Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Механизмы влияния экстракта шлемника байкальского на состояние системы естественной цитотоксичности при опухолевом росте

На правах рукописи

КАПЛЯ

Ольга Александровна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ЭКСТРАКТА ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ЕСТЕСТВЕННОЙ ЦИТОТОКСИЧ-НОСТИ ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

14.0025 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск - 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологам Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Ведущая организация:

ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН

Защита состоится «_»_2004 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Дыгай Александр Михайлович Шерстобоев Евгений Юрьевич

Красноженов Евгений Павлович Вельский Юрий Павлович

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

20Qg-H

154 2>9

Актуальность проблемы. В соответствии с современными представлениями существенное место в противоопухолевой защите организма занимает система естественной цитотоксичности (ЕЦТ) [Чекнев С.Б., 1993; 1999]. Реакции этой системы при опухолевом росте опосредуются следующими типами клеток: естественными (натуральными) киллерными клетками (ЕКК), мононуклеарными фагоцитами (моноцитами и макрофагами), Т-лимфоцитами, а также полиморфноядерными нейтрофилами [Семененя И.Н., 1991; Wahl L.M., Kleinman H.K., 1998; Чекнев СБ., 1999]. ЕКК и моно-нуклеарные фагоциты занимают ключевое положение в системе ЕЦТ, осуществляя как прямое цитотоксическое действие против злокачественно трансформированных клеток, так и опосредованное - через секрецию значительного числа цитокинов, важнейшими из которых являются ИФН-у [Кузнецов В.П., 1998; Фрейдлин И.С., 2001], ФНО-а [Зубова С.Г., Окулов В.Б., 2001], ИЛ-1 [Навашин СМ., Вядро М.М., 1989; Lin T.-J., Hirji N.. Stenton G.R., 2000]. Помимо ЕКК и мононуклеарных фагоцитов к эффекторным клеткам системы естественной цитотоксичности относятся Т- и В-лимфоциты, полиморфноядерные нейтрофилы, а также тромбоциты [Чекнев СБ., 1999; Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю., 2000; Головоз-нин М.В., 2001]. С другой стороны Т-лимфоцитам, а именно субпопуляции Т-хелперов (ТЫ и Th2) отводится роль главных регуляторов иммунного ответа из-за их способности продуцировать широкий спектр цитокинов. Считается, что противоопухолевая защита ассоциируется с ТЫ-типом иммунного ответа, в то время как опухолевая прогрессия с ТЪ2-типом [Потапнев М.П.,2002].

Одним из основных методов лечения злокачественных новообразований до настоящего времени остается цитостатическая терапия. Однако возможности химиотерапии лимитируются выраженными побочными эффектами цитостатических препаратов, связанными в первую очередь с низкой селективностью канцеролитического эффекта большинства известных в настоящее время цитостатиков и их токсическим влиянием на нормальные активно пролиферирующие клеточные системы организма [Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986; Кудаева И.В., 1997; Huitema A.D., Spander М, Mathit RA е.а., 2002; Katoh С, Kitajima S., Saga Y. e.a., 2002; Nicol D., 2002]. Кроме того, применение противоопухолевых препаратов усугубляет и без того нарушенный баланс основных звеньев иммунитета, приводя к вторичному иммунодефициту [Напалков Н.П., Бохман

В связи с этим, при проведении химиотерапии для повышения эффективности лечения применяют модификаторы биологических реакций (МБР) -агенты различной природы, воздействующие как на опухолевые клетки, так и различные регуляторные системы организма. В их число входят природные и синтетические иммуномодуляторы, цитокины, индукторы созревания и дифференцировки клеток, моноклональные антитела и др. [Навашин СМ., Вядро М.М., 1989; Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г. и др., 2003]. К сожалению, некоторые группы модификаторов биологических реакций, используемые в терапии злокачественных новообразований, не лишены недостатков, при их использовании нередко наблюдаются различные побочные эффекты, отсутствие антиканцерогенного действия, а иногда и усиление опухолевого роста [Симбирцев А.С., 1998; Гершанович МЛ., 2003; Киселевский М.В., 2003].

Препараты растительного происхождения - особая группа модификаторов биологических реакций, выгодно отличающаяся от остальных лекарственных средств, прежде всего широким спектром регулирующих эффектов, низкой токсичностью и отсутствием побочных явлений, а также высокой биологической доступностью [Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000]. Многочисленные данные указывают на возможность не только усиления с помощью растительных средств эффективности цитостатической терапии, но и существенного снижения токсичности последней [Валавичус Ю.М., Янкави-чус К.К., Вайчунене ЯЛ. и др, 1989; Зуева Е.П., Разина Т.Г, Амосова Е.Н., 1997; Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г и др., 2003]. Особенно важным свойством фитопрепаратов является их способность влиять как на цитоток-сическую, так и на секреторную функции клеток, в частности на продукцию ФНО, ИФН-у, ИЛ-1 и ИЛ-2, КСФ [У<ааЫа Е., №Шп О., Sezik Е е.а., 1997; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Вершинина С.Ф., Потявина Е.В., 2003], при этом наблюдается нормализация нарушенного баланса субпопуляций Т-лимфоцитов при развитии в организме опухоли [Вершинина С.Ф., Потявина Е.В., 2003].

В этом отношении большой интерес для исследования представляет жидкий экстракт шлемника байкальского. В ряде работ сотрудников НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН было показано, что жидкий экстракт шлемника байкальского подавляет процесс метастазирования и ингибирует рост перевиваемых опухолей. Кроме того, использование данного препарата при химиотерапии животных с опухолями приводит к повышению противоопухолевого и противометастатического эффектов цитостатиков и снижает их

лейкопенический эффект [Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., 1990; Удин-цев С.Н., Разина Т.Г., Яременко К.В., 1990; Разина Т.Г., Литвиненко В.И., Попова Т.П. и др., 1993]. Изучение механизмов влияния жидкого экстракта шлемника байкальского на состояние системы естественной цитоток-сичности при опухолевом росте является важным моментом для совершенствования терапевтических подходов при лечении злокачественных новообразований.

Цель исследования. Изучить влияние жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на состояние системы естественной цитотоксичности мышей при развитии карциномы легких Льюис.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние жидкого экстракта шлемника байкальского на гуморальный (антителообразование) и клеточный (реакция гиперчувствительности замедленного типа, макрофагальный фагоцитоз, пролиферативная активность лимфоцитов) иммунный ответ у интактных мышей.

2. Оценить противоопухолевое и антиметастатическое действие жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном при развитии карциномы легких Льюис.

3. Исследовать цитотоксическую активность перитонеальных макрофагов мышей с карциномой легких Льюис при введении жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном.

4. Изучить цитотоксическую активность естественных киллерных клеток мышей с карциномой легких Льюис при введении жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном.

5. Исследовать изменение секреторной активности клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности (естественных киллерных клеток, перитонеальных макрофагов, Т-лимфоцитов) под влиянием экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном.

Научная новизна. Показано, что жидкий экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) оказывает стимулирующее действие, как на гуморальный, так и на клеточный иммунный ответ. При развитии карциномы легких Льюис ЭШБ потенцирует противоопухолевое и антиметастатическое действие цик-лофосфана. В ходе проведенной работы впервые изучены механизмы влияния жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на состояние системы естественной цитотоксичности при развитии карциномы легких Льюис. При этом установлена способность исследуемого препарата и его комбинации с циклофосфаном, модулировать функ-

циональную активность естественных киллерных клеток и макрофагов, а также корректировать нарушенный баланс цитокинов при данной экспери-, ментальной модели опухолевого роста у мышей. Кроме того, было отмечено, что ЭШБ нивелирует иммуноцитотоксический эффект циклофосфана, путем влияния как на функциональную активность клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности, так и секрецию ими широкого спектра медиаторов иммунного ответа

Практическая значимость. Полученные данные расширяют имеющиеся представления о механизмах противоопухолевой защиты организма. Результаты работы могут быть использованы для разработки методов коррекции нарушений, возникающих в организме при применении цитостатиче-ских препаратов, а также патогенетически обоснованных методов противоопухолевой терапии с использованием препаратов, модулирующих функции клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на объединенном иммунологическом съезде (г. Екатеринбург, 2004), на конференции молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (г. Новосибирск, 2004), на пятом международном конгрессе молодых ученых "Науки о человеке" (г. Томск, 2004), на конференции посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН "Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (г. Томск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками, 31 таблицей и состоит из введения, 4 глав, выводов и указателя литературы, содержащего 248 источников (152 отечественных и 96 иностранных авторов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования ряда показателей иммунной системы у мышей в норме были проведены на 148 мышах-самцах линии СБЛ/СаЬас. В работе использовали жидкий экстракт шлемника байкальского («ГНЦЛС», г. Харьков), который вводили через зонд в желудок курсом в течение 5 дней, в дозе 1 мл/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды. Жидкий экстракт шлемника байкальского представляет собой раствор экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этиловым спиртом из корней и корневищ растения. Стандартизован по

содержанию флавоноида байкалина. Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя. В качестве фона использовали интактных мышей соответствующего пола и возраста.

Иммунизацию животных осуществляли корпускулярным тимусзави-симым антигеном - эритроцитами барана (ЭБ), однократно внутрибрюшинно по 0,2 мл 15% взвеси эритроцитов. Мышей умерщвляли методом декапита-ции. Забор материала для исследований осуществляли на 4-е, 7-е, 14-е и 21-е сут после иммунизации ЭБ. Определение антителообразующих клеток в селезенке (АОК) проводили методом локального гемолиза [Cunnigham A.J., 1965], уровень специфических антител в сыворотке крови - в реакции ге-магглютинации [Линг Н.Р., Кэтти Д., 1991]. Фагоцитарную активность пери-тонеальных макрофагов (ФАПМ) определяли методом, основанным на измерении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного [Vray В., Hoebeke J., Saint-Guillain M. е.а., 1980].

Изучение действия ЭШБ на клеточный иммунный ответ проводили с помощью постановки реакции гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов Р.М., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и др., 2000]. Изучаемый препарат вводили перед сенсибилизацией (1 схема) или в период между сенсибилизацией и введением разрешающей дозы антигена (2 схема). Влияние ЭШБ на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов осуществляли при постановке реакции бласт-трансформации [Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К. и др., 1989]. Также проводили оценку влияния ЭШБ при добавлении его in vitro на количество антитело- [Cunnigham A.J., 1965] и розеткообразующих клеток [Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К. и др., 1989]. В отдельной серии экспериментов к взвеси спленоцитов добавляли циклофосфан в концентрации 10"5 г/мл, который вносили после ЭШБ в пробы селезеночных клеток за 15 минут до постановки вышеуказанных реакций.

Изучение влияния ЭШБ на опухолевый процесс осуществляли на 292 мышах-самцах гибридах В качестве экспериментальной

модели злокачественного роста была использована карцинома легких Льюис (LLC), которую перевивали в мышцу задней лапы взвесью клеток в количестве 5-6х10б на мышь. Циклофосфан вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 12-е сут после трансплантации опухоли. ЭШБ вводили мышам, начиная с 6 суток после трансплантации опухоли и далее в течение 12 дней в той же дозе, что и в первой экспериментальной группе животных.

Изучалась противоопухолевая активность как одного ЭШБ, так и в комбинации с циклофосфаном. Эффективность лечения определяли по массе опухолевого узла, проценту торможения роста опухоли, частоте метастази-рования опухоли [Софьина З.П. и др., 1980], среднему количеству метастазов у одного животного в группе, индексу ингибирования метастазирования [Архипов С.А., Юнкер В.М., Грунтенко Е.В., 1982]. Оценку цитотоксической активности естественных киллерных клеток (ЕКК) проводили в мембрано-токсическом тесте на клетках-мишенях (соотношение эффекторов и мишеней 100:1 и 50:1) [Рыкова М.Н., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. и др., 1981]. Цитотоксическую активность перитонеальных макрофагов определяли по методу В.И. Селедцова и соавторов (1987). Уровни цитокинов ФНО-а, ИЛ-lß, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10 в культуральных супернатантах перитоне-альных макрофагов и не прилипающих к пластику спленоцитов тестировали на 13-е, 15-е, 17-е, 19-е и 22-е сут после трансплантации опухоли твердофазным иммуноферментным методом «сэндвича» (ELISA). Продукция оксида азота в супернатантах определялась по содержанию нитритов при помощи реактива Грейса [Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J., 1982]. Полученные в ходе исследования данные обрабатывали методом вариационной статистики, используя пакет статистических программ «Statistica for Windows».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали наши исследования, жидкий экстракт шлемника байкальского оказывал стимулирующее действие, как на гуморальный, так и на клеточный иммунный ответ у здоровых мышей линии CBA/CaLac. Так, введение ЭШБ увеличивало содержание антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей на 4-е сут эксперимента, повышало уровень гемагглютини-нов в сыворотке крови на 4-е, 7-е, 14-е сут опыта и усиливало интенсивность реакции ГЗТ (до применения сенсибилизирующей дозы антигена) по сравнению с контролем. Кроме того, курсовое введение ЭШБ при иммунизации животных ЭБ вызывало увеличение фагоцитарной активности перитонеаль-ных макрофагов на ранние сроки эксперимента относительно контрольной группы мышей. При исследовании влияния ЭШБ на пролиферативную активность лимфоцитов была выявлена способность изучаемого препарата стимулировать спонтанную бласт-трансформацию лимфоидных клеток.

Выявленная нами способность ЭШБ стимулировать реакции иммунной системы, вероятно, была связана с опосредованным влиянием изучаемого препарата на ЦНС [Першина О.В., 1994; Першина О.В., Суслов Н.И., Прова-

лова Н.В. и др., 2002], а также на эндокринную систему животного [Разина Т.Г., 1988; Удинцев С.Н., 1993]. В свою очередь доказана глубокая взаимосвязь нервной, эндокринной и иммунной систем. Механизмы иммунного ответа являются важной составляющей нейроэндокринной активности, а сам по себе иммунный ответ требует согласованного участия нервной и эндокринной систем [Корнева Е.А., 1993; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001]. Кроме этого, одним из основных биологически активных веществ экстракта шлемника байкальского является флавоноид байкалин, содержащий в своем составе остаток глюкуроновой кислоты [Жданов В.В., 2004]. D-глюкуроновая кислота представляет собой биологически высокоактивное соединение углеводного характера и входит в состав гликозаминогликанов (ГАГ) [Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981]. ГАГ являются естественной составной частью клеточной мембраны и надмембранного слоя клеток, влияют на различные процессы в клетках, в том числе и на пролиферацию [Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н., 1988; Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П., 1993; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др., 1995].

В связи с выявленными эффектами изучаемого препарата на систему иммунитета у интактных животных, в дальнейших экспериментах проводилось исследование противоопухолевой и антиметастатической активности ЭШБ, а также изучение эффектов этого препарата в комбинации с цитоста-тиком.

Было установлено, что курсовое введение мышам с карциномой легких Льюис ЭШБ вызывало достоверное уменьшение массы опухоли на 22-е сут развития неопластического процесса, а также оказывало умеренный проти-вометастический эффект на 19-е сут эксперимента. Возможно, противоопухолевый эффект ЭШБ связан с его флавоноидом байкалином, обладающим прямой цитотоксической активностью в отношении клеток лейкоза L-1210 [Sung H.R.e.a., 1985].

В основе противометастатического действия шлемника, по-видимому, лежит способность его флавоноидов (байкалина и байкалеина) снижать свертываемость крови, ингибируя процесс агрегации тромбоцитов [Kubo M., Ма-tsuda H., Tani Т. е.а., 1985; Разина Т.Г., Удинцев С.Н., Тютрин И.И. и др., 1989], так как известно, что гиперкоагуляция, которая имеет место при развитии злокачественных новообразований, способствует усилению метастатического процесса [Терещенко И.П., Кашулина А.П., 1983]. Вместе с тем, противометастатический эффект может являться следствием адаптогенной активности исследуемого препарата, поскольку адаптогены, обладают

способностью оказывать нормализующее воздействие на ряд измененных в процессе развития опухолей показателей гомеостаза. Так, К. П. Балицким и Ю.П. Шмалько (1987) было установлено, что при развитии карциномы легких Льюис наблюдается существенное усиление активности гипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем уже на 1-3-е сут после перевивки опухоли, сопровождающееся соответствующим возрастанием уровней глюкокортикоидов и катехоламинов в крови и моче с относительной нормализацией нейроэндокринного статуса к 14-м сут эксперимента. ЭШБ снижает уровень кортизола в плазме крови [Разина Т.Г., 1988]. Очевидно, что при уменьшении содержания глюкокортикоидов в плазме крови понижается возможность опухолевой ткани получать глюкозу - основной продукт питания (глюкокортикоиды способствуют образованию глюкозы из белков и жиров), а лимфоидная ткань, деструктивные изменения в которой обычно наблюдаются при избытке кортикостероидов, становится менее уязвимой для проникновения опухолевых клеток и развития метастазов [Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000]. Кроме того, показано, что большие фармакологические дозы глюкокортикоидных гормонов вызывают торможение гуморального и клеточного иммунного ответа и активности отдельных клеточных пулов, участвующих в иммунных реакциях [Корнева ЕА, Шхинек Э.К., 1988; Кор-нева ЕА, Рыбакина Е.Г., Фомичева Е.Е., 1998]. ЭШБ снижая содержание глюкокортикоидных гормонов, нивелирует их иммуносупрессорное действие, а, следовательно, восстанавливает механизмы иммунной защиты.

Сочетанное применение препарата шлемника байкальского и цитоста-тика для лечения мышей с карциномой легких Льюис усиливало противоопухолевое действие последнего на 22-е сут после трансплантации опухоли, а также приводило к ингибированию процесса дессиминации LLC в легкие по сравнению с контролем на 17-е, 19-е и 22-е сут эксперимента, а также по сравнению с группой мышей, получавших циклофосфан, на 19-е и 22-е сут опыта.

Известно, что химиотерапевтическое лечение усугубляет гиперкоагуляцию, вызванную опухолевым процессом [Терещенко И.П., Кашулина А.П., 1983]. Можно предположить, что нормализующее действие экстракта шлемника байкальского на показатели свертывающей системы крови в условиях цитостатической терапии является одним из механизмов его ингибирующего действия по отношению к процессу диссеминации опухолевых клеток. Вместе с тем, было показано, что байкалин является типичным антикоагулянтом прямого действия [Kubo M, Matsuda H., Tani Т. е.а., 1985], при этом извест-

но, что антикоагулянты улучшают проникновение противоопухолевых препаратов к опухолевым клеткам, а также предотвращают покрытие фибрином опухолевых клеток, что делает их доступными для ЕКК [Gorelik Е., 1980]. Наряду с повышением гиперкоагуляции крови, цитостатик усугубляет состояние гиперкортицизма, связанного с прогрессированием опухолевого процесса [Presiosi P., Vacca M., 1983; Дейчман Г.И., 1984]. По-видимому, ЭШБ регулирует гормональный статус организма животных с опухолью на фоне химиотерапевтического воздействия, создавая неблагоприятные условия для развития новообразований и метастатического процесса путем влияния на продукцию гормонов коры надпочечников.

Кроме того, потенцирование противоопухолевого действия циклофос-фана ЭШБ, в значительной мере может быть связано с мембранопротектив-ной и антиоксидантной активностью исследуемого экстракта. Известно, что метаболиты циклофосфана обладают способностью концентрироваться в клеточных, митохондриальных и микросомальных мембранах и, включаясь в свободнорадикальную фракцию, индуцировать перекисное окисление липи-дов (ПОЛ), продукты которого нарушают их структуру и функции, что в свою очередь приводит к нарушению всех клеточных процессов, протекающих с участием энергии [Олейник А.В., 1985; 1986]. В работе P.P. Сайфут-динова (1997) было показано, что байкалин, являющийся, основным действующим флавоноидом ЭШБ, обладает способностью препятствовать дезинтеграции мембранных структур и предотвращать нарушения активности ми-тохондриального аппарата в связи с прямым мембранотропным действием. Накопление избыточного количества продуктов ПОЛ реализуется в подавлении синтеза и активности ключевых ферментов гидроксилирующей системы микросом печени и замедлении метаболизма лекарственных препаратов. ЭШБ обладает способностью активировать микросомальную биотрансформацию цитостатиков и повышать дезинтоксикационную функцию печени [Гольдберг В.Е., Дыгай A.M., Новицкий В.В., 1992].

Согласно современным представлениям о механизмах канцерогенеза, взаимоотношениях опухоли и организма, а также данных последних лет о механизмах действия МБР различной природы, можно предположить, что в большинство указанных процессов вовлекаются факторы неспецифической резистентности организма.

В этой связи, следует остановиться на характеристике механизмов, задействованных в реализации противоопухолевой активности и антиметаста-

тического эффекта исследованного нами препарата и его комбинации с цик-лофосфаном.

Основными звеньями противоопухолевой защиты, ответственными за элиминацию злокачественных элементов, принято считать такие клетки системы естественной цитотоксичности, как макрофаги и естественные киллер-ные клетки [Дейчман Г.И., 1984; Чекнев СБ., 1999].

Мононуклеарные фагоциты играют важную роль в противоопухолевой защите организма. Моноциты и макрофаги непосредственно участвуют в качестве эффекторов в реакциях ЕЦТ. Цитотоксические механизмы, посредством которых осуществляется макрофагопосредованный киллинг опухолевых клеток, можно условно разделить на контактные и дистантно действующие, причем необходимым условием для реализации первых является тесное взаимодействие макрофага с опухолевой клеткой. В качестве медиаторов ци-тотоксичности макрофагов выступают активные формы кислорода, такие как перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др., генерируемые в системе NADFH-оксидазы [Чердынцева Н.В., Клишо Е.В., Кондакова И.В., 1998], окись азота, являющаяся продуктом NO-синтазной реакции [Maragos СМ., Wang J.M., Hrablie JA, 1993; Martin J.H., Edwards S.W., 1993], протеолитические энзимы, а также широкий спектр цитокинов, основными из которых являются

Исследование динамики цитотоксической активности перитонеальных макрофагов у мышей с карциномой легких Льюис при однократном применении циклофосфана выявило, что введение цитостатика оказывало стимулирующее влияние на цитотоксичность макрофагов (соотношение эффекторов и мишеней 10:1) на 13-е, 19-е и особенно на 22-е сут после трансплантации опухоли. По-видимому, этот эффект связан со способностью циклофос-фана в низких дозах оказывать иммуностимулирующее влияние на функциональную активность макрофагов [Навашин СМ., Вядро М.М., 1991].

Курсовое введение ЭШБ при развитии карциномы легких Льюис снижало гиперактивацию перитонеальных макрофагов на 13-е и 17-е сут после трансплантации опухоли, а на 19-е, 22-е сут эксперимента препарат незначительно повышал цитотоксическую активность макрофагов. Таким образом, ЭШБ оказывал модулирующее влияние на функциональную активность пе-ритонеальных макрофагов при данной экспериментальной модели злокачественного роста. Комбинированное использование экстракта шлемника и циклофосфана также способствовало повышению цитотоксичности перито-

неальных макрофагов на поздние сроки исследования (17-е, 19-е и 22-е сут после трансплантации опухоли).

Вероятно, что одним из механизмов усиления цитототоксической активности перитонеальных макрофагов при развитии неопластического процесса под влиянием ЭШБ является повышение выработки ИЛ-1 и ФНО, которые могут выступать медиаторами функциональной активности макрофагов [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Соколова Е.В. и др., 1995; Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Белявская В.А. и др., 2001]. Это предположение подтверждается данными, полученными при тестировании содержания изучаемых цитокинов в культуральных супернатантах макрофагов.

Так, под действием экстракта шлемника байкальского у мышей с карциномой легких Льюис повышалась продукция ИЛ-1Р и ФНО-а перитоне-альными макрофагами в терминальную стадию опухолевого процесса. Соче-танное применение экстракта шлемника и циклофосфана приводила к усилению выработки ИЛ-10 и ФНО-сс клетками-эффекторами, но также лишь на поздние сроки злокачественного роста (рис. 1а, б).

ИЛ-1 является важнейшим регулятором иммунного ответа, воспалительных и противоопухолевых реакций. Антибластомная активность ИЛ-1 может реализоваться как в прямом цитотоксическом действии в отношении злокачественно трансформированных клеток, так и модулирующем влиянии данного цитокина на систему естественной цитотоксичности. Эффективность ИЛ-1 отмечена при ряде опухолей у мышей, в том числе и карциномы легких Льюис у мышей гибридов Б^СВАхС57В1/6) [Навашин СМ., Вядро М.М., 1989]. ИЛ-1 стимулирует активность клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности (моноцитов/макрофагов, ЕКК, Т-лимфоцитов). Так, изучаемый цитокин способствует восстановлению сниженного литиче-ского потенциала Т-клеток и ЕКК у мышей-опухоленосителей. ИЛ-1 является амплификатором продукции цитокинов, проявляющих противоопухолевую активность (ИЛ-2, ИФН-у, ФНО-а) [Ковальчук Л.В., 1997; Фрейдлин И.С., 2001].

Кроме того, ИЛ-1 является медиаторной молекулой, воздействующей на нейроэндокринную систему [Михайлова А.А., 1992; Симбирцев А.С., 1998]. При этом данный цитокин способен проникать в мозг через гематоэн-цефалический барьер в участках системы циркумвентрикулярных органов [Крыжановский Г.Н., 1997], в которых существуют специфические механизмы транспорта цитокинов. Попадая в мозг, он стимулируют секрецию кор-тикотропин-рилизинг гормона (КРГ) в гипоталамусе [Михайлова А.А., 1992;

Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001]. КРГ по портальным сосудам достигает гипофиза и индуцирует секрецию АКТГ и глюкокортикоидов, которые в физиологических концентрациях (10"1о-10"12 М) обладают стимулирующими эффектами на клетки иммунной и кроветворной систем (макрофаги, глюко-кортикоидчувствительные лимфоциты, незрелые кроветворные клетки), действуя на уровне генома клеток, вызывая или усиливая экспрессию рецепторов к ИЛ-1, 2, 4, 6, ИФН-у, ФНО [Калашникова ЕА, Кокаровцева С.Н., Пу-хальский АЛ., 2000].

Рис. 1. Динамика продукции ИЛ-1|} (А) и ФНО-а (Б) перитонеальными макрофагами мышей с карциномой легких Льюис (1), на фоне введения цик-лофосфана (2), экстракта шлемника байкальского (3) и их сочетанного применения (4). Заштрихованным символом обозначены достоверные различия по сравнению с контролем.

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - содержание ИЛ-1р и ФНО-а в супернатантах перитонеальных макрофагов (в процентах от уровня интактных животных).

ФНО также как и ИЛ-1 считается эффекторной молекулой, опосредующей киллинг опухолевых клеток макрофагами. ФНО осуществляет как

прямое цитотоксическое действие в отношении злокачественно трансформированных клеток, так и опосредованное, за счет иммунорегуляторного влияния на систему противоопухолевой защиты организма. Так, ФНО-сс является аутокринным и паракринным активатором макрофагов, индуцирует цито-токсическую и цитостатическую активность нейтрофилов в отношении опухолевых клеток [Навашин СМ., Вядро М.М., 1989; Зубова СП, Окулов В.Г., 2001]. Кроме того, имеются сведения, что ФНО является эффекторной молекулой естественных киллеров типа ЕС [Навашин СМ., Вядро М.М., 1989].

Естественные киллерные клетки - гетерогенная группа клеток, родственных лимфоцитам, способных лизировать лейкозные клетки и клетки солидных опухолей [Бикол^к К, 1997]. Морфологически они соответствуют большим гранулярным лимфоцитам и особенно значимы в контроле над процессами метастазирования [ИегЬегтап КВ., 1986]. Клеточные суспензии спленоцитов - наиболее распространенный объект исследования функциональной активности ЕКК, поскольку в селезенке определяется максимальный уровень цитотоксичности естественных киллеров [Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000].

Проведенные нами исследования показали, что однократное введение циклофосфана в дозе 125 мг/кг на 12-е сут после трансплантации опухоли приводило к снижению индекса цитотоксичности ЕКК на 13-е, 15-е, 17-е сут опухолевого роста. В терминальную стадию опухолевого процесса (19-22-е сут) цитостатик оказывал стимулирующее влияние на цитотоксическую активность ЕКК. Интерпретируя эти данные, можно предположить, что снижение функциональной активности ЕКК на 1-е, 3-е и 5-е сут, а также повышение - на 7-е и 10-е сут после однократного введения цитостатика, явилось следствием модулирующего влияния циклофосфана на клетки-эффекторы. Так, общепризнанным является тот факт, что в средних и высоких дозах цитостатик приводит к ослаблению функций ЕКК, но восстановление их активности происходит довольно быстро (в течение 7 сут), раньше, чем наблюдается регенерация остальных клеточных популяций [Глазанова Т.В., 1989; Наполов В.К., Борисов К.Б., 1991].

Курсовое введение ЭШБ незначительно стимулировало цитотоксическую активность ЕКК селезенки на 13-е, 15-е и 19-е сут, при этом на 17-е и 22-е сут исследования препарат снижал гиперактивацию эффекторов системы естественной цитотоксичности.

На основании полученных результатов можно предположить, что ЭШБ предохраняет ЕКК селезенки от биологически неоправданной в данных ус-

ловиях гиперактивации эффекторов. Подобное протекторное действие изучаемого экстракта предупреждает истощение функциональных резервов исследуемого пула клеток. Кроме того, ЭШБ, вероятно, обладает способностью воздействовать на другие клетки-эффекторы системы естественной ци-тотоксичности. Так, в исследованиях, проведенных сотрудниками лаборатории онкофармакологии НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, было показано, что жидкий ЭШБ увеличивает функциональную активность клеток лимфатических узлов, а также нейтрофилов, сниженную после введения цикло-фосфана [Разина Т.Г., 1988; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000].

Сочетанное применение цитостатика и препарата растительного происхождения сопровождалось повышением индекса цитотоксичности ЕКК на 13-е и 15-е сут после трансплантации опухоли (соотношение эффектор/мишень 100:1) относительно нелеченных животных, а также по сравнению с группой мышей, получивших циклофосфан. Вместе с тем на поздние сроки эксперимента (19-22-е сут) в данной опытной группе наблюдалось снижение исследуемого показателя относительно значений в контроле (хотя и статистически недостоверное) и в группе с введением противоопухолевого препарата. То есть, применение ЭШБ на фоне цитостатической терапии препятствовало снижению функциональной активности ЕКК, а также отменяло гиперактивацию изучаемых клеток-эффекторов, наблюдавшеюся при изолированном введении циклофосфана мышам с карциномой легких Льюис. Таким образом, ЭШБ оказывал модулирующее влияние на функциональную активность ЕКК у мышей с однократным введением циклофосфана в дозе 125мг/кг. Возможно, этот эффект опосредуется флавоноидами, которые рассматриваются как один из наиболее перспективных источников выделения модификаторов биологических реакций [Finlay G.J., Smith G.P. е.а., 1988; Wiltrout R.H., Hornung R.Z., 1988].

Функциональная активность ЕКК селезенки опосредуется иммуноре-гуляторными цитокинами, которые продуцируются как самими вышеперечисленными клетками, так и Т-хелперами. Главными из цитокинов являются и ИЛ-2. По мнению ряда авторов, является ключевым медиа-

тором в активации системы естественной цитотоксичности [Herderman R.B. 1986; Чекнев СБ., 1993]. Данный цитокин регулирует процесс дифференци-ровки ЕКК и цитотоксическое взаимодействие этих клеток с клетками-мишенями, стимулирует цитотоксические и регуляторные функции макрофагов, а также активирует цитотоксические лимфоциты. Кроме того, под действием ИФН-у повышается продукция цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-2,

ИЛ-12, ИФН-ß и ФНО-а [Чекнев СБ., 1993; Кузнецов В.П., 1998; Фревдлин И.С., 2001]. Следует также отметить, что ИФН-у является запускающей молекулой, которая опосредует киллинг опухолевых клеток макрофагами посредством оксида азота [Taub D.D., Сох G.W., 1995].

ИЛ-2 является одним из основных цитокинов, участвующих в противоопухолевой защите организма. В настоящее время созданы препараты на основе ИЛ-2, которые включены в схемы лечения иммуногенных опухолей, таких как, меланома, почечноклеточный рак, рак мочевого пузыря [Fisher R.I., Rosenberg S.A. e.a., 1995; Fyfe G., Franks C.R., Palmer P.A., 1995; Молчанов O.E., Попова И.А., Козлов В.К. и др., 2001]. Использование препаратов ИЛ-2 при онкологических заболеваниях базируется на ряде свойств, которые позволяют использовать его как противоопухолевый агент [Козлов В.К., Смирнов М.Н., Егорова В.Н. и др., 2001]. Во-первых, этот цитокин может воздействовать на опухолевые клетки опосредованно, через активацию ЕКК и их потомков - ЛАК, макрофагов, цитотоксических Т-лимфоцитов, индукцию продукции цитокинов, разрушающих опухоль а также ИЛ-2 способствует увеличению экспрессии HLA I класса, что улучшает распознаваемость чужеродных антигенов опухоли [Кондратенко И.В., Ярилин А.А., Хахалин Л.Н., 1992; Симбирцев А.С., 1998; Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М., 2002; Симбирцев А.С., 2002; Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Сидоров СВ., 2003]. Во-вторых, ИЛ-2 непосредственно вмешивается в процессы пролиферации и дифференцировки опухолевых клеток, ингибируя ангиогенез и подавляя экспрессию ростовых факторов опухоли [Schwartz МА, Baron V., 1999; Копнин Б.П., 2000; Молчанов О.Е., Карелин М.И., Жаринов Г.М., 2001]. В-третьих, ИЛ-2 уменьшает апоптоз СТ)4-лимфоцитов, наблюдаемый при контакте опухолевых клеток с нормальными лимфоидны-ми клетками [Williams N., 1996; Contreras D.B., Krammer P.H., Pokul R.K., 2000; Потапнев М.П., 2002], помимо этого, ИЛ-2 увеличивает продукцию эндогенных интерферонов, вызывая прямой апоптоз опухолевых клеток [Молчанов О.Е., Карелин М.И., Жаринов Г.М., 2001].

При изучении динамики продукции гуморальных факторов лимфоцитами селезенки при развитии карциномы легких Льюис было выявлено смещение баланса цитокинов, вырабатываемых Т-хелперами, в сторону Th2. Так, выработка ИЛ-4 усиливалась по сравнению с интактной группой животных (рис. За), а продукция ИФН-у (рис. 2а) и ИЛ-2 (рис. 26) была снижена на протяжении всего периода исследования. Следует отметить, что при данной экспериментальной модели злокачественного роста у мышей наблюда-

лась волнообразная динамика продукции ИЛ-1 лимфоцитами: снижение исследуемого показателя на 13-15-е сут эксперимента сменялось повышением выработки данного цитокина на более поздние сроки исследования (17-е и 22-е сут) по сравнению с интактными животными (рис. 36). Полученные нами результаты согласуются с данными ряда исследований, свидетельствующих о том, что при развитии в организме неопластического процесса наблюдается дисбаланс основных звеньев цитокиновой сети организма в сторону Th2 [Maeda H., Shiraishi A., 1996; Handel-Fernandez M.E., Cheng X., Herbert L.M., 1997; Kobayashi M., Kobayashi H., Richard B. e.a., 1998; Tabata Т., Hazama S., Yoshio S. e.a., 1999].

10 -1-,-1---

13 15 17 19 22

110

40 ---,-1---

13 15 17 19 22

Рис. 2. Динамика продукции ИФН-у (А) и ИЛ-2 (Б) лимфоцитами мышей с карциномой легких Льюис (1), на фоне введения циклофосфана (2), экстракта шлемника байкальского (3) и их сочетанного применения (4). Заштрихованным символом обозначены достоверные различия по сравнению с контролем.

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - содержание ИФН-7 и ИЛ-2 в супернатантах лимфоцитов (в процентах от уровня интактных животных).

Немаловажная роль в этом процессе отводится трансформирующему фактору роста р (ТФР-Р). Так, в работе Н. Maeda, A. Shiraishia A. (1996) было показано, что клетки лимфомы EL-4 способны продуцировать ТФР-Р как in vitro, так in vivo. Вырабатываемый клетками опухоли ТФР-Р индуцировал выработку ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-6 и при этом снижал продукцию ИЛ-2 и ИФН-у по мере роста опухоли. Кроме того, известно, что сами опухолевые клетки обладают способность продуцировать ряд цитокинов в качестве аутокрин-ных факторов роста, способствующих экспансии опухоли, в частности: ИЛ-6 - при миеломе, саркоме Калоши, ИЛ-10 - при лимфоме [Kyrtsonis M.-C, De-boussis G., Zerias С. е.а., 1996; Fortis С, Foppoli M., Gianotti L. e.a., 1996; Демина E.A., Вотякова О.М., 1996; Ярилин А.А., 1997; Шичкин В.П., 1998; Фрейдлин И.С., 2001]. В свою очередь ИЛ-10 тормозит образование конкурентных ИЛ-2 и ИФН-у, способствуя развитию Th2, продуцирующих медиаторы, стимулирующие рост опухоли [Беклемишев Н.Д., 1998], а ИЛ-6 ауток-ринно ингибирует продукцию макрофагами ИЛ-1 и ФНО-а [Фрейдлин И.С., 2001]. Таким образом, при росте карциномы легких Льюис происходит селективное подавление функций ТЫ, с которыми ассоциируется противоопухолевая защита организма.

Как показали наши исследования, ЭШБ стимулировал продукцию ИЛ-2 спленоцитами в терминальную стадию опухолевого процесса (19-е сут) (рис. 26). Выявленное наряду с этим снижение выработки ИЛ-4 (15-е сут) указывает на способность ЭШБ частично корректировать нарушенный баланс цитокинов, продуцируемых Т-хелперами селезенки (рис. За). На сегодняшний день хорошо известен феномен функционального антагонизма между ИЛ-2 и ИЛ-4 по их влиянию на противоопухолевый иммунный ответ (считается, что противоопухолевая защита ассоциируется с цитокинами, продуцируемыми ТЫ, а опухолевая прогрессия - Th2). В частности, ИЛ-2 избирательно активирует дифференцировку ТЫ, вырабатывающих цитоки-ны, с которыми связана противоопухолевая защита организма [Симбирцев А.С., 2002]. ИЛ-4 подавляет индуцированную ИЛ-2 противоопухолевую активность ЛАК и моноцитов, ингибируя продукцию ими ряда цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а, ИФН-у [Лихванцева В.Г., Слепова О.С., Бровкина А.Ф., 2001]. Вместе с тем, растительный препарат оказывал стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-10 лимфоцитами селезенки на протяжении всего эксперимента, за исключением 15-х сут, когда данный показатель был досто-

верно ниже фона и контроля (рис. 36). Комбинированное использование экстракта шлемника и циклофосфана приводило к повышению продукции ИФН-у на 17-е и 22-е сут и ИЛ-2 на 13-е и 15-е сут исследования спленоци-тами мышей с карциномой легких Льюис (рис. 2а, б), однако при этом происходило усиление выработки ИЛ-4 на 13-е, 17-е, 22-е сут и ИЛ-10 в эти же сроки эксперимента (рис. 3 а, б). Отмеченный нами феномен индукции выработки цитокинов клетками иммунной системы мышей, получавших

900 >00 700 600 500 400 300 200 100 0

13 15 17 19 22

Рис. 3. Динамика продукции ИЛ-4 (А) и ИЛ-10 (Б) лимфоцитами мышей с мышей с карциномой легких Льюис (1), на фоне введения циклофос-фана (2), экстракта шлемника байкальского (3) и их сочетанного применения (4). Заштрихованным символом обозначены достоверные различия по сравнению с контролем.

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - содержание ИЛ-4 и ИЛ-10 в супернатантах лимфоцитов (в процентах от уровня интактных животных).

ЭШБ при однократном введении циклофосфана, позволяет раскрыть механизмы, опосредующие иммуномодулирующие и противоопухолевые свойства данного препарата.

Известно, что цитокиновый каскад обеспечивает последовательную или одновременную секрецию различных цитокинов в ответ на продукцию какого-либо цитокина. В частности, ИЛ-2 стимулирует лимфоциты к продукции ИФН-у [Чердынцева Н.В., 1999], который в свою очередь кроме прямого антипролиферативного действия на опухолевые клетки, может оказывать модулирующее влияние на их мембраны, приводя к снижению метастатического потенциала и повышению чувствительности к действию цитоста-тических препаратов. Вместе с тем, ИФН-у усиливает экспрессию антигенов ЫЬА на мембранах опухолевых клеток [Ершов Ф.И., 1996]. Одновременно происходит цитокин-индуцированная модуляция функциональной активности эффекторных клеток в иммунокомпетентных тканях. Активированные клетки иммунной системы способны мигрировать в опухолевую ткань, где наряду с цитотоксическим действием неспецифических клеток-эффекторов (макрофаги, ЕКК), может иметь место и специфический иммунный ответ на опухолевые клетки в связи с повышением антигенности опухоли в условиях повреждающего действия химиопрепарата и с уже упоминавшейся выше возможностью усиления экспрессии антигенов ЫЬА, необходимых для запуска специфической активации Т-лимфоцитов антиген-презентирующими клетками [Чердынцева Н.В., 1999].

Снижение роста опухоли, а также процесса метастазирования при использовании ЭШБ на фоне цитостатической терапии может быть обусловлено опосредованной ИФН-у, ИЛ-1 и ИЛ-2 модификацией чувствительности опухолевых клеток к цитостатику, потенцированием апоптоза как непосредственно, так и через активацию цитотоксических Т-лимфоцитов, ЕКК, избирательное накопление которых в метастазах также регулируется цитокинами [Ярилин А.А., 1997]. Наряду с повышением чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии, иммунокомпетентные клетки играют важную роль в плане защиты нормальных клеток от токсического действия цитостатических препаратов и ионизирующего излучения. Так, например, хорошо известно цитопротекторное действие ИЛ-1 при терапии алкилирующими препаратами [Чердынцева Н.В., 1999].

По мере роста карциномы легких Льюис в селезенке экспериментальных животных повышалась продукция оксида азота. Биологические эффекты оксида азота чрезвычайно многообразны. В зависимости от концентрации он

способен оказывать различные, подчас противоположные действия. Так, высокие концентрации N0 обладают выраженным антипролиферативным эффектом в отношении Т-лимфоцитов, а низкие способствуют их пролиферации [Liev F.Y., 1995]. Повышение содержания оксида азота в организме опу-холеносителя также неоднозначно. Так, данные литературы свидетельствуют об иммуносупрессорном влиянии NO [Hofman RA., Nussler N.C., Gleixner S.L. e.a., 1997; Lejeune P., Lagadec P., Onier N., 1997]. Вместе с тем существует и другая точка зрения, согласно которой оксид азота оказывает цитоток-сическое действие на опухолевые клетки [Stuehr D.J., Nathan C.F., 1989; Martin J.H.J., Edwards S.W., 1993].

Повышение продукции N0 спленоцитами при развитии карциномы легких Льюис, вероятно связано с активацией естественных супрессорных клеток ^СК). Так, рядом авторов показано, что опухолевый рост сопровождается активацией EŒ. костного мозга, с последующей их миграцией в селезенку [Кусмарцев С А, 1990; Трофимова E.C, 2002], карцинома легких Льюис не составляет исключения [Young MR., Newby M, Wepsis H.T., 1987]. Из селезенки супрессорные клетки мигрируют в саму опухоль и лимфатические узлы, где за счет выработки ими супрессорных факторов, таких как и др. способствуют подавлению противоопухолево-

го иммунитета [Young M.R., Wright MA, Matthews J.P., 1996]. Известно, что оксид азота также является медиатором иммуносупрессорного действия EСК [Вельская Н.В., Данилец М.Г., Вельский Ю.П. и др., 2000; Angulo I., Rullas J., Campillo J. A. e.a., 2000]. Вместе с тем, по данным литературы EŒ. наряду с иммуносупрессорным эффектом могут опосредовать и противоопухолевой эффект у мышей [Seledtsov V.I., Taraban V.Y., Seledtsova G.V., 1997; Бель-ский Ю.П., Вельская Н.В., Данилец М.Г. др., 1999].

Сочетанное введение экстракта шлемника с циклофосфаном приводило к усилению выработки оксида азота спленоцитами мышей лишь в терминальную стадию опухолевого процесса. Очевидно этот процесс связан с повышением продукции ИФН-у Т-лимфоцитами селезенки, зарегистрированном при комбинированном применении двух препаратов. Так как, известно, что этот цитокин является основным индуктором индуцибельной NO-синтазы в организме [Arai К., Nishida J., Hayashida К. e.a., 1990; Meet K.L., Ofenstein J.P., Sarnaik A.P. e.a.., 1998].

Анализ полученных нами результатов и литературных данных, посвященных механизмам действия ЭШБ, позволяет нам предположить следующие закономерности в реализации влияния данного препарата на опухоле-

вый процесс. Так, в наших экспериментах было показано, что комбинированное использование препарата растительного происхождения и циклофос-фана in vitro повышало число антителообразующих и розеткообразующих клеток, т.е. оказывало непосредственное влияние на клеточные элементы системы иммунитета животных, что может проявляться и при развитии опухоли. Кроме того, применение экстракта шлемника в процессе противоопухолевой химиотерапии больных раком легкого, предотвращает снижение относительного числа Т-лимфоцитов и существенно повышает количество Т-хелперов [Матяш М.Г., 1996]. Вместе с тем, экстракт шлемника байкальского, по-видимому, оказывает системное воздействие на организм животного с опухолью при цитостатической терапии путем влияния на ЦНС. Последнее предположение кажется вполне обоснованным в связи с наличием у данного препарата выраженных ноотропных свойств [Першина О. В., Суслов Н. И., Провалова Н. В. и др., 2002]. На сегодняшний день существуют экспериментальные и клинические работы, в которых говорится о непосредственном влиянии препаратов шлемника байкальского на ЦНС при онкологическом процессе в условиях проведения химиотерапии [Удинцев С.Н., 1993; Рыжа-ков В.М., 1998]. Так, в исследованиях В.М. Рыжакова (1998) убедительно доказана способность ЭШБ оказывать модулирующее влияние на состояние тонуса и реактивность вегетативной нервной системы. Кроме того, согласно данным С.Н. Удинцева (1993), ЭШБ в процессе развития опухоли и проведения лечебного химиотерапевтического воздействия реализует свои стабилизирующие эффекты на гомеостатические системы макроорганизма посредством изменения функционального состояния нейроэндокринного аппарата, снижая продукцию АКТГ, что приводит к уменьшению продукции глюко-кортикоидов и повышая чувствительность гипоталамуса к регуляторным сигналам. Вместе с тем, известно, что иммунокомпентентные клетки (Т-, В-лимфоциты, макрофаги, ЕКК) экспрессируют на своей поверхности специфические рецепторы к катехоламинам, нейропептидам, нейромедиаторам [Захарова Л.А., Петров З.В., 1991; Михайлова А.А., 1992; Mihm S., 1992; Ар-цимович Н.Г., Галушкина Т.С., 2000; Агаджанян В.В., 2003]. При этом установлено, что формирование иммунного ответа сопровождается изменением функциональной активности центральной нервной системы [Абрамов В.В., 1995]. Указанные изменения индуцируются при помощи следующих механизмов. Во-первых, в процессе иммуногенеза возможно воздействие гуморальных факторов, продуцирующихся иммунокомпетентными клетками, на чувствительные нервные окончания (расположенные в паренхиме лимфоид-

ных органов в непосредственной близости от указанных клеточных элементов) [Bret-Dibat J.-L., Bluthe R.-M, Kent S. e.a., 1995; Абрамов В.В., Егоров Д.Н., Вардосанидзе К.В., и др., 1998]. Во-вторых, описана способность ин-терлейкинов [Pousset F., 1993; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001] и даже активированных моноцитов, Т-лимфоцитов [Gordon S., Anderson P.B., Lawson L. e.a., 1993; Greenwood J., Wang Y., Calder V.L., 1995] и ЕКК [Арцимович Н.Г., Галушина T.C., 2000] проникать в мозг через гематоэнцефалический барьер в участках системы циркумвентрикулярных органов с последующим их задействованием на этом уровне.

Таким образом, ЭШБ наряду с регуляцией чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии, обладая мембраностабилизирующей и антиок-сидантной активностью, играет важную роль в защите нормальных клеток от токсического действия цитостатических препаратов. Вместе с тем, изучаемый препарат усиливает эффекторные эндогенные механизмы, осуществляющие противоопухолевую защиту как на клеточном (система естественной цитотоксичности), так и на гуморальном уровнях.

ВЫВОДЫ

1. Курсовое введение экстракта шлемника байкальского оказывает стимулирующее влияние, как на гуморальный (антителообразование), так и на клеточный (реакция гиперчувствительности замедленного типа, макрофа-гальный фагоцитоз, пролиферативная активность лимфоцитов) иммунный ответ у интактных мышей.

2. Экстракт шлемника байкальского при добавлении in vitro на фоне применения циклофосфана оказывает иммуномодулирующее влияние, восстанавливая подавленную цитостатиком функциональную активность анти-телообразующих и розеткообразующих клеток.

3. Применение экстракта шлемника байкальского повышает противоопухолевое и противометастатическое действие циклофосфана при развитии карциномы легких Льюис.

4. Курсовое введение экстракта шлемника байкальского оказывает модулирующее влияние на функциональную активность перитонеальных макрофагов: на 13-е и 17-е сутки после трансплантации опухоли препарат снижает гиперактивацию перитонеальных макрофагов, а на 19-е, 22-е сутки эксперимента незначительно повышает цитотоксическую активность макрофагов. Комбинированное использование экстракта шлемника и циклофосфана способствует повышению цитотоксичности перитонеальных макрофагов на

поздние сроки исследования (17-е, 19-е и 22-е сутки после трансплантации опухоли).

5. Под действием экстракта шлемника у мышей с карциномой легких Льюис повышается продукция перитонеальными макрофагами в терминальную стадию опухолевого процесса. Сочетанное применение экстракта шлемника и циклофосфана приводит к усилению выработки

клетками-эффекторами по сравнению с изолированным введением растительного препарата, но также лишь на поздние сроки злокачественного роста.

6. Применение экстракта шлемника не оказывает выраженного влияния на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток при развитии карциномы легких Льюис. При этом использование растительного препарата в комбинации с циклофосфаном повышает индекс цитотоксично-сти естественных киллеров на 13-е и 15-е сутки после трансплантации опухоли и снижает гиперактивацию клеток-эффекторов на поздние сроки эксперимента.

7. При развитии карциномы легких Льюис наблюдается смещение баланса цитокинов, продуцируемых Т-хелперами, в сторону ТЪ2. При этом введение экстракта шлемника частично корректирует нарушенный баланс цитокинов (выработка ИЛ-2 усиливется, а ИЛ-4 - уменьшается). Вместе с тем, растительный препарат оказывает стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-10 лимфоцитами селезенки и не влияет на секрецию ИФН-у.

8. Комбинированное использование экстракта шлемника и циклофосфа-на приводит к повышению продукции ИФН-у и ИЛ-2 спленоцитами мышей с карциномой легких Льюис, однако при этом происходит и усиление выработки ИЛ-4 и ИЛ-10.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Влияние экстракта шлемника байкальского и его комбинации с цик-лофосфаном на состояние системы естественной цитотоксичности у мышей с карциномой легких Льюис // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - Т. 137. - № 5. - С. 538-541. (в соавт. с Шерстобоевым Е.Ю., Зуевой Е.П., Разиной Т.Г. и др.).

2. Продукция цитокинов клетками-эффекторами системы естественной цитотоксичности мышей при развитии карциномы легких Льюис // Бюллетень Сибирской медицины. - 2004. - № 2. - С. 24-28. (в соавт. с Шерстобоевым Е.Ю., Зуевой Е.П., Разиной Т.Г. и др.).

3. Влияние жидкого экстракта шлемника байкальского на некоторые параметры иммунитета в норме и при опухолевом росте // Материалы пятого конгресса молодых ученых и специалистов "Науки о человеке". - Томск, 2021 мая 2004. - С. 81-83. (в соавт. с Шерстобоевым Е.Ю.).

4. Цитотоксическая активность естественных киллерных клеток у мышей с карциномой легких Льюис на фоне введения циклофосфана и экстракта шлемника байкальского // Тезисы докладов объединенного иммунологического форума. - Екатеринбург, 31 мая- 4 июня 2004. Russian Jornal of Immunology. - Vol. 9.- Sup. 1. - P. 22. (в соавт. с Шерстобоевым Е.Ю.).

5. Механизмы влияния экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на систему естественной цитотоксичности при опухолевом росте // Материалы пятой молодежной научной конференции СО РАМН " Фундаментальные проблемы современной медицины ". - Новосибирск, 2004. - С. 48-50.

6. Состояние системы естественной цитотоксичности мышей при развитии карциномы легких Льюис // Материалы российской научно-практической конференции посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН "Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии". - Томск, 24-25 июня 2004. - С. 309-310. (в соавт. с Шерстобоевым Е.Ю.).

Список сокращений

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АОК - антителообразующие клетки

ГАГ - гликозаминогликаны

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ПС - глюкокортикоиды

ЕКК - естественные киллерные клетки

ЕС - естественные супрессоры

ЕСК- естественные супрессорные клетки

ЕЦК - естественные цитотоксические клетки

ЕЦТ - естественная цитотоксичность

ИЛ - интерлейкин

ИФН-у - интерферон-гамма

КРГ - кортикотропин-рилизинг гормон

ЛАК - лимфокинактивированные киллеры

МБР - модификатор биологических реакций

простагландин

ПОЛ- перекисное окисление липидов

трансформирующий фактор роста

ФНО - фактор некроза опухоли

ЭБ - эритроциты барана

ЭШБ - экстракт шлемника байкальского

HLAI - молекула главного комплекса гистосовместимости класса I

LLC - карцинома легких Льюис

N0 - оксид азота

Th - Т-хелпер

№18 7 18

РНБ Русский фонд

2005-4 15439

Тираж 100. Заказ 1009.

Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы. В соответствии с современными представлениями существенное место в противоопухолевой защите организма занимает система естественной цитотоксичности (ЕЦТ) [Чекнев С.Б., 1993; 1999 а, в]. Реакции этой системы при опухолевом росте опосредуются следующими типами клеток: естественными (натуральными) киллерными клетками (ЕКК), мононуклеарными фагоцитами (моноцитами и макрофагами), Т-лимфоцитами, а также полиморфноядерными нейтрофилами [Семененя И.Н., 1991; Wahl L.M., Kleinman Н.К., 1998; Чекнев С.Б., 1999 а, б, в]. ЕКК и моно-нуклеарные фагоциты занимают ключевое положение в системе ЕЦТ, осуществляя как прямое цитотоксическое действие против злокачественно трансформированных клеток, так и опосредованное - через секрецию значительного числа цитокинов, важнейшими из которых являются ИФН-у [Кузнецов В.П., 1998; Фрейдлин И.С., 2001], ФНО-а [Зубова С.Г., Окулов В.Б., 2001], ИЛ-1 [Навашин С.М., Вядро М.М., 1989; Lin T.-J., Hirji N., Stenton G.R., 2000]. Кроме того, макрофаги продуцируют оксид азота, который обусловливает их цитотоксический эффект по отношению к опухолевым клеткам и патогенным микроорганизмам [Hibbs J.D., Taintor R.R., Vavrin Z. e.a., 1989; Maekawa H., Iwabuchi K., Nagaoka I. e.a., 2000]. Кроме ЕКК и мононук-леарных фагоцитов к эффекторным клеткам системы естественной цитотоксичности относятся Т- и В-лимфоциты, полиморфноядерные нейтрофилы, а также тромбоциты [Чекнев С.Б., 1999 б; Васильева Г.И., Иванова И.А., Тю-кавкина С.Ю., 2000; Головознин М.В., 2001]. С другой стороны Т-лимфоцитам, а именно субпопуляции Т-хелперов (Thl и Th2) отводится роль главных регуляторов иммунного ответа из-за их способности продуцировать широкий спектр цитокинов. Считается, что противоопухолевая защита ассоциируется с Thl-типом иммунного ответа, в то время как опухолевая прогрессия с Th2-типом [Потапнев М.П., 2002].

Одним из основных методов лечения злокачественных новообразований до настоящего времени остается цитостатическая терапия. Однако возможности химиотерапии лимитируются выраженными побочными эффектами цитостатических препаратов, связанных в первую очередь с низкой селективностью канцеролитического эффекта большинства известных в настоящее время цитостатиков и их токсическим влиянием на нормальные активно пролиферирующие клеточные системы организма [Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986; Кудаева И.В., 1997; Huitema A.D., Spander М., Mathit R.A. е.а., 2002; Katoh С., Kitajima S., Saga Y. e.a., 2002; Nicol D., 2002]. Кроме того, применение противоопухолевых препаратов усугубляет и без того нарушенный баланс основных звеньев иммунитета, приводя к вторичному иммунодефициту [Напалков Н.П., Бохман Я.В., Гранов A.M. и др., 1995].

В связи с этим, при проведении химиотерапии для повышения эффективности лечения применяют модификаторы биологических реакций (МБР) -агенты различной природы, воздействующие как на опухолевые клетки, так и различные регуляторные системы организма. В их число входят природные и синтетические иммуномодуляторы, цитокины, индукторы созревания и дифференцировки клеток, моноклональные антитела и др. [Навашин С.М., В ядро М.М., 1989; Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г и др., 2003]. К сожалению, некоторые группы модификаторов биологических реакций, используемые в терапии злокачественных новообразований, не лишены недостатков, при их использовании нередко наблюдаются различные побочные эффекты, отсутствие антиканцерогенного действия, а иногда и усиление опухолевого роста [Симбирцев А.С., 1998; Гершанович M.JL, 2003; Киселевский М.В, 2003].

Препараты растительного происхождения - особая группа модификаторов биологических реакций, выгодно отличающаяся от остальных лекарственных средств, прежде всего широким спектром регулирующих эффектов, низкой токсичностью и отсутствием побочных явлений, а также высокой биологической доступностью [Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000]. Многочисленные данные указывают на возможность не только усиления с помощью растительных средств эффективности цитостатической терапии, но и существенного снижения токсичности последней [Валавичус Ю.М., Янкави-чус К.К., Вайчунене Я.А. и др., 1989; Зуева Е.П., Разина Т.Г., Амосова Е.Н., 1997; Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г и др., 2003]. Особенно важным свойством фитопрепаратов является их способность влиять как на цитоток-сическую, так и на секреторную функции клеток, в частности на продукцию ФНО, ИФН-у, ИЛ-1 и ИЛ-2, КСФ [Yesilada Е., Ustun О., Sezik Е. е.а., 1997; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Вершинина С.Ф., Потявина Е.В., 2003], при этом наблюдается нормализация нарушенного баланса субпопуляций Т-лимфоцитов при развитии в организме опухоли [Вершинина С.Ф., Потявина Е.В.,2003].

В этом отношении большой интерес для исследования представляет жидкий экстракт шлемника байкальского. В ряде работ сотрудников НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН было показано, что жидкий экстракт шлемника байкальского подавляет процесс метастазирования и ингибирует рост перевиваемых опухолей. Кроме того, использование данного препарата при химиотерапии животных с опухолями приводит к повышению противоопухолевого и противометастатического эффектов цитостатиков и снижает их лейкопенический эффект [Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., 1990; Удинцев С.Н., Разина Т.Г., Яременко К.В., 1990; Разина Т.Г., Литвиненко В.И., Попова Т.П. и др., 1993]. Изучение механизмов влияния жидкого экстракта шлемника байкальского на состояние системы естественной цитоток-сичности при опухолевом росте является важным моментом для совершенствования терапевтических подходов при лечении злокачественных новообразований.

Цель исследования. Изучить влияние жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на состояние системы естественной цитотоксичности мышей при развитии карциномы легких Льюис.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние жидкого экстракта шлемника байкальского на гуморальный (антителообразование) и клеточный (реакция гиперчувствительности замедленного типа, макрофагальный фагоцитоз, пролиферативная активность лимфоцитов) иммунный ответ у интактных мышей.

2. Оценить противоопухолевое и антиметастатическое действие жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном при развитии карциномы легких Льюис.

3. Исследовать цитотоксическую активность перитонеальных макрофагов мышей с карциномой легких Льюис при введении жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном.

4. Изучить цитотоксическую активность естественных киллерных клеток мышей с карциномой легких Льюис при введении жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном.

5. Исследовать изменение секреторной активности клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности (естественных киллерных клеток, перитонеальных макрофагов, Т-лимфоцитов) под влиянием экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном.

Положения, выносимые на защиту:

1. Курсовое введение экстракта шлемника байкальского (ЭШБ) оказывает стимулирующее влияние на некоторые параметры иммунного ответа у интактных животных. При добавлении ЭШБ in vitro препарат оказывает иммуномодулирующее действие, нивелируя цитотоксическое влияние циклофосфана.

2. Экстракт шлемника байкальского обладает способностью повышать противоопухолевое и антиметастатичекое действие циклофосфана при развитии карциномы легких Льюис у мышей. Это связано с модуляцией функциональной активности естественных киллеров и перитонеальных макрофагов.

3. В основе модулирующего влияния изучаемого препарата на клетки-эффекторы системы естественной цитотокичности лежит способность ЭШБ в комбинации с цитостатиком индуцировать продукцию регуляторных цито-кинов (ИЛ-lp, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10). При этом изолированное введение растительного препарата частично корректирует нарушенный баланс цитокинов, наблюдаемый при развитии карциномы легких Льюис.

Научная новизна. Показано, что жидкий экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) оказывает стимулирующее действие, как на гуморальный, так и на клеточный иммунный ответ. При развитии карциномы легких Льюис ЭШБ потенцирует противоопухолевое и антиметастатическое действие циклофосфана. В ходе проведенной работы впервые изучены механизмы влияния жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с цикло-фосфаном на состояние системы естественной цитотоксичности при развитии карциномы легких Льюис. При этом установлена способность исследуемого препарата и его комбинации с циклофосфаном, модулировать функциональную активность естественных киллерных клеток и макрофагов, а также корректировать нарушенный баланс цитокинов при данной экспериментальной модели опухолевого роста у мышей. Кроме того, было отмечено, что ЭТТ ТЕ нивелирует иммуноцитотоксический эффект циклофосфана, путем влияния как на функциональную активность клеток-эффекторов системы еетественной цитотоксичности, так и секрецию ими широкого спектра медиаторов иммунного ответа (ФНО-а, ИЛ-1 (3, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10).

Практическое значение работы. Полученные данные расширяют имеющиеся представления о механизмах противоопухолевой защиты организма. Результаты работы могут быть использованы для разработки методов коррекции нарушений, возникающих в организме при применении цитостатиче-ских препаратов, а также патогенетически обоснованных методов противоопухолевой терапии с использованием препаратов, модулирующих функции клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на объединенном иммунологическом съезде (г. Екатеринбург, 2004), на конференции молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (г. Новосибирск, 2004), на пятом международном конгрессе молодых ученых "Науки о человеке" (г. Томск, 2004), на конференции посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН "Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (г. Томск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками, 31 таблицей и состоит из введения, 4 глав, выводов и указателя литературы, содержащего 248 источников (152 отечественных и 96 иностранных авторов).

выводы

1. Курсовое введение экстракта шлемника байкальского оказывает стимулирующее влияние, как на гуморальный (антителообразование), так и на клеточный (реакция гиперчувствительности замедленного типа, макрофа-гальный фагоцитоз, пролиферативная активность лимфоцитов) иммунный ответ у интактных мышей.

2. Экстракт шлемника байкальского при добавлении in vitro на фоне применения циклофосфана оказывает иммуномодулирующее влияние, восстанавливая подавленную цитостатиком функциональную активность анти-телообразующих и розеткообразующих клеток.

3. Применение экстракта шлемника байкальского повышает противоопухолевое и противометастатическое действие циклофосфана при развитии карциномы легких Льюис.

4. Курсовое введение экстракта шлемника байкальского оказывает модулирующее влияние на функциональную активность перитонеальных макрофагов: на 13-е и 17-е сутки после трансплантации опухоли препарат снижает гиперактивацию перитонеальных макрофагов, а на 19-е, 22-е сутки эксперимента незначительно повышает цитотоксическую активность макрофагов. Комбинированное использование экстракта шлемника и циклофосфана способствует повышению цитотоксичности перитонеальных макрофагов на поздние сроки исследования (17-е, 19-е и 22-е сутки после трансплантации опухоли).

5. Под действием экстракта шлемника у мышей с карциномой легких Льюис повышается продукция ИЛ-1|3 и ФНО-а перитонеальными макрофагами в терминальную стадию опухолевого процесса. Сочетанное применение экстракта шлемника и циклофосфана приводит к усилению выработки ИЛ-1|3 и ФНО-а клетками-эффекторами по сравнению с изолированным введением растительного препарата, но также лишь на поздние сроки злокачественного роста.

6. Применение экстракта шлемника не оказывает выраженного влияния на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток при развитии карциномы легких Льюис. При этом использование растительного препарата в комбинации с циклофосфаном повышает индекс цитотоксичности естественных киллеров на 13-е и 15-е сутки после трансплантации опухоли и снижает гиперактивацию клеток-эффекторов на поздние сроки эксперимента.

7. При развитии карциномы легких Льюис наблюдается смещение баланса цитокинов, продуцируемых Т-хелперами, в сторону Th2. При этом введение экстракта шлемника частично корректирует нарушенный баланс цитокинов (выработка ИЛ-2 усиливется, а ИЛ-4 - уменьшается). Вместе с тем, растительный препарат оказывает стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-10 лимфоцитами селезенки и не влияет на секрецию ИФН-у.

8. Комбинированное использование экстракта шлемника и циклофосфана приводит к повышению продукции ИФН-у и ИЛ-2 спленоцитами мышей с карциномой легких Льюис, однако при этом происходит и усиление выработки ИЛ-4 и ИЛ-10.

Заключение

Неопластический процесс является одним из наиболее сложных объектов исследования медицины. В настоящее время доказана ключевая роль системы естественной цитотоксичности в обеспечении противоопухолевой защиты организма. Лечение данной патологии на сегодняшний день включает применение лечебных воздействий, среди которых широко используются комбинации хирургических, лучевых и химиотерапевтических методов. Однако результаты не всегда являются положительными, возникающие в период цитостатического лечения серьезные осложнения становятся показанием для его прекращения.

Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных новообразований является использование биотерапевтических воздействий в сочетании с классическими методами лечения. Преимущество такого комплексного подхода заключается в одновременном повреждающем воздействии на опухолевые клетки и активации защитных механизмов организма, оказывающих в свою очередь противоопухолевый эффект. В качестве наиболее перспективных биотерапевтических воздействий рассматриваются модификаторы биологических реакций, проявляющие свой противоопухолевый эффект путем модуляции ответа организма на опухоль. В последнее время особый интерес вызывает использование в комбинированной терапии опухолей МБР растительного происхождения, выгодно отличающихся от остальных лекарственных средств, прежде всего широким спектром регулирующих эффектов, низкой токсичностью и высокой биологической доступностью.

Экстракт шлемника байкальского удовлетворяет всем вышеперечисленным требованиям, обладает широким спектром активности, подавляет процесс метастазирования и ингибирует рост перевиваемых опухолей, а также потенцирует противоопухолевый и противометастатический эффект цито-статиков. Однако механизмы влияния ЭШБ на противоопухолевую резистентность организма практически не исследованы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были проведены на 148 мышах-самцах линии CBA/CaLac и 292 мышах-самцах гибридах Fi(CBAxC57Bl/6) в возрасте 2 -2,5 месяцев, массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биологического моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Перед началом эксперимента мыши находились в стандартных пластиковых клетках (по 10-15 особей) с мелкой древесной стружкой на стандартном рационе. Все эксперименты были проведены в осенне-зимний период. Распределение животных по сериям экспериментов отображено в таблице 1.

Циклофосфан (производство Саранского комбината "Биохимик") вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 12-е сут после трансплантации опухоли. Корректором изменений со стороны иммунной системы служил жидкий экстракт шлемника байкальского («ГНЦЛС» г. Харьков). Жидкий экстракт шлемника байкальского представляет собой раствор экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этиловым спиртом из корней и корневищ растения. Стандартизован по содержанию флавоноида байкали-на. Использовали две схемы введения препарата, в зависимости от целей исследования и содержания эксперимента. Первой экспериментальной группе животных (мыши линии CBA/CaLac) ЭШБ вводили через зонд в желудок курсом в течение 5 дней, в дозе 1 мл/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды. В исследованиях, выполненных на животных с карциномой легких Льюис (вторая экспериментальная группа животных), ЭШБ вводили мышам, начиная с 6 суток после трансплантации опухоли и далее в течение 12 дней в той же дозе. Контрольным животным вводили соответствующий объем растворителя. В качестве фона использовали интактных мышей соответствующего пола и возраста.