Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние производных бетулина на антиоксидантный гомеостаз и метаболизм ксенобиотиков в печени при экспериментальной полихимиотерапии

003466700

На правах рукописи

ШАРАПОВ Игорь Викторович

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНА НА АНТИОКСИДАНТНЫЙ ГОМЕОСТАЗ И МЕТАБОЛИЗМ КСЕНОБИОТИКОВ В ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

• б /.:?

Томск-2009

003466700

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Грек Олег Рувимович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ

Венгеровский Александр Исаакович

доктор медицинских наук Алиев Олег Ибрагимович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_»_2009г. в_час на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Современная фармакология располагает широким набором цитостатических средств, позволяющих проводить эффективное лечение злокачественных новообразований. Однако серьезным ограничением в достижении лечебного эффекта является токсическое действие противоопухолевых препаратов (Гольдберг Е.Д., Карпова Г.В., Колмогорова Л.А., 1991, Кончаловский М.В., 2001, Гольдберг Е.Д. и др. 2003, Зборовский А.Б., Тюренков И.Н., 2003). При использовании комбинации 2-х и более препаратов, с целью повышения эффективности лечения (Дельгадо Ф.Г., 2002, Price F.V. et al., 1993), токсичность полихимиотерапии возрастает (Переводчикова Н.И., Горбунова В.А., 2001, Баранова О.Ю. и др., 2003, Богданов А.Н. и др., 2004, Nakamura S., 1984). Органом, наиболее подверженным токсическому действию цитостатиков является печень (Городецкий В.М., 1998, Ушкалова Е.А., 2003, Моисеев C.B., 2005, Barak A.J. et. al., 1984). В токсическом повреждении печени при полихимиотерапии ведущая роль отводится активации свободно-радикальных процессов окисления, приводящих к снижению антиоксидантной защиты (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1990, Морозкина Т.С., Суколинский В.Н., Стрельников A.B., 1991, Мишенина C.B., 2002).

Микросомальная монооксигеназная система печени, осуществляющая поддержание метаболического гомеостаза организма путем инактивации ксенобиотиков до безвредных продуктов (Арчаков А.И., 1983, Гуляева Л.Ф. и др., 1994, Щербаков В.М., Тихонов A.B., 1995), определяет способность цитостатиков и продуктов их метаболизма вызывать прооксидантный эффект (Koren G. et al., 1992) в результате синтеза реакционно-способных соединений с гепатотоксическими свойствами (Гуляева Л.Ф. и др., 1994). Поэтому гепатотоксичность цитостатических средств зависит от активности монооксигеназной системы и изменение ее активности меняет токсические и лечебные эффекты цитостатиков (Богуш Т.А. и др., 1995).

Достижение максимальной терапевтической эффективности существующих методов лечения злокачественных новообразований связывают с созданием новых фармакологических средств, блокирующих или замедляющих развитие токсических повреждений, но не снижающих антинеопластических свойств цитостатиков (Гольдберг Е.Д. и др., 1995, Звартау Э.Э., Гнездилова A.B., 2001, Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000, Грек O.P. и др., 2002, Птушкин В.В., 2004, Hoekman К. et al., 1999).

Многие из существующих гепатопротекторов на сегодняшний день являются препаратами растительного происхождения фенольной природы (Запрометнов М.Н., 1993, Сорокина И.В., Крысин А.П., Хлебникова Т.Б. и др., 1997) и оказываются недостаточно эффективными в условиях противоопухолевой полихимиотерапии (Гольдбер Е.Д., Зуева Е.П., 2000).

В последние годы внимание исследователей привлекают тритерпеноиды лупанового ряда (Толстиков Г.А., и др., 2005, Кузнецова

С.А., и др. 2008), наделенные рядом фармакологических эффектов, в том числе, цитотоксическим в отношении различных опухолей нейроэктодермального происхождения (Kim Darric S.H.L., 1998). Химическая модификация основного представителя тритерпеноидов лупанового ряда бетулина до бетулоновой кислоты существенно повышает цитотоксическую активность соединения (Ле Банг Шон, Посыпанова Г.А., Колибаба Л.Г и др., 2002), а введение в молекулу бетулоновой кислоты по С-28 атому различных фрагментов является перспективным направлением для создания новых лекарственных препаратов (Сорокина И.В., Жукова H.A., Волкова Е.Б и др., 2004, Позднякова С.В. и др., 2004,2005,2007, Шинтяпина А.Б., и др., 2008).

Таким образом, поиск новых природных соединений среди тритерпеноидов лупанового ряда, изучение их влияния на активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы печени и на основные звенья патогенеза токсического эффекта цитостатиков: процессы

* свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантный потенциал является актуальной задачей теоретической и практической медицины.

Цель исследования: Изучить влияние бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных на антиоксидантный гомеостаз и метаболизм ксенобиотиков в печени при введении полихимиотерапевтического комплекса цитостатиков в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантный потенциал плазмы крови и ткани печени у интактных животных.

2. Исследовать влияние бетулоновой кислоты и ее производных на скорость микросомального N-деметилирования амидопирина и эритромицина, р-гидроксилирования анилина и активность перекисного окисления липидов микросомальных мембран гепатоцитов у интактных животных.

3. Оценить дозозависимый эффект профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов и антиокислительную активность ткани печени у интактных животных при спонтанной индукции ПОЛ.

4. Изучить влияние профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на антиоксидантный потенциал плазмы крови и ткани печени при экспериментальной полихимиотерапии.

5. Оценить сравнительную эффективность профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на скорость микросомального метаболизма амидопирина, эритромицина, анилина и активность процессов перекисного окисления липидов микросомальных мембран гепатоцитов при экспериментальной полихимиотерапии.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение фармакологической активности бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных по влиянию на антиоксидантный гомеостаз и процессы перекисного окисления липидов плазмы крови, ткани печени и мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. Выявлен дозозависимый антиоксидантный эффект у бетулоновой кислоты.

Впервые на модели спонтанной индукции ПОЛ показано, что бетулоновая кислота и ее аланинамидные производные оказывают антиоксидантный эффект разной степени выраженности, проявляющийся ингибированием перекисного окисления липидов и повышением антиокислительной активности ткани печени. Наиболее выраженное влияние на антиоксидантный гомеостаз оказывает бетулоновая кислота, 2Р-аланин-бетулоновая кислота, метиловый эфир 2р-аланин-бетулоновой кислоты.

Впервые показано, что однократное введение бетулоновой кислоты и 2(3-аланин-бетулоновой кислоты оказывает выраженный индуцирующий эффект на изоформы цитохрома Р-450, ответственные за метаболизм амидопирина, эритромицина и анилина.

Показано, что предварительное введение бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных предупреждает снижение антиоксидантного потенциала плазмы крови и ткани печени, оказывает цитопротекторный и мембраностабилизирующий эффекты, предупреждая инактивацию микросомальных ферментов печени в раннем и отдаленном полихимиотерапевтическом периоде.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные экспериментальные данные существенно расширяют представления о фармакологических эффектах природных тритерпеноидов лупанового ряда как перспективного класса новых лекарственных средств.

Обнаруженные в эксперименте антиоксидантный, мембраностабилизирующий эффекты, лежащие в основе гепатопротекторного действия производных бетулина (бетулоновой кислоты, 2а- и 2р-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2а- и 2р-аланин-бетулоновой кислоты), открывают перспективы применения их в качестве гепатопротекторов в программах цитостатической химиотерапии.

Дано обоснование целесообразности применения бетулоновой кислоты, 2Р-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2р-аланин-бетулоновой кислоты как новых природных индукторов микросомальных монооксигеназ печени при проведении полихимиотерапевтических программ и других состояниях, сопряженных с депрессией детоксицирующей функции печени.

На основании экспериментальных данных бетулоновая кислота является перспективным препаратом сопроводительной терапии и как основа для синтеза соединений с новыми фармакологическими свойствами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полусинтетические тритерпеноиды лупанового ряда (бетулоновая кислота, 2а- и 2р-аланин-бетулоновая кислота, метиловый эфир 2а- и 2(3-аланин-бетулоновая кислота) оказывают выраженный антиоксидантный эффект, проявляющийся повышением антиокислительной активности и ингибированием процессов пероксидации липидов плазмы крови, спонтанного и индуцированного перекисного окисления липидов ткани печени и мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов.

2. Бетулоновая кислота и 2р-апанин-бетулоновая кислота оказывают индуцирующий эффект на активность микросомальных монооксигеназ печени, повышая каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450, катализирующих реакции ТМ-деметилирования и р-гидроксилирования ксенобиотиков.

3. Профилактическое введение бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных предупреждает сдвиг антиоксидантного гомеостаза и снижение активности микросомальных монооксигеназ печени при экспериментальной полихимиотерапии.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на ежегодных конкурс-конференциях студентов и молодых ученых НГМУ «АВИЦЕННА» (Новосибирск 2004-2008), на Всероссийской научной конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации (Новосибирск, 2005), на научно-практической конференции с международным участием «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2005), на Ш Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на региональной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 245 источников, из них 166 отечественных и 79 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные

Эксперименты проведены на 450 крысах самцах линии Вистар массой 180-200 гр. в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). Животных получали из вивария ЦНИЛ НГМУ (зав. - д.м.н., проф. Мичурина C.B.). Перед экспериментом животных лишали корма на 12 часов, забой проводили декапитацией под легким эфирным наркозом в утренние часы.

Условия проведения эксперимента

Работа выполнялась совместно с НИИ органической химии СО РАН им. Н.Н.Ворожцова (лаборатория фармакологических исследований -зав.лаб. - д.б.н. Толстикова Т.Г., лаборатория медицинской химии - зав.лаб.-д.х.н., проф. Шульц Э.Э.) и ЦНИЛ НГМУ (зав. - д.м.н, проф. Мичурина C.B.). Синтез изучаемых соединений проводился из бетулина (3-оксо-20(29)-лупен-28-ол): бетулоновая кислота (БК) - (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) и ее пептидные производные, содержащие у атома С-28: а-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (БК-2а), метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовой кислоты (ЭБК-2а) и ß-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (БК-2Р), метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовой кислоты (ЭБК-2р) (Петренко Н.И., Еланцева Н.В., Петухова В.З., 2002). В качестве препарата сравнения использовали дигидрокверцетин (ДКВ), предоставленный той же лабораторией.

Исследуемые соединения вводили в виде водно-твиновой взвеси (твин 80) внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг (и 100 мг/кг при изучении дозозависимого эффекта) (Сорокина И.В. и др. 2004) однократно за 6 часов до забора материала. В группах животных, получавших цитостатическую терапию, исследуемые препараты вводились внутрижелудочно в дозах 50 мг/кг (и 100 мг/кг при изучении дозозависимого эффекта) за б часов до проведения полихимиотерапии (ПХТ).

Проведено три серии экспериментов:

1-я серия: Изучалось влияния БК-соединений на активность пероксидативных процессов, антиоксидантный гомеостаз и метаболизм ксенобиотиков у интактных животных. БК-соединения вводились крысам за 6 часов до забора материала (плазма крови, ткань печени, микросомы печени). Контролем служили животные с введением водно-твиновой смеси.

2-я серия: Проводилось сравнительное изучение антиоксидантного эффекта БК-соединений на модели спонтанной индукции перекисного окисления липидов в ткани печени. Бетулоновая кислота и ее производные вводились крысам за 6 часов до забора печени и приготовления гомогената. Контролем служили животные с введением водно-твиновой смеси.

3-я серия: Изучался защитный эффект БК-соединений при их профилактическом введении на модели полихимиотерапии (ПХТ). Животные за 6 часов перед однократным введением комплекса цитостатических средств получали БК-соединения. Забор материала производился на 7-е и 14-е сутки ПХТ. Контролем служили животные с введением за 6 часов до ПХТ водно-твиновой смеси. В каждую опытную и контрольную группы методом случайной выборки отбиралось по 6 животных.

Экспериментальные модели

Моделирование спонтанной индукции переписного окисления липидов (ПОЛ) гомогената печени

Для сравнительной оценки антиоксидантной активности изучаемых соединений использовали модель спонтанной индукции ПОЛ гомогената печени (Шарапов В.И. и др., 1986, 1987). Гомогенат печени инкубировали 120 мин при 37°С и постоянном встряхивании. Заборы образцов проводились до начала (нулевое время), через 60 и 120 мин инкубации. В исследуемых образцах оценивалась активность спонтанного ПОЛ и антиокислительная активность (АОА) ткани печени.

Моделирование полихимиотерапии

В качестве экспериментальной модели использовали цитотоксическое действие комплекса антибластомных препаратов с различным механизмом действия, выбрав классическую химиотерапевтическую программу CHOP (Зарицкий А.Ю., Алексеева Ю.А., 2001): циклофосфан, доксорубицин (гидроксидауномицин), винкристин (онковин), преднизолон.

Цитотоксическую модель создавали однократным внутрибрюшинным введением животным комплекса противоопухолевых препаратов в дозе 1/5 LDso, рассчитанной по методу Беренса по количеству погибших и выживших животных (Беленький Л.М., 1963, Мишенина C.B., 2002): циклофосфан («Биохимик», Саранск) - 21мг/кг, доксорубицин ("ЛЭНС-Фарм", Россия) -2,1мг/кг, винкристин ("Гедеон Рихтер", Венгрия) - 0,04мг/кг, преднизолон ("Гедеон Рихтер", Венгрия) - 2,1 мг/кг массы. Группа контрольных животных получала внутрибрюшинно стерильный изотонический раствор натрия хлорида в том же объеме.

Материал исследования

Плазма крови

Кровь забирали после декапитации животных под эфирным наркозом. Плазму крови получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Определяли концентрацию альфа-токоферола и ретинола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе «Милихром» (определение проводилось в лаборатории клинической биофизики ГУ НЦКЭМ СО РАМН, руководитель проф. Сафронов И.Д.). Концентрацию церулоплазмина в плазме крови определяли по реакции с пара-фенилендиамином, АОА плазмы оценивали по методу Г.И.Клебанова и др.

(1988). Скорость реакций перекисиого окисления липидов оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Steinbrecher U.P., 1990, Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., ЗыбинаН.Н., 2000).

Гомогенат печени

После декапитации животных под легким эфирным наркозом печень отмывали через нижнюю полую вену буферным раствором с содержащий 0,154М KCl и 5мМ трис-НС1-буфер, рН=7,4 (Т 1-4°С). В качестве среды гомогенизации использовали холодный раствор 0,154М KCl, 5мМ трис-НС1-буфер, рН=7,4. Приготовленный 20% (вес/объем) гомогенат фильтровали через капроновую ткань и использовали для дальнейшего исследования.

Микросомалышя фракция печени

Микросомальную фракцию выделяли дифференциальным центрифугированием гомогената печени (Арчаков А.И., 1975). Первое центрифугирование гомогената проводили на центрифуге K70D (Германия) при 20000g (16000 об/мин) 20 минут. Второе центрифугирование проводили с супернатантом на ультрацентифуге VAC-601 (JANETZKI, Германия) при 105000g (35000 об/мин) в течение 60 мин. Осадок суспендировали в среде инкубации, содержащий 40 мМ трис-НС1-буфер, 16 мМ MgCl2 (рН=7,4). Все манипуляции проводили при 0-4°С. Микросомальный белок хранили в тающем льду и использовали в течение 2-4 часов с момента выделения.

Оценка активности процессов перекисного окисления липидов

Активность реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) изучалась в гомогенате печени в динамике спонтанной индукции и в микросомальной фракции гепатоцитов.

Для оценки активности процессов пероксидации в микросомах печени определяли спонтанное (СПОЛ), аскорбат-зависимое (АЗПОЛ) и НАДФН-зависимое (НЗПОЛ) ПОЛ по концентрации малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Steinbrecher U.P., 1990, Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H. 2000).

Расчеты проводили с использованием коэффициента молярной экстинкции (156 мМ"1). Результаты выражали для спонтанного ПОЛ в нмоль/мг белка, для индуцированного ПОЛ - в нмоль/ мин/мг белка.

Оценка активности микросомальиых ферментов печени

В микросомальной фракции печени определяли каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450: P450IIC, P450IIIA4 и P450IIE1. Каталитическую активность изоформы P450IIC оценивали по скорости метаболизма амидопирина, P450IIIA4 - эритромицина, P450IIE1 - анилина (Щербаков В.М., Тихонов A.B., 1995). Скорость метаболизма амидопирина и эритромицина оценивали по скорости образования формальдегида в реакции

N-деметилирования. Количество формальдегида определяли в реакции Nash Т. (1953). Показатели выражали в нмоль НСНО/мин/мг белка микросом.

Каталитическая активность изоформы P-450IIE1 определялась по скорости р-гидроксилирования анилина (Щербаков В.М., Тихонов A.B., 1995). Скорость р-гидроксилирования анилина оценивали по количеству образовавшегося р-аминофенола (Imai Y., 1966). Показатели выражали в нмоль р-аминофенола/мин/мг белка микросом.

Содержание белка в гомогенате и микросомах печени определяли по методу Лоури (LowryO.H., 1951).

Статистическая обработка результатов

Полученные данные подвергали статистической обработке с вычислением среднего арифметического (М), ошибки среднего (м). Достоверность различий рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента с уровнем вероятности р<0,05. Обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Statgraf, Microsoft Excel (Гублер Е.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании проводилось изучение гепатопро-текторного действия полусинтетических производных тритерпеноидов лупанового ряда: бетулоновой кислоты (БК) и ее амидных производных (БК-2а, БК-2р, ЭБК-2а, 3BK-2ß) по влиянию их на основные звенья патогенеза токсического действия цитостатиков: процессы свободно-радикального окисления липидов и антиоксидантный потенциал крови, ткани печени, субклеточных мембранных структур гепатоцитов, каталитическую активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы печени у интактных животных, на моделях спонтанной индукции ПОЛ и полихимиотерапии.

Изучение фармакологических эффектов производных бетулина на интактных животных

Проведенное исследование показало, что однократное введение бетулоновой кислоты и ее производных приводило к ингибированию процессов свободно-радикального окисления липидов плазмы крови, проявляющееся достоверным снижением концентрации МДА и увеличением антиокислительной активности плазмы крови у интактных животных. Данный эффект БК-соединений связан с достоверным увеличением в плазме крови концентрации а-токоферола, однако в то же время концентрация ретинола в плазме не изменялась, а концентрация церулоплазмина снижалась при введении БК, BK-2ß и ДКВ. Антиоксидантный эффект изучаемых БК-соединений не отличался от такового у препарата сравнения ДКВ (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных (в дозе 50 кг/кг) на концентрацию антиоксидантов и малонового диальдегида в плазме крови у

интактных животных (М ± ш, п=6).

Группы животных а-Токоферол мг/% Ретинол мкг/% АОА отн.ед Церулоплазмин мг/мл МДА нмодь/л

БК 0,70+0,07* 28,1±2,б 43,612,4* 148,3±17,6* 3,08+0,24

БК-2а 0,86±0,04* 35,4+3,5 44,6+2,1* 188,1+4,2 2,43+0,17*

БК-23 0,70+0,02* 33,1±4,4 4б,2±3,2* 146,5±15,9* 2,73±0,09*

ЭБК-2а 0,82+0,05* 35,7±2,6 47,2±2,3* 189,0+8,0 2,46+0,20*

ЭБК-23 0,51±0,13 35,4±3,1 45,8±2,5* 217,4±18,6 2,70+0,19*

ДКВ 0,81±0,12* 24,3±4,2 50,6±3,6* 138,1+14,8* 2,55+0,15*

Контроль 0,53±0,04 33,8+1,8 Зб,6±1,0 208,8+9,8 3,18±0,11

Примечание: контроль - интактные крысы с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений, * - достоверность различий с контролем (р<0,05).

Изучение эффектов бетулоновой кислоты и ее производных на антиоксидантный потенциал ткани печени проводилось по их влиянию на процессы спонтанного и индуцированного (аскорбат-зависимого и НАДФН-зависимого) ПОЛ. Исследование показало, что только ЭБК-2а и ДКВ тормозят спонтанное ПОЛ, но все соединения оказывают выраженный ингибирующий эффект на активность аскорбат-зависимого ПОЛ в ткани печени интактных животных. Скорость накопления МДА в аскорбат-зависимом ПОЛ снижалась при их предварительном введении в 2-5 раз по сравнению с контролем. Влияние изучаемых соединений на НАДФН-зависимое ПОЛ было разнонаправленным. Так, все соединения, за исключением БК, ингибировали НАДФН-зависимое ПОЛ на 20-40% по сравнению с контролем. БК оказывала индуцирующий эффект и увеличивала скорость образования МДА на 25,5% по сравнению с контролем (Табл. 2).

Изучение влияния бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов (ПОЛ) в микросомах печени и каталитическую активность монооксигеназных ферментов позволило оценить действие изучаемых соединений на структурные свойства мембран, определяющие активность мембраносвязанных ферментов. Известно, что активность микросомальных ферментов зависит от жидкостных свойств мембран (Арчаков А.И., 1975, Хакимов 3.3., Рахманов Ф.Х., 1992). Нарушение целостности мембраны, а так же повышение их вязкости, вследствие активации ПОЛ, приводят к изменению активности мембраносвязанных ферментов (Арчаков А.И., 1975, Ланкин В.З., 1981, Чекман И.С., Посохова Е.А., Береговая Е.Г., 1996). В то же время увеличение доли ненасыщенных жирных кислот в микросомальных мембранах при ингибировании ПОЛ сопровождается увеличением текучих свойств мембран и сохранением или увеличением активности мембраносвязанных ферментов (Александров В.Я., 1975, Шарапов В.И., Грек О.Р., Зыков A.A., 1988, 1990).

Таблица 2.

Изменение активности спонтанного и индуцированного ПОЛ в ткани печени у интактных животных через 6 часов после введения БК-соединений

(в дозе 50 мг/кг) (М ± т, п=6).

Группы животных Спонтанное ПОЛ Аскорбат-ПОЛ НАДФН-ПОЛ

МДА нмоль/мг белка % от контроля МДА нмоль/мин/ мг белка % от контроля МДА нмоль/мин/ мг белка % от контроля

БК 0,14+0,003 0 0,35+0,02 * 53,0* 0,59±0,03* 125,5*

БК-2а 0,13±0,005 92,8 0,14+0,008* 21,2* 0,29±0,01* 61,7*

БК-2р 0,14±0,03 0 0,15±0,009* 22,7* 0,32+0,01* 68,1*

ЭБК-2а 0,10±0,02* 71,4* 0,12+0,002* 18,2* 0,32+0,009* 68,1*

ЭБК-2р 0,13±0,005 92,8 0,15+0,003* 22,7* 0,36+0,009* 76,6*

ДКВ 0,11 ±0,002* 78,6* 0,24±0,02* 36,4* 0,39+0,01* 83,0*

Контроль 0,14+0,006 100,0 0,66+0,02 100,0 0,47±0,01 100,0

Примечание: контроль - интактные животные с введением водно-

твиновой взвеси без БК-соединений, *- достоверность различий с контролем 0x0,05).

Результаты исследования показали, что все изучаемые БК-соединения (за исключением EK-2ß) оказывали выраженный ингибирующий эффект на активность спонтанного и аскорбат-зависимого ПОЛ микросомальных мембран. Ингибирующий эффект изучаемых БК-соединений на спонтанное ПОЛ был сравним с таковым ДКВ, а при аскорбат-зависимом ПОЛ превышал эффект ДКВ в 1,7 (БК) и 2,7 (ЭБК-2р) раза. Влияние БК-соединений на НАДФН-зависимое ПОЛ было разнонаправленным. Так, БК активировала НАДФН-зависимое ПОЛ, ЭБК-2(3 не изменял его активности, а BK-2ß и ДКВ оказывали ингибирующий эффект (Табл. 3).

Оценивая результаты разнонаправленного влияния изучаемых соединений на НАДФН-зависимое ПОЛ мы исходили из известного факта, что фермент-индуцированное ПОЛ отражает состояние электрон-транспортной цепи, ее целостность и проводящую способность. Таким образом, активность НАДФН-зависимого ПОЛ в целом отражает каталитическую активность определенных изоформ микросомальных ферментов, такой, например, как цитохрома P450IIE1 (Johansson I., Ingelman-Sundberg М., 1983, Щербаков В.М., Тихонов A.B., 1995). Активность указанной изоформы цитохрома понижается при применении антиоксидантов (Ланкин В.З., 1981). Но при использовании БК-соединений наблюдалось снижение активности НАДФН-зависимого ПОЛ только в случае применения BK-2ß (в 1,3 раза), в то время как введение БК приводило к повышению активности НАДФН-зависимого ПОЛ (в 1,2 раза). Активирующий эффект БК является, вероятно, следствием преобладания субстратиндуцирующего воздействия соединения на изоформу цитохрома P450IIE1 над антиоксидантным эффектом (Табл. 3).

Таблица 3.

Изменение активности процессов ПОЛ (МДА нмоль/мин/мг белка) в микросомах печени интактных крыс через 6 часов после введения БК-соединений (М ± т, п=6).

Группы животных Спонтанное ПОЛ Аскорбат-ПОЛ НАДФН-ПОЛ

МДА нмоль/ мг белка % ингиби-рования МДА нмоль/ мин/мг белка % ингиби-рования МДА нмоль/ мин/мг белка % изменения от контроля

БК 0,13+0,01* 75,3±1,1* 1,34±0,15* 28,1+9,2* 2,1210,1* 120,515,6*

БК-20 0,13±0,01* 75,710,8* 1,8010,07 4,312,3 1,3110,15* 25,419,7*

ЭБК-2Р 0,18Ю,01* 66,3+2,5* 0,9510,06* 49,213,9* 1,77Ю,11 0

ДКВ 0,1610,01* 70,3±3,1* 1,5410,11* 18,215,8* 1,6310,04* 7,113,4*

Контроль 0,5410,01 100,0 1,8810,04 100,0 1,76+0,03 100,0

Примечание: контроль - интактные животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений, *- достоверность различий с контролем (рсО.05).

Оценка влияния однократного введения бетулоновой кислоты и ее производных на каталитическую активность изоформ цитохрома Р-450 показала, что все изученные соединения оказывали выраженный индуцирующий эффект. Каталитическая активность изоформы цитохрома Р-450ПС (Ы-деметилирование амидопирина) возрастала на 20-80%, изоформы цитохрома Р-450П1А4 (Ы-деметилирование эритромицина) - на 20-60%, изоформы цитохрома Р-450ЦЕ1 (р-гидроксилирование анилина) - на 45-65%. Препарат сравнения ДКВ незначительно индуцировал только изоформу цитохрома Р-450450НЕ1 (р-гидроксилирование анилина) - на 16,3% не влияя на активность других изоформ цитохрома Р-450. Наиболее выраженное индуцирующее действие на все изученные изоформы оказывало аланинамидное производное бетулоновой кислоты - БК-2р (Табл. 4).

Таким образом, полусинтетические тритерпеноиды лупанового ряда обладают рядом свойств, характерных для мембранотропных молекул. Они оказывают такие фармакологические эффекты как антиоксидантный и мембраностабилизирующий. Эти эффекты опосредованы, по-видимому, взаимодействием БК-соединений с мембранными фосфолипидами и встраиванием их в мембраны. Взаимодействие приводит к снижению доступности ненасыщенных жирных кислот к перекисному окислению и повышает степень ненасыщенности фосфолипидов, оказывая, таким образом, влияние на реологические свойства мембран, что и является причиной изменений активности связанных с мембраной монооксигеназных ферментов.

Таблица 4.

Изменение каталитической активности изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени интактных крыс через 6 часов после введения БК-

соединений (М ± ш, п=6).

Группы живот- Амидопирин P-450IIC Эритромицин P-450IIIA4 Анилин Р-450IIE1

ных нсно % НСНО % АФ %

нмоль/ изменения нмоль/ изменения нмоль/ изменения

мин/мг от мин/мг от мин/мг от

белка контроля белка контроля белка контроля

БК 3,71+0,16* 172,9+7,0* 0,84+0,02* 156,5+1,8* 1,36±0,01* 164,3+1,8*

BK-2ß 3,91±0,12* 182,1+6,7* 0,86+0,02* 159,112,6* 1,37±0,06* 165,5+2,3*

ЭБК-23 2,55±0,10* 119,6±5,3* 0,63±0,05* 118,2+9,9* 1,18±0,07* 142,9±8,5*

ДКВ 2,15+0,05 0 0,51+0,01 0 0,96±0,03* 116,3±4,3*

Контроль 2,15±0,01 100,0 0,54+0,01 100,0 0,83±0,01 100,0

Примечание: контроль - животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. Скорость N-деметилирования амидопирина и эритромицина выражена в нмоль НСНО/мин/мг белка, скорость р-гидроксилирования анилина - в нмоль р-аминофенола/мин/мг белка, * -достоверность различий с контролем, принятым за 100% (р<0,05).

Изучение фармакологических эффектов производных бетулина на модели спонтанной индукции ПОЛ

Задачей дальнейшего исследования явилась сравнительная оценка антиоксидантной активности и дозозависимых эффектов бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных с использованием модели спонтанной индукции ПОЛ. Предложенная модель позволяет оценить антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства изучаемых соединений, их способность предупреждать деструкцию субклеточных структур и инактивацию мембраносвязанных ферментов (Шарапов В.И., Грек О.Р., Долгов A.B., 1986, 1987). Проведенное исследование показало, что все БК-соединения достоверно ингибировали накопление МДА в гомогенате печени через 60 мин спонтанной индукции. Ингибирующий эффект сохранялся и через 120 мин индукции ПОЛ. Сравнительная оценка антиоксидантной активности бетулоновой кислоты и ее альфа- и бета-производных показала, что выраженным антиоксидантным эффектом обладает ЭБК-2а, ингибирующий эффект которой сравним с ДКВ. Менее выраженный антиоксидантный эффект по сравнению с другими изученными соединениями выявлен у 3BK-2ß. Ингибирующий эффект данного соединения наблюдался только до 60 мин спонтанной индукции ПОЛ и не отличался от контрольных значений через 120 мин индукции ПОЛ.

Изучение дозозависимых эффектов бетулоновой кислоты и ее альфа-производных показало, что увеличение дозы бетулоновой кислоты до 100

мг/кг повышает антиоксидантную активность данного соединения. БК в дозе 100 мг/кг ингибировала образование МДА в нулевой точке по сравнению с дозой 50 мг/кг на 15,4%, через 60 мин индукции - на 43% и через 120 мин -на 32%. Дозозависимый эффект при введении БК-2а (100 мг/кг) не выявлен, хотя ингибирование ПОЛ сохранялось на прежнем уровне. При увеличении дозы ЭБК-2а до 100 мг/кг антиоксидантный эффект нивелировался и был существенно ниже по сравнению с эффектом бетулоновой кислотой (в дозе 50 и 100мг/кг) и ее производным БК-2а и ДКВ.

По-видимому, ЭБК-2а, обладая выраженным антиоксидантным эффектом, значительно повышает антиокислительный потенциал ткани печени, тем самым создает избыток в мембранах ненасыщенных жирных кислот, являющихся субстратами для свободнорадикальных процессов, что изменяет состав фосфолипидов в сторону повышения их окисляемости. С этим механизмом связывают ослабление эффективности антиоксидантов при увеличении их концентрации, вплоть до обратного эффекта (Аристархова С.Д., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г., 1974, Заславская Ю.А., Храпова Н.Г., Терехова С.Ф. и др., 1977, Храпова Н.Г., 1982).

Таким образом, проведенные эксперименты с использованием модели спонтанной индукции ПОЛ показали, что все БК-соединения оказывают в разной степени выраженности дозозависимый антиоксидантный эффект и повышают антиокислительный потенциал ткани печени. Наиболее выраженный антиоксидантный эффект отмечен у БК, возрастающий с увеличением дозы соединения (Табл. 5).

Таблица 5.

Дозозависимый эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-производных на активность спонтанной индукции ПОЛ в ткани печени интактных животных

(М ± ш, п=6).

Условие эксперемента Время спонтанной индукции ПОЛ

0 мин 60 мин 120 мин

БК (50 мг/кг) 0,13±0,01 0,21±0,02* 0,35±0,03*

БК (100 мг/кг) 0,1 Ш,003*,** 0,12±0,007*,** 0,24±0,01*,**

БК-2а (50 мг/кг) 0ДЗ±0,005 0,17±0,01* 0,26±0,03*

БК-2а (100 мг/кг) 0,15±0,008 . 0,17±0,008* 0,27±0,01*

ЭБК-2а (50 мг/кг) 0,10±0,002* 0,12±0,02* 0,18±0,01*

ЭБК-2а (100 мг/кг) 0,13±0,005,** 0,29±0,02*,** 0,61±0,07*,**

ДКВ (50 мг/кг) 0,11 ±0,002* 0,17±0,01* 0,18±0,005*

Контроль 0,14±0,0 06 0,53±0,02 0,69±0,006

Примечания: Показатель выражены в нмолях МДА на 1 мг белка. Звездочка -достоверность различий с контролем, две звездочки - дозозависимый эффект (р<0,05).

Изучение фармакологических эффектов производных бетулина на модели полихимиотерапии

Задачей дальнейшего исследования явилось изучение влияния однократного введения бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных на процессы свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантный потенциал крови, ткани печени, субклеточных мембранных структур гепатоцитов и каталитическую активность микросомальных монооксигеназных ферментных систем на модели экспериментальной полихимиотерапии. Как было установлено в экспериментах на 7-е и 14-е сутки полихимиотерапии в плазме крови снижался уровень антиоксидантов: а-токоферола (на 30%), ретинола (на 26-30%), церулоплазмина (на 25-50%). Следствием снижения в плазме крови антиоксидантов, явилось существенное понижение уровня антиокислительной активности (АОА) плазмы (на 2550%), при этом активность процессов ПОЛ, оцененная по концентрации МДА в плазме крови существенно возрастала - уровень МДА превышал контрольные значения на 7-е сутки на 66%, на 14-е сутки - на 47%. Предварительное за 6 часов до ПХТ введение бетулоновой кислоты и ее производных способствовало сохранению антиоксидантов в плазме крови (а-токоферола и ретинола) на уровне контрольных значений. Следует отметить, что защитный эффект у БК-2р и ДКВ был менее выраженным на 7-е сутки ПХТ. Определение концентрации церулоплазмина в плазме крови показало, что все соединения предупреждали значительное снижение данного показателя как на 7-е, так и 14-е сутки ПХТ. Уровень церулоплазмина оставался достоверно выше показателя в группе ПХТ. Защитный эффект у БК-2Р и ДКВ был менее выраженным на 14-е сутки ПХТ. Оценка уровня АОА плазмы установила, что на 7-е сутки при введении производных БК показатель АОА снижался, однако был достоверно выше по сравнению с группой ПХТ. На 14-е сутки показатель АОА при введении всех соединений не отличался от контроля. Предварительное до ПХТ введение бетулоновой кислоты и ее производных оказывало выраженный ингибирующий эффект на процессы ПОЛ. Концентрация МДА в плазме крови была на уровне контрольных значений как на 7-е, так и 14-е сутки ПХТ (Табл. 6, 7).

Таким образом, предварительное введение бетулоновой кислоты и ее производных оказывает выраженный протективный эффект, предупреждая снижение в полихимиотерапевтическом периоде антиоксидантного потенциала и блокируя процессы перекисного окисления липидов плазмы крови.

Изучение сравнительной эффективности и дозозависимых эффектов бетулоновой кислоты и ее альфа- и бета-производных на антиокислительный потенциал ткани печени при экспериментальной ПХТ показало, что введение комплекса цитостатиков приводило к существенному снижению (на 40-50%) АОА ткани печени на 7-е и 14-е сутки ПХТ. Следствием снижения АОА ткани печени явилась активация процессов ПОЛ ткани печени, что выражалось в достоверном увеличении концентрации МДА на 53,8% и 92,3%

соответственно на 7-е и 14-е сутки полихимиотерапевтического периода. Оценка сравнительной профилактической эффективности изучаемых соединений показала, что БК, ЭБК-2а, БК-2р и препарат сравнения ДКВ предупреждали снижение АОА ткани печени как на 7-е, так и 14-е сутки ПХТ. Эффект у БК-2а и ЭБК-2(] был менее выраженным, однако показатели АОА ткани печени оставались достоверно выше аналогичных в группе ПХТ на 7-е и 14-е сутки. Оценка дозозависимого эффекта у БК и ее альфа-производных показала, что увеличение дозы БК до 100 мг/кг приводило к достоверному возрастанию АОА ткани печени, при увеличении дозы БК-2а антиокислительный эффект не изменялся, а увеличение дозы ЭБК-2а сопровождалось достоверным снижением АОА ткани печени по сравнению с контролем.

Таблица 6.

Изменение концентрации а-токоферола в плазме крови (мг%) при проведения ПХТ на фоне однократного предварительного введения БК-соединений (М ± т, п~6)._

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 0,35±0,03* 0,34±0,11*

БК+ПХТ 0,43±0,02 0,49±0,07

БК-23+ПХТ 0,39±0,01* 0,51+0,09

ЭБК-20+ПХТ 0,66±0,11 0,56±0,12

ДКВ+ПХТ 0,41 ±0,01* 0,46+0,08

Контроль 0,52±0,05 0,52±0,05

Примечания: контроль - интактные животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений, * - достоверность различий с контролем (р<0,05).

Таблица 7.

Изменение концентрация МДА в плазме крови (нмоль/л) при проведения ПХТ на фоне однократного предварительного введения БК-соединений

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 5,29+0,56* 4,68+0,52*

БК+ПХТ 3,33+0,17 3,21 ±0,46

БК-2(3+ПХТ 2,91±0,17 2,96±0,14

ЭБК-2Р+ПХТ 2,86+0,19 3,15±0,06

ДКВ+ПХТ 3,25±0,12 3,29±0,12

Контроль 3,18±0,11 3,18±0,11

Примечание: контроль - интактные животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений, * - достоверность различий с контролем (р<0,05).

Таблица 8.

Сравнительная эффективность профилактического введения БК и ее альфа- и бета-производных (в дозе 50 мг/кг) по влиянию на перекисное окисление липидов в ткани печени (нмоль МДА/мг белка) при экспериментальной

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 0,20±0,007* 0,25±0,02*

БК+ПХТ 0,Н±0,008* 0,14±0,006

БК-2а+ПХТ 0,15±0,006* 0,16±0,009*

ЭБК-2а +ПХТ 0,10±0,005* 0,07±0,001*

БК-2Р+ПХТ 0,11±0,006* 0,08±0,001*

ЭБК-2Р+ПХТ 0,12±0,007 0,10±0,002*

ДКВ+ПХТ 0,10±0,002* 0,11±0,002*

Контроль 0,13+0,007 0,13+0,007

Примечание: контроль - интактные животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений, * - достоверность различий с контролем (р<0,05).

Изучение сравнительной профилактической эффективности соединений показало, что БК, ЭБК-2а, БК-2Р и ДКВ оказывали наиболее выраженный ингибирующий эффект на процессы перекисного окисления липидов ткани печени. Менее выраженный антиоксидантный эффект отмечался у БК-2а, когда на 7-е и 14-е сутки ПХТ концентрация МДА в ткани печени была достоверно выше контрольных значений, но оставалась ниже на 25-36% соответственно по сравнению с группой ПХТ. Оценка дозозависимого эффекта у БК и ее альфа-производных показала, что при введении БК в дозе 100 мг/кг достоверно возрастала ингибирующая активность соединения на процессы ПОЛ ткани печени, при увеличении дозы БК-2а антиокислительный эффект не изменялся, а увеличение дозы ЭБК-2а приводило к повышению активности процессов ПОЛ: концентрация МДА в ткани печени была выше контрольных значений в 1,6 раза (Табл. 8,

9)-

Таким образом, все изученные соединения в различной степени выраженности оказывают протективный эффект в ранние и отдаленные сроки полихимиотерапевтичевкого периода. Наиболее эффективными протективными свойствами обладают БК, ЭБК-2а, БК-2р и ДКВ, причем у БК выражен дозозависимый эффект.

В дальнейшем исследовании оценивалось влияние однократного профилактического введения бетулоновой кислоты и ее производных на микросомальный метаболизм ксенобиотиков и ПОЛ микросомальных мембран гепатоцитов при моделировании полихимиотерапевтического воздействия введением комплекса цитостатических препаратов.

Таблица 9.

Дозозависимый эффект однократного профилактического введения бетулоновой кислоты и ее альфа-производных на перекисное окисление липидов в ткани печени (нмоль МДАУмг белка) при экспериментальной

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 0,20+0,007* 0,25±0,02*

БК (50 мг/кг) + ПХТ 0,11+0,008* 0,1410,006

БК (100 мг/кг) + ПХТ 0,09+0,005*,** -

БК-2а (50 мг/кг) + ПХТ 0,15+0,006 0,1610,009*

БК-2а (100 мг/кг) + ПХТ 0,14±0,01 -

ЭБК~2а (50 мг/кг) + ПХТ 0,10+0,005* 0,0710,001*

ЭБК-2а (100 мг/кг) + ПХТ 0,19±0,01*,** -

Контроль 0,13+0,007 0,1310,007

Примечание: контроль - интактные животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. Одна звездочка - достоверность с контрольной группой, две звездочки - дозозависимый эффект (р<0,05).

Изучение каталитической активности некоторых изоформ цитохрома Р-450 позволило установить ингибирующее влияние на микросомальный метаболизм применяемого полихимиотерапевтического комплекса препаратов. Отмечалось достоверное снижение на 7-е сутки активности микросомальных изоформ, катализирующих N-деметилирование амидопирина и эритромицина приблизительно на одинаковую величину. Но активность изоформы цитохома Р-450, метаболизирующей эритромицин, не восстанавливалась в отдаленном сроке исследования (14-е сутки), что согласуется с данными литературы о высокой чувствительности изоформы цитохрома P-450IIIA4, катализирующей преимущественно метаболизм эритромицина к повреждению в процессах ПОЛ (Щербаков В.М., Тихонов A.B., 1995). Кроме того, зафиксировано, что меньше всего при проведении ПХТ ингибируются изоформы, ответственные за метаболизм анилина, показатели которого на протяжении всего периода исследования оставались неизменными. Профилактическое введение изучаемых БК-соединений предупреждало снижение скорости N-деметилирования амидопирина и эритромицина как в раннем, так и отдаленном периоде ПХТ. Показатели активности указанных ферментов не отличались от контроля (Табл. 10).

Таким образом, скорость биотрансформации используемых полихимиотерапевтических средств при поступлении их в организм определяет последующие токсические эффекты полихимиотерапии. В этих условиях индукция микросомальных ферментов, повышающая их каталитическую активность, предупреждает развитие деструктивных изменений, вызываемых полихимиотерапевтическим комплексом

цитостатиков, уменьшая вероятность развития последующих эффектов «отложенной» токсичности.

Таблица 10.

Скорость И-деметилирования амидопирина (нмоль НСНО/мин/мг белка) в микросомах на фоне ПХТ с предварительным введением БК-соединений

(М ± т, п=6)

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 1,81+0,05* 2,07±0,02

БК+ПХТ 2,15±0,04 2,15±0,05

БК-23+ПХТ 1,92±0,02 2,09±0,05

ЭБК-23+ПХТ 1,99+0,04 2,08±0,06

ДКВ+ПХТ 1,98 ±0,06 2,02±0,06

Контроль 2,15+0,01 2,15±0,01

Примечание: контроль - интактные животные с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. ПХТ - группа животных с введенным ПХТ комплексом, * - достоверность различий с контролем (р<0,05).

Таблица 11.

Скорость образования МДА (нмоль/мин /мг белка) при аскорбат-зависимом ПОЛ в микросомах на фоне ПХТ с однократным предварительным введением БК-соединений (М ± ш, п=б)._

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 2,39+0,11* 2,12±0,06*

БК+ПХТ 1,27±0,04*,** 1,51±0,16*,**

БК-23+ПХТ 1,53±0,02*,** 1,76±0,03*,**

ЭБК-2Р+ПХТ 1,45±0,05*,** 1,86±0,04 **

ДКВ+ПХТ 1,31±0,08*,** 2,07±0,05*

Контроль 1,88+0,04 1,88±0,04

Примечание: контроль - интактные животные с предварительным введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. ПХТ - группа животных с введенным ПХТ комплексом. Одна звездочка - достоверность различий с контролем, две звездочки - с группой ПХТ (р<0,05).

Профилактическое ведение бетулоной кислоты и ее производных приводило на 7-е сутки ПХТ к достоверному снижению активности спонтанного ПОЛ липидов микросомальных мембран как по сравнению с контролем, так и с группой ПХТ. На 14-е сутки показатели ПОЛ при введении БК и БК-2Р оставались ниже контрольных значений, а при введении ЭБК-2Р и ДКВ не отличались от контроля. Аналогичный ингибирующий эффект оказывали бетулоновая кислота и ее производные на активность аскорбат-зависимого ПОЛ липидов микросомальных мембран.

Результаты, полученные при оценке процессов липидной пероксидации микросомальных мембран, индуцированной НАДФН на 7-е и 14-е сутки ПХТ периода свидетельствуют о снижении активности микросомальных изоформ цитохрома Р-450, катализирующих реакции НАДФН-индуцированного ПОЛ. Так, на 7-е сутки ПХТ периода НАДФН-зависимое ПОЛ снижалось в 1,4 раза, на 14-е сутки оставалось сниженным в 1,3 раза. Сохранение на низком уровне «активирующих» ПОЛ микросомальных изоформ в полихимиотерапевтическом периоде свидетельствует, что механизм повреждения мембран клеток в незначительной степени связан с утечкой активных форм кислорода из электрон-транспортных цепей микросом в другие клеточные структуры. Профилактическое введение БК и ее производных предупреждало на 7-е сутки ингибирование активности НАДФН-зависимого ПОЛ. Скорость образования МДА в НАДФН-зависимых реакциях была достоверно выше по сравнению с группой ПХТ, хотя и оставались ниже контрольных значений. На 14-е сутки ПХТ при введении БК и ЭБК-20 активность НАДФН-зависимого ПОЛ не отличалась от контрольной, а БК-2Р и ДКВ сохраняли ее на более высоком уровне по сравнению с группой ПХТ. Аналогичный протективный эффект получен при введении БК и ее производных в отношении отдельных изоформ цитохрома Р-450, катализирующих метаболизм амидопирина и эритромицина. По показателям их метаболизма так же наблюдалось предупреждение инактивации скорости каталитических реакций, В то же время не отмечалось достоверных изменений при исследовании анилин-р-гидроксилирующей реакции, которая во всех группах на исследуемый срок оставалась неизменной, что, возможно, отражает индивидуальные особенности действия используемых препаратов химиотерапевтического комплекса на отдельные изоформы микросомальных ферментов (Табл. 11,12).

Таблица 12.

Скорость образования МДА (нмоль/мин /иг белка) при НАДФН-зависимом ПОЛ в микросомах на фоне ПХТ с однократным предварительным введением БК-соединений (М ± т, п=6)._

Группы животных Период полихимиотерапии

7 сутки 14 сутки

ПХТ 1,27±0,03* 1,40±0,03*

БК+ПХТ 1,41+0,03*,** 1,71±0,01 **

БК-23+ПХТ 1,65+0,03*,** 1,66±0,04*,**

ЭБК-23+ПХТ 1,58±0,05*,** 1,75±0,02 **

ДКВ+ПХТ 1,70±0,02 ** 1,67+0,01*,**

Контроль 1,76±0,03 1,76±0,03

Примечание: контроль — интактные животные с предварительным введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. ПХТ - группа животных с введенным ПХТ комплексом. Одна звездочка - достоверность различий с контролем, две звездочки - с группой ПХТ (р<0,05).

Таким образом, в заключении следует отметить, что воздействие применяемого комплекса полихимиотерапевтических препаратов при их однократном введении в дозе 1/5 от 1ЛЭ50 в отношении микросомальных мембранных структур носит деструктивный характер и проявляется уже на ранних этапах активацией ПОЛ с последующим снижением активности мембраносвязанных ферментов в разной степени выраженности для разных изоформ цитохрома Р-450.

Совокупность полученных результатов дает основание полагать, что бетулоновая кислота и ее альфа- и бета-аланинамидные производные обладая антиоксидантным, мембраностабилизирующим, фермент-индуцирующим эффектами, оказывают цитопротективный эффект по отношению к гепатоцитам при проведении комбинированной полихимиотерапии.

Основываясь на проведенном исследовании бетулоновой кислоты и ее производных можно заключить, что изученные соединения имеют

' выраженное гепатопротекторное действие и, таким образом, представляют терапевтическую ценность для применения в клинике с целью предупреждения гепатотоксических эффектов при проведении ПХТ.

ВЫВОДЫ

1. Однократное введение бетулоновой кислоты и ее альфа- и бета-аланинамидных производных в дозе 50 мг/кг сопровождается повышением антиокислительного потенциала плазмы крови, ингибированием активности спонтанного и индуцированного перекисного окисления липидов, повышением скорости М-деметилирования амидопирина и р-гидроксилирования анилина в ткани печени у интактных животных.

2. Бетулоновая кислота и ее производное БК-2|3 при однократном введении интактным животным повышают каталитическую активность изоформ цитохрома Р450: Р-450ПС (№-деметилирование амидопирина), Р-450ША4 деметилирование эритромицина), Р-450ПЕ1 (р-гидроксилирование анилина), оказывают выраженный ингибирующий эффект на активность спонтанного, аскорбат- и НАДФН-индуцированного перекисного окисления липидов микросомальных мембран.

3. Бетулоновая кислота и ее альфа- и бета-производные в дозе 50 мг/кг в разной степени выраженности ингибируют активацию перекисного окисления липидов ткани печени, предупреждая снижение антиокислительной активности в динамике спонтанной индукции ПОЛ. Выраженный дозозависимый антиоксидантный эффект выявлен у бетулоновой кислоты, у метилового эфира 2р-аланин-бетулоновой кислоты антиоксидантный эффект при увеличении дозы нивелируется.

4. Профилактическое введение БК-соединений предупреждает активацию перекисного окисления липидов в плазме крови и снижение концентрации антиоксидантов: а-токоферола, ретинола, церулоплазмина и антиокислительной активности в ранний (7-е сутки) и отдаленный (14-е сутки) периоды полихимиотерапии.

Однократное профилактическое введение бетулоновой кислоты и ее альфа- и бета-производных в дозе 50 мг/кг ингибирует активацию перекисного окисления липидов, предупреждая снижение антиокислительной активности ткани печени в полихимиотерапевтическом периоде. При увеличении дозы БК-соединений до 100 мг/кг, у бетулоновой кислоты антиоксидантный эффект возрастает, у БК-2а дозозависимый антиоксидантный эффект не проявляется, а у ЭБК-2а - антиоксидантный эффект нивелируется. Предварительное однократное введение бетулоновой кислоты, 2Р-аланин-бетулоновой кислоты и метилового эфира 2р-аланин-бетулоновой кислоты перед введением комплекса цитостатиков эффективно предупреждает снижение каталитической активности изоформ цитохрома Р-450: P-450IIC (N-деметилирование амидопирина), P-450IIIA4 (N-деметилирование эритромицина) на 7-е и 14-е сутки полихимиотерапевтического периода. Полусинтетические тритерпеноиды лупанового ряда (бетулоновая кислота, 2р-аланин-бетулоновая кислота, метиловый эфир 2Р-аланин-бетулоновой кислоты) ингибируют процессы спонтанной, аскорбат- и НАДФН-индуцированной пероксидации липидов микросомальных мембран, что способствует сохранению каталитической активности микросомальных монооксигеназных ферментов в полихимиотерапевтическом периоде.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шарапов И.В., Жоголь P.A., Мотолова Т.И. Влияние производных бетулоновой кислоты на индуцированное аскорбатом перекисное окисление липидов в печени //АВИЦЕННА-2004: Ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2004,- С. 361.

2. Шарапов И.В., Жоголь P.A., Мотолова Т.Н. Изучение антиоксидантных свойств бетулоновой кислоты и ее производных на модели тепловой ишемии ткани печени //АВИЦЕННА-2004: Ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2004.- С. 375.

3. Жоголь P.A., Мотолова Т.И., Шарапов И.В., Грек O.P., Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Власова И.В. Влияние аланинамидопроизводных бетулоновой кислоты на активность микросомального метаболизма в печени при ее тепловой ишемии // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: Мат. Всерос. науч. конф. 5-7 окт., 2004 г. - Новосибирск, 2004,- С. 218-219.

4. Шарапов И.В., Мотолова Т.И., Жоголь P.A., Толстикова Т.Г., Власова И.В. Грек O.P., Шарапов В.И. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на НАДФН-Fe и аскорбат-Ре-зависимое перекисное окисление липидов в печени при ее ишемии // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: Мат. Всерос. науч. конф. 5-7 окт., 2004 г. - Новосибирск, 2004,- С. 259-260.

5. Жоголь P.A., Шарапов И.В., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Грек O.P., Шарапов В.И. Активность монооксигеназной системы печени при проведении цитостатической терапии на фоне профилактического введения бетулоновой кислоты и ее амидов // Современные проблемы фармакологии и фармации: Мат. Всерос. научно-практ. конф. 18-19 мая 2005 г.- Новосибирск, 2005,- С. 103-105.

6. Жоголь P.A., Мотолова Т.Н., Елькова A.B., Шарапов И.В., Грек O.P., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Шарапов В.И. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность микросомальной монооксигеназной системы печени // Медицина и образование в XXI веке: Ежегодн. научно-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 70-летию НГМА.- Новосибирск,

2005,- С. 124-126.

7. Шарапов И.В., Жоголь P.A., Елькова A.B., Мотолова Т.И. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов в микросомах печени у интактных животных // АВИЦЕННА-2005: Ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2005,- С. 376377.

8. Шарапов И.В., Шнипов М.М., Жоголь P.A., Мотолова Т.Н., Елькова

A.B. Влияние пикнолара на перекисное окисление и метаболизм у интактных животных в микросомах печени // АВИЦЕННА-2005: Ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2005.- С. 378-379.

9. Шарапов И.В., Шнипов М.М., Жоголь P.A. Цитопротекторный эффект пикнолара при токсическом поражении печени // АВИЦЕННА-2006: Ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск,

2006.- С. 503-504.

10. Жоголь P.A., Шарапов И.В., Грек O.P., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Шарапов В.И. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность микросомального метаболизма при тепловой ишемии печени // Журнал экспериментальной и клинической медицины,- Новосибирск, НГМА.- 2006,- № 1-2,- С.25-28.

И. Шарапов И.В., Жоголь P.A., Грек O.P., Шарапов В.И. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулина на модели тепловой ишемии печени // Журнал экспериментальной и клинической медицины,-Новосибирск, НГМА.- 2006.- № 1-2.- С.29-32.

12. Позднякова C.B., Грек O.P., Жоголь P.A., Шарапов И.В., Шарапов

B.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Активность монооксигеназ печени и биологические эффекты бетулоновой кислоты и ее амидных производных // Вестник Новосибирского государственного Университета.- Серия: биология, клиническая медицина.- 2006,- Т.4.- Вып. 3,- С. 66-70.

13. Грек O.P., Позднякова C.B., Жоголь P.A., Шарапов И.В., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты - новые индукторы монооксигеназной системы печени// Бюллетень сибирской медицины,- 2006.- Том 5.- Приложение 2.- С. 63-64.

14. Позднякова C.B., Грек O.P., Жоголь Р.А, Шарапов И.В., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты в лечении органотоксического действия цитостатиков// Сибирский консилиум,- 2006.- № 3(50).- С. 90-93.

15. Шарапов И.В., Шинкарева Н.В., Ким Т.В. Антиоксидантный потенциал плазмы крови при экспериментальной полихимиотерапии на фоне профилактического введения производных бетулина //АВИЦЕННА-2007: Мат. ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2007.- С. 466-467.

16. Шарапов И.В., Шинкарева Н.В., Ким Т.В. Сравнительная противоишемическая активность аланинамидных производных бетулоновой кислоты // АВИЦЕННА-2007: Мат ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2007.- С. 470-471.

17. Шарапов И.В., Позднякова C.B., Грек O.P., Жоголь Р.А, Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Влияние длительного введения бетулоновой кислоты и её амидов на активность монооксигеназной системы печени крыс // Фармакология - практическому здравоохранению - Мат III Съезда фармакологов России,- Санкт-Петербург, 23-27 сент. 2007 г.- С-Петербург, 2007.- Т.7.- С.2-2013.

18. Грек O.P., Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Жоголь Р.А, Шарапов И.В., Ким Т.В., Шинкарева Н.В. Гепатопротекторные свойства производных бетулина// Создание новых лекарственных препаратов: Мат. С 43 конф. 1 Под ред. Е.Д. Гольдберга.- Томск: Изд-во Томск. Ун-та, 2007.- С.

19. Шарапов И.В., Шинкарева Н.В., Ким Т.В. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность процессов перекисного окисления липидов в печени при экспериментальной полихимиотерапии// АВИЦЕННА-2008: Мат ежегод. конкурс-конф. студ. и молод, ученых: Тез. докл,-Новосибирск, 2008.- С. 411-412.

20. Ким Т.В., Грек О.Р., Начаров Ю.В., Толстикова Т.Г., Шарапов И.В., Шарапов В.И., Шинкарева Н.В. Влияние профилактического введения производных бетулоновой кислоты на активность процессов липопероксидации гомогената печени при экспериментальной полихимиотерапии// Вестник новых медицинских технологий.- 2008.- Т. XV, №.3-С. 13-14.

84-86.

Соискатель

И.В. Шарапов

Список сокращений

АЗПОЛ - аскорбат-зависимое перекисное окисление

БК - бетулоновая кислота

БК-2Р - 2(3-аланин бетулоновая кислота

БК-2а - 2а-аланин бетулоновая кислота

БК-соединения (БК, БК-2а, БК-2р, БК-2а, ЭБК-2а, ЭБК-2р)

ДКВ - дигидрокверцетин

ЛД50 - полулетальная доза

МДА - малоновый диальдегид

НЗПОЛ - НАДФН-зависимое перекисное окисление

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПХТ - полихимиотерапия

СПОЛ- спонтанное перекисное окисление

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭБК-2р - 2р-аланин-метиловый эфир бетулоновой кислоты ЭБК-2а - 2а-аланин-метиловый эфир бетулоновой кислоты ЭДТА - этилендиаминтетраацета

Подписано к печати 02 апреля 2009 г. Заказ № 658

Формат бумаги 60x84 1/16 Объем 1 п.л._Тираж 100 экз.

Отпечатано: ООО «Сибирская Сервис Служба» 630082, Новосибирск, ул. Д. Ковальчук, 85