Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов

На правах рукописи

МОЧАЛОВ КОНСТАНТИН СЕРГЕЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ И ГЕНЕРАЦИЮ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2009

003461237

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Медведев Юрий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Росздрава

Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Росздрава по адресу: г. Уфа, 450000, ул. Ленина 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Росздрава по адресу: г. Уфа, 450000, ул. Ленина 3

Автореферат разослан « ^ » оОи-с&О^АЛ 2009 г.

Веселов Станислав Юрьевич кандидат биологических наук, с.н.с. Курчатова Нелли Наилевна

Ученый секретарь диссертационного совета

Лукманова К.. А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Среди наиболее эффективных средств, используемых в различных областях медицины, важное место продолжают занимать препараты иммуноглобулинов, в том числе и для внутривенного введения (В13ИГ). Широкое применение ВВИГ определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых методов их лечебно-профилактического использования, определения разных сторон биологической активности данных препаратов, оценки их эффективности при разной патологии. Известно, что ВВИГ обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действием, механизмы которых полностью не прояснены [Добрица В.П. и др., 2001; Sapir T. et al., 2005].

В настоящее время продолжает оставаться актуальным исследование процессов фагоцитоза, характеризующих наряду с другими защитными механизмами иммунной системы способность организма противостоять инфекционным и другим факторам, в том числе вызывающим заболевания воспалительного характера [Медведев Ю.А. и др., 1999; Долгушин И.И. и др., 2001; Djaldetti M. et al., 2002; Dale D.C. et al., 2008; Kantari C. et al., 2008].

Препараты иммуноглобулинов могут оказывать разноплановое действие. Одним из важнейших свойств этих биопрепаратов является способность влиять на разные виды клеток, и в том числе стимулировать процессы фагоцитоза [Сибиряк C.B. и др, 1999; Медведев Ю.А. и др., 2000; Nilsdotter-Augustinsson A. et al., 2004]. Вместе с тем известно, что препараты ВВИГ обладают противовоспалительным действием, одним из компонентов которого является угнетение различных проявлений фагоцитарной активности клеток [Stangel M. et al., 2000]. Так, препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения используются для купирования системного воспалительного ответа [Белобородое В.Б. и др., 2000; Гизатуллин Р.Х. и др, 2004; Хвойнов Д.В. и др., 2005; Sriskandan S. et al., 2006] и явлений воспалений аллергической и аутоиммунной природы [Медведев Ю.А. и др., 2000; Бакиева И.Г. и др., 2005; Алсынбаев М.М. и др., 2006].

В результате активации фагоцитов осуществляется целый ряд метаболических перестроек. Важнейшим механизмом, задействованным в процессах фагоцитоза, является изменение активности кислород-зависимого метаболизма (КЗМ) и генерации свободных радикалов (CP) - активных форм кислорода (АФК) [Владимиров Ю.А., 2000; Фархутдинов P.P., 2006; Juergen А., 1999].

Интерес исследования данных процессов представлен в двух аспектах. С одной стороны, важным является оценка динамики кислород-зависимых процессов и генерации АФК, поскольку они выступают в качестве одного из критериев, отражающих изменения функционально-метаболической активности фагоцитов под действием различных факторов, что позволит охарактеризовать влияние препаратов ВВИГ на фагоцитарные механизмы. С другой стороны, актуальным является оценка действия препаратов на сами процессы образования свободных радикалов. Свободно-радикальное окисление (СРО) — фундаментальный биологический процесс, обеспечивающий нормальную жизнедеятельность, а процессы фагоцитоза являются одним из путей образования свободных радикалов в организме. CP являются предметом многочисленных исследований, имеют большое значение в

развитии воспаления [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Martins P.S. et al., 2003; Tripathi P. et al., 2007; Vajdovich P., 2008; Maor I. et al., 2008]. Так, АФК активируют белковый синтез, способствуют образованию хемоаттрактантов, образуют эффекторное звено аппарата биоцидности фагоцитов, направленной на деструкцию и элиминацию патогенных факторов [Маянский А.Н., 2005; Behe Р. et al., 2007; Nauseff W.M., 2007]. Однако, кроме своего физиологического значения АФК в избыточном количестве могут инициировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызывать модификацию антигенов и повреждения молекул и клеток собственного организма, стать основой патогенеза многих заболеваний [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Martins P.S. et al., 2003; Gilca M. et al., 2007; Nguyen H.X. et al., 2007; Papatheodorou L. et al, 2007].

Известно, что многие ингибиторы свободно-радикальных реакций оказывают выраженное противовоспалительное действие. Поэтому интерес представляет оценка прямого влияния иммуноглобулиновых препаратов ВВИГ на процессы образования свободных радикалов, а также опосредованного - через взаимодействие с фагоцитарными клетками.

В настоящее время влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитные свойства фагоцитов и генерацию ими АФК определяется только в процессе их лечебного применения in vivo [Алсынбаев М.М., 2002; Корженевский A.A. и др., 2002]. Сведения о лабораторных методах оценки активности ВВИГ до их клинического применения отсутствуют. В связи с этим, актуальна разработка экспресс-методов предварительной оценки влияния различных иммуноглобулиновых препаратов на функционально-метаболическую активность фагоцитов.

Перспективным способом оценки процессов кислород-зависимого метаболизма и генерации CP является регистрация сверхслабого свечения -хемилюминесценции (XJ1), дающей возможность непрерывно наблюдать за динамикой образования радикалов [Владимиров Ю.А., 1999,2007; Фархутдинов P.P. и др., 2005, 2006; Guzik T.J. et al., 2005]. Хемилюминесцентные методы позволяют судить о влиянии различных препаратов на процессы СРО. Так, в экспериментах in vitro можно по изменению интенсивности XJI при добавлении препаратов в модельные системы определить антиокислительную активность препаратов (АОА). Исследование спонтанной и стимулированной XJI фагоцитарных клеток все шире используется для изучения их функционального состояния и динамики образования АФК [Друх В.М., 2005; Заславская М.И. и др., 2006; Тевдорадзе С.И., 2006; Pavclkova М. et. al., 2004; Sinyakov M.S. et al., 2007].

С учетом вышеизложенного, изучение изменений функционально-метаболической активности фагоцитов и генерации ими CP под влиянием препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, а также определение антиокислительных свойств данных препаратов представляет научный и практический интерес.

Цель исследования

Оценить влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов.

Задачи исследования

1 Определить воздействие разных препаратов иммуноглобулинов на генерацию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах.

2 Исследовать влияние препаратов внутривенных иммуноглобулинов на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода разними типами фагоцитов (интактные из крови и активированные из перитонеального воспалительного экссудата полиморфно-ядерные лейкоциты) при добавлении стимуляторов - объектов фагоцитоза in vitro и возможность оценки влияния препаратов по изменениям этой интенсивности с помощью регистрации хемилюминесценции.

3 Оценить in vitro изменения кислород-зависимого метаболизма интактных полиморфно-ядерных лейкоцитов из крови и перитонеальных макрофагов и участвующих в динамике воспалительного процесса активированных перитонеальных полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеарных фагоцитов под влиянием разных доз препаратов внутривенных иммуноглобулинов.

4 Исследовать in vivo влияние препаратов на кислород-зависимые процессы фагоцитов (активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - на фоне развития воспаления) при введении экспериментальным животным.

Научная новизна

Проведена оценка влияния препаратов ВВИГ на процессы свободно-радикального окисления: генерацию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах in vitro. Впервые показано, что все исследуемые ВВИГ угнетают ХЛ в модельных системах. ВВИГ способны подавлять образование свободных радикалов. Наиболее выраженное антиокислительное действие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения проявляется в липидосодержащих модельных системах с высоким содержанием липидов низкой и очень низкой плотности.

Изучено воздействие препаратов ВВИГ на функционально - метаболическую активность фагоцитарных клеток разных видов и генерацию ими АФК при взаимодействии с различными стимуляторами - объектами фагоцитоза. Установлено, что препараты ВВИГ в низких концентрациях способны оказывать стимулирующее действие на функциональную активность фагоцитов, в неодинаковой степени выраженное для препаратов с разными технологиями производства по отношению к тем или иным объектам фагоцитоза.

Впервые установлено, что препараты ВВИГ в высоких концентрациях способны оказывать прямое ингибирующее действие на функционально-метаболическую активность полиморфно-ядерных и мононуклеарных фагоцитов -угнетать активацию процессов кислород-зависимого метаболизма этих клеток, генерацию ими АФК, выявляемую с помощью регистрации хемилюминесценции.

Воздействие ВВИГ на инактные полиморфно-ядерные фагоциты крови и активированные полиморфно-ядерные лейкоциты из очага воспаления носит дозозависимый модулирующий разнонаправленный характер: низкие концентрации стимулируют генерацию АФК, высокие подавляют. Воздействие ВВИГ на интактные макрофаги и активированные мононуклеарные фагоциты крыс из очага воспаления характеризуются однонаправленными изменениями: происходит

подавление генерации активных форм кислорода.

Впервые проведено исследование влияния ВВИГ на процессы кислород-зависимого метаболизма фагоцитов и генерацию АФК (полиморфно-ядерные лейкоциты) in vivo. Установлено, что изменения активности кислород-зависимого метаболизма полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс из очага воспаления после введения животным ВВИГ in vivo соответствуют таковым при воздействии препаратов на клетки in vitro и характеризуются дозозависимой разнонаправленностыо: низкие концентрации ВВИГ стимулируют генерацию АФК клетками, а высокие - подавляют.

В результате проведенных исследований разработаны тест-системы, основанные на измерении хемилюминесценции, позволяющие оценивать влияние ВВИГ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток и генерацию ими активных форм кислорода.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты исследования расширяют представление о влиянии ВВИГ на фагоцитарные механизмы иммунной защиты и процессы образования свободных радикалов - генерацию АФК и реакции перекисного окисления липидов.

Выявленные в работе свойства ВВИГ непосредственно взаимодействовать со CP и разнонаправлено изменять функционально-метаболическую активность фагоцитов и сопутствующую ей генерацию АФК являются одними из механизмов модулирующего и противовоспалительного действия препаратов. Результаты, полученные с помощью регистрации хемлюминесценции, дают возможность рекомендовать разработанные в работе методы для определения биологических свойств препаратов ВВИГ и доклинической сравнительной оценки их эффективности in vitro. По материалам диссертации получены два патента на изобретение: "Способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов" № 2318 202, Бюл. № 6, 2008 и "Способ определения противовоспалительного действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения" № 2331 885, Бюл. № 23,2008.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лаборатории препаратов крови филиала Иммунопрепарат ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ г. Уфа и Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на лекциях и занятиях на кафедре морфологии и физиологии человека и животных биологического факультета Башкирского государственного университета и кафедре нормальной физиологии Башкирского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения в модельных системах подавляют процессы перекисного окисления липидов и генерации активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хемилюминесценции.

2 Препараты внутривенных иммуноглобулинов оказывают стимулирующее действие на показатели функционально - метаболической активности (поглотительная способность, кислород-зависимый метаболизм) интактных полиморфно-ядерных лейкоцитов крови и активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов воспалительного экссудата по отношению к разным объектам фагоцитоза и на интенсивность генерации ими активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хемилюминесценции, в которой четко отражается степень выраженности такого влияния.

3 Воздействие препаратов in vitro на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными полиморфно-ядерными лейкоцитами из крови и перитонеального экссудата характеризуется дозозависимыми разнонаправленными изменениями их кислород-зависимой активности: низкие концентрации препаратов ее стимулируют, а высокие - подавляют. Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на генерацию интактными и активированными перитонеальными мононуклеарными фагоцитами из экссудата характеризуется однонаправленным характером: как низкие, так и высокие дозы препаратов угнетают процессы кислород-зависимого метаболизма.

4 Введение экспериментальным животным внутривенных иммуноглобулинов (Иммуновенин) в разных концентрациях оказывает разнонаправленное воздействие на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами из очага воспаления, аналогичное воздействию препарата на фагоциты in vitro.

Апробация работы

Материалы исследований представлены на I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006), научно-практических конференциях с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2006, 2007, 2008), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2007), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).

Апробация диссертации проведена на расширенном заседании научно-технического совета Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации (протокол № 18 от 28.10.08); на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 (протокол № 2 от 24.11.08).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 в изданиях журналов, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 14 таблиц, 23 рисунка, 1 схемы. Список литературы включает 214 источников (106 отечественных и 108 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В данной работе изучали влияние препаратов ВВИГ на функциональную и метаболическую активность фагоцитов и процессы образования свободных радикалов in vitro, оценивали перспективы использования хемилюминесцентных методов исследования для изучения фагоцитарных механизмов и определения биологических свойств иммуноглобулиновых препаратов крови. Общая характеристика проведенного исследования представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Общая характеристика проведенного исследования

Этапы исследования Методы исследования

I. Изучение влияния ВВИГ на СРО в модельных системах. Измерение железоиндуцированной ХЛ модельных систем [Фархутдинов P.P. и др., 2005]; Оценка АОА по угнетению ХЛ -светосуммы (S), и максимального свечения (Imax); Измерение спонтанной и стимулированнои люминолзависимой ХЛ; Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест); Моделирование фагоцитарной реакции (поглотительная способность фагоцитов, фагоцитарный индекс, фагоцитарный показатель) [Имельбаева Э.А. и др., 2006]; Оценка функционального резерва фагоцитарных клеток [Тевдорадзе С.И., 2006].

II. Действие ВВИГ на функциональную и метаболическую активность и генерацию АФК интактными полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПМЯЛ) крови и активированными ПМЯЛ при добавлении различных стимуляторов фагоцитоза

III. Оценка влияния разных концентраций ВВИГ на кислород-зависимый метаболизм и генерацию АФК: - интактными ПМЯЛ крови крыс и человека - интактными макрофагами крыс - активированными ПМЯЛ крыс из очага воспаления - активированными мононуклеарными фагоцитами крыс из очага воспаления

IV. Исследование изменений кислород-зависимого метаболизма и генерации АФК ПМЯЛ из очага воспаления при влиянии ВВИГ in vivo

В работе были использованы препараты нормальных донорских иммуноглобулинов для внутривенного введения, различающиеся по технологиям получения и составу - Иммуновенин (производства Филиала ФГУП "НПО "Микроген" МЗ и CP РФ "Иммунопрепарат", г. Уфа), Хумаглобин (Human Serum Production and Medicine Manufacturing CoLtd, Венгрия) и Пентаглобин (Biotest Pharma GmbH, Германия).

Регистрацию свечения проводили на приборе хемилюминомер «XJIM-003» (производитель - Уфимский государственный авиационный технический университет). В качестве наиболее информативных показателей XJT были взяты светосумма - S и максимальная амплитуда медленной вспышки - Imax [Фархутдинов P.P. и др., 2005].

Прямое влияние препаратов ВВИГ на процессы генерации свободных радикалов in vitro оценивали в модельных системах. В качестве первой модели использовали фосфатный буфер (КН2Р04 - 20 мМ, KCl - 105 mM, pH 7,45 ед.) с добавлением цитрата натрия (50 мМ) и люминола (5-амино, 2-3-дегидро-4-

8

фталазиндион, 105 М). Для оценки антиокислительной активности препаратов ВВИГ на процессы ПОЛ была использована вторая модельная система, содержащая липидно-белковые комплексы из гомогенизированного куриного желтка [Харитонов В.В. и др., 2004], а также плазма крови человека (третья модельная система). Образование свободных радикалов инициировали введением 1 мл раствора сернокислого железа (Ре8047Н20 - 50 мМ) в 19 мл исследуемого образца при постоянном перемешивании. Реакция сопровождалась ХЛ. Свечение регистрировалось в течение 5 минут. Антиокислительную активность препаратов определяли по угнетению ХЛ модельных систем, результаты выражали в процентах от контроля [Фархутдинов Р.Р. и др., 2005].

Для исследования влияния препаратов на функционально-метаболическую активность и генерацию АФК фагоцитами при добавлении стимуляторов-объектов фагоцитоза использовали генаринизированную кровь (из расчета 50 ЕД гепарина на 1 мл) интактных животных и суспензию ПМЯЛ из очага воспаления крыс, вызванного внутрибрюшинным введением 20 мл стерильного 8 % пептона через сутки ("спровоцированные " ПМЯЛ). Кровь интактных крыс и суспензии ПМЯЛ разливали в лунки 96-луночного пластикового планшета. К образцам добавляли препараты ВВИГ в конечных концентрациях 5 мг/мл. После предварительной инкубации при 37 °С в течение 30 минут во все лунки добавляли по 0,01 мл суспензий с объектами фагоцитоза - микросферы латекса, частицы зимозана, живые клетки из культуры стафилококка в концентрации Ю10 частиц/л и дополнительно инкубировали при 37 °С в течение 15 минут. Интенсивность генерации фагоцитами АФК определяли с помощью регистрации уровня люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) [Фархутдинов Р.Р. и др., 2005]. Изучая ХЛ ответ фагоцитов крови на стимуляторы фагоцитоза, представлялось целесообразным исследовать резервные возможности фагоцитирующих клеток крови. Для оценки емкости резерва функциональной активности фагоцитов крови применялась формула, показывающая кратность отношения резерва к спонтанному свечению [Тевдорадзе С.И., 2006]: X = ( 1ы - 15р ) \ 15р, где X - соотношение резерва функциональной активности к спонтанному свечению фагоцитов крови; 1м -максимальная интенсивность индуцированного свечения крови, 15р - максимальная интенсивность спонтанного свечения крови. В материале из параллельных лунок исследуемых и контрольных образцов определяли поглотительную способность фагоцитов и индуцируемую активзцию кислород - зависимого метаболизма фагоцитов - НСТ тест [Имельбаева Э.А. и др., 2006].

Для изучения действия разных концентраций ВВИГ на активность фагоцитарных клеток разных типов и генерации ими АФК были использованы интактные и активированные клетки. Действие препарата на интактные фагоцитарные клетки тестировали по изменению функционально-метаболических показателей клеток венозной крови крыс и практически здоровых доноров, промывной перитонеальной жидкости (резидентные тканевые макрофаги) интактных крыс.

Для оценки действия препаратов на активированные фагоцитарные клетки у крыс моделировали процесс воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением 20 мл стерильного 8 % раствора пептона. После инъекции из очага асептического воспаления путем отбора перитонеального экссудата получали через сутки

"спровоцированные" ПМЯЛ, через трое суток "спровоцированные" мононуклеарные фагоциты (МФ) [Тевдорадзе С.И., 2006]. К образцам биологических жидкостей, содержащим фагоцитирующие клетки и гепарин (50 ЕД/мл), добавляли препараты ВВИГ в разных концентрациях: 0,05-5,00 мг/мл -соответствующих иммунокорригирующим дозам и в высоких («подавляющих активность») концентрациях 25-50 мг/мл - соответствующих применяемым дозам при курсовом лечении больных с признаками выраженной острой воспалительной реакции (тяжелые травмы, септические состояния и другие) [Сибиряк C.B. и др., 1999; Гизатуллин Р.Х. и др., 2004]. Выбранные дозы соответствуют принятым в фармакологической практике: в опытах in vitro лечебные дозы препаратов десятикратно завышаются.

Исследуемые образцы суспензий клеток в пластиковых пробирках типа «Эппендорф» инкубировали в течение 24 часов при 24 °С. Определяли спонтанную активацию процессов кислородзависимого метаболизма по восстановлению нитросинего тетразолия (спонтанный НСТ-тест) после 15-минутной инкубации общепринятым методом и интенсивность генерации фагоцитами АФК методом регистрации люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ).

Следующим этапом работы было исследование влияния ВВИГ (Иммуновенин) на кислород-зависимую активность, генерацию АФК фагоцитами in vivo. Опыты проведены на 30 крысах-самках массой 180-200 грамм. Животные были разделены на 3 группы по 10 в каждой. Крысам вводили однократно внутрибрюшинно раствор пептона, как было описано выше, с целью развития воспалительного процесса. Животные первой группы служили контролем. Крысам второй и третьей групп в день инъекции пептона вводили однократно внутримышечно препарат ВВИГ - Иммуновенин в дозах 250 мг/кг и 1250 мг/кг соответственно. Через сутки животных декапитировали с соблюдением методических рекомендаций по их выведению из эксперимента и эвтаназии [Западнюк И.П. и др., 1984]. Путем промывания перитонеальной полости получали суспензию клеток ПМЯЛ. Определяли их кислород-зависимую метаболическую активность с помощью регистрации ХЛ и НСТ-теста.

Оценка достоверности результатов проводилась с применением пакета программ Statistica v. 6.0 (StatSoft). Достоверность оценивалась по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе работы проводили исследование влияния препаратов ВВИГ на процессы СРО в модельных системах. При введении в модельные системы препаратов в концентрации 0,5 мг/мл интенсивность ХЛ уменьшалась. С увеличением концентрации препаратов угнетение ХЛ усиливалось (рисунок 1).

А) активных форм кислорода; Б) куриного желтка; В) плазмы крови человека.

1 - контроль; 2 - добавлен Иммуновенин 0,5 мг/мл; 3 - добавлен Иммуновенин 5 мг/мл.

Снижение максимальной амплитуды и светосуммы свечения, по сравнению с контрольными образцами в дозе 5 мг/мл, в большей степени было выражено в системе желточных липопротеидов, соответствующих по составу липопротеидам крови низкой и очень низкой плотности (таблица 2).

Таблица 2 - Влияние препаратов внутривенных иммуноглобулинов на параметры хемилюминесценции модельных систем

Препарат Концентрация мг/мл XJI модельной системы АФК ХЛ желточных липопротеидов ХЛ плазмы крови человека

S (в % от контроля) I (в % от контроля) S (в % от контроля) 1 (в % от контроля) S (в % от контроля) 1 (в % от контроля)

Контроль (п=10) 100 100 100 100 100 100

Иммуновенин (п=10) 0,5 79,2±0,3* 74,5+1,2* 74,5+1,0* 80,6+2,1* 69,5±4,5* 77,1+6,3*

5 60,3 ±1,2* 58,1±3,0* 31,8±1,5* 39,7±2,5* 59,4±1,6* 65,2+3,0*

Хума-глобин (п=10) 0,5 81,8±1,6* 79,3±2,3* 65,4±1,9* 73,6±2,0* 76,3 ±3,8* 73,7+5,1*

5 63,3+1,1* 59,8±1,8* 37,7±0,5* 46,1 ±1,2* 63,8±5,0* 67,3+4,3*

Г1е] па-глобин (п=10) 0,5 83,0±3,6* 81,314,6* 77,1+0,6* 79,6±1,4* 64,3±1,9* 66,7+2,4*

3 73,4±1,4* 68,3±1,2* 42,5i0,6* 53,3±1,5* 57,2±3,7* 69,7±5,2*

* - различие с контролем статистически значимо (Р<0,05).

Следовательно, препараты ВВИГ способны непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами: подавлять генерацию АФК и выработку перекисных радикалов липидов.

Интерес представляет изучение влияния ВВИГ на генерацию АФК и функционально-метаболическую активность фагоцитов при добавлении стимуляторов - объектов фагоцитоза in vitro. В связи с этим были проведены исследования влияния препарата Иммуновенин при добавлении к ПМЯЛ различных объектов фагоцитоза.

Предварительная инкубация лейкоцитов крови интактных крыс с препаратом Иммуновенин в концентрации 5 мг/мл увеличивала продукцию АФК на стимуляторы фагоцитоза (таблица 3).

Таблица 3 - Изменения функционально-метаболической активности полиморфно-ядерных лейкоцитов крови крыс после предварительной инкубации с препаратом Иммуновенин

Показатели активности Объект фагоцитоза Контроль С Иммуновенином

Светосумма ХЛ (у.е.) (п=10) латекс 5,13±0,60 7,29±0.67*

стафилококк 18,39+3,26 36,14+2,33*

Фагоцитарный индекс (%) (п=10) латекс 55,77+1.85 58,60+4,12

стафилококк 58,92+3,64 61,35+4,43

Фагоцитарный показатель (п=10) латекс 3,82+0,22 5,14+0,30*

стафилококк 5,18+0,43 6,43+0,22*

НСТ индуцированный (%) (п=10) латекс 58,84+2,63 60,27+4,52

стафилококк 60,18+2,77 65,14+3,43

НСТ индуцированный (п=10) (индекс активации) латекс 0,98+0,09 1,38+0,15*

стафилококк 1,14+0,13 1,66+0,19*

различие с контролем статистически значимо (Р<0,05).

Активирующее влияние Иммуновенина на генерацию АФК, регистрируемую в реакции XJI, отмечалось параллельно с увеличением интенсивности поглощения фагоцитами объектов фагоцитоза и уровня активации лейкоцитов в НСТ - тесте. При этом стимулирующее влияние на фагоциты затрагивало качественные (фагоцитарный показатель и индекс активации в НСТ-тесте в каждом из активных фагоцитов), а не количественные показатели функционально-метаболической активности фагоцитов.

Препараты ВВИГ, различающиеся составом и технологиями производства, при добавлении индуктора зимозан к лейкоцитам крови крыс оказывали активирующее влияние, выраженное в разной степени (рисунок 2).

. 25 л

5 § 10

5 5

Рисунок 2 - Уровень индуцированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов крови крыс после предварительной инкубации с препаратами внутривенных иммуноглобулинов * - различие с контролем статистически значимо (Р<0,05).

□ Контроль Я Иммуновенин ЕХумаглобнн 5 Пентаглобин

Как видно из рисунка, препараты Иммуновенин и обогащенный и I ".А Пентаглобин вызывали достоверно выраженную активацию фагоцитов крови, в то время как для Хумаглобина такая активация не была достоверной.

Для полной характеристики состояния фагоцитов при воздействии 13ВИГ необходимо иметь представление об изменении емкости их функционального резерва (таблица 4).

Таблица 4 - Изменения относительной емкости функционального резерва фагоцитарных клеток крови крыс при воздействии препаратов внутривенных иммуноглобулинов

Препарат Iiijax inj ïmax sp, y. e Imaxind ïmaxsp îfnax sd Относительная емкость резерва фагоцитов крови, %

Контроль (п=10) 1,0 3±0,08 I,45±0,25 100

Иммуновенин (п=10) 1,73±0,15* 2,461-0,05* 169,7*

Хумаглобин (п=10) 2,35±0,31* 2,30±0,20* 158,6*

Пентаглобин (п=10) 2,10±0,04* 2,65±0,15* 182,7*

* - различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

Как следует из таблицы 4, относительная емкость резервных возможностей фагоцитов крови при воздействии ВВИГ значительно увеличилась (в среднем на 70 %).

Далее было изучено влияние ВВИГ на кислород-зависимую функционально-метаболическую активность и генерацию АФК фагоцитарными клетками, обладающими повышенным начальным уровнем активации (стимулированные фагоциты).

Все исследованные препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения вызывали достоверное увеличение показателей активированных ПМЯЛ в отношении объектов фагоцитоза (таблица 5).

Таблица 5 - Уровень хемилюминесценции активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс, индуцированной зимозаном, латексом или стафилококком после предварительной инкубации клеток с препаратами внутривенных иммуноглобулинов

Препарат Светосумма ХЛ (у.е.) при индукции:

зимозаном латексом стафилококком

Без препаратов (п=10) 1,22±0,15 5,34+0,92 33,93±6Д4

Иммуновенин (п=10) 4,57±1,43* 8,20+0,56* 60,16±9,82*

Хумаглобин (п=10) 3,54±0,44* 6,4 8± 1,07 56,18±7,03*

Пентаглобин (п=10) 5,05±1,48* 6,21+1,51 58,98±8,92*

*- различие с контролем статистически значимо (Р<0,05).

Защитную активность и генерацию АФК в отношении зимозана стафилококков достоверно усиливали все препараты, в то время как реакцию с

инородными корпускулярными частицами не биологической природы микросферами латекса (взаимодействие опосредуется лектиноподобными рецепторами мембран фагоцитов) только Иммуновенин.

Следующим этапом работы стала оценка влияния различных концентраций ВВИГ на функционально-метаболическую активность разных типов фагоцитарных клеток и генерацию ими АФК.

По полученным данным, воздействие препаратов ВВИГ в разных концентрациях на кислород-зависимый метаболизм, генерацию АФК интактными полиморфно-ядерными лейкоцитами крови крыс и человека характеризовалось одинаковыми закономерностями (таблица 6).

Таблица 6 - Показатели хемилюминесценции полиморфно-ядерных лейкоцитов крови крыс и человека после инкубации с препаратами внутривенных иммуноглобулинов

Объект Концентрации Иммуновенин Хумаглобин Пентаглобин

исследования препаратов

Лейкоциты Контроль 2,24±0,41 2,24±0,41 2,24±0,41

КрОБИ 0,05 мг/мл 2,01±0,14 1,99±0,05 2,50±0,44

крыс 0,25 мг/мл 3,37±1,12 2,01±0,28 2,53±0,18

(п=10) 1,25 мг/мл 3,26±0,11* 4,04±0,54* 3,28±0,02*

5 мг/мл 8,12±3,72 5,34±0,98* 2,15±0,01

12,5 мг/мл 1,14±0,13* 2,58±0,40 0,37±0,02*

25 мг/мл 0,63±0,30* 1,03±0Д2* 0,40±0,06*

Лейкоциты Контроль 3,54±0Д6 3,54±0,26 3,54±0,26

крови 0,05 мг/мл 3,41±0,10 3,17±0,41 3,27±0,03

человека 0,25 мг/мл 3,22±0,41 3,54±0,91 3,07±0,44

(п=10) 1,25 мг/мл 5,34±0,04* 5,87±0,41* 2,87±0,61

5 мг/мл 6,03±0,31* 3,62±0,71 5,36±0,50*

12,5 мг/мл 1,64±0,35* 3,14£0,89 2,86±0,95

25 мг/мл 1,54±0,15* 1,82±0,34* 1,78±0,35*

* - различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

Дозы в 0,05-0,25 мг/мл не оказывали влияния на интенсивность ХЛ, а 1,25 мг/мл вызывали усиление свечения образцов. Более высокие дозы препаратов ВВИГ (5-25 мг/мл) оказывали различные по направлению воздействия на ХЛ клеток. Иммуновенин и Пентаглобин в концентрации 5 мг/мл повышали интенсивность ХЛ крови человека, тогда как усиление ХЛ крови крысы вызывал только Хумаглобин. Добавление высоких доз 12,5-25 мг/мл препаратов оказывало противоположно направленное воздействие - то есть подавляло свечение клеток крови, отражающее снижение генерации АФК клетками.

Показатели НСТ-теста в той или иной степени повторяли изменения светосумм ХЛ, однако в диапазоне доз 0,05-0,25 мг/мл показатели НСТ-теста практически не менялись. Влияние ВВИГ в НСТ-тесте проявлялось в дозах 5-25 мг/мл (рисунок 3).

Рисунок 3 - Показатели НСТ-теста полиморфно-ядерных лейкоцитов крови к - крыс, ч - человека:

А - процент позитивных клеток, Б - индекс активации, при добавлении препаратов внутривенных иммуноглобулинов в дозах 5 мг/мл; 12,5 мг/мл; 25 мг/мл.

*- различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

Препараты воздействовали сходным образом на показатели НСТ-теста: усиливающее влияние в концентрации 5 мг/мл (в 1,5 раза от контроля) и подавляющее в дозе 25 мг/мл (снижение в 1,5-2 раза).

Следовательно, препараты ВВИГ в зависимости от используемой концентрации способны стимулировать либо подавлять процессы генерации АФК фагоцитами крови.

Изучение влияния исследуемых ВВИГ на ХЛ резидентных перитонеальных макрофагов выявило снижение значений исследуемых концентраций (таблица 7).

Таблица 7 - Показатели светосумм резидентных перитонеальных макрофагов крыс после инкубации с препаратами внутривенных иммуноглобулинов в разных концентрациях

Объект исследования Концентрации препаратов Иммуновенин Хумаглобин Пентаглобин

Резидентные перитонеальные макрофаги крыс (п=10) Контроль 3,40+0,22 3,40±0,22 3,40+0,22

0,05 мг/мл 1,55+0,16* 2,14±0,09* 1,41+0,25*

0,25 мг/мл 1,62±0,15* 1,42+0,02* 0,69+0,02*

1,25 мг/мл 1,26±0,49* 0,92+0,32* 0,93+0,31*

5 мг/мл 0,94+0,48* 0,42±0,06* 0,81+0,11*

12,5 мг/мл 0,77+0,50* 0,45+0,18* 0,38+0,28*

25 мл/мл 0,23+0,11* 0,38+0,28* 0,28+0,11*

* - различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

Параметры НСТ не менялись при добавлении низких концентраций ВВИГ. Только высокие дозы этих препаратов угнетали значения НСТ-теста в 1,5-2 раза (рисунок 4), что может быть связано с меньшей чувствительностью этого показателя в сравнении с регистрацией ХЛ.

ЛБ

Концентра1дада(мгЛ*1л)

0,05 0,251,25 5 12,5 25

5 «¿9

а 0.8

ч ОЛ

Я 0,6

Ю

03

0,2

11

X

0

Р

О Контроль я Нммуновенин

в Хум.чг нпбпн

в Пентаглобпн

Концентр ации(мг/мл)

0,050,251,25 5 12,5 25

Рисунок 4 - Показатели НСТ-теста перитонеальных интакных макрофагов крыс:

А - процент позитивных клеток, Б - индекс активации, при добавлении препаратов внутривенных иммуноглобулинов в различных дозах. *- различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

Таким образом, препараты внутривенных иммуноглобулинов подавляют генерацию АФК интактными макрофагами крыс.

Воздействие ВВИГ на ХЛ ПМЯЛ из очага воспаления крыс характеризовалось сходными закономерностями, сопоставимыми с влиянием ВВИГ на интактные ПМЯЛ крови: в низких концентрациях (0,25-1,25 мг/мл) они усиливали генерацию фагоцитами АФК, а в высоких (12,5-25 мг/мл) ее подавляли. Выявленное зависимое от дозы разнонаправленное проявление биологической активности препаратов ВВИГ можно характеризовать как модулирующее. Интенсивность стимулирующего влияния низких концентраций препаратов существенно различалась (рисунок 5).

Рисунок 5 - Модулирующее влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на кислород-зависимый метаболизм активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс по данным регистрации хемилюминесценции.

Так, Пентаглобин, отличающийся значительным содержанием иммуноглобулинов классов ^М и ^А, вызывал усиление ХЛ фагоцитов уже начиная с минимальной использованной концентрации (0,05 мг/мл), в то время как препараты Иммуновеаин

и Хумаглобин, представленные в подавляющем количестве ^О, в данной дозе не оказывали стимулирующего влияния на активность фагоцитарных клеток. ВВИГ в концентрациях 0,25 мг/мл и в еще большей степени 1,25 мг/мл - стимулировали данные процессы. Дозы в 5 мг/мл не оказывали достоверного влияния на определявшиеся показатели полиморфно-ядерных лейкоцитов, а в концентрациях 12,5 мг/мл и 25 мг/мл препараты в равной степени вызывали угнетение кислород-зависимого метаболизма, генерации АФК.

Изучение воздействия ВВИГ на процессы кислород-зависимого метаболизма мононуклеарных активированных фагоцитов, полученных из очага воспаления, выявило однонаправленный характер и было сопоставимо с влиянием ВВИГ на генерацию АФК интактными перитонеальными макрофагами крыс. Уже в минимальной использованной концентрации данные препараты вызывали угнетение ХЛ (рисунок 6).

Рисунок 6 - Влияние препаратов внутривенных иммуноглобулинов на кислород -зависимый метаболизм активированных перитонеальных мононуклеарных фагоцитов крыс по данным регистрации хемилюминесценции.

В диапазоне доз 1,25-25 мг/мл ВВИГ вызывали подавление процессов генерации АФК как по данным XJI, так и по показателям НСТ-теста.

Таким образом, влияние ВВИГ in vitro на мононуклеарные активированные фагоциты крыс носило угнетающий характер, в целом, в равной степени выраженный для всех исследуемых препаратов, в то время как в экспериментах по изучению прямого влияния ВВИГ на функции ПМЯЛ in vitro была выявлена модулирующая способность препаратов: в низких дозах усиливать и в высоких -подавлять процессы кислород-зависимого метаболизма и генерации АФК.

Выявленные закономерности модулирующего влияния ВВИГ подтвердились при введении разных доз препарата животным в опытах in vivo. После введения животным Иммуновенина в дозе 250 мг/кг уровень XJI клеток повышался (в 1,4 раза в сравнении с контролем) (таблица 8).

Таблица 8 - Показатели активности кислород-зависимого метаболизма активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс из очага воспаления после воздействия Иммуновенина in vivo

Введение препарата Иммуновенин в дозах Показатели НСТ-теста Светосумма JI3XJI (У.е.)

Процент НСТ Индекс активации

Контроль (без ИВ) (п=10) 75,21+2,49 1,18+0,08 12,35+0,76

250 мг/кг (п=10) 82,60+4,90 1,10+0,10 16,43+1,50*

1250 мг/кг (п=10) 57,14+7,14* 0,76+0,07* 6,22+0,82*

* - различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

Используемая доза соответствовала низким (1,25-5 мг/мл) концентрациям препарата в пересчете на применяемые концентрации в in vitro эксперименте.

Введение крысам Иммуновенина в дозе 1250 мг/кг вызывало противоположно направленное изменение активности - снижение свечения ПМЯЛ в 2 раза в сравнении с контролем. В пересчете на используемые в эксперименте in vitro исследуемая доза соответствовала высоким концентрациям (12,5 мг/мл) препарата. Снижение кислород-зависимого метаболизма наблюдалось также и в НСТ - тесте.

Таким образом, по данным ХЛ, как и в in vitro экспериментах разнонаправленные эффекты В ВИГ были выявлены in vivo: активация генерации АФК в низких и подавление кислород-зависимого метаболизма фагоцитов в высоких дозах. В то же время, действие препарата in vivo проявлялось менее выражено. Это может быть объяснено тем, что действие ВВИГ у животных in vivo осуществлялось не в результате прямого воздействия препарата на клетки, как в эксперименте in vitro, а имело опосредованный характер.

Фагоцитарные клетки являются ведущими участниками воспалительных реакций, а вырабатываемые ими свободные радикалы АФК играют роль в регуляции воспалительного и иммунного ответа. Положительное или отрицательное физиологическое значение CP и активации кислород-зависимых процессов фагоцитарных механизмов определяется множеством условий: балансом уровня генерации АФК, приуроченностью активации фагоцитов к стадии воспаления, локализацией этих процессов и др. Наряду с этим многосторонними эффектами в организме обладают и молекулы иммуноглобулинов.

Подводя итоги проведенного исследования, можно сделать следующее заключение о том, что ВВИГ способны непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами: подавлять генерацию АФК и реакции ПОЛ in vitro, то есть обладают антиокислительной активностью. Антиокислительная активность препаратов иммуноглобулинов, вероятно, может быть обусловлена наличием в их молекулах аминокислот с антиокисидантыми свойствами, например цистеина (компонента антиоксидантной системы организма - глутатиона) со свободными SH -группировками. Поскольку многие ингибиторы свободно-радикальных реакций обладают противовоспалительной активностью, то выявленные антиокислительные свойства ВВИГ могут быть одним из механизмов их терапевтического воздействия при воспалении. Однако, наряду со способностью непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами, эти препараты могут, напротив,

стимулировать функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию ими АФК in vitro при осуществлении реакций в отношении объектов фагоцитоза, что также имеет важное значение в механизмах защиты организма от чужеродных факторов.

В основе стимулирующего влияния препаратов лежит, вероятно, способность иммуноглобулинов взаимодействовать с фагоцитами (трансрецепторное, опсонизирующсе).

Препараты ВВИГ способны оказывать разнонаправленное модулирующее влияние на генерацию АФК фагоцитарными клетками (интактные из крови и активированные полиморфно-ядерные лейкоциты из очага воспаления) в зависимости от концентрации in vitro: в низких дозах осуществляется активация кислород-зависимого метаболизма, в высоких - подавление. Различия в интенсивности действия на генерацию АФК разных ВВИГ могут послужить основой для уточнения показаний к применению того или иного препарата при лечении больных. Усиление процессов кислород-зависимого метаболизма фагоцитов при применении ВВИГ может способствовать повышению резистентности организма, а в условиях воспаления - скорейшей деструкции и элиминации чужеродных факторов. Однако, в случаях гиперактивации кислород-зависимых процессов и генерации АФК, когда их действие выступает в меньшей степени как защитный приспособительный механизм, а в большей как повреждающий фактор, создается необходимость снижения активности данных процессов. В связи с этим, подавление генерации АФК в фагоцитах из очага воспаления характеризует способность ВВИГ снижать гиперактивацию фагоцитарных процессов, нормализовать динамику кислород-зависимой активности.

В восстановительную стадию воспаления, переход к которой осуществляют мононуклеарные фагоциты, не наблюдается усиленной выработки биоокислителей и отмечаются низкие показатели свечения активированных мононуклеаров по сравнению с полиморфно-ядерными лейкоцитами. Препараты ВВИГ не оказывали стимулирующего эффекта на мононуклеарные фагоциты и тем самым не вызывали усиления процессов СРО.

С учетом ключевой роли фагоцитирующих клеток и реакций свободно-радикального окисления в воспалительных процессах можно полагать, что выявленная способность ВВИГ модулировать активность фагоцитов является одним из механизмов противовоспалительного действия данных препаратов.

Выводы

1 Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения обладают способностью непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами, проявляют антиокислительные свойства, подавляя процессы радикалообразования в разных модельных системах. Наиболее выраженное антиокислительное действие проявляется в модельных системах с высоким содержанием липидов низкой и очень низкой плотности.

2 Воздействие препаратов внутривенных иммуноглобулинов в концентрации 5 мг/мл на интактные полиморфно-ядерные фагоциты крови и активированные, участвующие в воспалении полиморфно-ядерные лейкоциты, при добавлении разных объектов фагоцитоза характеризуется стимулирующей активностью

(поглотительная способность, кислород-зависимый метаболизм в НСТ-тесте), усилением генерации активных форм кислорода. Регистрируемая с помощью люминол-зависимой хемилюминесценшш интенсивность генерации активных форм кислорода четко отражает степень воздействия препаратов.

3 Влияние препаратов на функционально-метаболическую активность интакных циркулирующих в крови и «воспалительных» перитонеальных полиморфно-ядерных лейкоцитов носит дозозависимый модулирующий характер: в диапазоне концентраций от 1,25 мг/мл до 5,0 мг/мл они усиливают генерацию активных форм кислорода, выявляемую с помощью регистрации хемилюминесценции, а при концентрациях 12,5-25 мг/мл - подавляют. При добавлении к интактным перитонеальным макрофагам и активированным мононуклеарным фагоцитам крыс из очага воспаления препараты внутривенных иммуноглобулинов в концентрациях от 0,05 мг/мл до 25 мг/мл по результатам хемилюминесценции проявляют однонаправленное дозозависимое ингибирующее действие на процессы генерации активных форм кислорода.

4 Препараты внутривенных иммуноглобулинов при введении их экспериментальным животным in vivo в разных дозах проявляют разнонаправленное воздействие, аналогичное действию препаратов на фагоциты in vitro: в дозе 250 мг/кг массы тела через сутки происходит повышение, а в дозе 1250 мг/кг - снижение показателей активации кислород-зависимого метаболизма полиморфно-ядерных лейкоцитов воспалительного экссудата, генерации клетками активных форм кислорода по результатам хемилюминесценции.

Практические рекомендации

1 Выявленные антиокислительные свойства препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения позволяют рекомендовать их к использованию при патологических состояниях, сопровождающихся активацией процессов свободно-радикального окисления и перекисного окисления липидов.

2 Установленные антиокислительные свойства препаратов внутривенных иммуноглобулинов в модельных системах сочетаются со способностью активировать функционально-метаболическую активность фагоцитарных клеток, что является их преимуществом в сравнении с другими препаратами антиоксидантного действия, угнетающими функциональную активность фагоцитов. Эти результаты дают возможность использовать препараты внутривенных иммуноглобулинов для коррекции функциональных нарушений фагоцитарного звена иммунитета.

3 Способность препаратов внутривенных иммуноглобулинов модулировать в зависимости от дозы функционально-метаболическую активность разных типов фагоцитарных клеток является основанием для рекомендаций к применению этих препаратов в любую фазу воспалительной реакции для профилактики развития тяжелых осложнений

4 Используемые методы лабораторного определения воздействия внутривенных иммуноглобулинов на фагоцитарные механизмы можно рекомендовать для оценки биологических свойств препаратов от разных производителей и осуществлять отбор наиболее эффективных из них.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Алсынбаев М.М., Туйгунов М.М., Исрафилов А.Г., Фархутдинов P.P., Медведев Ю.А., Мочалов К.С., Маннанова И.В. Оценка стимулирующего препарата иммуновенин на функционально-метаболическую активность фагоцитов методом регистрации хемилюминесценции // Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8.- № 2-3.- С. 116.

2 Алсынбаев М.М., Туйгунов М.М., Фархутдинов P.P., Медведев Ю.А., Исрафилов А.Г., Мочалов К.С. Иммуновенин как стимулятор защитной активности фагоцитов // Медицинский вестник Башкортостана. - 2006. - T.L.- № 1- С. 22-24.

3 Мочалов К.С. Влияние препаратов интраглобина, пентаглобина, хумоглобина и октагама на генерацию активных форм кислорода в цельной крови in vitro // Материалы Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых. Вестник РГМУ. - М., 2006,- №2 (49). - С.404-405.

4 Мочалов К.С. Генерация активных форм кислорода при активации процессов фагоцитоза препаратами хумоглобина, пентаглобина и интраглобина // Материалы конференции «Вопросы теоретической и практической медицины». -Уфа, 2006. -С.135-136.

5 Мочалов К.С., Туйгунов М.М., Медведев Ю.А., Исрафилов А.Г Изменение люминол-зависимой хемилюминесценции крови при добавлении препаратов хумаглобина, И.Г. Вена Н.И.В., октагама, интраглобина и пентаглобина // Актуальные вопросы биологии и медицины. Сборник научных трудов. - Москва -Уфа, 2006.-С. 103-106.

6 Туйгунов М.М., Фархутдинов P.P., Алсынбаев М.М., Медведев Ю.А., Мочалов К.С., Маннанова И.В. Активация кислородзависимых микробицидных свойств фагоцитов некоторыми препаратами иммуноглобулинов для внутривенного введения // Материалы V конференции иммунологов Урала. Иммунология Урала. -Оренбург, 2006. - №1(5). - С.126-127.

7 Мочалов К.С., Исрафилов А.Г., Туйгунов М.М. Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на генерацию активных форм кислорода in vitro // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине». - Нижний Новгород, 2007. Казанский медицинский журнал. Приложение. - Т.88 - № 4.-С.84-85.

8 Мочалов К.С. Оценка противовоспалительного действия препаратов иммуноглобулинов с применением хемилюминесцентных методов. // Материалы конференции «Вопросы теоретической и практической медицины». - 2007. - С. 189190.

9 Алсынбаев М.М., Туйгунов М.М., Медведев Ю.А., Фархутдинов P.P., Исрафилов А.Г., Мочалов К.С., Маннанова И.В. Патент на изобретение № 2331 885 Способ определения противовоспалительного действия препаратов для внутривенного введения // Бюл. № 23, 2008.

10 Алсынбаев М.М., Туйгунов М.М., Фархутдинов P.P., Медведев Ю.А., Исрафилов А.Г., Мочалов К.С., Маннанова И.В. Патент на изобретение №2318 202. Способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов // Бюл. № 6,2008.

11 Мочалов К.С., Медведев Ю.А., Фархутдинов P.P., Алсынбаев М.М., Туйгунов М.М., Исрафилов А.Г. Изменения интенсивности генерации активных форм кислорода полиморфно-Ядерными и мононуклеарными фагоцитами крыс при влиянии препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения in vitro // Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда. - Барнаул, 2008. - Т.1.- С. 239-240.

12 Мочалов К.С. Модулирующее влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на генерацию активных форм кислорода полиморфно-ядерными фагоцитами из очага воспаления // Материалы конференции «Вопросы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2008. - Т.1.- С.228-230.

13 Мочалов К.С. Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов (иммунологический и патофизиологический аспекты) // Проблемные вопросы физиологии и психологии: межвузовский научный сборник. -Уфа, 2008. - С.101-105.

Список сокращений и условных обозначений

АОА - антиокислительная активность

АФК - активные формы кислорода

КЗМ - кислород-зависимый метаболизм

JI3XJ1 - люминол-зависимая хемилюминесценция

МС - модельная система

МФ - мононуклсарные фагоциты

ПМЯЛ - полиморфно-ядерные фагоциты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

CP - свободные радикалы

СРО - свободно-радикальное окисление

ХЛ - хемилюминесценция

I max - максимальная амплитуда медленной вспышки lg G (М, А) - иммуноглобулин G (М, А) S - светосумма

ВВИГ - иммуноглобулины для внутривенного введения ЦФТ - цитрат-фосфат-люминол НСТ - нитросиний тетразолий

Мочалов Константин Сергеевич

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ И ГЕНЕРАЦИЮ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 22.01.2009. Формат 60x90. Бумага для множ. ап. Печать на ризографе. Усл. п. л 1,5 Заказ № 8-09. Тираж 100.

Башкирский институт физической культуры Редакционно-издательский центр (лицензия №257 от 22.07. 2005 г.)

450000, г. Уфа, ул. Достоевского, 73 Тел. (347) 276-14-84

Актуальность проблемы

Среди наиболее эффективных средств, используемых в различных областях медицины, важное место продолжают занимать препараты различных иммуноглобулинов, в том числе и для внутривенного введения (ВВИГ) [2,7,80,117,168,192]. Широкое применение ВВИГ определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых методов их лечебно-профилактического использования, определения разных сторон биологической активности данных препаратов, оценки их эффективности при разной патологии. Ввиду возможности быстрого введения в организм значительной массы ВВИГ, они служат также эффективным средством неотложной коррекции у пациентов количественного дефицита содержания иммуноглобулинов. Известно, что ВВИГ обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действием, механизмы которых полностью не прояснены [30,120,194].

В настоящее время продолжает оставаться актуальным исследование процессов фагоцитоза, характеризующих наряду с другими защитными механизмами иммунной системы, способность организма противостоять инфекционным и другим факторам, в том числе вызывающим заболевания воспалительного характера [31,51,53,55,102,106].

Препараты иммуноглобулинов могут оказывать разноплановое действие. Одним из важнейших свойств этих биопрепаратов является способность влиять на разные виды клеток [127,140,149,164,205], и в том числе стимулировать процессы фагоцитоза [158,165,203]. Вместе с тем известно, что препараты ВВИГ обладают противовоспалительным действием, одним из компонентов которого является угнетение различных проявлений фагоцитарной активности клеток [172,177]. Так, препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения используются для купирования системного воспалительного ответа

11,46,81,89,142] и явлений воспалений аллергической и аутоиммунной природы [3,30,57,79,89].

В процессе активации фагоцитов осуществляется целый ряд метаболических перестроек. Важнейшим механизмом, задействованным в процессах фагоцитоза является изменение активности кислород-зависимого метаболизма (КЗМ) и генерации свободных радикалов (CP) - активных форм кислорода (АФК) [21,24,25,38,87,88,98,108]. Интерес исследования данных процессов представлен в двух аспектах.

С одной стороны важным является оценка динамики кислород-зависимых процессов и генерации АФК, поскольку они выступают в качестве одного из критериев, отражающего изменения функционально-метаболической реактивности фагоцитов под действием различных факторов, что позволит охарактеризовать влияние препаратов ВВИТ на фагоцитарные механизмы. С другой стороны актуальным является оценка действия препаратов на сами процессы образования свободных радикалов АФК. Свободно-радикальное окисление (СРО) -фундаментальный биологический процесс, обеспечивающий нормальную жизнедеятельность, а процессы фагоцитоза являются одним из путей образования свободных радикалов в организме. CP имеют большое значение в развитии воспаления [87,113,181,182,209,212,213].

Так, АФК активируют белковый синтез, способствуют образованию хе-моаттрактантов, образуют эффекторное звено аппарата биоцидности фагоцитов, направленного на деструкцию и элиминацию патогенных факторов

50,51,98,102,115,167,170]. Однако, кроме своего физиологического значения

АФК в избыточном количестве могут инициировать процессы перекисного окисления липидов, вызывать модификацию антигенов и повреждения молекул и клеток собственного организма, стать основой патогенеза многих заболеваний [98,102,175,181,183,186,197,207,212,213,214].

Известно, что многие ингибиторы свободно-радикальных реакций, оказывают выраженное противовоспалительное действие. Поэтому интерес представляет оценка прямого влияния иммуноглобулиновых препаратов ВВИГ на процессы образования свободных радикалов, а также опосредованного - через взаимодействие с фагоцитарными клетками.

В настоящее время влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитные свойства фагоцитов определяется только в процессе их. лечебного применения in vivo [3,82]. Сведения о лабораторных методах оценки активности ВВИГ до их клинического применения отсутствуют.

В связи с этим, актуальна разработка экспресс-методов предварительной оценки влияния различных иммуноглобулиновых препаратов на функционально-метаболическую активность фагоцитов.

Перспективным способом оценки процессов кислород-зависимого метаболизма и генерации CP является регистрация сверхслабого свечения - хеми-люминесценции (XJ1), дающим возможность непрерывно наблюдать за генерацией образования радикалов [22,23,96,97,99,100,138]. Хемилюминесцентные методы позволяют судить о влиянии различных препаратов на процессы СРО. Так, в экспериментах in vitro можно по изменению интенсивности XJ1 при добавлении препаратов в модельные системы, имитирующие наиболее распространенные в организме реакции СРО - образование активных форм кислорода и перекисное окисление липидов, изучить механизм их действия и определить антиокислительную активность (АОА) препаратов.

Исследование спонтанной и стимулированной XJI фагоцитарных клеток в последние годы используется для изучения их функционального состояния [8,33,37,92,118].

С учетом вышеизложенного, изучение изменений функционально-метаболической активности фагоцитов и генерации ими CP под влиянием препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, а также определение антиокислительных свойств данных препаратов представляет научный и практический интерес.

Цель исследования

Оценить влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов.

Задачи исследования

1 Определить воздействие разных препаратов иммуноглобулинов на генерацию свободных радикалов активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах.

2 Исследовать влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода разными типами фагоцитов (интактные из крови и активированные из перитонеального воспалительного экссудата полиморфно-ядерные лейкоциты) при добавлении стимуляторов — объектов фагоцитоза in vitro, и возможность оценки влияния препаратов по изменениям этой интенсивности с помощью регистрации хемилюминесценции.

3 Оценить in vitro изменения кислород-зависимого метаболизма интакт-ных полиморфно-ядерных лейкоцитов из крови и перитонеальных макрофагов, и участвующих в динамике воспалительного процесса активированных перитонеальных полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеарных фагоцитов под влиянием разных доз препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения.

4 Исследовать in vivo влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на кислород-зависимые процессы фагоцитов (активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - на фоне развития воспаления) при введении экспериментальным животным.

Научная новизна

Проведена оценка влияния препаратов ВВИТ на процессы свободно-радикального окисления: генерацию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах in vitro. Впервые показано, что все исследуемые ВВИТ угнетают XJ1 в модельных системах. ВВИГ способны подавлять образование свободных радикалов. Наиболее выраженное антиокислительное действие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения проявляется в липидосодержащих модельных системах с высоким содержанием липидов низкой и очень низкой плотности.

Изучено воздействие препаратов ВВИГ на функционально - метаболическую активность фагоцитарных клеток разных видов и генерацию ими АФК при взаимодействии с различными стимуляторами - объектами фагоцитоза. Установлено, что препараты ВВИГ в низких концентрациях способны оказывать стимулирующее действие на функциональную активность фагоцитов, в неодинаковой степени выраженное для препаратов с разными технологиями производства по отношению к тем или иным объектам фагоцитоза.

Впервые установлено, что препараты ВВИГ в высоких концентрациях способны оказывать прямое ингибирующее действие на функционально-метаболическую активность полиморфно-ядерных и мононуклеарных фагоцитов - угнетать активацию процессов кислород-зависимого метаболизма этих клеток, генерацию ими АФК, выявляемую с помощью XJI.

Воздействие ВВИГ на инактные полиморфно-ядерные лейкоциты крови и активированные полиморфно-ядерные лейкоциты из очага воспаления,носит дозозависимый модулирующий разнонаправленный характер: низкие концентрации стимулируют генерацию АФК, высокие подавляют. Воздействие ВВИГ на интактные макрофаги и активированные мононуклеарные фагоциты крыс из очага воспаления характеризуются однонаправленными изменениями, осуществляется подавление генерации АФК.

Впервые проведено исследование влияния ВВИГ на процессы кислород-зависимого метаболизма фагоцитов и генерацию АФК (полиморфно-ядерные лейкоциты) in vivo. Установлено, что изменения активности кислород-зависимого метаболизма полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс из очага воспаления после введения животным ВВИГ in vivo соответствуют таковым при воздействии препаратов на клетки in vitro и характеризуются дозозависимой разнонаправленностью: низкие концентрации ВВИТ стимулируют генерацию АФК клетками, а высокие - подавляют.

В результате проведенных исследований разработаны тест-системы, основанные на измерении хемилюминесценции, позволяющие оценивать влияние ВВИТ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток и генерацию ими АФК.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты исследования расширяют представление о влиянии препаратов ВВИГ на фагоцитарные механизмы иммунной защиты и процессы образования свободных радикалов - генерацию активных форм кислорода и реакции перекисного окисления липидов.

Выявленные в работе свойства ВВИГ непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами, и разнонаправлено изменять функционально-метаболическую активность фагоцитов и сопутствующую ей генерацию актив-пых форм кислорода, являются одним из механизмов модулирующего и противовоспалительного действия препаратов. Результаты, полученные с помощью регистрации хемилюминесценции, дают возможность рекомендовать разработанные методы для определения биологических свойств препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения и доклинической сравнительной оценки их эффективности in vitro. По материалам диссертации получены два патента Российской Федерации на изобретение.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лаборатории препаратов крови филиала Иммунопрепарат ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа и Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на лекциях и занятиях на кафедре морфологии и физиологии человека и животных биологического факультета Башкирского государственного университета и кафедре нормальной физиологии Башкирского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения в модельных системах подавляют процессы перекисного окисления липидов и генерации активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хеми-люминесценции.

2 Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения оказывают стимулирующее воздействие на функционально-метаболическую активность (поглотительную способность, кислород-зависимый метаболизм) интактных полиморфно-ядерных лейкоцитов крови и активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов воспалительного экссудата по отношению к разным объектам фагоцитоза и на интенсивность генерации ими активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хемилюминесценции, в которой четко отражается степень выраженности такого влияния.

3 Воздействие препаратов иммуноглобулинов in vitro на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными полиморфно-ядерными лейкоцитами из крови и перитонеального экссудата характеризуется дозозависимыми разнонаправленными изменениями их кислород-зависимой активности: низкие концентрации иммуноглобулинов ее стимулируют, а высокие — подавляют. Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на генерацию интактными и активированными перитонеальными мо-нонуклеарными фагоцитами из экссудата характеризуется однонаправленным характером: как низкие, так и высокие дозы препаратов угнетают процессы кислород-зависимого метаболизма.

4 Введение экспериментальным животным препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения («Иммуновенин») в разных дозах оказывает разнонаправленное воздействие на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами из очага воспаления, аналогичное воздействию препаратов на фагоциты in vitro.

Материалы исследований представлены на ряде научных форумов: I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006); научно-практической конференции с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2006, 2007, 2008), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2007), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).

Апробация диссертации проведена на расширенном заседании научно-технического совета центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (протокол от 28.10.2008 г. № 18); на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 (протокол от 24.11.2008 г. № 2).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах. Она состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 14 таблиц, 23 рисунка и 2 схемы. Список литературы включает 214 источников (106 отечественных и 108 зарубежных).

Выводы

1 Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения обладают способностью непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами, проявляют антиокислительные свойства, подавляя процессы радикалообразо-вания в разных модельных системах. Наиболее выраженное антиокислительное действие проявляется в модельных системах с высоким содержанием липидов низкой и очень низкой плотности.

2 Воздействие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения в концентрации 5,0 мг/мл на интактные полиморфно-ядерные фагоциты крови и активированные, участвующие в воспалении полиморфно-ядерные лейкоциты, при добавлении разных объектов фагоцитоза характеризуется стимулирующей активностью (поглотительная способность, кислород-зависимый метаболизм в НСТ-тесте), усилением генерации активных форм кислорода. Регистрируемая с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции интенсивность генерации активных форм кислорода четко отражает степень воздействия данных препаратов.

3 Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность интактных лейкоцитов, циркулирующих в крови, и «воспалительных» перитонеальных полиморфно-ядерных лейкоцитов носит дозозависимый модулирующий характер: в диапазоне концентраций от 1,25 до 5,00 мг/мл они усиливают генерацию активных форм кислорода, выявляемую с помощью регистрации хемилюминесценции, а при концентрациях от 12,50 до 25,00 мг/мл - подавляют. При добавлении к интактным перитонеальным макрофагам и активированным мононуклеарным фагоцитам крыс из очага воспаления препараты иммуноглобулинов в концентрациях от 0,05 до 25,00 мг/мл по результатам хемилюминесценции проявляют однонаправленное дозозависимое ингибирующее действие на процессы генерации активных форм кислорода.

4 Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения при введении их экспериментальным животным in vivo в разных дозах проявляют разнонаправленное действие, аналогичное действию препаратов на фагоциты in vitro: в дозе 250 мг/кг массы тела препарат спустя сутки вызывает повышение, а в дозе 1250 мг/кг - снижение уровня активации кислород-зависимого метаболизма полиморфно-ядерных лейкоцитов воспалительного экссудата, генерации клетками активных форм кислорода по результатам хемилюминесценции.

Практические рекомендации

1 Выявленные антиокислительные свойства препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения позволяют рекомендовать их к использованию при патологических состояниях, сопровождающихся активацией процессов свободно-радикального окисления и перекисного окисления липидов.

2 Установленные антиокислительные свойства препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения в модельных системах сочетаются со способностью активировать функционально-метаболическую активность фагоцитарных клеток, что является их преимуществом в сравнении с другими препаратами антиоксидантного действия, угнетающими функциональную активность фагоцитов. Это дает возможность использовать данные препараты иммуноглобулинов для коррекции функциональных нарушений фагоцитарного звена иммунитета.

3 Способность препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения модулировать в разных дозах функционально-метаболическую активность разных типов фагоцитарных клеток является основанием для рекомендаций к применению этих препаратов в любую фазу воспалительной реакции для профилактики развития тяжелых осложнений

4 Используемые лабораторные методы определения воздействия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на фагоцитарные механизмы можно рекомендовать для оценки биологических свойств препаратов разных производителей и отбора наиболее эффективных.