Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние шлемника байкальского на энергетический метаболизм головного мозга крыс при гипоксии

РГ6 од

На правах рукописи

Сайфутдинов Риф Рафатович

ВЛИЯНИЕ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ГИПОКСИИ

14.00.25 - фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

академик МАН В. А. Хазанов

Научный консультант: доктор медицинских наук, Н. И. Суслов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор М. Б, Плотников

кандидат медицинских наук, доцент E.H. Чернова

Ведущая организация: Медицинский институт, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится "_"_1997 г. в_час

на заседании специализированного совета К 001.33.01 при НИИ фармакологии ТНЦ РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии ТНЦ РАМН.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Е. Н. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гипоксическое состояние организма, возникающее в результате ограниченного поступления в клетку кислорода, либо из-за нарушенной способности последней утилизировать его в метаболических процессах, сопутствует практически любой патологии: заболевание органов дыхания, сердечнососудистой системы, систем крови, печени, почек, во время наркоза и оперативных вмешательств, вследствие отравления различными ядами, кровопотерях, шоках, клинической смерти, а также при аварийной герметизации окружающего человека пространства и т. д. [A.A. Корнеев, 1993; Л.Д. Лукьянова, 1991, 1992].

Воздействие гипоксии проявляется неспецифическими стереотипными реакциями нейроэндокринной системы, метаболизма, кровообращения и дыхания по типу стресс-синдрома [Н. Selye, 1974]. Они сопровождаются усилением процессов свободно-радикального перекисного окисления липидов [Г.Г. Жданов, 1989; Л.Д. Лукьянова, 1992; Ф.З. Меерсон, 1984; В.А. Хазанов, 1993; И.С. Чекман, 1996], являющихся частью общего адаптационного механизма, направленного на поддержание клеточного гомеостаза.

В настоящее время поиску антигипоксантов - веществ, облегчающих реакцию организма на гипоксию, либо предотвращающих ее развитие посвящено много работ. Многокомпонент-ность гипоксического фактора предопределила, что в качестве антигипоксантов используют вещества самого различного действия: центрального (производные барбитуратов, нейролептики, транквилизаторы), симпатомиметики, антиоксиданты, ингибиторы циклооксигеназ, блокаторы Са2+-каналов и фосфолипаз, стабилизаторы мембран и др. [Л.Д. Лукьянова, 1989, 1992].

Большое число случаев непереносимости синтетических лекарственных препаратов, побочные эффекты при их применении, а иногда и возникновение лекарственной болезни из-за их токсичности заставляют обращать внимание на возможность использования препаратов растительного происхождения, изыскивать новые антигипоксические средства, обладающие малой токсичностью или равной активностью с базовым препаратом, а в некоторых случаях и превышающие эту активность. Работы, проведенные в НИИ фармакологии (Томск) показали, что профилактическое введение экстракта шлемника байкальского при гипоксии, судя по поведенческим реакциям крыс, предотвращает развитие энцефалопатии. Препарат проявил рав-ную с пирацета-мом ноотропную активность в ближайшие периоды после гипоксического воздействия и существенно превосходил его

по влиянию на отдаленные последствия гипоксической травмы [Н.И. Суслов, 1994].

Ключевая роль системы энергопродукции в формировании адаптивной реакции организма на дефицит кислорода и выявленный протекторный эффект экстракта шлемника байкальского на поведенческие реакции крыс при данном состоянии послужили основанием для углубленного исследования церебропротекторного действия препарата при гипоксии, в частности изучения механизма его влияния на систему энергопродукции головного мозга.

Цель работы. Изучить влияние экстракта шлемника байкальского на систему митохондриального окисления головного мозга крыс при гипоксии.

Задачи исследования.

1. Провести скрининг антигипоксической активности препаратов шлемника байкальского на модели нормобарической ги-перкапнической гипоксии.

2. Отобрать информативные критерии оценки функционального состояния митохондрий головного мозга крыс при гипоксии; оценить состояние сукцинат- и НАД-зависимой энергопро-дукшш головного мозга крыс при нормобарической гиперкапни-ческой гипоксии средней (2 часа) и большой (3,5 часа) степени тяжести.

3. Оценить состояние сукцинат- и НАД-зависимой системы энергопродукции головного мозга при профилактике гипок-сического повреждения экстрактом шлемника байкальского, натрия оксибутиратом и эмоксипином.

4. Исследовать защитные свойства байкалина и ионола на модели "старения" гомогената мозга крыс.

5. Исследовать влияние байкалина на дыхание и уровень восстановленное™ пиридиннуклеотидов митохондрий головного мозга in vitro.

Научная новизна.

1. Показано, что митохондрии головного мозга крыс через 2 часа нормобарической гиперкапнической гипоксии находятся в состоянии выраженной активации сукцинат- и НАД-зависимого дыхания, удлинение гипоксического воздействия до 3,5 часов вызывает срыв адаптивной реакции, характеризующийся деэнергиза-цией органелл, обусловленной ингибированием сукцинат-оксидазной системы.

2. Впервые предложен анализ функционального состояния митохондрий по характеристике переходных процессов в дыхательной цепи до установления метаболического состояния 4 по-

коя. Показана информативность сопоставления показателей дыхательной активности митохондрий в переходном (нестационарном) и стационарном состоянии для оценки регуляции системы энергопродукции.

3. На основании сравнительного изучения препаратов шлемника байкальского выявлено, что флавоноид байкалин в значительной мере определяет антигипоксическую и антиоксидант-ную активности шлемника байкальского.

4. Показано, что экстракт шлемника байкальского ограничивает активацию энергопродукции и препятствует деэнергизации митохондрий, модулируя работу дыхательной цепи путем прямого с ней взаимодействия на уровне НАДН-дегидрогеназы.

5. Выявлена антирадикальная активность экстракта шлемника байкальского.

Практическая значимость.

1. Экстракт шлемника байкальского предложен в качестве нового высокоэффективного антигипоксанта.

2. Обосновано применение экстракта шлемника байкальского в качестве антиоксиданта.

2. Предложены новые критерии оценки функционального состояния митохондрий:

а) количество потребленного кислорода (и) со скоростью Уо за время То при переходе в стационарное состояние 4 покоя;

б) отношение времени восстановления исходного уровня НАДН после добавки АДФ ко времени фосфорилирования (Тг/Тр).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на итоговой научной конференции НИИФ ТНЦ РАМН (Томск, 1996), итоговой научной конференции, посвященной 40-летию Омского медицинского института (Омск, 1997), научной конференции "Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке" (Хабаровск, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка используемой литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 125 отечественных и 54 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 120 белых беспородных крысах-

самцах массой 180-220 г., что соответствует в условиях нашего вивария возрасту 2,5-3 месяца, и 180 белых беспородных мышах-самцах массой 22-25 г.

В работе использован экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) и его флавоноид байкалин, относящийся к семейству триоксифлавонов. ЭШБ получен экстрагированием 70 % этиловым спиртом из подземной части растения в Украинском государственном научном центре лекарственных средств, Харьков; байкалин и байкадинат-лизин выделены там же. По данным В.И. Лит-виненко [1989] в сухом спиртовом экстракте корней шлемника байкальского содержание байкалина составляет 30 %.

Препаратами сравнения служили натрия оксибутират, ио-нол [М.Д. Машковский, 1986] и эмоксипин [Л.Д. Смирнов, 1982; A.A. Шведова, 1986].

Скрининг антигипоксической активности препаратов проводили на мышах. Гипоксию гермообъема моделировали в термокамере 200 мл. Регистрировали продолжительность жизни животных в мин.

Изучение энергетического обмена головного мозга проводили на крысах. Исследуемые препараты вводили внутрижелудоч-но двукратно за 5 суток и за 1 час до эксперимента. Гипоксию гермообъема моделировали помещением животного в термокамеру объемом 5 л на 2 и 3,5 часа (средняя и большая тяжесть патологии). По нашим данным время наступления агональных явлений при данной модели гипоксии соответствует 3,5 - 4 часам.

По окончании гипоксического воздействия животных под наркозом декапитировали и выделенный головной мозг гомогенизировали. Дыхательную активность митохондрий (MX) гомогена-та головного мозга крыс исследовали полярографическим методом в различных метаболических состояниях по Чансу [В. Chance, С. Williams, 1956].

Среда гомогенизации: Î^IO"1 M KCl, 2«10"3 M К2С03, МО"2 M НереБ-буфер, 2»10"4 M ЭДТА (pH 7.2). Среда инкубации: 1.2.10"1 M KCl, 2*10"3 M К2С03, 1-10"2 M НереБ-буфер, 2*10'4 M ЭДТА, 2® 10"3 M КН2РО4 (pH 7.2). Субстраты окисления: янтарная кислота (ЯК) 5»10'4 М, глутамат и малат по 3*10"3 М. В качестве активаторов сукцинатдегидрогеназы (СДГ) использовали а-глицерофосфат (а-ГФ) и ß-оксибутират (ß-OM) по 1,5* 10"3 M [M.H. Кондрашова, 1991]. С целью разделения вклада сукцината и НАД-зависимых субстратов в уровень дыхания MX использовали ингибитор СДГ - малонат 2»10"3 M и ингибитор переноса электронов от НАДН-дегидрогеназы к убихинону - ротенон 4»10"6 М.

В работе использован ингибитор аминотрансфераз - аминооксиа-цетат (АОА) 1,0 • 10"3 М.

Регистрировали скорости дыхания митохондрий гомогената до (У4п), после (\^40) и во время цикла фосфорилирования добавленной АДФ (Уз), время фосфорилирования (Тр). АДФ вносили в ячейку в количестве 100 мкмолей.

Для оценки энергетического статуса использовали коэффициенты стимуляции дыхания (СД=У3/У/.п), дыхательного контроля (ДК=Уз/У40), диапазона дыхательной активности органелл (у3-У4), способности МХ мембран к сохранению энергетического потенциала (У40/У4П), сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О). Кроме того флуориметрически определяли уровень восстановленности пиридиннуклеотидов в основных метаболических состояниях: до внесения АДФ - Р4г1, после добавки АДФ - Рз, а также после окончания времени (Тг) восстановления исходного уровня НАДН - Р4о.

Степень торможения СДГ (т-СДГ) регистрировали по приросту УЗ на внесение в среду инкубации МХ, окисляющих сукци-нат, активаторов СДГ [М.Н. Кондрашова, 1991]. В качестве дополнительных критериев т-СДГ нами предложено оценивать с какой скоростью (Упс), в каком количестве (и) и за какое время (То) утилизируется кислород прежде чем наступит метаболическое состояние 4п при помещении МХ в среду инкубации.

Антирадикальные свойства ЭШБ оценивали экспресс-методом определения антирадикальной активности лекарственных веществ в реакции с дифенилпикрилгидразином (ДФПГ) - стабильным радикалом [М.Л. Тараховский, 1985].

Белок определяли спектрофотометрическим методом [Г.А Кочетов, 1980]. Величину рН гомогенатат мозга измеряли в норме и после гипоксического воздействия через 2 и 3,5 часа на фоне профилактического введения препарата и без.

Весь экспериментальный материал подвергнут статистическому анализу с использованием параметрических и непараметрических критериев (Манн-Уитни, ^критерий Стьюдента) [Г.Ф. Лакин, 1990].

АНТИГИПОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО И ЭТАЛОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Все исследованные препараты шлемника байкальского проявили в эксперименте антигипоксическую активность; она

наиболее выражена у экстракта шлемника байкальского и по интенсивности превосходит действие антигипоксических доз натрия оксибутирата и эмоксипина. Ионол в широком диапазоне концентраций не проявил отчетливого противогипоксического действия, лишь в высоких дозировках отмечена тенденция к увеличению времени жизни животных (таб. 1).

Установлено, что соотношение наиболее эффективных доз ЭШБ и байкалина 200 и 60 мг/кг соответствует содержанию последнего в экстракте шлемника (30 %).

Таблица 1

Влияние препаратов шлемника байкальского, ионола, натрия оксибутирата и эмоксипина на время жизни (Тж) мышей при гипоксии гермообъема (X; и)

Препарат Доза.мг/ кг Тж А % Р

Контроль (48) - 22,2; 1,9 0 -

Байкалинат лизина (16) 80 мг/кг 23,6; 2,1 3,5 > 0,05

Байкалинат лизина (10) 200 мг/кг 25,5; 4,3 11,8 > 0,05

Байкалинат лизина (7) 2000 мг/кг 30,2; 6,8 32,2 < 0,05

Байкалин (9) 15 мг/кг 27.3; 3,6 20,1 < 0,01

Байкалин (11) 60 ыг/ кг 29,8; 4,2 30,7 < 0,01

Байкалин (11) 120 мг/кг 29,2; 4,5 28,1 < 0,01

ЭШБ (14) 50 ыг/кг 26,7; 3,8 17,1 < 0,05

ЭШБ (24) 200 мг/кг 32,5; 3,5 42,5 < 0,01

ЭШБ (10) 1000 мг/кг 27,3; 3,2 19,7 < 0,05

Ионол (6) 50 мг/кг 24,2; 3,9 6,1 > 0,1

Ионол (6) 200 мг/кг 26,6; 1,9 16,6 < 0,1

Ионол (5) 1000 мг/кг 26,2; 3,3 14,9 < 0,1

ГОМК (10) 100 мг/кг 28,3; 2,2 24,1 < 0,01

Эмоксипин (10) 5 мг/кг 28,4; 1,9 25,0 < 0,01

Примечание: в скобках указано количество животных; А % - различие с контролем.

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА КРЫС

При исследовании дыхательной активности МХ животных, перенесших гипоксию средней тяжести (2 часа), при окислении ЯК (0,35 мМ) отмечено снижение на 20 % скорости контролируемого дыхания до цикла фосфорилирования добавленной АДФ (У4п) (рис. 1) и на 27 % коэффициента дыхательного контроля (ДК), а также увеличение коэффициента стимуляции дыхания (СД), диапазона дыхательной активности (Уз - У4п) и показателя, характеризующего способность митохондриальных мембран к сохранению энергетического потенциала (У4о/У4п) на 24 , 50 и 49 % соответственно. Одновременно наблюдали тенденцию к повышению скоростей дыхания МХ после и во время цикла фосфорилирования (У4о и У3) на 13 и 4 % (рис. 1). Выявленные изменения указывают на снижение энергетического контроля метаболизма в МХ мозга в ответ на гипоксию - развитие низкоэнергетического сдвига (НЭС) [М.Н. Кондрашова, 1975, 1987, 1991].

Повышение субстратной нагрузки (ЯК 0,5 мМ) способствовало контрастированию изменений, вызываемых гипоксией, -дальнейшему снижению относительно контрольных значений скорости У4п (на 25 %) и увеличению скоростей Уз, У40, коэффициентов СД, У3 - У4п и У4о/У4п на И, 24, 40, 87 и 69 %, соответственно, что подтверждает нарушение метаболического контроля процессов окислительного фосфорилирования в МХ головного мозга крыс при 2-х часовой гипоксии гермообъема.

Применение ингибитора аминотрансфераз АОА, блокирующего быстрый путь утилизации продукта окисления ЯК - ок-салоацетата (ОА), являющегося главным эндогенным регулятором СДГ [А.Д. Виноградов, 1979], усиливало проявление признаков НЭС в МХ опытной группы животных (нарастание величин У4о и У40/У4П на 27 и 86 % и снижение У4п и Тр на 28 и 54 % соответственно). Коэффициент АДФ/О возрастал на 95 %, составляя величину 3,38, против 1,75 в контроле, что на 69 % выше теоретически возможной. Очевидно парадоксальное нарастание величины АДФ/О отражает накопление ОА вследствие несостоятельности путей его утилизации. Полученные данные свидетельствуют о важной роли быстрого метаболического кластера МХ [М.Н. Кондрашова, 1991], в частности реакций переаминирования О А, в поддержании энергетического гомеостаза мозга при гипоксии.

Добавка совместно с ЯК и АОА активаторов СДГ (а-ГФ и (3-ОМ) нормализовала до 1,6 величину АДФ/О, однако не влияла на соотношение скоростей и У40, что при снижении уровеня т-СДГ (-6 %) указывает на существенную роль в механизме развивающегося НЭС не только ингибирования СДГ посредством ОА, но и изменений на уровне внутренней мембраны МХ.

Эффект активаторов более выражен в условиях функционирования трансаминаз - быстрого пути утилизации ОА (отсутствие в среде инкубации АОА). При этом существенно увеличивалась скорость Уз, коэффициенты стимуляции дыхания, дыхательного контроля и диапазона дыхательной активности при одновременном снижении У40, отношения У^/У,^ и Тр. Высокий уровень т-СДГ (+30 %) на фоне вышеперечисленных изменений указывает на важнейшую роль процессов переаминирования в поддержании метаболического гомеостаза МХ мозга при гипоксии.

Удлинение срока гипоксического воздействия до 3,5 часов усугубляло нарушения в системе энергопродукции головного мозга. В частности, отмечено снижение на 20 и 18 % соответственно скоростей до и во время цикла фосфорилирования на фоне повышения У40 при окислении ЯК (0,5 мМ) (рис. 1), на 25 % снижалась величина АДФ /О. Дыхательный контроль и диапазон дыхательной активности падали на 22 и 55 % при повышении на 10 % отношения Уь/У^- Полученные данные свидетельствуют о прогрессирующем при гипоксии длительностью 3,5 часа нарастании явлений НЭС, резком нарушении энергетического контроля дыхания МХ.

Ограничение процессов переаминирования посредством АОА в МХ животных, перенесших гипоксию большой тяжести, вызвало увеличение расчетной величины АДФ/О выше теоретически возможной (с 1,4 до 4,0), что при одновременном снижении на 30 % скорости фосфорилирующего дыхания свидетельствует о глубоком торможении СДГ оксалоацетатом. На этом фоне добавление в среду инкубации активаторов СДГ сокращало разрыв в скоростях дыхания органелл относительно контроля и снижало расчетную величину АДФ/О на фоне действия АОА до 3,5. В опытах без АОА активаторы СДГ изменяли величину коэффициента АДФ/О с 3,5 до 1,4.

Высокая чувствительность дыхания МХ мозга крыс, перенесших 3,5-часовую гипоксию, к АОА говорит о существенном вкладе на данной стадии патологии реакций переаминирования в поддержание энергетического гомеостаза органа, в обеспечение функционирования быстрого метаболического кластера. Примене-

ние при окислении сукцината совместно активаторов СДГ а-ГФ и Р-ОМ приводило к снижению коэффициента АДФ/О, росту на 30 % У40 и на 21 % отношения У4о/У4п, что указывает на нарастание признаков НЭС, выраженном нарушении энергетической регуляции метаболизма МХ.

Полученные данные иллюстрируют зависимость степени нарушений в энергетическом метаболизме головного мозга крыс от тяжести приложенного воздействия (2 или 3,5 часа гипоксии), что проявляется, например, в недостоверном снижении показателя сопряженности окислительного фосфорилирования после гипоксии средней тяжести при выраженном падении такового после более тяжелой патологии или в различном ответе на патогенное воздействие - активация фосфорилирующего дыхания или его торможение после 2 и 3,5 часов гипоксии соответственно. Гипоксия приводит к снижению рН в ткани мозга с 7,0 до 6,8 к 2 часам и до 6,65 к 3,5 часам патологии.

2-х часовое гипоксическое воздействие при окислении ЯК в присутствии ротенона и глутамата, также как и при окислении одного сукцината, вызвало повышение скоростей дыхания МХ во всех метаболических состояниях (У^, Уз и У^) на 83, 141 и 160 % соответственно при значительном снижении на 136 % показателя сопряженности окислительного фосфорилирования (против 20 % при окислении одной ЯК); время фосфорилирования добавленной АДФ увеличивалось на 50 %. Указанные изменения, как и при окислении одной ЯК, подтверждают, обусловленное гипоксией, наличие низкоэнергетического сдвига, не компенсируемого активацией митохондриального окисления. Ингибирование НАД-зависимого дыхания МХ контрастирует проявление патологии. Чтобы понять как осуществляется это неблагоприятное влияние ротенона на дыхательную цепь МХ нам потребовалось сопоставить данные подпрограмм при окислении ЯК в присутствии ротенона и без него внутри контрольной и опытной групп.

Добавление в среду инкубации ротенона и глутамата при окислении сукцината у контрольных животных вызвало выраженное падение скоростей дыхания во всех метаболических состояниях: У4П, Уз и У4о в среднем на 35, 45 и 35 %. Коэффициент АДФ/О возрастал на 50 %. Считается, что ротенон, блокируя дыхательную цепь МХ на уровне первого участка и восстанавливая НАДН-ДГ, создает благоприятные условия для диссоциации комплекса СДГ-ОА, тем самым повышая активность фермента. Это выражается в росте скоростей дыхания органелл и снижении

коэффициента АДФ/О. На первый взгляд, полученные нами данные не укладываются в привычную схему действия ротенона. Однако, анализ участка подпрограммы от внесения гомогената мозга в полярографическую ячейку до наступления 4 метаболического состояния покоя, позволил нам объяснить, кажущееся противоречие: вместо ожидаемого ускорения дыхания и снижения расчетной величины коэффициента АДФ/О в присутствии ротенона и глутамата - снижение дыхательной активности МХ и рост АДФ/О.

В таблице 3 показано с какой скоростью (Упс) и в каком количестве (и) утилизируется кислород прежде чем наступит метаболическое состояние 4п. В контрольных группах животных при окислении сукцината добавление ротенона и глутамата увеличивало показатели Упс и и в среднем на 150 и 70 %. Это означает, что еще до наступления состояния 4п происходит выраженная активация работы СДГ, соответствующая представлениям об энергизующем действии ротенона на фермент. Усиление окисления сукцината резко увеличивает содержание ОА, избыточное накопление которого за счет несостоятельности путей утилизации, в свою очередь, ограничивает активность СДГ и вклад сукцинат-оксидазной системы в работу второго и 3-го пунктов фосфорили-рования. Очевидно наличие в среде инкубации глутамата недостаточно в данных условиях для эффективного переаминирования ОА, а вскрытие особенностей регуляции СДГ стало возможным лишь при исползовании предложенных нами критериев.

Изменения, связанные с дыхательной активностью и показателем сопряженности окислительного фосфорилирования МХ, в присутствии ротенона и глутамата в среде инкубации при окислении ЯК у животных опытной группы отличались от таковых у контрольной. Так, менее выраженное снижение скоростей дыхания У4П, Уз и У4о (на 23, 34 и 28 %) сопровождалось уменьшением коэффициента АДФ/О до 1,1. Добавление ротенона и глутамата в условиях гипоксии не вызывало столь интенсивного, как в контрольных группах, увеличения скорости и количества потребляемого кислорода при переходе в стационарное состояние 4п (рост Упс и и на 42 и 55 % против 150 и 70 % в контроле).

Таким образом, ограничение дыхательной активности МХ интактных животных и увеличение расчетной величины АДФ/О при окислении сукцината в присутствии ротенона и глутамата связано с начальной активацией СДГ и последующим ингибирова-нием работы фермента. С другой стороны, судя по показателям Уо

и U, характеризующим дыхательную активность МХ до наступления стационарного состояния 4п, гипоксическое воздействие создает условия способствующие ингибированию СДГ оксалоацета-том. Реоксигенация ткани мозга, обусловленная гипероксическими условиями измерения дыхания МХ, приводит к окислению дыхательной цепи, инициации каскада свободнорадикальных процессов, акцептирующих восстановительные эквиваленты мембранных структур, снижению восстановленности переносчиков дыхательной цепи, пула НАДН, что способствует нарастанию т-СДГ. Парадоксальное отсутствие активирующего действия ротенона на окисление ЯК обусловлено глубоким торможением активности СДГ.

При окислении НАД-ЗС результат 2-х часового гипоксиче-ского воздействия менее выражен. В частности, увеличение скоростей дыхания МХ во всех метаболических состояниях составляло 181, 170 и 170 % от уровня интактной группы против 176, 202 и 229 % соответственно при окислении ЯК. Показатель сопряженности АДФ/О снижался на 9 %, а дыхательный контроль на 35 %. Сдвиги функционального состояния МХ не сопровождались изменениями времени фосфорилирования (Тр) и восстановления уровня НАДН после добавления к гомогенату мозга АДФ (Тг). Тогда как время Тр при окислении ЯК уменьшалось на 27 % при увеличении на 100 % времени Тг. При утилизации субстратов обоего типа отмечено снижение уровня НАДН во всех метаболических состояниях органелл. На 57 и 166 % возрастало после гипоксии отношение Тг/Тр при окислении НАД-ЗС и сукцината, соответственно. Полученные данные отражают развитие в тканях мозга при гипоксии низкоэнергетического сдвига.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭШБ И ИОНОЛА НА СИСТЕМУ ЭНЕРГОПРОДУКЦИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА В ОПЫТАХ IN

VITRO

Действие препаратов изучали на модели "старения" гомо-гената головного мозга крыс, исследуя функциональное состояние МХ гомогената.

Данная модель позволяет наблюдать действие препарата на всех этапах низкоэнергетического сдвига. Процессы перекисно-го окисления липидов, играющие ключевую роль в деградации системы митохондриального окисления при "старении" органелл, вносят существенный вклад в развитие различных патологических состояний. Для оценки защитного действия шлемника байкалько-

го использовали байкалин. В качестве препарата сравнения применяли эталонный антиоксидант ионол.

Функциональное состояние МХ оценивали путем расчета величины, разработанного в нашей лаборатории [В.А. Хазанов, 1993], количественного критерия интактности функционального состояния (ИФ). Коэффициент ИФ интегрально объединяет изменение величины показателей дыхательной активности МХ и позволяет в диапазоне 0-1,0 сопоставить состояние различных объектов. Величина ИФ = 1,0 соответствует интактным МХ, диапазон 1,0 - 0,5 отражает состояние объекта с сохраненными физиологическими адаптивными реакциями.

Препараты вносили в гомогенат мозга до конечной концентрации 10"5 или 10"6 М. Расчет показателя ИФ производили по величинам скоростей дыхания до, после и во время фосфорилиро-вания добавленной АДФ, коэффициентам стимуляции дыхания и дыхательного контроля, времени фосфорилирования АДФ, степени сопряженности окислительного фосфорилирования.

Ионол, в концентрации 10 6 М, соответствующей среднему содержанию в организме различных классов нерецепторного действия лекарственных препаратов при введении их в терапевтической дозе, проявлял отчетливое защитное действие, предупреждая повреждение МХ при старении. В течение 30 мин препарат позволял сохранить в рамках диапазона физиологических компенсаторных реакций сдвиги функционального состояния МХ (ИФ > 0,5) (таб. 2). Различия с контрольной группой нарастали к 36 мин инкубации и сохранялись достаточно выраженными к концу 1-го часа эксперимента.

Байкалин в концентрации 10"6 М оказывал выраженное протекторное действие сохраняя ИФ в диапазоне 1,0 - 0,5 в течение 20 мин эксперимента. На 36 мин действие препарата прекращалось. Увеличение концентрации байкалина до 10"5 М влияло на величину защитного действия препарата, не изменяя его продолжительность.

Как видно из таблицы, "старение" вызывало выраженное изменение функционального состояния МХ. Начиная с 10 мин инкубации величина ИФ контрольных МХ опускалась ниже уровня 0,5, соответствующего нижней границе диапазона физиологических, адаптивных сдвигов состояния органелл. Наблюдаемые с 10 мин инкубации МХ изменения можно охарактеризовать, как проявления проградиентно нарастающего низкоэнергетического сдвига, сопровождающегося срывом компенсаторных механизмов регуляции системы энергопродукции. По нашим данным, падение

величины ИФ от 0,5 и ниже характерно для выраженных деструктивных изменений во внутренней мембране органелл, разобщения окислительного фосфорилирования.

Таблица 2

Влияние ионола и байкалина на величину коэффициента ИФ при "старении" МХ

Время, Ионол Байкалин Байкалин

мин 10° М ю-6 М 10"5м

К О А % К О Д % К о Д %

10 0,47 0,78 66 0,50 0,67 34 0,54 0,87 61

13 0,38 0,70 84 0,45 0,60 33 0,39 0,73 87

20 0,30 0,55 83 0,38 0,50 32 0,33 0,53 61

30 0,21 0,42 100 0,29 0,37 28 0,29 0,42 45

37 0,15 0,35 133 0,27 0,27 0 0,27 0,27 0

40 0,13 0,28 115 0,20 0,20 0 0,21 0,21 0

60 0,12 0,20 67 0,15 0,15 0 0,16 0,16 0

70 0,12 0,12 0 0,15 0,15 0 0,16 0,16 0

Примечание: (К) - показатель контрольных МХ; (О) - МХ под действием препарата (опытные); (А) - разница между показателями опытной и контрольной группы.

Таким образом, байкалин, подобно антиоксиданту ионолу, предупреждает нарушение функционального состояния МХ головного мозга на модели "старения". Препараты пролонгируют период сохранения физиологических, адаптивных реакций органелл, снижают динамику нарастания грубых патологических сдвигов. В большей степени защитное действие выражено у ионола.

ВЛИЯНИЕ ЭШБ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МХ ПРИ ГИПОКСИИ

Введение препаратов интактным животным не оказывало влияние на скорости дыхания МХ мозга и уровень НАДН, однако увеличивало Тг на 81-90 % при окислении ЯК и на 55-65 % при утилизации НАД-зависимых субстратов.

Профилактическое внутрижелудочное введение ЭШБ, натрия оксибутирата и эмоксипина, несмотря на достаточно тяжелое гипоксическое воздействие, каким является 2-х и 3,5-ой часовая гипоксия гермообъема, предотвращало развитие патологии;

введение препаратов предупреждало снижение рН ткани мозга при гипоксии.

Профилактическое введение ЭШБ животным, у которых вызывали гипоксию средней тяжести приводило к снижению до 90 % от уровня контроля скорости У3 при окислении 0,35 мМ ЯК, однако, в отличие от группы животных, не получавших препарат, скорости и \Л}0 оставались неизменными (рис. 1). Очевидно препарат способствует сохранению метаболического контроля энергопродукции на фоне ограничения активности сукцинат-оксидазной системы. При увеличении субстратной нагрузки (ЯК 0,5 мМ) Уз снижалась на 20 %, все остальные показатели оставались неизменными относительно контрольных величин.

Добавление в среду инкубации АОА при окислении ЯК, не влияя на скорости дыхания органелл, вызывало увеличение расчетной величины АДФ/О с 1,9 до 3,3, т. е. выше теоретически возможной. Такая реакция МХ указывает на проявление нарастающего т-СДГ [М.Н. Кондрашова, 1987]. Следует отметить, что при этом признаки структурных изменений в МХ отсутствовали (неизменны скорости дыхания и их отношения), т. е. т-СДГ носит регуляторный характер и не связано с повреждением мембран органелл.

Применение активаторов СДГ на этом фоне привело к росту скоростей дыхания МХ во всех метаболических состояниях до уровня таковых в контроле. Расчетная величина коэффициента АДФ/О снизилась с 3,3 до 2,8, что свидетельствует о уменьшении проявления т-СДГ. Дальнейшее снижение коэффициента АДФ/О с 2,9 до 1,9 на фоне активаторов в отсутствие АОА подтверждает участие процессов переаминирования в нормализующем действии ЭШБ при гипоксии, сохранение под действием препарата метаболического гомеостаза МХ.

Сходное нормализующее действие оказывал ЭШБ на МХ мозга и при окислении НАД-ЗС. При выраженном падении скоростей дыхания во всех метаболических состояниях до величин, регистрируемых в контрольной группе (У4П, Уз и У^ до 111, 116 и 96 % соответственно), идет повышение дыхательного контроля и показателя сопряженности окислительного фосфорилирования до значений превышающих таковые в интактной группе на 19 и 21 % соответственно.

Внесение ротенона в среду инкубации при окислении ЯК ограничивало проявление нормализующего действия ЭШБ на МХ при гипоксии.

2 часа

3,5 часа

[ | контроль

а гипоксия

П1П0КСНЯ +

ЭШБ

У4п

V3

У4о

Рис. 1. Влияние ЭШБ при гипоксии средней (2 часа) и большей тяжести (3,5) на скорости дыхания МХ во всех метаболических состояниях при окислении 0,35 мМ ЯК (1-3), 0,5 мМ ЯК (4), 0,5 мМ ЯК в присутствии АОА (5), 0,5 мМ ЯК в присутствии АОА и активаторов СДГ (6), 0,5 мМ ЯК в присутствии активаторов СДГ (7).

Таблица 3

Влияние гипоксии и антигипоксантов на скорость дыхания МХ переходного состояния (Упс) и количество потребленного кислорода (и) до наступлением метаболического состояния 4п (X; ст)

Условия и Упс

эксперимента нгат 02/ мг белка нгат Ог/мин/ мг белка

1 66,0; 4,8 46,5; 9,3

К 2 111,9; 4,5" 116,4; 5,1"

3 113,4; 16,2" 113,4; 7,2"

К 1 69,0; 4,2 42,0; 4,8

+ 2 101,4; 12,6" 108,9; 7,5"

ЭШБ 3 91,5; 17,4« 100,5; 12,0"

К 1 60,9; 7,5 46,5; 7,5

+ 2 92,4; 8,7" 80,4; 15,4.

ГОМК 3 84,9; 4,5" 75,5; 12,2.

К 1 68,4; 6,3 54,9; 9,9

+ 2 107,4; 3,9" 91,5; 3,0"

эмоксипин 3 84,0; 6,6* 76,4; 4,5.

1 45,3; 10,8** 45,0; 6,0

Г 2 71,4; 11,1"** 64,8; 24,0«**

3 82,2; 14,4"** 69,9; 15,9"**

Г 1 48,0; 20,4** 37,2; 13,2*

+ 2 61,8; 7,5** 45,6; 10,2**

ЭШБ 3 62,4; 9,9** 49,2; 12,3**

Г 1 39,0; 9,6** 29,4; 6,9**

+ 2 47,4; 16,2** 42,0; 6,9**

ГОМК 3 51,6; 24,6** 42,6; 7,8**

г 1 36,0; 7,5** 31,2; 9,6*

+ 2 61,0; 26,4*** 41,2; 18,0**

эмоксипин 3 62,4; 23,4*** 46,8; 9,3.**

Примечание: различия достоверны по сравнению с (1) при Р < 0,05 - •, при Р < 0,01 - контролем - * при Р < 0,05 и ** при Р < 0,01. 1 - при окислении ЯК 0,5 мМ, 2 - ЯК с глутаматом в присутствии ротенона без АОА и с АОА - 3. К - интактный контроль, Г - гипоксия.

Ротенон отдельно и в смеси с АОА не позволял в полной мере восстановиться под действием ЭШБ исследуемым показателям (\^4П, Уз, У40, ДК и АДФ/О). Очевидно это связано с начальной активацией СДГ ротеноном, ведущей к накоплению ОА и последующему ингибированию фермента (таб. 3). Ограничение работы СДГ не позволяет увидеть эффект препарата в полной мере.

Под действием ЭШБ, наряду с нормализацией скоростей дыхания, величин дыхательного контроля и сопряженности окислительного фосфорилирования, отмечено восстановление уровня НАДН в МХ во всех метаболических состояниях и уменьшения отношения Тг/Тр. Причем, если введение препарата интактной группе увеличивает Тг в среднем на 55 % при утилизации субстратов обоего типа, то на фоне гипоксического воздействия Тг составляет при окислении сукцината в среднем 120-130 %, а НАД-ЗС - 80-100 %.

Использование ЭШБ в условиях более выраженного гипоксического воздействия (3.5 часа), судя по полученным нами данным, также препятствовало возникновению нарушений в системе энергопродукции. В частности, отмечен подъем скорости фосфорилирующего дыхания при окислении 0,35 мМ ЯК на 6, 0,5 мМ ЯК - на 16, 0,5 мМ ЯК с АОА - на 18, 0,5 мМ ЯК с АОА и активаторами на - 20, 0,5 мМ ЯК с активаторами СДГ - на 13 % соответственно. Препарат увеличивал степень сопряженности окислительного фосфорилирования, которая составила при вышеперечисленной последовательности субстратов 106, 106, 110, 123 и 101 % от контрольной группы. При отсутствии в среде инкубации АОА при окислении ЯК с активаторами, либо без них увеличивался дыхательный контроль на 33 и 27%, а также снижалось отношение У^/У^ на 22% в обоих случаях. Ограничение процессов переаминирования при добавлении в инкубационную среду АОА вызывало снижение дыхательной активности МХ и не позволило проявится нормализующему действию ЭШБ. Видно, что в данных условиях также, как и при гипоксии длительностью 2 часа, ЭШБ предотвращает развитие НЭС, препятствует разобщению окислительного фосфорилирования, но в отличие от первого случая, когда скорость фосфорилирующего дыхания (Уз) повышается, при гипоксии длительностью 3,5 часа на фоне действия ЭШБ отмечено ее снижение.

Судя по полученным нами данным, введение ЭШБ и эталонных антигипоксантов натрия оксибутирата и эмоксипина ин-тактным животным не влияет на скорости дыхания МХ мозга и

уровни НАДН, однако, все три препарата значительно увеличивают время Тг, приводя его в соответствие с временем фосфори-лирования добавленной АДФ - Тр при окислении ЯК, либо превышая таковое на 50-90% при утилизации НАД-ЗС. По-видимому, Тг < Тр при утилизации ЯК обусловлено обратным переносом электронов на участке убихинон-НАДН-дегидрогеназа, который играет ключевую роль в образовании восстановительных эквивалентов в MX [В. Chance, 1976]. Возрастание Тг под действием исследуемых препаратов отражает, на наш взгляд, антиоксидант-ное действие последних. В частности, формирование условий увеличения оттока восстановительных эквивалентов от НАДН к другим звеньям системы антиперекисной защиты организма. С нашим предположением согласуется возрастание Тг/Тр при гипоксии и снижение такового при профилактическом введении препаратов независимо от типа окисляемого субстрата. Действительно, ги-поксическое воздействие, инициируя свободнорадикальные реакции, создает предпосылки для активации ПОЛ в гомогенате мозга, помещенном в гипероксические, по сравнению с таковыми in vivo, условия исследования in vitro. Нарастание Тг отражает использование НАДН системой антиперекисной защиты. Благодаря своим антиоксидантным свойствам исследуемые препараты снижают "отток" НАДН, уменьшают Тг.

Байкалин относится к семейству 3-оксифлавонов, по некоторым источникам являющихся наиболее активной формой био-флавоноидов. Немаловажным компонентом в системе антиперекисной защиты в процессах глюкуронидации является глюкуроно-вая кислота - радикал в 7 положении флавоноида.

Как нам кажется, возможная схема участия байкалина в системе антиоксидантной защиты в клетке выглядит таким образом (рис. 2): донорно-акцепторные свойства байкалина позволяют находится ему в трех формах (хинонной, семихинонной и феноль-ной), благодаря чему препарат может переключать поток восстановительных эквивалентов от пиридиннуклеотидов (НАДФН и НАДН) или иных источников через токоферол и, возможно, уби-хинон на гашение свободных радикалов липидов. Очевидно байкалин служит донором водорода для фермента глутатион-пероксидазы. Это косвенно подтверждают данные других исследователей (М. Г. Матяш, 1996).

Таким образом, экстракт шлемника байкальского, равно как и антигипоксанты натрия оксибутират и эмоксипин, препятствует развитию в ткани мозга характерных для гипоксии сдвигов энергетического гомеостаза. Возможно антигипоксическая актив-

ность связана с антиоксидантными свойствами исследуемых препаратов. Так, известна положительная корреляция противогипок-сичеекой и антиоксидантной активности у эмоксипина [Т. А. Воронина, 1989]. Экранирование оксигруппы препарата снижало ан-

КзООН НАДФ-пероксидаза

пситозиыи шпсг _^ НАДФН_

АДФ

БХ

А

Б БФ

Я:*

Щ1Т. ааз

ИгООН

КлООН

НАДН-ДГ

/

аза /

\—К

О-ЗН-псроксилаза в-БН Ли Д1.

каталаза

СОД

ноон

Рис. 2. Возможная схема участия байкалина в системе антиоксидантной защиты в клетке. БФ, БС, БХ - фенольная, семихинонная и хинонная форма байкалина. (^Н и С? - восстановленная и окисленная форма убихлнона. й -БН ий-Б-Б-О- восстановленная и окисленная форма глутатиона. 1п - природный ан-тиоксидант. СОД - супероксиддисмутаза. й;« и Иг® - липидные и гидрофильные радикалы. цит.аа3 - цитохромоксидаза. НАДН-ДГ -НАДН-дегидрогеназа.

тиоксидантные свойства и вызывало ослабление противогипокси-ческой активности. Известны нтиоксидантные свойства флавоно-

идов [I. В. Afanas'ev, 1989]. Нами было показано ингибирование флавоноидом байкалнном (основным действующим началом ЭШБ) свободнорадикального перекисного окисления липидов. В опытах in vivo показана антиоксидантная активность натрия оксибутирата [М. Б. Плотников, 1991]. Существует предположение, что проти-вогипоксическая активность различных ноотропов имеет общий базисный механизм, связанный с их антиоксидантной способностью восстанавливать нарушенные гипоксией структурно-функциональные характеристики биомембран. Полученные нами результаты подтверждают данное предположение.

ВЫВОДЫ

1. Ответная реакция системы энергопродукции головного мозга крыс на нормобарическую гиперкалническую гипоксию нарастающей тяжести характеризуется начальной активацией мито-хондриального окисления с последующей деэнергизацией орга-нелл, ингибированием сукцинатоксидазной системы, выраженным разобщением окислительного фосфорилирования.

2. Разработанные критерии оценки функционального состояния митохондрий Тг/Тр и Vnc позволяют получить дополнительную информацию о системе энергопродукции органелл, оценить степень ингибируемости быстрого метаболического кластера при гипоксии.

3. Экстракт шлемника байкальского и его флавоноид бай-калин обладают антигипоксической активностью; эффективная доза у крыс при введении внутрижелудочно составляет 200 мг/ кг для экстракта шлемника байкальского и 60 мг/кг для байкалина.

4. Экстракт шлемника байкальского препятствует деэнер-гизации митохондрий головного мозга крыс и развитию каскада патологических реакций, оптимизируя работу дыхательной цепи: при гипоксии длительностью 2 часа - путем ограничения дыхательной активности органелл, при гипоксии большей тяжести (3,5 часа) - повышая ее активность.

5. Байкалин в значительной мере определяет антигипокси-ческую активность шлемника байкальского.

6. Механизм защитного действия байкалина при гипоксии связан с взаимодействием с дыхательной цепью на уровне НАДН-дегидрогеназы и антиоксидантной активностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Влияние экстракта шлемника байкальского на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях мозга крыс при гипоксии// Труды молодых ученых Института фармакологии ТНЦ РАМН. - Томск, 1995. - С. 29-31.

2. Оценка антигипоксической активности шлемника байкальского на модели гипоксии гермообъема/ / Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1996. С. 106.

3. Влияние препарата шлемника байкальского на состояние энергопродукции в митохондриях мозга крыс при гипоксии// Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1996. С. 107 (соавт. Хазанов В.А.).

4. Оксидазные системы митохондрий головного мозга крыс после гипоксии и действие антигипоксантов// Проблемы экспе-рим. и клинич. медицины. - Томск, 1996. - Вып. 1. - С. 51-54.