Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Влияние рекомбинантного белка вируса натуральной оспы на биологические эффекты фактора некроза опухолей альфа

005010327

Басова Алёна Александровна

ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 0ЕЗ 20|2

Новосибирск - 2012

005010327

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Орловская Ирина Анатольевна

Аутеншлюс Александр Исаевич Королькова Ольга Юрьевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения РАМН (г. Томск)

Защита состоится « 1 » марта 2012 года в__________часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической

иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «» .^швтаа< 12 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета /Г)/

доктор медицинских наук Ольга Петровна Колесникова

Актуальность темы. Ключевую роль в развитии воспалительного процесса играют провоспалительные цитокины, в частности, ЮТ-а, П.-1,1Ь-6, интерфероны. Особое внимание придают провоспа-лительным свойствам ЮТ-а; гиперпродукция ЮТ-а приводит к развитию хронических воспалительных заболеваний, в том числе аутоиммунной природы. К числу заболеваний, при которых наблюдается гиперпродукция П^-а, относятся ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, системная красная волчанка, полимиозит, дерматомиозит, псориаз, атопический дерматит и многие другие. Наиболее веские доказательства патогенетического значения ЮТ-а получены при ревматоидном артрите, характеризующемся неуклонно прогрессирующим поражением суставов и внутренних органов. Под действием ЮТ-а повышается функциональная активность нейтрофилов, в том числе мигрировавших в сустав с образованием активных форм кислорода и высвобождением лизосомальных ферментов, которые оказывают повреждающее действие на хрящевую и костную ткань. Хронические воспалительные процессы часто сопровождаются формированием анемии. В основе патогенеза анемии хронических заболеваний лежат ЮТ-опосредованные нарушения пролиферации эритро-идных предшественников, продукции эритропоэтина. Таким образом, среди широкого спектра провоспалительных медиаторов, участвующих в развитии воспалительных процессов, особое внимание привлечено к ЮТ-а - основному цитокину, определяющему развитие воспаления [Насонов Е. Л., 2003].

В качестве подходов к антицитокиновой стратегии этих заболеваний используют различные ингибиторы ЮТ-а на основе генноинженерных продуктов, которые блокируют биологическую активность этого цитокина. [Кгетег 1.М. й а!., 2003, ЯесШсЬ К. е1 а1., 2003]. Необходимость расширения спектра анти-ЮТ-а препаратов диктуется тем, что существующие анти-ЮТ-а препараты обладают разной терапевтической эффективностью. Несмотря на достигнутые первые успехи в лечении воспалительных процессов, патогенетическое обоснование использования анти-ЮТ-а терапии остается важнейшей задачей. Известные в настоящее время ингибиторы ТОТ-а продемонстрировали относительно высокую эффективность в процессе контролируемых исследований терапии РА [вайкИпег в. е1 а1., 2006, Клгои К. А. ех а1.,

2006], но в реальной клинической практике около 30-40% пациентов рефрактерны к терапии этими препаратами, менее чем у половины удается достигнуть полной или частичной ремиссии, а около 1/3 вы-

нуждены прекращать лечение из-за развития вторичной неэффективности или побочных эффектов через 2-3 года терапии. Лечение известными в настоящее время ингибиторами TNF-a может сопровождаться развитием инфекционных осложнений, в первую очередь туберкулезной инфекции. [Dixon W.G. et al., 2006] Следовательно, существует необходимость создания препаратов нового типа, более безопасных и эффективно блокирующих активность TNF-a.

Цель исследования: Оценка in vitro и in vivo гемопоэз-модулирующей и противовоспалительной функций TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние вирусного белка (VARV-CrmB) на TNF-зависимые изменения колониеобразующей активности костномозговых гемопоэтических предшественников мыши и человека.

2. Исследовать влияние VARV-CrmB на TNF-зависимые изменения окислительно-метаболической активности и продукции IL-ip и IL-6 мононуклеарными клетками (МНК) человека.

3. Исследовать влияние VARV-CrmB на клинические проявления, костномозговой гемопоэз и окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов крови в модели коллаген-индуцированного артрита (КИА).

4. Исследовать костномозговой гемопоэз, окислительнометаболическую и миграционную функции лейкоцитов крови мышей при эпикутанном воздействии VARV-CrmB.

Научная новизна

Впервые показано, что в культуре клеток костномозговых гемопоэтических предшественников действие VARV-CrmB приводит к восстановлению TNF-индуцированного снижения количества эритро-идных колоний и повышения численности гранулоцитарных колоний мыши до исходного уровня. Воздействие VARV-CrmB дозозависимым образом восстанавливает TNF-обусловленное снижение колониеобразующей способности гемопоэтических предшественников человека.

Установлено, что предварительная соинкубация TNF-a и VARV-CrmB полностью отменяет стимулирующий эффект TNF-a на продукцию IL-ip и IL-6 в культуре МНК человека.

Впервые показано, что белок VARV-CrmB отменяет TNF-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода лейкоцитами мыши и человека.

На модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) впервые продемонстрировано, что введение мышам VARV-CrmB приводит к снижению степени активности артрита, коллагенолитической активно-

сти сыворотки (КАС) и содержания гликозаминогликанов (ГАГ) на ранних сроках развития КИА. Введение УАЮ/-СгтВ приводит к снижению численности нейтрофильных гранулоцитов и гранулоцитарных предшественников, а также к достоверному снижению окислительнометаболической активности лейкоцитов на ранних сроках развития КИА.

Впервые показано, что эпикутанное воздействие УА11У-СгтВ нормализует повышенную миграционную и окислительнометаболическую активность лейкоцитов гшТОТ-обработанных мышей. При эпикутанном воздействии УА11У-СгтВ оказывает корригирующие эффекты в отношении ЮТ-зависимых изменений колониеобразующей активности гемопоэтических предшественников.

Теоретическая и практическая значимость работы

Изучение влияния рекомбинантного белка вируса натуральной оспы на реализацию биологических эффектов ЮТ-а позволило выявить новые закономерности в регуляции гемопоэз-модулирующей и противовоспалительной функций этого цитокина.

Результаты исследования обосновывают новые подходы в лечении заболеваний человека, основанные на использовании вирусных белков. Белки вируса натуральной оспы, оказывающие влияние на биологические эффекты фактора некроза опухолей, являются перспективными для разработки нового метода антицитокиновой стратегии лечения заболеваний человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1.Белок УАЯУ-СгтВ восстанавливает ЮТ-зависимые изменения колониеобразующей активности гемопоэтических предшественников и окислительно-метаболической функции лейкоцитов мыши и человека.

2.Белок УА11У-СгтВ оказывает противовоспалительный эффект на ранних сроках формирования коллаген-индуцированного артрита.

Личный вклад автора в проведение исследования. Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийской научной конференции «Молекулярногенетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», г. Новосибирск (2010 год), 8-ой итоговой конференции НИИКИ СО РАМН «Иммуногенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (2011 год). Апробация диссертации состоялась 30 августа 2011г. на семинаре Института клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 127 страницах машинописного текста, включающего 12 таблиц и 27 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 183 литературных источника, в том числе 152 иностранных. Работа выполнена на базе лаборатории иммунобиологии стволовой клетки отдела экспериментальной иммунологии Института клинической иммунологии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы и среды. В работе использовались rmTNF-a, rhTNF-

a, выделенные из бактериального штамма-продуцента (1,5 мг/мл, ЗхЮ7 ME) [Пустошилова Н.М., 1994]. Выделение рекомбинантного VARV-CrmB (0,2 мг/мл) проводили по методу, описанному в работе [Лебедев Л.Р., 2001]. Поликлональные антитела к TNF-a (TNF АТ) получали путем иммунизации кроликов mrTNF-a и rhTNF-a. Использовались: моноклональные антитела к TNF-a компании «R&D System», среда М 3434 (Stem Cell Technology, Canada), среда Metho Cult GF H 4434 (Stem Cell Technology, Canada), среда RPMI-1640, бычий коллаген П типа («Sigma»). Поликлональные антитела к TNF-a, rmTNF-a, rhTNF-a, VARV-CrmB были предоставлены ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Животные. В экспериментах использовали мышей линии (CBAxC57Bl/6)F-l в возрасте 2-6 мес., полученных из вивария НИИКИ СО РАМН. Животных содержали и выводили из эксперимента в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Оценка числа коммитированных предшественников клеток костного мозга человека. Оценка производилась на донорских клетках костного мозга (ККМ) человека, которые были предоставлены НИИКИ СО РАМН. Для определения числа коммитированных предшественников ККМ в концентрации 2,5x104/мл инкубировали на 24-луночных планшетах с использованием метилцеллюлозной среды Metho Cult GF Н 4434 (Stem Cell Technology, Canada), содержащей

rSCF, rGM-CSF, rIL-3, rEpo. Гранулоцитарно-макрофагальные (KOE-ГМ), эритроидные (БОЕ-Э, КОЕ-Э) и гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии

подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada.

Оценка числа коммитированных предшественников клеток костного мозга мышей линии (CBAxC57BI/6)Fl. Клетки костного мозга в концентрации 2,5х104/мл инкубировали на 24-луночных планшетах в метилцеллюлозной среде М 3434 (Stem Cell Technology, Canada), содержащей цитокины SCF, ЕРО, IL-3, IL-6.

Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (БОЕ-Э, КОЕ-Э) и гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-

мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada.

Облучение животных. Облучение животных производили на аппарате РУМ-25 при мощности 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока ЮмА. Летальная доза составляла 8.5 Гр.

Определение количества колониеобразующих единиц селезенки КОЕ-с8. Клетки костного мозга в количестве 0,5х105/мышь вводили внутривенно летально облученным реципиентам. На 8-е сутки производили забой реципиентов, после фиксации селезенок в реагенте Телесницкого подсчитывали число макроскопически видимых колоний в селезенках.

Количество форменных элементов периферической крови (лейкоцитов и тромбоцитов) определяли с помощью гематологического анализатора ERMA PCI90 (Япония). Относительное количество форменных элементов крови подсчитывали на мазках, окрашенных по Романовскому-Г имзе.

Коллаген-индуцированный артрит (КИА) моделировали на мышах линии (CBAxC57B16)Fl с использованием бычьего коллагена П типа («Sigma»). В заднюю часть спины мышей подкожно вводили 45 мкг коллагена П типа с полным адъювантом Фрейнда («Difco») и через 18 суток повторно вводили коллаген П типа (45 мкг) с неполным адъювантом Фрейнда («Difco») в основание хвоста в 4-6 точках [Paul-Clark M.J. et al., 2002]. Всего каждому животному вводили по 90 мкг коллагена П типа. Поли-AbTNF и VARV-CrmB вводили мышам через 4 часа после разрешающей инъекции коллагена П типа, когда в крови животных увеличивается концентрация TNF [Kirou К. A. et al., 2006].

Животные были разделены на 4 группы: I-я - контрольная (животным вводили физ. раствор), П-я - мыши с КИА, Ш-я - животные с КИА, которым внутрибрюшинно вводили поликлональные антитела к TNF (поли-AbTNF) по 2 мкг/мышь (группа сравнения) и IV-я - мыши с КИА, которым внутрибрюшинно вводили по 2 мкг рекомбинантного TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы VARV-CrmB (основная группа).

Оценка степени активности КИА. Характер и степень активности КИА оценивали по 4-точечной шкале на каждой конечности. Критериями шкальной оценки активности КИА были: 0 - нормальный вид суставов и сохраненный объем движения в суставах; 1 - эритемы и отек конечностей; 2 - видимая деформация суставов; 3 - анкилоз суставов при сгибании [Inglis J.J. et al., 2007].

Оценка структурно-метаболических изменений соединительной ткани. О структурно-метаболических изменениях соединительной ткани в динамике развития КИА судили по коллагенолитиче-ской активности сыворотки (КАС) крови мышей и по суммарному содержанию гликозаминогликанов (ГАГ) [Шараев П.Н., 1987, Шараев П.Н., 1987]. Величины КАС и ГАГ выражали в микромолях оксипро-лина на 1 л сыворотки крови за 1 час (мкмоль оксипролина/л) и микромолях гексуроновой кислоты в 1 л сыворотки (мкмоль/л) соответственно. Оценка КАС и уровня ГАГ была проведена на базе кафедры биохимии НГМУ.

Оценка окислительно-метаболической функции лейкоцитов. МНК крови 6 здоровых доноров, выделенных в градиенте фиккол-урографина (р=1,077), культивировали в количестве 106/мл в RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гента-мицина 80 мкг/мл, 2мМ L-глутамина, 5х10'5 мМ меркаптоэтанола. Для оценки нейтрализующей активности использовали различные концентрации антител (полиАЬгмр - 1000, 100, 50, 8 нг/мл и моноАЬ-tnf - 100 и 50 нг/мл) и белка VARV-CrmB (100, 50, 10, 8 нг/мл), которые предварительно инкубировались с TNF-a при 37°С в течение 3 часов. После инкубации образцы растворов добавляли в культуру МНК. Во всех исследованиях использовали 2 нг/мл TNF.

Окислительно-метаболическую (ОМ) функцию МНК крови здоровых доноров оценивали с помощью люминол-зависимой хемилюми-несценции (ХЛ) [Tono-oka Т. et al., 1983]. Измерение интенсивности ХЛ ответа МНК проводили с помощью мультимодального планшетного ридера «LB 941 TriStar» («Berthold Technologies», Германия). Результаты ХЛ исследования выражали как суммарный ХЛ ответ МІЖ -Isum = имп/103 МНК/30 мин, где п - число импульсов, испускаемых

МНК в течение 30 минутного исследования, а также регистрировали его максимальное значение - Imax.

Оценка содержания цитокинов IL-ip и IL-6 в кондиционной среде культуры МНК. Содержание цитокинов IL-ip и IL-6 в кондиционной среде культуры донорских МНК оценивалось через 24 часа инкубации с помощью коммерческих тест-систем ИФА («Вектор-Бест», Новосибирск). Измерение IL-ip и IL-6 проводили с помощью мультимодального планшетного ридера «LB 941 TriStar» («Berthold Technologies», Г ермания).

Оценка миграции лейкоцитов при эпикутаиных аппликациях. Эпикутанную аппликацию rmTNF и VARV-CrmB на дорзальную поверхность обоих ушей мышей в объёме 25 мкл/ухо проводили по [Cumberbatch М. et al., 2005]. Животные были разделены на 4 группы: I-я (контрольная) группа - эпикутанная обработка фосфатным солевым раствором (PBS); П-я группа - эпикутанная аппликация rmTNF в дозе 500 нг/мышь; Ш-я группа - обработка рекомбинантным VARV-CrmB в дозе 500 нг/мышь; Г/ группа - 500 нг rmTNF + 500 нг VARV-CrmB спустя 30 мин. Животных выводили из эксперимента через 2, 24 и 72 ч после эпикутанной аппликации rmTNF и VARV-CrmB. Для оценки миграции клеток из кожного эксплантата уши промывали 70% этанолом, отделяли дорзальную часть кожи уха и помещали дермальной стороной вниз в ячейку 24-луночного планшета с 1 мл полной среды RPMI1640. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг- Затем клетки отсасывали в центрифужные пробирки, вносили в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды с 0,25% трипсином, инкубировали при 37 °С, затем вносили по 200 мкл полной среды RPMI1640, смывали прилипшие клетки и объединяли с первой порцией клеток в центрифужных пробирках. Клетки концентрировали центрифугированием при 1500 об/мин. Количество клеток, мигрировавших из одного уха, подсчитывали в камере Горяева.

При проведении исследований на МНК и ККМ у всех доноров было получено информированное согласие на использование данных обследования в научных целях и согласие этического комитета на проведение исследования. В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964,2000) и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Статистическая обработка данных. Статистическая обра-

ботка материала осуществлялась пакетом лицензированных программ Excel 7,0 и Statistica 5,0 с использованием среднего арифметического, ошибки средней, критерия Стьюдента. Результаты считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследование влияния VARV-CrmB на колониеобразующую активность ККМ мышей.

Для того чтобы оценить TNF-блокирующие свойства белка VARV-CrmB был проведен ряд экспериментов на модели костномозгового гемопоэза мыши при воздействии rTNF-a.

Было обнаружено, что VARV-CrmB в отсутствие rmTNF-a не оказывает эффекта на костномозговой гемопоэз мыши (количество эритроидных и гранулоцитарно-макрофагальных колоний под воздействием VARV-CrmB достоверно не изменялось), что можно интерпретировать как отсутствие токсического эффекта изучаемого белка на гемопоэтические предшественники (рис. 1).

Рис. 1. Влияние СгшВ на колониеобразующую активность ККМ мышей ВАЬВ/с.

Из данных представленных на рисунке 2 видно, что внесение гтТМР-а в различных концентрациях в культуру ККМ мыши приводило к достоверному снижению количества эритроидных предшественников (БОЕ-Э+КОЕ-Э). Вместе с тем при воздействии гтЮТ-а в концентрации 2 нг/мл наблюдалось достоверное увеличение числа КОЕ-ГМ по сравнению с контролем (культуральная среда), а при воздействии гглТОТ-а в концентрации 10 нг/мл не наблюдалось достоверного увеличения числа КОЕ-ГМ. Для исследования влияния VARV-СгтВ на гтТЭТ-индуцированные изменения констномозгового гемопоэза была выбрана концентрация гтТМ-'-сс 2 нг/мл.

В дальнейших экспериментах исследовалось влияние рекомби-

нантного белка-антагониста TNF (VARV-CrmB) в различных концентрациях на rmTNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ (рис. 3). Следствием воздействия rmTNF-a (2 нг/мл) в данной серии экспериментов было достоверное снижение количества эритроидных колоний (БОЕ-Э+КОЕ-Э) и достоверное повышение количества КОЕ-ГМ по сравнению с контролем. Воздействие VARV-CrmB приводило к дозозависимому усилению эритроидного колоние-образования и восстановлению количества КОЕ-ГМ до контрольного уровня.

Рис. 2. Влияние гтЮТ на колониеобразующую активность ККМ мышей. * - Достоверное снижение относительно контроля (р<0.05)

** Достоверное повышение относительно контроля (р<0.05)

650

еоо

^ 550 500 450 400

Ы

О 350 ?« 5 250 2 200

1150

| КОЕ-Э+БОЕ-Э 1 КОЕ-ГМ

УШ

2 3

Рис. 3. Влияние VARV-CrmB на rmTNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ мышей. 1: контроль, 2: 2 нг/мл rmTNF, 3 -5: 2 нг/мл гтТОТ+2нг/мл, 6 нг/мл и 12 нг/мл CrmB.

# Достоверное снижение относительно контроля (р < 0.05)

## Достоверное повышение относительно контроля (р < 0.05)

* Достоверное повышение относительно 2 нг/мл rmTNF-a (р < 0.05)

Исследование влияния УАКУ-СгтВ на колониеобразующую активность ККМ человека.

Были проведены эксперименты по исследованию влияния рекомбинантного белка-антагониста ЮТ-а (УАЯУ-СгтВ) в различных концентрациях на гИТЧБ-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ человека (рис.4). Предварительно было установлено, что гЬТОТ-а (2 нг/мл) достоверно снижал количество эрит-роидных и гранулоцитарно-макрофагальных колоний в культуре ККМ человека. Добавление в культуру клеток УАЯУ-СгтБ в дозе 2 нг/мл не оказывало влияние на гИТЫР-индуцированное снижение количества гемопоэтических предшественников. А в дозах 6 и 12 нг/мл УАЛУ-СгшВ дозозависимым образом повышал исследуемые показатели, отменяя эффект гИОТ-а.

I IКОЕ-Э+БОЕ-Э

Рис. 4. Влияние УА11У-СгтВ на ЛТЫР-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ человека. 1: контроль, 2: 2 нг/мл АТОТ, 3 -5: 2 нг/мл гЬТМБ+ 2 нг/мл, 6 нг/мл и 12 нг/мл СгшВ.

* - относительно контроля (р < 0.05); ** - относительно 2 нг ТОТ-а (р < 0.05)

Оценка влияния УАКУ-СгтВ на функциональную активность мононуклеарных клеток.

Биологическая активность ТЫБ-а опосредуется связыванием со специфическими рецепторами, экспрессированными на различных клетках, Поэтому было проведено исследование по оценке способности УАНУ-СгтВ отменять эффекты ТКТ-а на функциональную активность мононуклеарных клеток человека.

Было показано, что предварительная соинкубация ЮТ-а и белка УАКУ-СгшВ в различных концентрациях (100 нг/мл и 10 нг/мл) полностью отменяет эффекты ТМмх на продукцию 1Ь-1р и ГЬ-6 в культуре МНК, а концентрации ГЬ снижалась до уровня спонтанной

продукции (табл. 1). При изучении влияния ТОТ-связывающего белка вируса натуральной оспы (УА11У-СгтВ) на ЮТ-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода установлено, что тестируемый белок отменяет ЮТ-стимулированный хемилюминесцентный ответ клеток (табл. 2).

Таблица 1. Содержание цитокинов 1Ь-1р и 1Ь-б в кондиционной среде культуры МНК условно здоровых доноров через 24 ч после добавления в среду различных стимуляторов (М± т), п=6.____________

Группы 1Ь-13, пкг/мл 1Ь-6, пкг/мл

Спонтанная (без стимулятора) 3,1±1,1ь 112,8±21,2Ь

ТОТ 2 нг/мл 764,9±197,0а 1525,8±45,За

УАЛУ-СгтВ 100 нг/мл 8,7±1,4а’ь 186,1±32,5Ь

УАЛУ-СгтВ 50 нг/мл 9,5±4,0Ь 215,4±84,6Ь

УАЯУ-СгтВ 10 нг/мл 4,3±1,0Ь'С 107,2±19,2Ь

ТОТ 2 нг/мл+полиАЬют 1000 нг/мл 4,9±1,3Ь 155,а±31,4ь

ТИБ 2 нг/мл+полиАЬтот 100 нг/мл 8,1±1,7Ь 182,2±40,5Ь

ТОТ 2 нг/мл+полиАЬтот 50 нг/мл 18,7±13,2Ь 181,5±52,1ь

ТОТ 2 нг/мл+моноАЬтмр 100 нг/мл 8,2±1,8а’ь 170,4±37,1ь

ТОТ 2 нг/мл+моноАЬют 50 нг/мл 50,3±16,4а’ь 957,2±201,8а’ь

ТИТ 2 нг/мл+УАКУ-СгтВ 100 нг/мл 6,8±1,3Ь 164,3±37,7Ь

ТОТ 2 нг/мл+УАЛУ-СгтВ 10 нг/мл 7,1±1,6Ь 178,6±49,0Ь

Примечание: а - достоверно по сравнению с гр. «Спонтанная» (р < 0.05)

Ь - достоверно по сравнению с группой «ТОТ 2 нг/мл» (р < 0.05) с - достоверно по сравнению с группой «УАЯУ-СгтВ 100 нг/мл» (р < 0.05)

Таблица 2. Эффективность нейтрализации стимулирующего действия гТОТ различными ТОТ-антагон и стам и (М±ш). ________

ТОТ и препараты ТОТ-антагон. Суммарный ХЛ ответ (имп/103 МНК/30 мин) Р

Без стимуляторов (0) 8,4±2,8

ТОТ 2 нг/мл 16,9±1,5 Рм<0,01

АЬТмр + 8 нг/мл 7,3±2,2

АЬтот 50 нг/мл 7,4±1,9

УАІІУ-СгтВ 8 нг/мл 7,8±2,2

ТОТ 2 нг/мл + АЬют 8 нг/мл 12,5±2,3 Рб-і<0,05

ТОТ 2 нг/мл + АЬют 50 нг/мл 8,4±1,6 Рт-г^ОІ Р7-б<0,05

ТОТ 2 нг/мл + СгтВ 8 нг/мл 7,3±1,8 Р8-2<0,01 Р8-6<0,01

Таким образом, при изучении влияния TNF-связывающего белка VARV-CrmB была продемонстрирована достаточно высокая эффективность его блокирующей способности TNF-индуцированной генерации АМК и продукции IL-1Р и IL-6 МНК здоровых доноров.

Исследование противовоспалительных эффектов VARV-CrmB в модели коллаген-индуцированного артрита.

Модель КИА была выбрана для оценки in vivo противовоспалительных эффектов белка VARV-CrmB. Результаты шкальной оценки клинического проявления КИА у мышей разных представлены в табл.

3. В динамике развития КИА (П группа) наблюдали закономерное усиление клинических проявлений артрита, которое, судя по результатам шкальной оценки, повышается вплоть до 21 суток наблюдения. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB, судя по показателям шкальной оценки, приводило к снижению степени активности артрита у мышей на ранних сроках наблюдения. Так, только через 2 суток после введения поли-AbTNF сумма баллов по шкале была статистически ниже, чем у мышей П группы (КИА). В то же время, у мышей IV группы (KHA+VARV-CrmB) сумма баллов была достоверно меньшей на 2 и 7 сут. Затем, к 14 и 21 суткам показатели шкальной оценки степени активности артрита во всех сравниваемых группах практически не отличались (табл. 3).

Таблица 3. Показатели шкальной оценки клинических проявлений коллаген-индуцированного артрита у мышей в динамике его развития и при введении поли-ЛЬЮТ и VARV-CrmB (М±т)._______________

Гр. животных Сроки наблюдения, сут.

2 7 14 21

I. Контроль 0 0 0 0

II КИА 3,8±0,17 5,3±0,6 7,2±1,4 9,6±1,5

ШКИА+abTNF 2,7±0,7** 4,4±0,9 6,9±0,8 9,7±1,2

IV КИА+СгтВ 2,2±0,3** 3,7±0,5** 6,2±0,6 9,3±1,7

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с I группой (контроль);

** - по сравнению с данными животных II группы; X - по сравнению с данными животных III группы (р<0,05).

Развитие воспалительного процесса при КИА реализуется за счет эффекторных клеток крови (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов), имеющих костномозговое происхождение. Для оценки активности воспаления была проведена оценка численности и функционального состояния лейкоцитов крови.

На ранних сроках (2 сутки) развития КИА общее количество

лейкоцитов крови снижалось, затем возрастало (7 сутки), что отражает классический характер течения воспалительного процесса (табл. 4). Снижение общего количества лейкоцитов крови на ранних сроках наблюдения (2 сутки), вероятно, связано с усилением миграции этих клеток в ткани, а рост их численности к 7 суткам наблюдения, возможно, является результатом активации костномозгового кроветворения. При введении поли-ЛЬЮТ численность лейкоцитов крови менялась волнообразно. Так, на 2 сутки после введения поли-АИШ7 численность лейкоцитов возрастала, к 7 суткам снижалась, а к 14 суткам, напротив, возрастала. На 2 сутки после введения УАЯУ-СгтВ численность лейкоцитов крови снижалась, затем происходила нормализация, а к 14 суткам имела тенденцию к росту.

Таблица 4. Изменение количества лейкоцитов крови в динамике развития коллаген-индуцированного артрита у мышей и при введении поли-АЬЮТ и УАЛУ-СггпВ (М±ш)._______________________________

Гр. животных Сроки наблюдения, сут.

2 7 14 21

II КИА 10,6±0,2* 18,9±2,2* 14,1 ±2,3 11,3±5,0

III КИА+аЬЮТ 17,1±2,1*/** 8,9±1,9*/** 17,2±3,4 10,4±2,1

IV КИА+СппВ 9,4±0,6*/Х 12,3±2,3 X 19±5 10,9±3,4

I. Контроль 14,2±2,4

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с I группой (контроль); ** - по сравнению с данными животных II группы; X - по сравнению с данными мышей III группы (р<0,05).

Анализ результатов оценки клеточных элементов крови показал, что при развитии КИА происходит увеличение как относительной, так и абсолютной численности нейтрофилов крови, которые играют ключевую роль в реализации воспалительного процесса [Маянский Д.Н.

2007]. Результаты исследования показали, что введение поли-АЬТЭТ и УАЯУ-СгшВ приводит к снижению численности нейтрофилов крови (данные не приведены).

Пополнение популяции нейтрофильных гранулоцитов в процессе развития КИА происходит, очевидно, за счет увеличения численности гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в условиях активной продукции ЮТ-а. В дальнейших экспериментах исследовалось влияние введения поли-АЬТМР и ТОТ-связывающего белка вируса натуральной оспы УАКУ-СгтВ на состояние костномозгового кроветворения мышей в динамике развития КИА. Показано, что введение животным антител и УАКУ-СгтВ приводит к достоверному снижению числа КОЕ-ГМ на 7 сутки наблюдения, а в последующие сроки

исследования не наблюдается корректирующих эффектов от введения препаратов. На 3 неделе обнаруживается достоверная стимуляция исследуемого показателя под воздействием УАЮ/-СгтВ (Рис.5). Повышение количества КОЕ-ГМ наблюдалось в группе КИА на всех сроках исследования.

Рис. 5. Влияние УА11У-СгтВ и анти-ТОТ антител на количество КОЕ-ГМ в процессе развития КИА

# - достоверно относительно контроля; * - достоверно относительно КИА.

Было проведено исследование КАС и содержания суммарных сГАГ в динамике развития коллаген-индуцированного артрита у мышей.

КАС в динамике развития КИА закономерно возрастает, что свидетельствует о повышении суммарной активности коллагеназы и протеаз [Шараев П.Н., 1987]. При этом результаты исследования показали, что КАС в динамике развития КИА достигает максимума к 14 суткам наблюдения. Введение поли-АЬЮТ и УАЛУ-СгтВ приводило к снижению КАС. Однако исследование показало, что введение УАЯУ-СгтВ был более эффективным, чем поли-АЬЮТ (табл. 5).

Активация КАС в динамике развития КИА сопровождается разрушением хрящевой ткани, о чем свидетельствуют данные исследования сГАГ [Шараев П.Н., 1987]. Результаты исследования показали, что уровень сГАГ в динамике развития КИА закономерно возрастает. При этом введение поли-АЬЮТ и ЮТ-связывающего белка вируса натуральной оспы УАКУ-СгтВ приводило к снижению уровня сГАГ, что говорит о нейтрализации эффекта действия ТОТ-а (табл. 6).

Таблица 5. Показатели коллагенолитической активности сыворотки крови в динамике развития коллаген-индуцированного артрита у мышей и при введении поли-АЬТ№ и УА11У-СгтВ (М±т).________________

Группы животных Сроки наблюдения, сут

2 7 14 21

I. Контроль 5,3±0,6 5,7±0,3 5,1±0,7 5,5±0,4

II КИА 11,6±1,4* 18,1±2,2* 19,2±1,9* 17,4±2,4*

III КИА+аЬТОТ 8,2±0,7*/** 16,1±1,4* 17,2±1,5* 17,6±1,8*

ГУКИА+СгтВ 6,4±0,б*/** 9,7±1,6*/**/Х 16,3±2,5*^ 15,7±2,1*

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с 1 группой (контроль); ** - по сравнению с данными животных II группы; X - по сравнению с данными мышей Ш группы (р<0,05).

Таблица 6. Изменение содержания суммарных сывороточных гликозаминогликанов в динамике развития коллаген-индуцированного артрита у мышей и при введении поли-АЬТОТ и УАБ-У-СгтВ (М±т).

Группы животных Сроки наблюдения, сут

2 7 14 21

I. Контроль 21,3±1,2 20,7±1,6 19,7±1,5 20,1±1,4

II КИА 32,3±2,2* 44,5±2,7* 41,2±2,4* 56,3±3,6*

Ш КИА+аЬТОТ 26,2±1,5*/** 36,3±1,9'/*' 40,7±2,8* 51,4±3,3*

IV КИА+СгшВ 25,7±1,7** 31,2±1,Г;“/Х 35,7±2,3* 49,3±2,7*

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с I группой (контроль); ** - по сравнению с данными животных II группы; X - по сравнению с данными мышей III группы (р<0,05).

Таким образом, результаты исследования показали, что развитие КИА сопровождается разрушением соединительной ткани и, по всей видимости, суставов животных. При этом известно, что поражение суставов при аутоиммунных заболеваниях зависит от эффекта действия ЮТ-а, включая индукцию/стимуляцию окислительных процессов эффекторными клетками воспаления, в связи с чем, нами были проведены исследования по оценке окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови мышей.

Результаты исследования показали, что ОМ функция лейкоцитов крови в динамике развития КИА значительно усиливается и сохраняется на высоком уровне до конца срока наблюдения (рис. 10). Введение поли-АИМ7 и VАV- Спя В мышам с КИА приводило к достоверному снижению ОМФ лейкоцитов крови. При этом, УА11У-СгтВ оказывал более выраженный эффект на ОМ функцию лейкоцитов крови мышей с КИА (рис. 6).

Рис. 6. Изменение окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови в динамике развития коллаген-индуцированного артрита у мышей и при введении поли-АИШ7 и УАЯУ-СггпВ.

* - достоверные различия по сравнению с данными контрольной группы; X - по сравнению с II группой (КИА) и ♦ - по сравнению с III группой (КИА+ поли-АЬТ№).

Хронические воспалительные процессы (в т.ч. аутоиммунные, к которым относится ревматоидный артрит) часто сопровождаются формированием анемии. В процессе развития коллаген-индуцированного артрита не наблюдалось достоверного снижение количества эритроидных колоний на 1 неделе исследования; в последующие сроки этот показатель не отличался от контроля. На модели коллаген-индуцированного артрита показано, что введение животным поли-АЬТЫР и УАР.У-С'гтВ приводит к достоверному повышению количества (БОЕ-Э+КОЕ-Э) на 1 неделе (рис. 7).

[Контроль

1 неделя 2яеделя 3 неделя 20 неделя

Рис. 7. Влияние УАКУ-СппВ и поли-АЬТОТ на количество БОЕ-Э+КОЕ-Э в процессе развития КИА.

# - достоверно относительно контроля; * - достоверно относительно КИА.

В наших исследованиях не обнаружено анемии у экспериментальных животных в процессе развития КИА. Тем не менее на ранних сроках (1 неделя) поли-AbTNF и VARV-CrmB оказывают достоверный стимулирующий эффект на эритроидное колониеобразование.

Можно предположить, что введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводит к снижению степени активности артрита у мышей на ранних сроках наблюдения. При введении как поли-AbTNF, так и VARV-CrmB на ранних сроках исследования отмечается снижение КАС и содержание ГАГ в сыворотке крови мышей.

Изучение эффектов rmTNF и VARV-CrmB при эпикутанном способе воздействия

Метод чрезкожной доставки лекарственных средств в составе мазей, гелей и других форм широко применяется в клинической практике. Поэтому было решено исследовать TNF-нейтрализующей способности белка VARV-Crmb при эпикутанном аппликативном методе воздействия. Животные были разделены на 4 группы: I-я (контрольная) группа (15 мышей) - эпикутанная обработка фосфатным солевым раствором (PBS); П-я группа - эпикутанная аппликация rmTNF в дозе 500 нг/мышь (15 мышей); Ill-я группа - обработка рекомбинантным VARV-CrmB в дозе 500 нг/мышь (15 мышей); IV группа - 500 нг rmTNF + 500 нг VARV-CrmB спустя 30 мин (15 мышей). Животных выводили из эксперимента через 2, 24 и 72 ч после эпикутанных аппликаций.

У мышей всех групп, за исключением животных, обработанных VARV-Crmb, наблюдалось усиление миграции лейкоцитов. При обработке мышей VARV-Crmb миграционная активность клеток не менялась. В то же время практически на всех сроках наблюдения VARV-Crmb достоверно снижал количество мигрирующих лейкоцитов у rmTNF-обработанных мышей (табл. 7).

Показано, что уже через 2 ч после эпикутанной обработки rmTNF-а происходит усиление активности ОМ функции лейкоцитов крови мышей, которое достигает максимума через 24 ч, а затем постепенно снижается, достигая контрольных величин к 72 ч наблюдения. При эпикутанной аппликации VARV-CrmB показатель, отражающий ОМ функции лейкоцитов крови мышей, обработанных rmTNF-a, значительно снижался, что свидетельствует о TNF-нейтрализующей способности белка (рис. 8).

В работе исследовалось влияние TNF-нейтрализующего рекомбинантного белка VARV-CrmB и rmTNF-a при эпикутанном способе воздействия на колониеобразующую активность ККМ мышей.

Таблица 7. Общее количество лейкоцитов крови и их миграционная активность у мышей после аппликации белка УАКУ-СгтЬ гтШЕ-обработанным животным.______________________________

Группы жи- п лейкоцитов крови, х106/л / п мигрирующих лейкоцитов, х103

вотных 2ч 24 ч 72 ч

Контроль 4,2±0.7 7,6±0,8 8,4±3,7 11,3±0,7 16.0±1.9 15,3±1,5

ТОТ-а 8.7±0,7* 17,1±0.6* 18.6±2,8

17,8±1,4* 8,2 ±0,9 11,8±1,6

СгтЬ 7.0±0.5* 18,1±0.9* 12.5±3.7

8,0 ±1,7х 8,7±1,0 7,1± 0,7*

Т№+ СгтЬ 2.9±0.3*/ Х 9,6±1.8Х 15,2±1,5

11,7±1ДХ 10,2 ±1,2 9,7 ± 0,9

* - достоверные различия по сравнению с данными у мышей контрольной группы; X -по сравнению с данными у мышей, обработанных гтЮТ-а.

—•— Г. Контроль —О— П.

—2^— Ш. VАКУ- СгтЬ -О— IV. Т№5^\’АЯ\7-СгтЬ

Рис. 8. Изменение спонтанного ХЛ ответа лейкоцитов крови после аппликации белка УА11У-СгтЬ гтТОТ-обработанным мышам.

* - достоверно относительно контроля; ** - достоверно относительно ТОТ-а.

Накожные аппликации плЮТ-а в течение трёх суток вызывают статистически достоверное снижение количества эритроидных колоний (БОЕ-Э+КОЕ-Э), в основном за счет поздних КОЕ-Э (рис. 9). Совместное эпикутанное нанесение ТЫЕ+УА11У-СгтВ восстанавливает как количество эритроидных колоний в целом, так и число КОЕ-Э. После аппликации гтЮТ-сс повышается количество КОЕ-ГМ, УАЯУ-

СгтЬ достоверно снижает КОЕ-ГМ относительно гглТОТ до уровня контрольных значений. Аналогичные изменения наблюдаются через сутки после однократной аппликации (рис.10).

nnTNF а -+-VARV-Crmb

Рис. 9. Влияние VARV-CгmB и гтТКГ-а при эпикутанном способе воздействия на колониеобразующую активность ККМ мышей (трехкратная аппликация).

# - достоверно относительно контроля, * - достоверно относительно ТОТ-а.

Рис. 10. Влияние VARV-CrmB и rmTNF-а при эпикутанном способе воздействия на колониеобразующую активность ККМ мышей (однократная аппликация).

# - достоверно относительно контроля, * - достоверно относительно TNF-a

Результаты оценки влияния белка VARV-CrmB и rmTNF-a на гемопоэз, полученные при использовании эпикутанного способа воздействия, имеют сходства с результатами, полученными в экспериментах in vitro на культуре ККМ мышей.

■И КОЕ-Э+БОЕ-Э [gg КОЕ-Э

I I КОЕ-ГМ

контроль rmTNF-a rmTNF-a-г VARV-Crmb

VARV-Crmb

Рекомбинантный вирусный белок VARV-CrmB, показал свою эффективность в моделях in vitro и in vivo. Совокупность полученных нами данных позволяет рассматривать рекомбинантный вирусный белок VARV-CrmB как новый потенциальный TNF-антагонист, эффекты которого могут быть реализованы за счет его нейтрализующей способности к TNF-индуцированноу снижению колонеобразующей активности ККМ, активации окислительно-метаболической функции и продукции провоспалительных цитокинов эффекторными клетками.

ВЫВОДЫ

1.VARV-CrmB обладает способностью восстанавливать rmTNF-обусловленное снижение количества эритроидных колоний в метилцеллюлозной культуре клеток костного мозга мыши и человека.

2. VARV-CrmB обладает свойством отменять эффекты TNF-a на продукцию IL-ip и IL-6 в культуре мононуклеарных клеток человека, снижая концентрацию цитокинов до уровня спонтанной продукции.

3. В культуре мононуклеарных клеток человека VARV-CrmB достоверно снижает TNF-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода.

4. В модели коллаген-индуцированного артрита введение VARV-CrmB приводит к снижению степени активности артрита, кол-лагенолитической активности сыворотки и содержания гликозаминог-ликанов на ранних сроках коллаген-индуцированного артрита.

5. На ранних сроках развития коллаген-индуцированного артрита введение VARV-CrmB приводит к снижению численности нейтро-фильных гранулоцитов и гемопоэтических предшественников, а также к достоверному снижению окислительно-метаболической активности лейкоцитов.

6. При эпикутанном воздействии VARV-CrmB обладает способностью восстанавливать rmTNF-обусловленное снижение количества эритроидных колоний в метилцеллюлозной культуре клеток костного мозга, нормализует повышенную миграционную и окислительнометаболическую активность лейкоцитов rmTNF-обработанных мышей.

7. Белок VARV-CrmB in vitro и in vivo демонстрирует TNF-связывающую способность, оказывая противовоспалительный эффект.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Топоркова Л.Б., Петухова А.А. Гилева И.П., Орловская И.А. Рекомбинантный белок вируса натуральной оспы нейтрализует эффекты фактора некроза опухолей на модели костномозгового гемопоэза мышей ВАЬВ/С // Медицинская иммунология.- 2010.- № 12,4-5.- С 297-304.

2. Цырендоржиев ДД„ Сенников С.В., Вязовая ЕА., Гилева И.П., Рязанкин ИА., Лебедев Л.Р, Топоркова Л.Б., Курилин В.В., Петухова АА., Орловская И А. Влияние рекомбинантного ТОТ-связывающего белка вируса натуральной оспы га миграционную и окислигельнометаболическую функцию лейкоцитов крови мышей при эрикутанной аппликации фактора некроза опухолей // Бюллетень Сибирского отделения РАМН.- 2011.- № 3.- С.73-79.

3. Цыревдоржиев Д.Д., Сенников С.В., Орловская ИА., Курилин ВВ., Лопат-никова Ю.А., Гилева И.П, Щелкунов С.Н, Рязанкин И.А, Басова АА.. Козлов

B.А. Влияние ПЧР-связывающего беж а вируса натуральной оспы на ТОТ-ивдуцированную оислительно-метаболическую активность и продукцию 1Ь-1? И 1Ь-б мононуклеарными клетками здоровых доноров // Иммунология.-2011.- № 4.- С. 209-213.

4. Петухова АА- Топоркова Л.Б, Вязовая ЕА., Гилева И.П., Орловская И.А. Влияние рекомбинантного ТОТ-связывающего белка вируса натуральной оспы на костномозговой гемопоэз мышей Ва1Ь/с при эпикутанной аппликации гтЮТ. Всероссийская научная конференция «Молекулярно-генетические основы функционирования цито кино вой сети в норме и при патологии», г. Новосибирск, Россия, 15-17 сентября 2010. И Цигокины и воспаление,- 2010,-№9.- С. 56.

5. Петухова А. А, Топоркова Л. Б., Гилева И. П., Орловская И. А. Изучение влияния гтЮТ и ЮТ-связывающего белка вируса натуральной оспы на костномозговой гемопоэз мышей Ва1Ь/с. Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», г. Красноярск, Россия 2-3 марта 2010- Сборник материалов конференции.- С.140-142.

6. Басова А А. Топоркова Л. Б.. Гилева И. П., Орловская И. А. Исследование влияния ТОТ-иетралшующего белка вируса натуральной оспы на колониеобразующую активность клеток костного мозга человека. 8-я итоговая конференция НИИКИ СО РАМН «Иммуногенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике», г. Новосибирск, Россия, 21 -23 июня 2011. Сборник материалов конференции,- С.10.

7. Басова А. А. Топоркова Л. Б, Гилева И. П., Орловская И. А Исследование влияния ЮТ-нейгралшующего белка вируса натуральной оспы на костномозговой гемопоэз мышей линии МЯИргЛрг. Конференция молодых ученых «Проблемы биомедицияжой науки третьего тысячелетия», г. Санкт-Петербург, Россия, 21 -22 декабря 2010. Сборник материалов конференции.-

C. 16.

Подписано к печати 23.01.2012 формат - 60x84, Уел. печ. л. 1,5

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа №127 ИП Грязнова Е.Э. ИНН 540816437901 г. Новосибирск, ул. Иванова, 4