стромальных элементов и их участии в регенераторных процессах.

Следует также отметить, что при сопоставлении регенераторной активности препарата Спленопид и цептидов из неонатальной П по морфологическим и функциональным показателям достоверных различий мы не обнаружили.

Таким образом, исследование возможности лечения ПН с помощью современных биотехнологий путем замещения клеточной терапии на терапию пептидными экстрактами с молекулярной массой более 10 кД показало, что пептиды из ткани селезенки и неонатальной П обладают регуляторной активностью близкой к эффекту использования фрагментов ткани селезенки. Использование пептидов из П взрослого животного было менее эффективным, чем терапия с помощью фрагментов ткани П взрослого животного.

Полученные нами данные открывают возможность для широкого применения регуляторных пептидов из ткани неонатальной П и, особенно из ткани селезенки -промышленно более доступного биоматериала, для повышения эффективности лечения острой и хронической ИН. Регуляторные пептиды могут найти применение в клинике в качестве самостоятельного метода терапии ПН, а также в комбинации с другими методами, такими как афферентные методы детоксикации оргапизма.

ВЫВОДЫ

1. Пептиды, полученные из пеонатальной печени (с молекулярной массой до 27 кД) и селезенки (препарат Снленопид с молекулярной массой до 40 кД) активизируют регенераторную активность поврежденных гепатоцитов, и поэтому применение их может составить основу нового метода терапии печеночной недостаточности с использованием регуляторных пептидов. Пептиды из ткани печени взрослых животных (с молекулярной массой до 12 кД) регуляторпыми свойствами практически не обладают.

2. Для приготовления препаратов биорегуляторных пептидов, стимулирующих восстановительные процессы в печени, следует использовать донорские органы, которые обеспечивают активацию восстановительных процессов не только в паренхиматозных клетках, но в в клетках стромальных структур (клетки макрофагальпо-моноцитариого ряда): ткань селезенки взрослого животного и ткань печени неонаталышх или растущих животных.

3. Печень взрослых животных не пригодпа для получения биорегуляторных пептидов даже после предварительной стимуляции ее в организме донора пептидами селезенки.

4. Развитие токсического гепатита, вызванного курсовым введением четыреххлористого углерода, сопровождается жировой инфильтрацией паренхимы печени и характеризуется постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипортальной зоны к центру.

5. Период прогрессирования печеночной недостаточности у крыс с токсическим гепатитом под влиянием терапии биорегуляторными пептидами (однократное внутрибрюшинное введение препарата Спленопид и пептидов неонатальной печени) сокращается за счет стимуляции не только процессов репаративной регенерации гепатоцитов, но и процессов их адаптации.

6. В развитии процессов адаптации, компенсации и репаративной регенерации печени важная роль принадлежит ядерному аппарату, так как увеличение количества гепатоцитов с внутриядерными лшщдными включениями происходит на фоне снижения интенсивности жировой дистрофии клеток печени.

7. Пептиды селезенки обладают более выраженным регуляторпым влиянием на морфо-функциональное состояние гепатоцитов по сравнению с фрагментами

ткани селезенки, по-видимому, за счет наличия в составе пептидного препарата тех внутриклеточных регуляторных факторов, которые высвобождаются в процессе выделения пептидов. Пептидный экстракт из ткани печени взрослого животного обладает более низкой регуляторпой активностью на морфо-функциояальное состояние гепатоиитов, по-видимому, за счет тех ингибиторпых внутриклеточных факторов, которые высвобождаются в процессе выделения пептидов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pathophysiology of clinical experience with bioartificial liver support systems. XXTV Congress European Society for artificial organs, Budapest, 16-18 Oct, 1997. Co-authors Basieva F., Onischenko N., Pervakova E. et aL

2. Comparative characteristic of efficiency of using cellular and cellular-tissue cultures of xenoliver and other organs for regeneration of the structure and function of damaged liver. Congress European Society for artificial organs, Budapest, 16-18 Oct, 1997. Co-authors Basieva F., Onischenko N., Pervakova E. et al.

3. Liver cell-tissue cultures for restoration of hepatic function. // ХХХШ International congress of pathophysiological sciences. St. Petersburg. June 30 - July 5 1997, p. 193. Co-aulhrs Onischenko N., Basieva F., Pervakova E. et al.

4. Liver assist devise for hepatic failure (clinical experience). // ХХХШ International congress of pathophysiological sciences. St Petersburg. June 30 - July 5 1997, p. 193. Co-authrs Onischenko N., Basieva F., Pervakova E. et al.

5. К механизму восстановления функции пораженной печени с помощью устройств биоискусственной поддержки. // Трансплантология и искусственные органы, 1997, №3-4, стр. 86-91. Соавт. Ояшценко Н.А., Базиева Ф.Х., Первакова Э.И. и др.

6. Гистологические и цитологические изменения в печени крыс, подвергшихся отравлению четыреххлористым углеродом. Феномен образования внутряядерпых включений в генатоцитах. // Трансплантология и искусственные органы, 1998, №2, Соавт. Блюмкин В.Н., Северин В.В., Первакова Э.И., Оншценко Н.А. и др.

7. Использование систем бяоискусствешюй поддержки печени в комплексном лечении гепатоцеребральной дистрофии. И Метод, рекомендации, Москва. Соавт. Оншценко Н.А., Базиева Ф.Х., Первакова Э.И. и др.

8. Возможности регуляции восстановительных процессов в пораженной печени с помощью клеточно-тканевых культур. Тезисы докладов 17 Всероссийского конгресса физиологов, г. Ростов-на-Дону, 14-18 сентября 1998. Соавт. Оншценко Н. А., Базиева Ф.Х., Первакова Э.И. и др.

9. Воссоздание впутрипеченочной и системной регуляции в поврежденной печепи с помощью комбинированных устройств биоискусственной поддержки печени. Тезисы докладов I Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам, г. Москва, 8-10 октября 1998. Соавт. Оншценко Н.А., Базиева Ф.Х., Первакова Э.И. и др.

Разработка новых более эффективных и доступных методов лечения острой и хронической печеночной недостаточности (ПН) по-прежнему остается одной из актуальных проблем современной медицины, так как смертность и нетрудоспособность при заболеваниях печени (П) занимает одно из первых мест и не имеет тенденции к снижению.

По данным ВОЗ за 1994 г. среди причин летальности ПН занимает пятое место в мире среди других патологий и восьмое место среди причин нетрудоспособности. Смертность от острой ПН, сопровождающейся обширным некрозом паренхимы, по-прежнему колеблется от 50 до 70-80% и более (В.И. Шумаков, Н.А. Онищенко, 1994; С.А. Лепехова и др., 1998; Damen, Reesing, 1995). Анализ показателей смертности в России при заболеваниях органов пищеварения за период 1988-1992 гг. показал, что смертность при заболеваниях П занимает второе место среди заболеваний других органов этой системы и из года в год увеличивается (А.И. Хазанов и др., 1996). Клинический опыт показывает, что медикаментозная терапия (Б.П. Солопаев, 1990; О.Ю. Абакумова и др. 1996; А.Г. Глоба и др. 1996; Lieber et al., 1994) и аппаратные эфферентные методы не утратили своего значения при лечении ПН (Л.А. Андрейман, 1988; Н.А. Лопаткин, Ю.М. Лопухин, 1989). Однако этим методам отводится лишь вспомогательная роль при крайне тяжелых поражениях П. В то же время, трансплантация П, которая признана одним из самых эффективных методов лечения необратимо тяжелых поражений П, имеет существенные ограничения для использования в широкой клинической практике, и это связано, главным образом, с возрастающей во всем мире нехваткой донорских органов.

В последние 10-15 лет во всем мире стали разрабатываться новые методы лечения ПН, основанные на применении современных клеточных технологий. Эти новые биотехнологии ставят своей задачей не "лечение" старых тяжело поврежденных клеток в органе, а своевременное их обновление либо путем трансплантации пула изолированных донорских гепатоцитов (Г) (Strom, 1997), либо путем стимуляции собственного резерва регенерации поврежденной П с помощью систем биоискусственной поддержки П (БПП), в экстракорпоральном контуре которых производится культивация донорских Г (М.С. Маргулис и др., 1987; В.И. Шумаков и др., 1990; И.И. Шиманко, С.Г. Мусселиус 1993; В.И. Шумаков, Н.А. Онищенко, 1994; Ю.Н. Лебедева, 1996; Г.И. Строжаков и др., 1997; Н.А. Онищенко и др. 1999; Hoffman et al., 1994; Demetriou et al., 1995; Chen et al., 1996; Patzer et al., 1999). Развитие лечебного эффекта от применения этих новых клеточных технологий связывают (Г.Т. Сухих, 1998; B.C. Репин, 1998; Nakamura et al., 1999) с осуществлением доставки к клеткам поврежденной П необходимого спектра регенерационных факторов, которые продуцируют донорские Г, наделенные высокой митотической активностью (используют Г, выделенные из фетальной, неонатальной П или П молодых доноров).

Между тем, определенные организационные и технологические проблемы, связанные с заготовкой, хранением и применением аллогенных и ксеногенных изолированных Г (ИГ), оказались тормозом на пути внедрения клеточных технологий в широкую клиническую практику. Эти ограничения стимулировали разработку другого, более доступного метода биорегуляции П с помощью факторов пептидной и белковой природы, выделенных из донорской П и других органов, системно с ней связанных (селезенка).

К настоящему времени в литературе уже имеются единичные работы по изучению свойств регуляторных пептидов П телят с молекулярной массой до 10-12 кД (С.В. Оковитный, 1995; В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон, 1996). Между тем, известно (Н.Г. Арцимович и др., 1991), что наиболее выраженной пролиферативной активностью обладают пептиды П с молекулярной массой более 15 кД. Однако пептиды П с такой молекулярной массой для стимуляции восстановительных процессов в П не применялись. В литературе также полностью отсутствуют сведения о возможности более эффективной регуляции восстановительных процессов в П с помощью биологически активных пептидов селезенки - органа, который сам по себе, но особенно в сочетании с донорскими Г, усиливает восстановительные процессы в паренхиме П (Т.Р. Мамхегова, 1998; Э.И. Первакова, 1998). Кроме того, для обоснования эффективности и целесообразности применения регуляторных пептидов для лечения ПН необходим сравнительный анализ результатов применения выделенных тканевых пептидов и методов клеточной терапии. Однако таких исследований проведено не было.

Отсутствие в доступной нам литературе ответов на вопросы, связанных с совершенствованием методов пептидной биорегуляции восстановительных процессов в пораженной П, явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Целью настоящего исследования явилось: обоснование эффективности и целесообразности использования пептидных препаратов из ткани донорской печени и селезенки с молекулярной массой более 10-12 кД для расширения возможностей применения клеточных биотехнологий при лечении печеночной недостаточности.

Для достижения поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать модель для изучения динамики восстановительных процессов в гепатоцитах токсически поврежденной печени при их инкубации в опытах in vitro.

2. Изучить динамику восстановительных процессов в токсически поврежденных гепатоцитах, используя очищенные регуляторные пептиды из ткани нативной печени животных различных возрастных групп и селезенки.

3. Сравнить эффективность регулирующего воздействия на поврежденные гепатоциты питательных сред, содержащих регуляторные пептиды печени и селезенки, а также питательных сред, предварительно кондиционированных фрагментами ткани донорской печени и селезенки (модель клеточной терапии).

4. Сравнить степень активации гранулоцитов (клеток моноцитарно-макрофагальной системы) - стромальных участников регенераторного процесса в паренхиме печени - при использовании сред, содержащих очищенные регуляторные пептиды печени и селезенки.

5. Изучить возможность повышения регуляторной активности пептидов печени взрослых животных путем предварительной стимуляции этих животных пептидами селезенки.

6. В опытах на животных с моделью токсического гепатита изучить особенность стимуляции восстановительных процессов в печени при однократном внутрибрюшинном введении фрагментов ткани печени и селезенки взрослого животного, а также очищенных регуляторных пептидов, выделенных из такого же количества ткани соответствующего органа.

Научная новизна.

Создана модель для изучения в опытах in vitro эффективности различных гуморальных регуляторных воздействий на жизнеспособность и функциональную активность Г поврежденной П в процессе их инкубации. При насыщении среды инкубации регуляторными пептидами путем добавления в нее лиофилизированных очищенных экстрактов тканевых полипептидных комплексов (препарат Спленопид, с молекулярной массой до 40 кД; экстракт неонатальной П с молекулярной массой до 27 кД; экстракт П взрослого животного с молекулярной массой до 12 кД) или путем предварительного кондиционирования ее фрагментами ткани П и селезенки было установлено, что используемые тканевые факторы пролонгируют жизнеспособность и повышают функциональную активность Г, но выраженность этих эффектов у разных биоматериалов различная. Наиболее выраженный регуляторный эффект оказался присущ фрагментам ткани селезенки, препарату Спленопид и пептидам из неонатальной П; у фрагментов ткани П и экстракта пептидов, приготовленных из П взрослых животных, регуляторная активность была слабовыраженной. Было показано, что биорегуляторные пептиды селезенки оказывают стимулирующее воздействие лишь на поврежденные (но не на интактные) Г и при непосредственном контакте с ними. Было подтверждено, что для приготовления экстрактов биорегуляторных пептидов следует использовать органы, клетки которых обладают высокой пролиферативной активностью: ткань селезенки взрослого животного и ткань П неонатальных (или растущих) животных. В опытах на крысах с токсическим гепатитом подтверждено, что введение фрагментов селезенки, а также пептидов из ткани селезенки (Спленопид) и неонатальной П, обеспечивает более выраженную стимуляцию восстановительных процессов в пораженной П. Морфологически активация процессов внутриклеточной регенерации Г выражалась в более быстром снижении количества Г с признаками жировой дистрофии цитоплазмы, в более резком первоначальном снижении и в более быстром темпе последующего восстановления количества двуядерных Г, в более быстром темпе нарастания и снижения количества полиплоидных Г, а также в более быстром темпе повышения и снижения количества Г с внутриядерными липидными включениями. Кроме того, под влиянием регуляторных пептидов наступала выраженная гиперплазия эндоплазматического ретикулума и гипертрофия митохондрий; функционально это выражалось в более быстром темпе восстановления детоксицирующей функции (уровень билирубина) П и более быстром темпе снижения показателей цитолиза (АлАт и АсАт).

Было показано, что полипептидные комплексы оказывают регуляторное воздействие не только на Г, но и на клетки макрофагально-моноцитарного ряда стромы П, которые являются непременными участниками регенераторного процесса в поврежденной П.

Было высказано предположение, что стимуляция восстановительных процессов в токсически поврежденной П наступает в результате не только митогенетического, но и трофического влияния регуляторных пептидов селезенки и неонатальной П на процессы внутриклеточной регенерации Г.

Практическая значимость работы:

Предложена модель инкубации Г, выделенных из поврежденной П, для изучения гуморальной регуляции восстановительных процессов в них путем подбора адекватных корригирующих факторов. Показано, что для стимуляции процессов регенерации паренхимы П наряду с имплантацией клеток П и селезенки целесообразно осуществлять введение в организм очищенных полипептидных комплексов, полученных из тканей тех же органов. Показано, что, используя пептидные экстракты с молекулярной массой более 10 кД (Спленопид - до 40 кД, пептиды неонатальной П - до 27 кД), можно достигнуть эффекта биорегуляции, аналогичного воздействию трансплантированных клеточных взвесей (фрагменты ткани селезенки и П).

Показано, что пептидные комплексы, полученные из органов с высокой пролиферативной активностью (селезенка, неонатальная П), представляют собой наилучший биоматериал для выделения пептидов с высокой биорегулирующей активностью. Установлено, что П взрослых животных не следует использовать для выделения регуляторных пептидов, так как П взрослых животных имеет крайне низкий уровень митотической активности митотической пролиферации и митотической полиплоидизации) и низкий уровень продукции ростовых факторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Полипептидные экстракты из ткани неонатальной П и селезенки взрослых животных (препарат Спленопид), подобно фрагментам ткани селезенки, обладают способностью к стимуляции восстановительных процессов в поврежденной П. Пептиды, выделенные из П взрослых животных, такими свойствами не обладают.

- Для приготовления препаратов с высокой биорегуляторной активностью должны использоваться ткани селезенки и неонатальной П, которые стимулируют восстановительные процессы в Г, а также активизируют клетки макрофагально-моноцитарного ряда, инфильтрирующих строму П при повреждении.

- П взрослых животных не пригодна для получения активных биорегуляторных пептидов даже после предварительного воздействия на нее пептидов селезенки (препарат Спленопид).

Пептиды с высокой биорегуляторной активностью сокращают период прогрессирования ПН за счет ускорения адаптации, а также стимуляции процессов репаративной регенерации Г.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на XXXIII Международном Конгрессе по физиологическим наукам (г. Санкт-Петербург, 1997); на XXIII Европейском Конгрессе по искусственным органам (г. Варшава, 1996); на XXIV Европейском Конгрессе по искусственным органам (г. Будапешт, 1997); на 218 заседании общества трансплантологов г. Москвы и Московской области, ноябрь 1997; на 17 Всероссийском конгрессе физиологов (г. Ростов-на-Дону, сентябрь 1998).

Публикации

Материалы выполненных исследований отражены в 8 публикациях и 1 методических рекомендациях.

ВЫВОДЫ

1. Пептиды, полученные из неонатальной П (с молекулярной массой до 27 кД) и селезенки (препарат Спленопид с молекулярной массой до 40 кД) активизируют регенераторную активность поврежденных Г, и поэтому применение их может составить основу нового метода терапии ПН с использованием регуляторных пептидов. Пептиды из ткани П взрослых животных (с молекулярной массой до 12 кД) регуляторными свойствами практически не обладают.

2. Для приготовления препаратов биорегуляторных пептидов, стимулирующих восстановительные процессы в П, следует использовать донорские органы, которые обеспечивают активацию восстановительных процессов не только в паренхиматозных клетках, но и в клетках стромальных структур (клетки макрофагально-моноцитарного ряда): ткань селезенки взрослого животного и ткань П неонатальных или растущих животных.

3. П взрослых животных не пригодна для получения биорегуляторных пептидов даже после предварительной стимуляции ее в организме донора пептидами селезенки.

4. Развитие токсического гепатита, вызванного курсовым введением четыреххлористого углерода, сопровождается жировой инфильтрацией паренхимы П и характеризуется постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипортальной зоны к центру.

5. Период прогрессирования ПН у крыс с токсическим гепатитом под влиянием терапии биорегуляторными пептидами (однократное внутрибрюшинное введение препарата Спленопид и пептидов неонатальной П) сокращается за счет стимуляции не только процессов репаративной регенерации Г, но и процессов их адаптации.

6. В развитии процессов адаптации, компенсации и репаративной регенерации П важная роль принадлежит ядерному аппарату, так как увеличение количества Г с внутриядерными липидными включениями происходит на фоне снижения интенсивности жировой дистрофии клеток П.

7. Пептиды селезенки обладают более выраженным регуляторным влиянием на морфо-функциональное состояние Г по сравнению с фрагментами ткани селезенки, по-видимому, за счет наличия в составе пептидного препарата тех внутриклеточных регуляторных факторов, которые высвобождаются в процессе выделения пептидов. Пептидный экстракт из ткани П взрослого животного обладает более низкой регуляторной активностью на морфо-функциональное состояние Г, по-видимому, за счет тех ингибиторных внутриклеточных факторов, которые высвобождаются в процессе выделения пептидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование было проведено с целью совершенствования эффективности лечения ПН с помощью современных биотехнологий. Это потребовало от нас проведения сопоставления биорегуляторной активности пептидов неонатальной П и П взрослых животных и пептидов селезенки с регуляторной активностью фрагментов ткани П и селезенки взрослых животных. Влияние клеточной и пептидной терапии на процессы репаративной регенерации П оценивали по показателям структурной целостности и функциональной активности Г в опытах in vitro и в опытах in vivo на модели токсического гепатита крыс.

Сопоставляя биорегуляторную активность регуляторных пептидов с активностью фрагментов ткани П и селезенки, мы установили, что пептиды селезенки и неонатальной П обладают биорегуляторной активностью сходной по эффективности с активностью фрагментов ткани селезенки. Регулирующая активность пептидов П взрослых животных значительно уступает эффективности действия фрагментов ткани П.

Эти результаты позволили нам придти к заключению, что П взрослых животных не может использоваться для приготовления регуляторных пептидов. Она не пригодна для приготовления пептидных препаратов даже после ее предварительной стимуляции биорегуляторными пептидами (препарат Спленопид).

Источниками получения регуляторных пептидов для стимуляции регенераторных процессов в поврежденной П могут служить ткань селезенки взрослых животных и ткань П неонатальных и растущих животных.

Модельные опыты in vitro и in vivo позволили нам заключить, что репаративные процессы в поврежденной П происходят за счет стимуляции восстановления морфо-функциональных характеристик и пролиферативной активности Г, а так же за счет активации клеток макрофагально-моноцитарного ряда, инфильтрирующих строму П (НСТ-тест), с помощью регуляторных пептидов с молекулярной массой более 10 кД (препарат Спленопид содержит спектр белков с молекулярной массой до 40 кД, пептидный экстракт из неонатальной П - до 27 кД).

Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что биорегуляторные пептиды из ткани неонатальной П и селезенки могут служить альтернативой проведения клеточной терапии ПН с помощью фрагментов ткани П и селезенки. Промышленное выделение регуляторных пептидов позволит устранить недостатки и ограничения, возникающие при использовании методов клеточной терапии, и обеспечит широкое внедрение в клиническую практику метода терапии ПН биорегуляторными пептидами.