Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Влияние стресса на метаболические процессы в пульпе зуба

На правах рукописи

/

УДК: 616.314.18-092.9:577.121

ОСТРОВСКАЯ ИРИНА ГЕННАДЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В

ПУЛЬПЕ ЗУБА (экспериментальное исследование)

14.00.21 - «Стоматология» 03.00.04 - «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003450935

' Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ». Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Митронин Александр Валентинович Доктор медицинских наук, профессор Вавилова Татьяна Павловна Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Максимовская Людмила Николаевна

ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ

Доктор биологических наук, профессор Сазонтова Татьяна Геннадьевна

Московский государственный университет им. Ломоносова

Ведущая организация: ФГУ Институт повышения квалификаци

Федерального Медико-биологического агентства

Защита состоится « 008 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет

Минздравсоцразвития РФ» по адресу: 127206, г. Москва, Долгоруковская ул., д.4; почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ» (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан « "$^/£¿¿¿¿¿^^2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

МА Зотеина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Большинство стоматологов в своей практике уделяют особое внимание стрессорным воздействиям, которые на сегодняшний день играют центральную роль в патогенезе заболеваний зубочелюстной системы.

Клинические наблюдения за людьми, работающими в экстремальных условиях или определенных зонах риска, в том числе за полярниками антарктических экспедиций, моряками дальнего плавания, авиаторами и другим контингентом, показали, что кариозные и некариозные поражения зубов, деструктивные изменения в тканях пародонта встречаются у них в два раза чаще по сравнению с людьми, работающими в обычных условиях (Ярошенко А.И., Голубев В .Г, 1973; Manhold J.N., 1979; Viltsek Е., 1978; Сирота Г.И. с соавт., 1989; Федоров Ю.А., Дрожжина В.А., 1997; Тарасенко Л.М., 2002; Hand G.A. et al., 2003; Краснова В.В., 2005; Белоклицкая Г.Ф., 2007; Соловьева - Савоярова Г.Е., 2008).

Установлено, что стрессорные стимулы влияют на устойчивость к болезням путём одновременной активации всех сигналов, исходящих из центральной нервной системы, что осуществляется сетью сложных ответов эндокринной и иммунной систем (Судаков К.В., 1996; Melmed S., 2001). Стресс является, прежде всего, адаптивной реакцией и способствует восстановлению гомеостаза, но при длительном его протекании он может вызывать метаболические изменения во всех тканях организма, активировать свободнорадикальные процессы, что приводит к нарушению структуры и функции клеток (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Девяткина Т.А., 1990; Горецкий О.С. с соавт., 1992; Sternberg Е.М., et al., 1992; McEwen B.S., 1998; Илюха B.A., 2003).

л / t *

Действие стресс-факторов на ткани полости рта исследователи чаще связывают с изменениями количественного и качественного состава белков смешанной слюны, что способствует, по их мнению, деминерализации твердых тканей зубов (Кузнецов ПЛ., 2000; Кузьмина Э.М. с соавт., 2001; Тарасенко Л.М. с соавт., 2002). Однако, причины декальцинации твёрдых тканей зубов могут быть связаны как с угнетением защитных свойств слюны, так и с функциональным состоянием клеток пульпы зуба, обеспечивающих трофику твёрдых тканей.

Влияние эмоционально- холодовых нагрузок на пульпу зуба не изучено, поэтому настоящее исследование является актуальным не только для теоретической, но и практической стоматологии. Цель настоящего исследования:

Оценить в эксперименте влияние эмоционально-холодового стресса различной продолжительности на метаболические процессы в пульпе зуба и выявить реакцию пульпы на применение стресспротекторов растительного происхождения. Задачи исследования:

1. Изучить активность ферментов лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и щелочной фосфатазы локализованных в различных органеллах клеток пульпы зубов крыс, определить содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой при остром и хроническом эмоционально-холодовом стрессе.

2. Определить уровень отдельных белков - эндотелина-1, интерлейкинов -1|3 и -6, аннексина V, растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия, а-дефензинов и фактора некроза опухоли - а в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности.

3. На основании полученных данных охарактеризовать энергетический обмен, состояние системы антиоксидантная защита - перекисное окисление

липидов, фосфорно-кальциевый обмен и сосудистую реакцию пульпы зубов крыс, подвергшихся эмоционально-холодовому стрессу.

4. Сопоставить метаболические изменения в пульпе зубов крыс при краткосрочном и длительном эмоционально-холодовом стрессе.

5. Исследовать изменения в активности ферментов пульпы зубов крыс при стрессе в условиях ингибирования синтеза карнитина.

6. Выявить реакцию пульпы зуба в ответ на введение стресспротекторов при эмоционально-холодовом стрессе.

Научная новизна

Впервые в эксперименте выявлены сдвиги в метаболических процессах в пульпе зубов крыс, находящихся в состоянии острого и хронического стресса.

Впервые в пульпе зубов крыс использованы методы определения аннексина V, а-дефензинов и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой.

Впервые предложена гипотеза возможного механизма нарушения целостности твёрдых тканей зуба, обусловленного изменением трофики пульпы зуба в ответ на стресс. Впервые для оценки фосфорно-кальциевого обмена в пульпе зуба было применено определение содержания аннексина V.

Впервые исследована реакция пульпы на стресс в условиях введения стресспротекторных фитопрепаратов и показана роль |3-окисления жирных кислот в пульпе зубов в развитии стресс - реакции. Практическая значимость работы

Холодовой психоэмоциональный стресс, которому подвергался организм крыс, вызывает реакцию со стороны клеток пульпы зуба. Экспериментальные исследования показали, что применение фитопрепаратов на длительных сроках стресса оказывает положительный эффект на метаболизм клеток пульпы зубов крыс, а введение ингибитора синтеза карнитина, напротив, негативно сказывается на их течении.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клетки пульпы зубов крыс реагируют на эмоционально - эмоционально-холодовой стресс различной продолжительности, которому подвергается организм животного, что выражается в изменении их метаболизма.

2. Ингибирование транспорта жирных кислот в матрикс митохондрий при эмоционально-холодовом стрессе негативно влияет на обменные процессы в пульпе зубов крыс и активирует свободно-радикальное окисление.

3. Введение стресспротекторных фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» оказывает положительный эффект на течение метаболических процессов в клетках пульпы зуба при стрессе.

Внедрение результатов исследования

Полученные данные использованы в лекционном курсе кафедр факультетской терапевтической стоматологии, биохимии, нормальной физиологии МГМСУ. Личный вклад

Автором лично выполнена экспериментальная работа на 230 беспородных белых крысах. В ходе сбора и исследования материала соискателем освоены и использованы современные биохимические методы: иммуноферментный анализ и спектрофотометрия. Полученные результаты статистически обработаны и представлены в виде таблиц и графиков. Апробация работы

Результаты исследования докладывались на 54-ой итоговой студенческой научной конференции МГМСУ с международным участием (Москва, 2005), научно-практической конференции МГМСУ «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Москва, 2007), на 8-ом Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», РУДН (Москва, 2007), на межкафедральном заседании кафедр факультетской

терапевтической стоматологии, нормальной физиологии, биохимии

МГМСУ, октябрь 2008 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 монография и 4 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Объём и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 237 источников, из них 72 отечественных и 165 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 4 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В эксперименте было использовано 230 беспородных крыс-самцов весом 250-300 г., содержавшихся на стандартном рационе вивария.

Было проведено три серии опытов. Первая экспериментальная серия была разделена на три подгруппы, в зависимости от сроков холодового воздействия. Для моделирования эмоционально-холодового стресса крыс погружали в ванну с холодной (1=4°С) водой на 10 минут. Острый стресс вызывали путём однократного погружения крыс в воду с их последующей декапитацией через 15 минут. Животным 4-х и 30-ти дневных серий опыта количество погружений соответствовало срокам длительности стресса. Контролем для этой группы служили интактные животные, не подвергавшиеся холодовому воздействию.

Во второй серии опытов крыс подвергали стрессовому воздействию по той же схеме, что и в первой серии опыта, но за 30 минут до погружения в

холодную воду каждой крысе внутримышечно в заднюю лапу вводили по 0,15 мл 0,5%-ного раствора синтетического ингибитора у-бутиробетаингидроксилазы (у-ББГ), блокирующего синтез карнитина. В качестве плацебо крысам второй опытной группы вводили равный объем 0,9%-ного раствора ЫаС1.

В третьей серии опытов крысам после эмоционально-холодового стресса в пищевод через зонд с помощью шприца вводили цитопротекторные фитопрепараты на основе растительного сырья - «Болюсы Хуато» в дозе 4,6 г. на 1 кг веса животного и «Коронатера» в дозе 2,8 г. на 1 кг. В качестве плацебо животным вводили 1 мл дистиллированной воды. Крыс контрольной группы (п=20) не подвергали стрессовому воздействию и не вводили препараты. Длительность стрессового воздействия составила 4 и 30 дней. Лабораторные методы исследования

После декапитации под эфирным наркозом у крыс всех экспериментальных групп из верхних и нижних резцов извлекали пульпу и гомогенизировали в фарфоровой ступке на холоду, с добавлением 0,5 М раствора трис-НС1 буфера (рН=7,3). Гомогенат центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. В полученной надосадочной жидкости спектрофотометрически определяли активность супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), лактатдегидрогеназы (ДДГ) и

малатдегидрогеназы (МДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), а также содержание ТБК- активных продуктов (ТБК-АП). Активность ферментов СОД, ЛДГ, ГПО, ЩФ выражали в мкмоль/минт ткани, а МДГ в ммоль/минт ткани, содержание ТБК-АП в мкмоль/ г ткани. В супернатанте пульпы зуба иммуноферментным методом определяли содержание белков: эндотелина-1 (фг/мг ткани), интерлейкинов-1 ¡3 и -6, аннексина V (пг/мг ткани), растворимого белка сосудистого фактора адгезии-1, фактора некроза опухолей-а, а-дефензинов (нг/мг ткани). Уровень стресса определяли по содержанию кортизола (нг/мл),

глюкозы (мг/л) в плазме крови, и образованию язв на стенках желудка путём визуального осмотра под бинокулярной лупой.

Выраженность стресс-реакции также оценивали также при помощи теста вынужденного плавания по Порсолту (Рогвок И..О. е1 а1., 1978), по изменениям температуры тела и вегетативных параметров (количеству болюсов дефекации). Длительность теста составляла 10 мин, в течение которых регистрировалось поведение животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оценка стресс реакций у крыс, подвергнутых эмоциоиально-холодовому

стрессу

Состояние симпатоадреналовой системы мы оценивали с помощью определения содержания кортизола и глюкозы в плазме крови крыс, подвергшихся эмоционально-холодовому стрессу различной продолжительности. Содержание кортизола и глюкозы в крови крыс, подвергнутых стрессу изменялось незначительно и недостоверно (р>0,1).

При вскрытии животных в первые сутки опыта на стенках желудка визуально определялось незначительное количество точечных кровоизлияний. К 4-му дню эксперимента у животных опытных групп на стенках желудка отмечались обширные точечные кровоизлияния, занимавшие значительную часть обследуемой площади, а на 30-ый день на поверхности слизистой были видны мелкие рубцовые тяжи. Вегетативные реакции и тест по Порсолту достоверно указывали на развитие стресс-реакции.

Полученные нами результаты свидетельствуют о незначительной выраженности эмоционально-холодового стресса, вызванного холодовой иммерсией на 10 мин. Явлений, характерных для стадии истощения, мы не наблюдали, что соответствовало общему состоянию животных.

Влияние эмоционально-холодового стресса на окислительно-

восстановительные процессы в пульпе зубов крыс Для оценки интенсивности аэробных и анаэробных процессов на фоне стресса мы определяли активность ЛДГ - фермента, кататализирующего

последнюю реакцию гликолиза, и МДГ - фермента, участвующего в а:

50 * 40

I

га

I 30

I

1 20

I 1 10 г

0

Рис. 1.1. Активность ЛДГ и МДГ в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности

На фоне острого стресса нами было отмечено достоверное повышение (р<0,05) активности ЛДГ и МДГ в пульпе зубов опытных крыс по сравнению с интактными животными. Таким образом, при остром стрессе происходит мобилизация всех энергетических ресурсов, сопряжённая в первую очередь с интенсивным потреблением клетками кислорода. На 4-ый день эксперимента активность ЛДГ повышалась в 4 раза, а активность МДГ снижалась в 2,8 раз по сравнению с контролем, что свидетельствует о частичном переключении аэробных процессов на анаэробные. На фоне длительного стресса, продолжающегося в течение 30 дней - активность ЛДГ остаётся повышенной (р<0,05) по сравнению с контролем и острым стрессом (р>0,05), но достоверно ниже по отношению к 4-му дню опыта (р<0,01), а активность МДГ остаётся сниженной по сравнению с острым стрессом и контролем (р<0,01), но повышенной по сравнению с 4-ым днём стрессорного воздействия (р<0,05). Возможно, это связано со спазмом сосудов пульпы зубов крыс на фоне эмоционально-холодового стресса, вследствие чего, из-за кислородного голодания клетки пульпы вынуждены компенсировать энергодефицит за счёт реакций субстратного фосфорилирования, активно протекающих в гликолизе.

и

Влияние эмоционально-холодового стресса на процессы свободно-радикального окисления в пульпе зубов крыс

При исследовании активности ферментов антиоксидантной защиты СОД и ГПО, в пульпе зубов крыс примененным нами методом не обнаружена активность ГПО. Под влиянием острого стресса активность СОД имела тенденцию к повышению (р>0,05), а к 4-му дню это повышение становилось достоверным (р<0,01) по сравнению со значениями контрольной группы. К 30-му дню эксперимента в пульпе зубов крыс происходило снижение активности СОД (р<0,05) по отношению к 4-му дню опыта, но она оставалась достоверно повышенной по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

СОД ТБК-АП

острый 4 дня 30 дней

Рис. 1.3. Активность СОД и содержание ТБК-АП в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности

Интенсивность свободно-радикальных процессов в пульпе зубов крыс мы оценивали по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП). При остром стрессе содержание ТБК-АП не менялась (р>0,1), но достоверно снижалась (р<0,05) к 4-му дню. К 30 дню выявлялось достоверное увеличение содержания ТБК-АП (р<0,05) по сравнению с интактными животными и опытными группами острого и 4-х дневного стресса.

Исследование содержания цитокинов в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе

Полученные результаты показали, что в пульпе зубов интактных крыс количество ИЛ-1(3 в 2 раза превышает содержание ИЛ-6. При остром стрессе наблюдалась тенденция к увеличению (р>0,05) количества ИЛ-1(3 и незначительное повышение (на 12,1%) содержания ИЛ-6.

ИЛ-1В ил.6

ФНО-а

острый 4 дня 30 дней

Рис. 1.4. Содержание ИЛ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности

К 4 дню эксперимента имелась тенденция к снижению количества ИЛ-1р по отношению к значениям, полученным при остром стрессе, при этом количество ИЛ-6 возрастало почти в 3 раза (р<0,001). К 30-му дню эмоционально-холодового стресса количество ИЛ-1(3 продолжало снижаться, а

количество ИЛ-6 сохранялось повышенным, но было ниже, чем при 4-х дневном стрессе.

Во все сроки эксперимента имелось достоверное (р<0,05) уменьшение содержания ФНО-а по отношению к значениям в контрольной группе и отсутствовали существенные отличия между опытными группами (р>0,1).

Исследование содержания белков сосудистого эндотелия в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе О реакции сосудистого эндотелия на стресс мы судили по количественному содержанию эндотелина (ЭТ-1) и растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия (зУСАМ-1). В наших исследованиях мы не выявили содержание бУСАМ-!, как в пульпе зубов интактных крыс, так и у опытных животных. Содержание ЭТ-1 в пульпе зубов крыс, подвергнутых острому стрессу, достоверно повышалось (р<0,05) по сравнению со значениями контрольной группы, а на 4-ый день определялась лишь тенденция к повышению (р>0,1). На фоне длительного стресса содержание ЭТ-1 достоверно (р<0,05) понижалось как по сравнению с интактными крысами, так и при сопоставлении с более короткими сроками стрессорного воздействия.

ЕТ-1 а-дефензины

острый 4 дня 30 дней острый 4 дня 30 дней

Рис. 1.5. Содержание ЕТ-1 и а-дефензинов в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности

Реакция эндотелия тесно связана с миграцией лейкоцитов. Исследователями отмечено, что на фоне стресса возрастает лейкоцитарная

активность (O'Connor Т.М., et al., 2000). Поэтому исследование содержания белков, отражающих накопление этих клеток в сосудистом русле, может являться важным прогностическим критерием реакционной способности сосудов пульпы зуба в ответ на стресс.

При исследовании содержания а-дефензинов, которые синтезируются нейтрофилами, нами был отмечен недостоверный рост (р>0,5) количества этого белка на фоне острого и 4-х дневного стресса. На 30-ый день опыта содержание а-дефензинов достоверно возрастало в 2,5 раза по сравнению со значениями, полученных у интактных животных и в 1,5 раза по отношению количества этих белков у животных, подвергнутых острому и 4-х дневному стрессу (р<0,01).

Исследование в пульпе зубов крыс белков, участвующих в фоефорно-

кальциевом обмене

Трофическая функция пульпы зубов определяется транспортом кальция и фосфатов из одонтобластов в зону предентина. В связывании ионов кальция в клетках участвует аннексии V.

ЩФ

Аннексии V

острый 4 дня 30 дней

острый 4 дня 30 дней

Рис. 1.6. Содержание аннексина V и активность щелочной фосфатазы в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности

Согласно нашим данным, острый и 4-х дневный стресс вызывали достоверное повышение (р<0,05) содержания аннексина V в пульпе зубов крыс, а длительный 30-ти дневный стресс, напротив, снижение (р<0,05) как по

отношению к показателям контрольных животных, так и опытных, подвергнутых более короткому времени стрессорного воздействия.

Процессы минерализации происходят и при участии щелочной фосфатазы. Данный фермент отщепляет фосфатные группы от других органических соединений, благодаря чему увеличивается локальная концентрация фосфатов (Пикалюк B.C., Мостовой С.О., 2006), и значительное увеличение активности ЩФ наблюдается в период дентиногенеза. Наши данные показали, что активность щелочной фосфатазы в пульпе зубов крыс при остром стрессе практически не отличалась от данных в контрольной группе (р>0,1), а к 4-му и 30-му дню определялось достоверное снижение активности исследованного фермента в 2-3 раза по сравнению с интактными животными и показателями острого стресса (р<0,001).

Таким образом, полученные нами данные показали, что эмоционально-холодовой стресс оказывает значительное влияние на метаболические процессы в пульпе зубов крыс, что отражается изменениями в количественном содержании исследованных белков и активности ферментов.

Исследование метаболических процессов в пульпе зубов крыс, подвергнутых эмоционально-холодовому стрессу на фоне введения

ингибитора у-ББГ Согласно проведённым ранее исследованиям, при гипоксических состояниях в целях уменьшения потребления клетками кислорода для экономии энергии рекомендуется блокировать митохондриальное |3-окисление жирных кислот.

В наших опытах введение на фоне стресса ингибитора у-ББГ, угнетающего синтез карнитина, приводит к ещё большей активации гликолиза, о чём свидетельствует достоверно (р<0,05; р<0,001) возрастающая во все дни эксперимента активность ЛДГ. Наибольший пик активности ДДГ в пульпе зубов крыс на фоне введения ингибитора у-ББГ отмечен на 4-ый день эксперимента (рис. 1.7). Активность этого энзима была в 8 раз выше по

сравнению с интактными животными (р<0,001) и в 2,7 раз по сравнению с животными, получавшими инъекции физиологического раствора (р<0,05) и в 3,5 раза со значениями опытных крыс краткосрочного (р<0,05) и 30-ти дневного эксперимента (р<0,01). Следует отметить, что к 30-му дню стрессорного воздействия на фоне введения ингибитора у-ББГ активность ЛДГ в пульпе зубов крыс приближается к таковым на фоне острого стресса (р>0,05).

а контроль □ Стресс+ р-р N301 ЩСтресс+ингибитор

100

| 80

- 60

X

з:

£

1 40

0

%

1 20-Г

0

острый 4 дня 30 дней

Рис. 1.7. Активность ЛДГ в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением ингибитора у-ББГ

У крыс на фоне острого стресса при введении у-ББГ отмечено недостоверное (р>0,5) повышение МДГ по сравнению с интактными крысами и снижение по отношению к крысам, получавших инъекции 0,9% раствора ЫаС1.

@контроль □ Стресс+ р-р ЫаС1 ШСтресс +ингибитор

острый

4 дня

30 дней

Рис. 1.8. Активность МДГ в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением ингибитора у-ББГ

К 4-му дню эксперимента имеется достоверное снижение (р<0,05) активности МДГ в пульпе зубов опытных крыс при введении ингибитора у-ББГ, которая сопоставима с значениями в группах крыс, получавших инъекции физраствора (р>0,1). К 30-му дню, активность МДГ достоверно увеличивалась (р<0,001) по сравнению с интактными крысами и с животными, получавших инъекции 0,9% раствора NaCl..

Эти данные показывают, что энергетическое обеспечение пульпы зубов при ингибировании транспорта жирных кислот в матрикс митохондрий к 30-му дню опыта осуществляется преимущественно за счёт аэробного распада глюкозы.

Нарушение транспорта жирных кислот, по-видимому, сопровождается изменениями в утилизации кислорода митохондриями клеток и накоплением активных форм кислорода вне митохондрий, что сопровождается образованием большого числа гидроперекисей, о чём свидетельствует достоверно (р<0,05) высокая активность СОД во все дни эксперимента при введении ингибитора у-ББГ.

острый 4 дня 30 дней

Рис. 1.9. Активность СОД в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением ингибитора у-ББГ

Сопоставление активности СОД между опытными животными в различные сроки холодового воздействия на фоне введения ингибитора у-ББГ не выявило достоверных отличий (р>0,05).

На фоне введения ингибитора у- ББГ на 4-ый и 30-ый дни эксперимента повышалось содержание ТБК-АП в пульпе зубов крыс, и наибольшее увеличение конечных продуктов перекисного окисления липидов определялось к 30 дню опыта.

0 контроль □ Стресс+р-р ЫаС1 Е! Стресс+ингибитор

острый

4 дня

30 дней

Рис. 1.10. Содержание ТБК-АП в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением ингибитора у-ББГ

По полученным нами данным, ингибирование синтеза карнитина, участвующего в транспорте жирных кислот в матрикс митохондрий для последующего р-окисления при стрессе приводит к активации свободнорадикального окисления, что негативно сказывается на состоянии метаболических процессов в пульпе зубов крыс.

Исследование влияния фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» на обменные процессы в пульпе зубов крыс, подвергнутых эмоционально-холодовому стрессу

Оценка состояния обменных процессов в пульпе зубов крыс, подвергнутых эмоционально-холодовому воздействию показала значительные изменения в активности оксидоредуктаз и содержании отдельных регуляторных белков при длительном стрессе. Поэтому, для возможной нормализации метаболизма в пульпе зуба, нами вводились фитопрепараты «Болюсы Хуато» и «Коронатера». Единственный недостаток этих препаратов -это замедленное действие во времени, поэтому в наших экспериментах для

оценки их влияния на организм крыс не был выбран краткосрочный (острый) стресс.

Введение крысам обоих фитопрепаратов в течение 4-х дней на фоне холодовой иммерсии приводило к недостоверному (р>0,05) повышению активности ЛДГ в пульпе зубов по сравнению с контролем, но оно было достоверно ниже (р<0,001) по отношению к значениям, полученным при стрессе (рис. 1.11).

В контроль □ стресс+вода 0 стресс+"Болюсы Хуато" Б стресс+"Коронатера"

4 дня 30 дней

Рис. 1.11. Активность ЛДГ в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением фитопрепаратов «Болюсов Хуато» и «Коронатера»

На 30-ый день опыта значения активности ЛДГ, у животных, получавших фитопрепараты, приближались к данным контрольной группы.

Шконтроль □стресс+вода Шстресс+"Болюсы Хуато" £3 стресс+"Коронатера"

4 дня

30 дней

Рис. 1.12. Активность МДГ в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением фитопрепаратов «Болюсов Хуато» и «Коронатера».

На фоне незначительного повышения ЛДГ к 4-му дню опыта в пульпе зубов крыс при введении как препаратов «Болюсы Хуато», так и «Коронатера» активность МДГ при стрессе достоверно не менялась по отношению к контролю и была достоверно выше по сравнению с активностью этого фермента, определяемого только при стрессе. На 30-ый день эксперимента активность МДГ в пульпе зубов крыс, получавших фитопрепараты, возрастала вдвое по сравнению с животными, подвергнутых только стрессу и незначительно была выше по сравнению с показателями активности этого энзима в пульпе зубов интактных животных.

На 4-ый день опыта у животных, получающих препараты «Болюсы Хуато» и «Коронатера» при стрессорной нагрузке выявлено недостоверное (р>0,05) повышение активности СОД по сравнению с значениями в контрольной группе, но она была достоверно ниже (р<0,001) по сравнению с крысами, подвергнутых только стрессу (рис. 1.13).

Рис. 1.13. Активность СОД в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением фитопрепаратов «Болюсов Хуато» и «Коронатера».

На 30-ый день эксперимента введение фитопрепаратов также приводило к снижению активности СОД, которая была сопоставима с активностями в пульпе зубов интактных крыс. Это действие было более выражено у крыс, получавших препарат «Коронатера».

30

Шконтроль □ стресе+вода ЕЗстресс+'Ъолюсы Хуато' И стресс+"Коронатера"

4 дня

30 дней

Содержание ТБК-АП в пульпе зубов крыс при введении фитопрепаратов также меняется неоднозначно. На 4-ый день опыта их количество достоверно снижалось по сравнению с контролем и не отличалось от содержания ТБК-АП, определяемого только при стрессе, то есть это понижение не зависело от введения обоих фитопрепаратов (рис. 1.14).

К 30-му дню на фоне введения фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» крысам, подвергнутых эмоционально-эмоционально-холодовому стрессу, количество ТБК-АП приближалось к содержанию определяемого в контрольной группе (р>0,1), но было недостоверно ниже (р>0,05) по отношению к значениям, полученным у крыс, подвергнутых только стрессу и получавших воду.

4 дня 30 дней

Рис. 1.14. Содержание ТБК-АП в пульпе зубов крыс на разных сроках эмоционально-холодового стресса с введением фитопрепаратов «Болюсов Хуато» и «Коронатера».

Таким образом, согласно полученным нами результатам, применение растительных препаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» способствует нормализации окислительно-восстановительных процессов в пульпе зубов крыс на длительных сроках эксперимента, что выражается в отсутствии существенных отличий изучаемой ферментативной активности при сопоставлении с группами контрольных животных.

ВЫВОДЫ

1. На фоне эмоционально-холодового стресса в пульпе зубов крыс меняется активность окислительно-восстановительных ферментов, что отражает активацию анаэробных и аэробных процессов на ранних стадиях стресс-реакции. К 30-му дню на фоне адаптации к стрессу происходит восстановление значений их активности до исходного уровня.

2. Во все сроки эмоционально-холодового стресса в пульпе зубов крыс определяется высокая активность супероксиддисмутазы и отсутствует активность глутатионпероксидазы. Содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, возрастает к 30-му дню эксперимента. Эти изменения свидетельствуют об активации свободно-радикального окисления.

3. Длительный эмоционально-холодовой стресс влияет на фосфорно-кальциевый обмен в пульпе зубов крыс, что выражается снижением в 3 раза активности щелочной фосфатазы и уменьшением в 2 раза содержания аннексина V.

4. В процессе развития адаптации к стрессу в пульпе зубов опытных крыс не выявлено присутствие растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия, но реакция сосудов пульпы проявляется в виде снижения содержания интерлейкина-1 (3, эндотелина-1, фактора некроза опухоли-а, с одновременным накоплением большого количества а-дефензинов и повышением количества интерлейкина-6.

5. Ингибирование синтеза карнитина в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе приводит к усилению процессов свободно-радикального окисления, по сравнению с животными, подвергнутых только стрессу.

6. Введение фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» на фоне длительного эмоционально-эмоционально-холодового стресса поддерживает активность лактатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы и

количество продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой

кислотой на уровне значений, определяемых у интактных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У пациентов, с генерализованными деструктивными изменениями твёрдых тканей зубов, необходимо включать в сбор анамнеза оценку условий жизни связанных с экстремальными воздействиями. Следует учитывать, что при стрессе в пульпе зуба страдает энергетический обмен, активируется свободно-радикальное окисление и нарушается минеральный обмен.

2. При длительном стрессе, для предотвращения сдвигов в метаболизме клеток пульпы, целесообразно принимать стресспротективные препараты, в частности фитопрепараты «Болюсы Хуато» и «Коронатера».

3. В случае воздействия стрессорных факторов не следует вводить препараты, блокирующие синтез карнитина, участвующего в транспорте жирных кислот в матрикс митохондрий для последующего р-окисления, так как при этом активируется свободно-радикальное окисление в клетках пульпы.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 монография и 4 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

1. Островская И.Г., Маджидова Е.Р., Александрова O.A. «Влияние стресса на

активность ферментов в пульпе зубов крыс» // 54-я итоговая студенческая научная конференция с международным участием, М., 2005. - С. 38-38

2. Островская И.Г., Гаверова Ю.Г., Вавилова Т.П. «Влияние стресса на

иммунный статус пульпы зубов крыс» //Ж. Аллергология и иммунология. - 2006. - Том 7, №3. - с. 267-267 .

3. Островская И.Г., Гаверова Ю.Г. Содержание иммуноглобулинов в пульпе

зуба при стрессе. //Сборник трудов XXIX итоговой конференции Общества молодых учёных МГМСУ. Под общей редакцией з.д.н. РФ профессора И.Ю. Лебеденко. Москва: МГМСУ, 2007. - С. 301-302

4. Вавилова Т.П., Гаверова Ю.Г., Островская И.Г., Савинова Е.А. Реакция

пульпы зуба на хроническое охлаждение. //Ж. Морфология. - 2007. -№3. -с.61-61.

5. Вавилова TU, Гаверова Ю.Г., Островская И.Г. Влияние хронического

змоционально-холодового стресса на метаболические процессы в пульпе зубов крыс. // Ж. «Cathedra». - 2007. - №1. - С. 28-32

6. Островская И.Г., Гаверова Ю.Г., Савинова Е.А. Особенности

антиоксидантной защиты пульпы зуба. //8-й Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке», РУДН Москва, 2007, С. 471-471.

7. Гаверова Ю.Г., Островская И.Г., Вавилова Т.П., Корецкая H.A. Влияние ингибирования ß-окисления на активность ферментов энергетического метаболизма в пульпе зубов крыс. //8-й Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке», РУДН Москва, 2007, С. 191-191.

8. Вавилова Т.П., Островская И.Г., Гаверова Ю.Г., Курбатов С.М., Митронин

A.B. Адаптивные изменения в тканях полости рта крыс при эмоционально-холодовом стрессе. // Ж. «Cathedra». - 2008. - Том 7, №2. -С. 22-26

9. Вавилова Т.П., Островская И.Г. Биохимия и физиология пульпы зуба.

Монография. М., Изд. «Медиа Сфера», 2008, с. 136

Заказ № 285. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатало в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Большинство стоматологов в своей практике уделяют особое внимание стрессорным воздействиям, которые на сегодняшний день играют центральную роль в патогенезе заболеваний зубочелюстной системы.

Клинические наблюдения за людьми, работающими в экстремальных условиях или определенных зонах риска, в том числе за полярниками антарктических экспедиций, моряками дальнего плавания, авиаторами и другим контингентом, показали, что кариозные и некариозные поражения зубов, деструктивные изменения в тканях пародонта встречаются у них в два раза чаще по сравнению с людьми, работающими в обычных условиях (Ярошенко А.И., Голубев В.Г, 1973; Manhold J.N., 1979; Viltsek Е., 1978; Сирота Г.И. с соавт., 1989; Федоров Ю.А., Дрожжина В.А., 1997; Тарасенко Л.М., 2002; Hand G.A. et al., 2003; Краснова В.В., 2005; Белоклицкая Г.Ф., 2007; Соловьева - Савоярова Г.Е., 2008).

Установлено, что стрессорные стимулы влияют на устойчивость к болезням путём одновременной активации всех сигналов, исходящих из центральной нервной системы, что осуществляется сетью сложных ответов эндокринной и иммунной систем (Судаков К.В., 1996; Melmed S., 2001). Стресс является, прежде всего, адаптивной реакцией и способствует восстановлению гомеостаза, но при длительном его протекании он может вызывать метаболические изменения во всех тканях организма, активировать свободнорадикальные процессы, что приводит к нарушению структуры и функции клеток (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Девяткина Т.А., 1990; Горецкий О.С. с соавт., 1992; Sternberg Е.М., et al., 1992; McEwen B.S., 1998; ИлюхаВ.А., 2003).

Действие стресс-факторов на ткани полости рта исследователи чаще связывают с изменениями количественного и качественного состава белков смешанной слюны, что способствует, по их мнению, деминерализации твердых тканей зубов (Кузнецов П.А., 2000; Кузьмина Э.М. с соавт., 2001;

Тарасенко JLM. с соавт., 2002). Однако, причины декальцинации твёрдых тканей зубов могут быть связаны как с угнетением защитных свойств слюны, так и с функциональным состоянием клеток пульпы зуба, обеспечивающих трофику твёрдых тканей.

Влияние эмоционально- холодовых нагрузок на пульпу зуба не изучено, поэтому настоящее исследование является актуальным не только для теоретической, но и практической стоматологии. Цель настоящего исследования:

Оценить в эксперименте влияние эмоционально-холодового стресса различной продолжительности на метаболические процессы в пульпе зуба и выявить реакцию пульпы на применение стресспротекторов растительного происхождения. Задачи исследования:

1. Изучить активность ферментов лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и щелочной фосфатазы локализованных в различных органеллах клеток пульпы зубов крыс, определить содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой при остром и хроническом эмоционально-холодовом стрессе.

2. Определить уровень отдельных белков - эндотелина-1, интерлейкинов -ip и -6, аннексина V, растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия, а-дефензинов и фактора некроза опухоли - а в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности.

3. На основании полученных данных охарактеризовать энергетический обмен, состояние системы антиоксидантная защита - перекисное окисление липидов, фосфорно-кальциевый обмен и сосудистую реакцию пульпы зубов крыс, подвергшихся эмоционально-холодовому стрессу.

4. Сопоставить метаболические изменения в пульпе зубов крыс при краткосрочном и длительном эмоционально-холодовом стрессе.

5. Исследовать изменения в активности ферментов пульпы зубов крыс при стрессе в условиях ингибирования синтеза карнитина.

6. Выявить реакцию пульпы зуба в ответ на введение стресспротекторов при эмоционально-холодовом стрессе.

Научная новизна

Впервые в эксперименте выявлены сдвиги в метаболических процессах в пульпе зубов крыс, находящихся в состоянии острого и хронического стресса.

Впервые в пульпе зубов крыс использованы методы определения аннексина V, а-дефензинов и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой.

Впервые предложена гипотеза возможного механизма нарушения целостности твёрдых тканей зуба, обусловленного изменением трофики пульпы зуба в ответ на стресс. Впервые для оценки фосфорно-кальциевого обмена в пульпе зуба было применено определение содержания аннексина V.

Впервые исследована реакция пульпы на стресс в условиях введения стресспротекторных фитопрепаратов и показана роль (З-окисления жирных кислот в пульпе зубов в развитии стресс - реакции. Практическая значимость работы

Холодовой психоэмоциональный стресс, которому подвергался организм крыс, вызывает реакцию со стороны клеток пульпы зуба. Экспериментальные исследования показали, что применение фитопрепаратов на длительных сроках стресса оказывает положительный эффект на метаболизм клеток пульпы зубов крыс, а введение ингибитора синтеза карнитина, напротив, негативно сказывается на их течении. Положения, выносимые на защиту:

1. Клетки пульпы зубов крыс реагируют на эмоционально - эмоционально-холодовой стресс различной продолжительности, которому подвергается организм животного, что выражается в изменении их метаболизма.

2. Ингибирование транспорта жирных кислот в матрикс митохондрий при эмоционально-холодовом стрессе негативно влияет на обменные процессы в пульпе зубов крыс и активирует свободно-радикальное окисление.

3. Введение стресспротекторных фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» оказывает положительный эффект на течение метаболических процессов в клетках пульпы зуба при стрессе.

Внедрение результатов исследования

Полученные данные использованы в лекционном курсе кафедр факультетской терапевтической стоматологии, биохимии, нормальной физиологии МГМСУ. Личный вклад

Автором лично выполнена экспериментальная работа на 230 беспородных белых крысах. В ходе сбора и исследования материала соискателем освоены и использованы современные биохимические методы: иммуноферментный анализ и спектрофотометрия. Полученные результаты статистически обработаны и представлены в виде таблиц и графиков. Апробация работы

Результаты исследования докладывались на 54-ой итоговой студенческой научной конференции МГМСУ с международным участием (Москва, 2005), научно-практической конференции МГМСУ «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Москва, 2007), на 8-ом Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», РУДЫ (Москва, 2007), на межкафедральном заседании кафедр факультетской терапевтической стоматологии, нормальной физиологии, биохимии МГМСУ, октябрь 2008 г.

Объём и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, глав, включающих обзор

выводы

1. На фоне эмоционально-холодового стресса в пульпе зубов крыс меняется активность окислительно-восстановительных ферментов, что отражает активацию анаэробных и аэробных процессов на ранних стадиях стресс-реакции. К 30-му дню на фоне адаптации к стрессу происходит восстановление значений их активности до исходного уровня.

2. Во все сроки эмоционально-холодового стресса в пульпе зубов крыс определяется высокая активность супероксиддисмутазы и отсутствует активность глутатионпероксидазы. Содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, возрастает к 30-му дню эксперимента. Эти изменения свидетельствуют об активации свободно-радикального окисления.

3. Длительный эмоционально-холодовой стресс влияет на фосфорно-кальциевый обмен в пульпе зубов крыс, что выражается снижением в 3 раза активности щелочной фосфатазы и уменьшением в 2 раза содержания аннексина V.

4. В процессе развития адаптации к стрессу в пульпе зубов опытных крыс не выявлено присутствие растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия, но реакция сосудов пульпы проявляется в виде снижения содержания интерлейкина-1 (3, эндотелина-1, фактора некроза опухоли-а, с одновременным накоплением большого количества а-дефензинов и повышением количества интерлейкина-6.

5. Ингибирование синтеза карнитина в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе приводит к усилению процессов свободно-радикального окисления, по сравнению с животными, подвергнутых только стрессу.

6. Введение фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» на фоне длительного эмоционально-эмоционально-холодового стресса поддерживает активность лактатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы и количество продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой на уровне значений, определяемых у интактных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У пациентов, с генерализованными деструктивными изменениями твёрдых тканей зубов, необходимо включать в сбор анамнеза оценку условий жизни связанных с экстремальными воздействиями. Следует учитывать, что при стрессе в пульпе зуба страдает энергетический обмен, активируется свободно-радикальное окисление и нарушается минеральный обмен.

2. При длительном стрессе, для предотвращения сдвигов в метаболизме клеток пульпы, целесообразно принимать стресспротективные препараты, в частности фитопрепараты «Болюсы Хуато» и «Коронатера».

3. В случае воздействия стрессорных факторов не следует вводить препараты, блокирующие синтез карнитина, участвующего в транспорте жирных кислот в матрикс митохондрий для последующего Р-окисления, так как при этом активируется свободно-радикальное окисление в клетках пульпы.