Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Влияние паратиреоидного гормона на кроветворные и стромальные клетки-предшественники

На правах рукописи

Свинарева Дарья Анатольевна

Влияние паратиреоидного гормона на кроветворные и стромальные клетки-предшественники.

14.00.29 — гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

доктор биологических паук Нина Иосифовна Дризе;

член-корреспопдент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Валерий Григорьевич Савченко.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Ивановна Булычева; кандидат биологических наук Ольга Петровна Ильинская.

Ведущее научное учреждение:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук.

Защита состоится « -/ » 2006 г. в часов

на заседании диссертационного Совета Д 001.042.02 при Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

по адресу: 125167 Москва, Новозыковский проезд, д.4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук.

Автореферат разослан «2£г> ¿^^¡^^2006 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Лечения множества заболеваний требует большого количества стволовых кроветворных клеток (СКК). Довольно часто их не достаточно для успешной трансплантации костного мозга и полноценного восстановления кроветворения у реципиентов после облучения или курсов интенсивной химиотерапии. В большом числе случаев необходимо восстанавливать кроветворение, угнетенное в результате лечения у больных солидными опухолями. Применение факторов роста для стимуляции пролиферации СКК приводит, по всей видимости, к получению более зрелых кроветворных предшественников, а не к увеличению ранних СКК.

Главным кроветворным органом млекопитающих является костный мозг, который обеспечивает специфическое микроокружение, необходимое для развития и поддержания пула стволовых клеток на протяжении жизни организма, а кроме этого регулирует процессы дифференцировки СКК. До недавнего времени, роль регулятора стволовой кроветворной клетки приписывалась гипотетической кроветворной «нише», причем это понятие было скорее функциональным, поскольку устройство ниши оставалось абсолютно неизвестным. Эксперименты, показавшие опосредованное влияние паратиреоидного гормона (ПТГ) на СКК, позволили установить анатомическое строение ниши: ее основным структурным элементом оказались веретеновидные остеобласты. Эти клетки поддерживают СКК в состоянии стволовости за счет активирующих и модулирующих сигналов, передающихся между плотно контактирующими остеобластами и стволовыми клетками. Было установлено, что на веретеновидных остеобластах присутствуют рецепторы к ПТГ [Calvi et al., 2003;Zhang et al., 2003], который регулирует обмен кальция и остеогенез в организме. В настоящее время ПТГ активно используют в лечении остеопороза. В зависимости от дозы и условий введения ПТГ может вызывать как увеличение массы кости (благодаря активации остеобластов), так и ее резорбцию (активируя остеокласты). Показано, что СКК локализуются на эндостальной поверхности губчатой кости [Gong, 1978;Nilsson et al., 2001] и контактируют с веретеновидными остеобластами. Недавние эксперименты

показали, что после инъекций небольших количеств ПТГ, сопоставимых с используемыми для лечения остеопороза [Finkelstein et al., 2003], число ранних полипотентных СКК увеличивалось в 2 раза, а мыши, восстановленные после летального облучения обработанным ПТГ костным мозгом, лучше выживали [Calvi et al., 2003]. Этот эффект связан с повышением экспрессии Jagged 1 - лиганда, локализованного на поверхности остеобластов, который взаимодействует с рецептором Notch 1, экспрессированным на поверхности СКК. Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию СКК.

Таким образом, был выявлен системный регулятор кроветворных ниш -паратиреоидный гормон. В связи с этим появились возможности, во-первых, воздействовать на ниши СКК, во-вторых, опосредованно регулировать ранние кроветворные клетки-предшественники, чего раньше не удавалось, и в-третьих, изучать молекулярные механизмы, задействованные в этих процессах.

Цель работы:

Изучить влияние паратиреоидного гормона на кроветворные клетки-предшественники из отделов поли- и олигопотентых стволовых кроветворных клеток, на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, и на их потомков методами in vivo и в длительных культурах костного мозга мыши и человека.

Задачи:

1. Оценить основные характеристики кроветворения in vivo и изменения, происходящие in vitro, в длительной культуре костного мозга мыши и человека под воздействием параггиреоидного гормона.

2. Изучить влияние паратиреоидного гормона на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных органов.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии некоторых важных генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток, а также маркеров дифференцировок, молекул адгезии и ростовых факторов в стромальных клетках после воздействия паратиреоидного гормона.

Научная новизна:

После курса инъекций паратиреоидного гормона мышам количество ранних полипотентных СКК в их костном мозге увеличивается в 2 раза, однако до настоящего времени не было выявлено, являются ли эти предшественники «настоящими» ранними СКК, способными к длительной репопуляции костного мозга. В данной работе in vivo впервые было функционально показано, что применение ПТГ приводит к увеличению количества таких СКК в 2-4 раза, но не оказывает действия на более поздние мультипотентные стволовые кроветворные клетки. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем может объясняться отсутствие экспансии зрелых клеток крови. Аналогичное действие ПТГ наблюдалось в модельной системе кроветворения - длительной культуре костного мозга человека и мыши. Полученные в работе данные выявили, что ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на стромальные остеобласты и длительно репопулирующие СКК.

Научно-практическое значение работы:

Из результатов исследования стало ясно, что ПТГ действительно является физиологическим, опосредованным через остеобласты регулятором, с помощью которого можно in vivo увеличить число длительно репопулирующих костный мозг СКК. Полученные данные говорят в пользу возможного практического использования ПТГ в качестве фармакологического метода воздействия на СКК и дифференцировку стромальных клеток. Результаты работы используются в экспериментальной гематологии. На основании полученных данных в настоящее время в лаборатории физиологии кроветворения ведется работа по изучению влияния паратиреоидного гормона на стволовые клетки в модельной системе длительных культур костного мозга доноров и больных гематопролиферативными заболеваниями. Для изучения повреждений стромального микроокружения у больных апластической анемией в ГУ ГНЦ РАМН применяются результаты данного исследования.

Положения, выносимые на защиту:

• Паратиреоидный гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток, к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение.

• Введение паратиреоидного гормона не влияет на более зрелые мульти- и олигопотентные клетки-предшественники.

• Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию параггиреоидного гормона,

• Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромального микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние стволовые кроветворные клетки, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трансплантации.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 5 сентября 2006 года на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология ; гемобластозы и депрессии кроветворения» ГУ ГНЦ РАМН.

Материалы работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

1. "РТН treatment induce alterations in murine Long-Term Bone Marrow Culture". 9th

Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland, june 10-13,

2004.

2. "Effect of PTH on hematopoiesis in human and murine Long-Term Bone Marrow Cultures". 10th Congress of the European Hematology Association, Stockholm, Sweden, June 2-5,2005.

3. "Effect of parathyroid hormone (PTH) on hematopoietic and stromal precursor cells". "Modern trends in human leukemia", XVI Wilsede Meeting, June 18-22, 2005.

4. "Effect of parathyroid hormone on hematopoietic and stromal precursor cells", 34th Annual Scientific Meeting of the International Society for Experimental Hematology, Glasgow, Scotland, July 30-august 2,2005.

5. "Действие паратиреоидного гормона на кроверворные и стромальные стволовые клетки". I Съезд Физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября, 2005.

6. "Effect of PTH (1-34) on homing of hematopoietic stem cells". 11th Congress of the European Hematology Association. Amsterdam, Netherlands, June 15-18,2006.

7. "Влияние паратиреоидного гормона на кроветворение в длительных культурах костного мозга человека". XXX Международная Гематологическая Школа "Лейкозы. Терапия и фундаментальные исследования", Москва, 28-29 июня, 2006.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора J литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста и включают 59 рисунков, 7 таблиц и список литературы из 164 источников.

Работа выполнена в лаборатории физиологии кроветворения ГУ ГНЦ РАМН (зав. лаборатории - д.б.н. Дризе Н.И.). За помощь и содействие в проведении работы автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам отделений и лабораторий ГУ ГНЦ РАМН: д.б.н. Дризе Н.И., чл-корр. РАМН, д.м.н., проф. Савченко В .Г., к.б.н. Нифонтовой И.Н., к-м.н. Момотюк К.С., к.б.н. Сац Н.В., к.м.н. Ольшанской Ю.В., Сурину В.Л., к.б.н. Эршлеру М.А. и проф. Черткову ИЛ., а также сотруднику института Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Розову Ф.Н.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Обзор литературы подробно освещает современные взгляды на иерархию кроветворных предшественников, особенности регуляции самоподдержания и дифференцировки стволовых клеток крови, в том числе дистантной регуляции, на функциональные особенности мезенхимальных стволовых клеток. Отдельная глава посвящена паратиреоидному гормону, его свойствам и роли в регуляции клеток стромы и гемопоэза.

Материалы и методы

Получение длительных культур костного мозга (ДЕСКМ) проводили по методу Декстера [Dexter et al., 1977]. Культуру вели при 33°С и 5% СОг с еженедельной сменой половины среды без возвращения удаляемых клеток. Крысиный (Bachem, USA) или человеческий (GenScript Corp.) синтетический паратиреоидный гормон ГШ (1-34) добавляли в ДККМ мыши и человека соответственно при инициировании культуры и еженедельно при смене среды до итоговой концентрации 10"8 М, 5х10'8 М и 10'7 М. Клетки из суспензионной фракции, полученные при смене среды через 3, 6 и 10 недель, осаждали центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин, 25°С) и использовали в описанных ниже экспериментах. Интенсивность пролиферации клеток-предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатика (клетки в концентрации 10б/мл инкубировали с оксимочевиной (Serva) (концентрация 1мг/мл) в течение 2 часов в среде Фишера с 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) при температуре 37°С и 5% СОг, затем клетки отмывали средой Фишера и использовали для определения количества различных кроветворных предшественников).

Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клональных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на 12 день (КОЕ-С 12) в сублетально облученных мышах-реципиентах (по методу Тилла и МакКаллока), подсчет колониеобразующих единиц культуры (КОЕ-К) и предшественников гранулоцитов и макрофагов КОЕ-ГМ в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области

6

булыжника (КООБ) на 7 и 28-35 день. Колонии в полужидких средах (КОЕ-К) изучали, как описано [Чертков ИЛ., Гуревич O.A., 1984]. Для определения концентрации КОЕ-К клетки костного мозга или из ДККМ культивировали в среде, содержащей 0,8% метилцеллулозы (ICN). Для этого помещали по 4х105 клеток (в 100 мкл среды) в 1 лунку 24-ячеечной платы в 1,12 мл среды следующего состава: 600 мкл ЭТС (HyClone), 120 мкл концентрированной питательной среды (см. далее), 200 мкл среды с колониестимулируещим фактором (кондиционированная среда от линии U5637 [Welte et al., 1985] для человеческих культур и смесь кондиционированных сред от клеток линий \VEHI ЗВ и L929 (2:1) - для мышиных), 100 мкл эритропоэтина (50 ед/мл, Boehringer Mannheim Gmbh). Концентрированная питательная среда готовилась из следующих компонентов: 2 мл глутамина (ICN)» 1 мл бычьего сывороточного альбумина (Gibco V 7,5%), 1 мл ß-меркаптоэтанола (10*3 М) (Serva), 2 мл IM HEPES (ICN), 1 мл антибиотиков (100Х). Затем шприцом добавляли 1,3 мл 2,8% раствора "метилцеллулозы, перемешивали и разливали по вертикали в 3 ячейки по 0,6 мл в каждую. Таким образом получали по 4 ячейки на вариант. Через 7, 14 и 21 день культивирования (37°С, 5% СОг) суммарное число колоний для каждого варианта подсчитывали с помощью инвертированного микроскопа.

Для подсчета мышиных КОЕ-ГМ помещали по 105 клеток в I лунку 24-ячеечной платы (по 4 лунки на вариант) в 0,5 мл питательной агаровой среды следующего состава: среда 1 (из следующих компонентов: 93,7 мл а-МЕМ, 2,5 мл IM HEPES, 1 мл пирувата натрия (ICN), 1 мл смеси витаминов (ICN), 1 мл смеси незаменимых аминокислот (ICN) и 0,8 мл смеси заменимых аминокислот (ICN)), 0,3% бактоагара (Difco), 30% ЭТС, 2мМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина (Ферейн), 50 мкг/мл стрептомицина (Ферейн), 0,1% ß-меркаптоэтанола (10"3 М) и 10% смеси кондиционированных сред от клеток линий WEHI ЗВ и L929 (2:1) в качестве источника ростовых факторов. Суммарное число колоний для каждого варианта подсчитывали через 7 дней.

Для подсчета клеток, образующих области булыжника, в 60 ячеек 96-ячеечиой платы, предварительно обработаннх в течение 30 минут 0,1% желатиной, было посажено по 2000-3000 клеток линии MS5 в среде аМЕМ с 10% эмбриональной

7

телячьей сыворотки. Клетки этой линии мышиного происхождения экспрессируют фактор, вырабатываемый клетками стромы (8ЭР1) [КоЬап еХ а1., 1995], и поддерживают рост КООБ мыши и человека. На следующие сутки вместе с полной сменой среды имплантировали на полученный подслой исследуемую взвесь клеток из суспензионной фракции ДККМ человека или мыши, из контрольной группы и после добавления ПТГ, в четырех последовательных разведениях (как правило, в случае ДККМ человека - 30,15,7,5 и 3,75 тысяч клеток на ячейку, в случае мыши -50,25,12,5 и 6,25 тысяч клеток на ячейку, на каждое разведение по 15 ячеек) в среде для Дектеровской культуры. Платы культивировались при 33°С и 5% ССЬ во влажной атмосфере. Еженедельно проводилась смена половины среды. Просмотр ячеек производили каждую неделю под инвертированным микроскопом. Согласно методу Пломахера для определения частоты КООБ использовалось количество отрицательных (не содержащих КООБ) ячеек. Вычисление частоты КООБ производили с помощью уравнения Пуассона [ИоетасЬег е1 а1., 1989].

Режим обработки животных ПТГ был следующим. Крысиный синтетический ПТГ (1-34) вводили мышам внутрибрюшинно в дозе, увеличивающей число остеобластов (10,30 и 80 мгк/кг 5 дней в неделю в течение 4 недель). Через 2 недели после последнего введения костный мозг из бедер контрольных и опытных мышей использовали в описанных ниже экспериментах.

Метод конкурентной репопуляции основан на способности СКК восстанавливать летально облученного реципиента. В опыте были использованы самцы и самки мышей-гибридов (СВАхС57В1/6)Р1 в возрасте 9-26 недель. Самцам вводили крысиный синтетический ПТГ (1-34) внутрибрюшинно в дозе 80 мкг/кг 5 раз в неделю в течение 4 недель. Для анализа конкурентоспособности СКК мышей-самцов, обработанных ПТГ, клетки их костного мозга (КМ) смешивали с равным количеством клеток КМ интактных самок (по 250x103 клеток) или в соотношении 1 к 3 и 1 к 19 и инъецировали внутривенно реципиентам-самкам, летально облученным в общей дозе 10 Гр, В качестве контроля использовали аналогичные 3 группы животных, которым вводили смесь клеток из КМ самок с клетками мышей-самцов, необработанных ПТГ. Частоту конкурентно репопулирующих единиц (КРЕ) определяли с помощью метода лимитирующих разведений. Через 3, 10 и 16 месяцев

8

после восстановления кроветворения у опытных и контрольных мышей под легким эфирным наркозом забирали КМ из бедра через коленный сустав. Полученные клетки вводили летально облученным реципиентам-самкам для анализа генотипа клеток-потомков полипотентных клоногенных КОЕ-С. На 10 день под бинокулярной лупой из селезенки выделяли отдельные колонии. ДНК из 25 колоний от каждой мыши анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) на генетическую принадлежность самцу или самке. Анализ генотипа клеток костного мозга и периферической крови опытных и контрольных мышей проводили с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Частоту встречаемости предшественников определяли по числу Y — негативных колоний из общего числа проанализированных для каждой мыши на базе статистики Пуассона, используя метод наименьших квадратов. Концентрацию КРЕ определяли по пересечению экспериментальных кривых с прямой: y=-lnN для N, равного 1. В этом случае координаты пересечения кривых по оси абсцисс показывают число клеток костного мозга, на которые приходится 1 КРЕ.

Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через 24 часа (Ф-24). Смесь клеток КМ от 8 мышей доноров использовали после адгезии в течение 2-х часов на пластике с целью максимально освободиться от стромальных клеток и макрофагов. Для определения исходной концентрации КОЕ-С в КМ мышей-реципиентов облучали в общей дозе 10 Гр и через 1-2 часа вводили внутривенно 2x104 смеси клеток КМ. Как неинъецированных, так и подвергшихся инъекциям ПТГ животных облучали летальной дозой и вводили внутривенно по 16х10б смеси клеток костного мозга (промежуточные реципиенты). Через 24 часа у промежуточных реципиентов извлекали селезенку и КМ, Селезенку измельчали в гомогенизаторе, КМ из бедер и голеней превращали в одноклеточную взвесь. Полученные клетки в эквиваленте 1/30 селезенки или 1/5 содержимого КМ одного бедра и голени вводили животным третьей группы летально облученных реципиентов (окончательные реципиенты). На 8 день под бинокулярной лупой подсчитывали число колоний в селезенках, фиксированных в жидкости Буэна, из контрольной и окончательной групп реципиентов. Расчет фактора проводили по

формуле: Ф-24 = (а/Ы)*100, где а - среднее число колоний в селезенке или КМ окончательных реципиентов, N - общее число КОЕ-С, введенное промежуточному реципиенту. Фактор оседания КООБ-28 определяли аналогичным способом. Подсчитывали число КООЕ-28 в исходном КМ, селезенке или КМ голени и бедра промежуточных реципиентов.

Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузерн-блот гибридизации.

Достоверность отличий между данными, полученными в экспериментах по изучению влияния ПТГ, определялась по г-критерию Стьюдента для двух независимых выборок.

Результаты работы

В данной работе с помощью метода конкурентной репопуляции впервые показано увеличение количества конкурентно репопулирующих единиц (КРЕ), т.е. клеток, способных к длительной репопуляции костного мозга, в 4 раза в костном мозге (КМ) мышей, получивших курс паратиреоидного гормона (ПТГ). Суммируя полученные данные, можно проследить за динамикой экспансии в КМ конкурирующих СКК в течение длительного времени после восстановления кроветворения (Рис. 1).

Время после восстановления 3 месяца 10 месяцев 16 месяцев

Рис, 1, Частота КРЕ в костном мозге восстановленных мышей.

Если через 3 месяца после восстановления кроветворения частота КРЕ в группе мышей, получавших ПТГ, была ниже, чем в контрольной, то уже через 10 месяцев

после восстановления их частота превысила контрольные значения в 2,5 раза и достигла увеличения в 4 раза еще через полгода. Полученные данные являются прямым доказательством повышения конкурентной способности СКК из костного мозга мышей, получавших ПТГ, с течением времени. Более выраженное увеличение частоты встречаемости КРЕ из костного мозга мышей, получавших ПТГ, говорит о том, что такое воздействие повлияло на очень ранние СКК, занимающие наиболее высокое положение в кроветворной иерархии. Возрастание количества донорских КРЕ с течением времени позволяет надеяться, что при использовании такого метода в клинике можно будет снизить частоту реверсий кроветворения и вероятность поздних рецидивов после аллогенной трансплантации костного мозга. У облученных самок, восстановленных необработанными ПТГ стволовыми клетками, мы наблюдали снижение доли У-позитивных КОЕ-С в костном мозге (Рис. 2), что могло произойти за счет реверсии кроветворения, т.е. начала функционирования собственных стволовых клеток реципиента. При использовании метода конкурентной репопуляции тестируются потомки только маркированных клеток, следовательно, возможная реверсия кроветворения к реципиентскому типу не оказывает влияния на полученные результаты.

Рис. 2. Динамика содержания У-позитивных предшественников в КМ восстановленных мышей (разведение смеси костного мозга 1:1) .

В других аналогичных экспериментах через 3 месяца после восстановления обнаруживалось только 66,7 ± 12,8 % КОЕ-С генотипа самца, а через 10 месяцев — 41,3 ± 11,7 %. Такое ухудшение приживления может быть связанно с иммунологическим отторжением по половым антигенам (Scott et al., 1997], В то же время процент У-позитивных КОЕ-С в мышах, восстановленных костным мозгом,

• ©о

■ контроль ш +птг

Время после восстановления

обработанным ПТГ, неуклонно возрастает и к 16 месяцам значительно превышает контрольный уровень, что говорит об увеличении вклада ГГГГ-обработанных КОЕ-С в процесс кроветворения.

Таким образом, обработка мышей ПТГ приводит к увеличению самых ранних СКК в кроветворной иерархии. Анализ более поздних предшественников из этого отдела СКК показал, что частота встречаемости КООБ 28-35 увеличивается в 3,5 раза в костном мозге мышей, получавших 80 мкг/кг ПТГ, а клеток, инициирующих длительную культуру (КИДК), — почти в 5 раз (Рис. 3). Эти данные совпадают с ранее полученными в литературе данными [СаМ й а1.„ 2003]. КООБ 28-35 и КИДК -разные предшественники в иерархии СКК [Оеппи^-Кеп(1а11 е1 а1., 2003], что подтверждается, в частности, разницей их встречаемости в костном мозге обработанных ПТГ мышей. Полученные в работе данные косвенно подтверждают предположение, что КИДК более ранние, чем КООБ 28-35, предшественники, так как они лучше отвечают на ПТГ.

время наблюдения КООБ, дни ЮЩК

А. Б.

Рис. 3. Изменение частоты встречаемости КООБ (А) и КИДК (Б) в КМ мышей, получивших курс ПТГ\ За 1 принята частота встречаемости КООБ в необработанных ПТГ мышах.

ПТГ в зависимости от концентрации через разные сигнальные пути стимулирует как остеобласты, так и остеокласты. В данной работе показано, что обработка мышей 1111" в низких концентрациях (10 мкг/кг) гормона увеличивает частоту встречаемости КООБ 21 в КМ (Рис. ЗА). Это достаточно ранние предшественники, но, в отличие от КООБ. 28-35 и КООБ 7, неизвестно, каким

предшественникам, определенным другими методами, они соответствуют [Friedenstein, 1989]. Действие ГГГГ не отражается на содержании КООБ 7 и КООБ 28-35 (Рис. 3-А), однако частота встречаемости КИДК увеличивается в 12 раз в костном мозге мышей, получавших инъекции 10 мкг/кг паратгормона (Рис. 3-Б). Эти данные указывают на необходимость очень тщательного подбора концентрации ПТГ для применения при трансплантации костного мозга или экспансии стволовых кроветворных клеток, В работе показано, что ГПТ в дозе 80 мкг/кг стимулирует пролиферацию самых ранних кроветворных предшественников - КООБ 35. Этот очень важный результат подтверждает способность ПТГ стимулировать деление не только остеобластов [Calvi et al., 2001], но, опосредованно, и ранних кроветворных клеток-предшественников. Таким образом, экспансия СКК in vivo под действием ПТГ, вероятно, объясняется двумя происходящими процессами: с одной стороны, увеличивается количество ниш за счет пролиферации остеобластов, с другой -пролиферируют находящиеся в нише СКК, способные заселить образующиеся ниши. В результате происходит очевидное увеличение количества длительно р епопул иру ющих СКК.

Под действием ПТГ также происходит стимуляция пролиферации КООБ 7, соответствующих КОЕ-С. Эти данные подтверждают работы GaJlien-Lartigue и Whitfield [Gallien-Lartigue and Carrez, 1974;WHITFIELD, 2006], в которых методом тимидинового «самоубийства» было показано, что ГПТ стимулирует деление КОЕ-С. Интересно, что несмотря на стимуляцию пролиферации КОЕ-С их концентрация в костном мозге мышей после обработки ПТГ не изменялась, что было показано как в наших экспериментах, так и в работе Calvi et al, 2003, Также не изменялась концентрация и более поздних, о л и гопотентных предшественников - КОЕ-ГМ. В литературе предположено следующее объяснение увеличению количества ранних стволовых кроветворных клеток при остающемся неизменным числе более поздних, отвечающих за конечную клеточную продукцию [WHITFIELD, 2006]: возможно, ПТГ приводит к увеличению экспрессии молекул ангиопоэтина-1 (Ang-1) в стромальных клетках, которые взаимодействуют с Tie2 - молекулами, экспрессированными на стволовых клетках, вследствие чего усиливается взаимодействие кроветворных предшественников с внеклеточным матриксом. Такое

плотное взаимодействие ведет к ингибированию активации пролиферации КОЕ-С и более поздних предшественников в КМ, которые все же имеют потенциальную возможность быть активированными для ответа организма в случае угнетения кроветворения тем или иным способом. С другой стороны, показано, что НИ может непосредственно стимулировать выход КОЕ-С из поздней G1 фазы клеточного цикла и вызывать начало их пролиферации [Gallien-Lartigue and Carrez, 1974]. Скорее всего, в организме имеют место оба этих процесса, и баланс между стимуляцией и иншбированием пролиферации очень подвижный.

Возможно и другое объяснение отсутствия экспансии поздних кроветворных предшественников и зрелых клеток крови. При изучении хоминга кроветворных клеток-предшественников в строму костного мозга мышей, обработанных ПТГ, оказалось, что фактор оседания через 24 часа (Ф-24) не меняется для ранних предшественников КООБ 28 (Рис. 4-А) и резко снижается для КОЕ-С (Рис. 4-Б).

3,0 2,5

>

2.0

Ml

£ ï S 1.5

О S 5 it f

А.

1.0 0,5 0,0

M

& s

s*

9.5 S 3,0

M

S I 25 2,0

1,5

1,0

g- 0,5 0,0

10

Дозы ПТГ, мкг/кг

80

10

Дозы ПТГ, мкг/кг

60

Б.

Рис. 4. Фактор оседания КООБ 28 (А) и КОЕ-С (Б) в костном мозге интактных и обработанных ПТГ мышей. По оси абсцисс - группа, по оси ординат - % клеток-предшественников, осевших в костном мозге.

Несмотря на большие погрешности в этих экспериментах, можно утверждать, что ПТГ не оказывает негативного влияния на способность СКК находить свое место в строме костного мозга. Однако, учитывая данные СаЫ, 2003, мы ожидали увеличения оседания ранних кроветворных предшественников в костном мозге мышей, обработанных ПТГ, чего не произошло. Следовательно, увеличение количества остеобластов, входящих в состав «ниш» для СКК, напрямую не связано со способностью кроветворных клеток-предшественников оседать в костном мозге.

Возможно, молекулы хоминга - хемоатрактанты и молекулы адгезии для СКК, располагаются на разных клеточных элементах. В селезенке мышей, получавших малую дозу ПТГ (10 мкг/кг), Ф-24 для КООБ-28 не отличается от контрольного (Рис. 5-А), Резкое уменьшение Ф-24 для КООБ-28 в селезенке мышей, обработанных ПТГ в дозе 80 мкг/кг, вряд ли можно объяснить необратимым изменением стромы селезенки, т.к. клетки паренхимы селезенки не имеют рецепторов к ПТГ. Видимо, такие изменения могут быть результатом изменений стромального микроокружения в КМ.

14,0

12.0

£ „ =ю,0 I х

II

II

ь и

о а

*

8,0 | в,0

I 2,0

0,0

I I 6 £

Я

-Шва —

о ю

Дозы ПТГ, мкг/кг

во

10

Дозы ПТГ, мкг/кг

во

А.

Б.

Рис. 5. Фактор оседания КООБ 28 (А) и КОЕ-С (Б) в селезенке интактных и обработанных ПТГ мышей. По оси абсцисс - группа, по оси ординат - % клеток-предшественников, осевших в селезенке соответственно.

В работе [Со1уш ег а1., 2004] определено распределение кроветворных клеток мыши по всей территории костного мозга. Исходя из С1фупулезного расчета авторов, на бедра и голени мыши приходится 14% всех клеток костного мозга. Из этих данных можно рассчитать, сколько СКК попало на кроветворные территории в течение суток после облучения. Результаты такого расчета представлены в Табл. 1.

Табл. 1. Распределение КОЕ-С и КООБ 28 в костном мозге и селезенке.

доза ПТГ, Органы % оседания

мкг/кг КОЕ-С КООБ 28

Костный мозг 43 34

0 Селезенка 5 7

Не попало в кроветворные органы 52 ' 59

Костный мозг 9 39

80 Селезенка 6 I

Не попало в кроветворные органы 85 60

В условиях данных экспериментов, как у контрольных мышей, так и у мышей, обработанных ПТГ, в течение первых суток после введения на кроветворную территорию не попадает около 60% введенных КООБ-28. Среди попавших КООБ-28 отличия между контрольными и экспериментальными группами выражаются в распределении между исследованными территориями и не являются достоверными. Возможно, с одной стороны, под действием ПТГ могут происходить изменения в сигнальных путях, а с другой — изменяются компоненты стромы, участвующие в миграции и хоминге более поздних кроветворных предшественников, которые регулируются не в остеобласгной, а в васкулярной нише [Yin and Li, 2006].

. is

¡14 rf 12 I 10

r 8 S Í

I 4

1: Si

- —

контроль 10 MKT 30 МКГ дозы ПТГ, на кг веса

80* мкг

16 14 12 10 8 6 4 2 0

контроль 10 мкг 30 мкг Дозы ПТГ, на кг веса

"Г

нш

та

Ш

1ВД

-1 ВО' мкг

А.

Б.

Дозы ПТГ, мкг/кг 0 10 30 80 0 10 30 80

вес кости, мг 2,П±0,43 3,75 1,5 2,33 ±0,29 4 3,7 3,7 6,3± 0,25

Рис. 6. Клеточностъ и вес костной раковины очага эктопического кроветворения, образованного из костного мозга мышей, получивших четырехнедельный курс ПТГ (А) или у мышей, получавших инъекции ПТГ (Е).

Приведенные данные говорят о сильном влиянии ПТГ на свойства клеток строи ал ьного микроокружения. В связи с этим возникает важный вопрос о влиянии ПТГ на мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — родоначальники большинства клеток стромального микроокружения. В данной работе показано, что ПТГ не влияет на МСК как при образовании очага de novo, т.е. при инъекциях ПТГ в течение первых 4 недель после имплантации костного мозга под капсулу почки сингенных животных (Рис. 6-Б), так и во время стабильного функционирования кроветворного микроокружения — при предварительной обработке мышей-доноров костного мозга (Рис. 6-А). МСК, способные к переносу кроветворного

микроокружения, не теряют своей способности к самоподдержанию и при реимплантации очага образуют во вторичном реципиенте очаг такого же размера:

Эти данные очень важны в виду перспективы использования ПТГ для экспансии СКК и улучшения кроветворения у больных, подвергающихся радио и химиотерапии. Остеогенная дифференцировка потомков МСК также не претерпевает больших изменений, так как только при больших дозах ПТГ (80 мкг/кг) незначительно увеличивался вес костной раковины (3,75 мг против 2,18 мг, образованной из контрольного КМ) (Рис. 6-А).

Концентрация кроветворных предшественников в очагах, в отличие от костного мозга, не изменяется под действием ПТГ (Рис. 7). Возможно, это связано с замедленным ответом остеогенных предшественников, которые дифференцировались в процессе построения очага и не были способны ответить на инъекции ПТГ. Однако ПТГ при этом стимулировал пролиферацию всех видов кроветворных предшественников в исследованных отделах иерархии, что хорошо соотносятся с представленными выше результатами по пролиферации кроветворных предшественников в костном мозге обработанных паратгормоном мышей.

тип предшественника время наблюдения КООБ, дни

Рис. 7. Концентрация КОЕ-ГМ, КОЕ-К и КООБ в очагах эктопического кроветворения.

В качестве модели для исследования влияния ПТГ на элементы стромы мы использовали также длительные культуры костного мозга (ДККМ) мыши. При попадании клеток костного мозга в культуру в течение 2-3 недель формируется стромальный подслой, поддерживающий кроветворение и образующий de novo ниши для СКК, Оказалось, что при обработке подслоя прилипающих клеток ПТГ в течение 6 недель, размер очага, формирующегося из таких клеток, в интактных

17

мышах (группа I) достоверно не изменяется, однако проведение курса инъекций ПТГ животным в период построения очага (группа II) приводило к увеличению клеточности очага в 2-3 раза. Наблюдаемый эффект не зависел от предварительной обработки культур гормоном (Рис. 8).

4,5 мг

3,75 мг

Контроль

ПТГ

к+гпт гпт+гпт

.__п ___^

Рис. 8. Размер и вес костной раковины очага эктопического кроветворения сформированного га подслоя ДККМ через 6 недель культивирования.

За формирование функционального стромального подслоя в культурах в основном отвечают не МСК, а более поздние стромальные предшественники, отвечающие на запрос [Chertkov et al., 1983]. Именно эти недифференцированные мультипотентные предшественники строят микроокружение в культуре и реагируют на добавление ПТГ в процессе построения кроветворного микроокружения de novo при имплантации подслоя под капсулу почки. Эта часть работы продемонстрировала нечувствительность МСК и чувствительность индуцибельных предшественников, отвечающих за построение микроокружения в культуре, к ГОТ, что очень важно в перспективе его использования в клинике. Полученные данные подтверждают наличие иерархии в отделе мезенхимальных стволовых клеток.

Исследования кроветворных клеток в ДККМ человека и мыши показали, что суммарная клеточная продукция как в ДККМ мыши, так и человека не меняется под действием ПТГ. Концентрация КОЕ-К также не изменяется в сравнении с необработанными ПТГ культурами вплоть до 9-10 недели культивирования (Рис. 9). Однако на более поздних сроках частота их встречаемости заметно повышается в обоих типах культур, что можно объяснить, с одной стороны, пролиферацией этих кроветворных предшественников, а с другой — наблюдаемым увеличением количества более ранних предшественников к 6 неделе культивирования. В случае

18

их полноценной дифференцировки увеличение количества их потомков может выявляться при дальнейшем культивировании.

4 5 6 7 8 э ю Время культивирования, недели

2 4 7 9

Время культивирования, недели

А.

Б.

Рис, 9. Изменения концентрации КОЕ-К в СФ ДККМ мыши (Л) и человека (Б), обработанной и не обработанной ПТГ.' За 1 принята концентрация КОЕ-К в необработанных ПТГ ДККМ.

Частота встречаемости КООБ 28 также повышается в культурах мыши через 10 недель. Качество культур из человеческого костного мозга не позволило провести подобный анализ после длительного культивирования, в связи с чем соответствующие данные не были получены. Анализ пролиферации всех типов кроветворных предшественников в ДККМ мыши показал, что с разной интенсивностью они пролиферируют вплоть до 10 недели культивирования. Интенсивность пролиферации поздних клеток-предшественников через 10 недель культивирования всегда выше в культурах, обработанных ПТГ (Рис. 10).

Г~*"Контроль 1"*Т1ТГ. 10"7М

Контроль ПТГ. 10-7М

3 в 10

Врем* культивирования, надели

А. 7 дней:

5 в 10

Вр»мя культивирования, надели

3 I 10

Время культивирования, недели

В. 21 день:

Б. 4 дней:

Рис. 10. Пролиферация клеток-предшественников (КОЕ-К) из суспензионной фракци ДККМ обработанной и не обработанной ПТГ.

Для КООБ 7 наблюдается аналогичное увеличение доли пролиферирующих клеток в 10 неделе культивирования в присутствии 1111 (Рис. 11-А), тогда как ранние предшественники КООБ 28 в обработанных ПТТ культурах к 10 неделе полностью перестают пролиферировать (Рис. 11-Б). Истощение кроветворения в культуре связано как с небольшим количеством ранних СКК, выживающих при эксплантации костного мозга в культуру, так и со снижением их пролиферативного потенциала.

-■-Контроль

■ Контроль -^-ПТГ, 10"7М

3 в 10

Время культивирования, недели

А. КООБ (7 дней):

»ею

Время купьтивировения, надели

Б. КООБ (28 дней):

Рас. 11. Пролиферация клеток-предшественников КООБ 7 (А) и КООБ 28 (Б) из суспензионной фракции ДККМмышей, обработанных и не обработанных ПТГ.

I *

г $

ПТГ, 10"°М

ПТГ, 5кЮ"*М

г КООБ 7 □ КООБ 35

ПТГ, 10ТМ

Рис. 12. Концентрация КООБ в стромальном подслое донора через 5 суток после посадки КМ на подслои ДККМ, обработанные ПТГ. За 1 принята частота встречаемости КООБ в необработанных ПТГ ДККМ.

Была проведена серия экспериментов, в которых клетки костного мозга высаживали на предварительно обработанные ПТГ стромальные подслои. Оказалось, что такие подслои не стимулируют ни суммарную клеточную продукцию в культурах, ни выживание и функциональную активность всех типов

кроветворных предшественников при длительном культивировании. Анализ количества выживших в течение 5 суток предшественников на обработанных ПТГ подслоях доноров выявил существенное улучшение выживания КООБ 28 (Рис. 12). Тенденция к увеличению концентрации ранних кроветворных предшественников подтверждается и данными Calvi с соавторами (2003), которые показали, что как in vitro, так и in vivo ПТГ стимулирует двукратное увеличение количества ранних СКК. Функциональные свойства стромального подслоя после действия ПТГ изменяются; к такому подслою прикрепляется существенно больше ранних кроветворных предшественников, улучшается поддержание более поздних предшественников - КОЕ-К, однако это не приводит к более эффективной продукции зрелых клеток крови. В процессе активации остеобластов и их взаимодействии со стволовыми кроветворными клетками задействовано множество сигнальных путей отвечающих за адгезию, самоподцержание и дифференцировку СКК. Активированные ПТГ остеобласты экспрессируют ангиопоэтин-1 (Ang-1), стимулирующий экспрессию Tie2 на СКК, что приводит к образованию дополнительного к N-кадгерин - Р-катенин контакта. ПТГ приводит к увеличению количества остеобластов и повышению в них уровня Jagged 1, вследствие этого активируется Jagged 1 - Notch 1 взаимодействие, отвечающее за пролиферацию СКК [Calvi et al., 2003].

5 7 9 11

Время культивирования, модели

# 7 9 Время культивирования, недели

А.

Б.

Рис, 13. Относительный уровень экспрессии генов BMI-1, Jagged 1, Notch 1 (А) и осеопонтина, COMP (Б) в подслоях ДККМ мыши в присутствии ПТГ. По оси ординат - за 1 принят уровень экспрессии в необработанных ПТГ подслоях.

В работе изучали экспрессию генов в подслоях ДККМ мыши и человека, контрольных и подвергшихся обработке ПТГ, по мере культивирования. Было показано, что относительный уровень экспрессии генов, участвующих в пролиферации и самоподдержании СКК, таких как Notch 1 и Jagged 1, изменяется в 1,5-2 раза в течение первых 5 недель обработки клеток ПТГ (Рис. 13-А). Более длительная обработка ПТГ приводит к повышению уровня экспрессии Jagged 1 в 33,5 раза и генов стромальной дифференцировки COMP и остеопонтина (Рис. 13-Б), ингибирующего экспансию СКК и уменьшающего их количество [Adams and Scadden, 2006;Nilsson et al., 2005]. Выявленное в культуре повышение уровня экспрессии остеопонтина, маркера костной дифференцировки с одной стороны и ингибирующего продукцию СКК - с другой, может объяснять довольно слабое влияние ПТГ на кроветворение в культуре.

ПТГ

В.

А. Б.

Рис. 14. Относительный уровень экспрессии генов ICAM-1 (А), BMI-1 (Б) и ангиопоэтина-1 (В) в подслоях ДККМ доноров без и в присутствии ПТГ.

В нормальных физиологических условиях СКК находятся в нишах: более ранние, длительно поддерживающие кроветворение СКК, встречаемость которых коррелирует с частотой КООБ 28-35, локализуются в микроокружении, основным компонентом которого являются остеобласты, тогда как в строме, связанной с сосудистым эндотелием, пролиферируют и дифференцируются более поздние, коротко репопулирующие СКК, соответствующие КООБ 7. Поэтому повышение уровня экспрессии молекулы адгезии к остеобластам ICAM-1 (Рис. 14-А) объясняет наблюдаемое улучшение выживания как КООБ 7, так и КООБ 28-35 на активированных ПТГ подслоях в культурах человека. Увеличение уровня экспрессии BMI-1 в ДККМ человека (Рис. 14-Б) активирует пролиферацию

22

короткоживущих СКК, что приводит к увеличению их количества в 3,5-4 раза и способствует выживанию более ранних предшественников КООБ 35. При обработке подслоя паратиреоидным гормоном в концентрации 10"7М количество КООБ 35 не снижается, как в других вариантах при культивировании, а увеличивается в 1,5 раза, что может быть связано с наблюдаемым повышением экспрессии Ang-1, отвечающего за удержание СКК в нише и обеспечение состояния покоя (Рис. 14-В).

Полученные данные еще раз подтверждают, что регуляция кроветворения - это многофакторный процесс. В кроветворной системе имеется множество механизмов для ее стабилизации и соблюдения баланса количества СКК, их способности к самоподдержанию и, особенно, терминальным дифференцировкам.

Совокупность данных, полученных на модели длительной культуры костного мозга, подтверждает результаты исследований действия ПТГ in vivo, однако все эффекты в культуре проявляются менее определенно и зачастую недостоверно. Тем не менее, мы можем утверждать, что ПТГ не оказывает патологического эффекта на кроветворные и стромальные клетки человека. Результаты работы можно использовать для изучения повреждений стромального микроокружения у больных с такими нарушениями.

В заключении можно отметить, что полученные в работе данные характеризуют ПТГ как перспективный препарат для экспансии СКК in vivo и для стимуляции восстановления кроветворения у пациентов после химио- и радиотерапии. ПТГ может увеличивать количество СКК и ускорять их приживление и репопуляцию костного мозга, во-первых, путем увеличения количества остеобластов и, соответственно, ниш для СКК, и во-вторых, за счет экспансии пула трансплантированных СКК. Несомненно, для использования паратиреоидного гормона в клинике необходимо провести еще множество исследований, главные из которых относятся к тщательному подбору концентрации гормона и времени его введения.

выводы

1. Применение паратиреоидного гормона (ПТГ), вызывающего активацию и пролиферацию остеобластов, приводит к увеличению в 2-4 раза количества ранних стволовых кроветворных клеток (СКК), способных длительно поддерживать кроветворение.

2. После введения ПТГ в костном мозге животных концентрация более поздних поли- и олигопотентных клеток-предшественников (КООБ 7, КОЕс, КОЕ-К) не изменяется.

3. Добавление ПТГ в длительную культуру костного мозга человека и мыши не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников (КОЕ-К) увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) увеличивается в 9-10 раз.

4. На обработанных паратиреоидным гормоном стромальных подслоях длительных культур костного мозга мыши и человека адгезия и выживание кроветворных клеток улучшается, что отражается в увеличении числа ранних мультипотентных предшественников (КООБ 2В) в 2-2,5 раза. Вместе с тем, отмечается увеличение уровня экспрессии гена BMI-1, отвечающего за самоподцержание СКК.

5. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем объясняется отсутствие экспансии зрелых клеток крови.

6. ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на их потомки -стромальные остеобласты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Дризе Н.И., 2004. Влияние паратиреоидного гормона /ПТГ (1-34)/ на кроветворные и стромальные стволовые клетки. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 138, №12, с. 645-648.

2. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков ИЛ., Дризе Н.И., 2005. Экспансия кроветворных клеток-предшественников ex vivo на подслое, обработанном паратиреоидным гормоном. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 140, №9, с. 320-324.

3. Свинарева ДА., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2006. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. Бголл.экспер.биол.мед., Том.142, №7, с.' 97-101.

4. Свинарева Д.А., Нифонтова И.П., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2005. Действие паратиреоидного гормона на кроверворные и стромальные стволовые клетки. Научные труды I Съезда Физиологов, Том 1, с. 215.

5. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N .J., 2004. PTH treatment induce alterations in murine Long-Term Bone Marrow Culture. The Hematology Journal, vol. 5, Suppl. 3, S68.

6. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. Mesenchymal stem cells capable to transfer hematopoietic microenvironment did not change their behavior after PTH treatment. Experimental Hematology, Vol 32, N7, Suppl. 1, p. 89.

7. Nina Drize, Daria Svinareva, Irina Nifontova, Joseph Chertkov, 2004. Parathyroid Hormone (1-34) Treatment Induces Hematopoietic Precursor Cells Expansion in Murine Long-Term Bone Marrow Culture. Blood, Vol 104, N11, part 2, p. 127b.

8. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Momotuk K.S., Savchenko V.G., Chertkov J.L., Drize N.J., 2005. Effect of PTH on hematopoiesis in human and murine Long-Term Bone Marrow Cultures. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 90: Suppl. 3, S2.,p. 120.

9. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2005. Effect of parathyroid hormone on hematopoietic and stromal precursor cells. Experimental Hematology, Vol. 33,№7, Suppl. 1, p.121.

lO.Svinareva DA., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2006. Effect of PTH (1-34) on homing of hematopoietic stem cells. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 91, Suppl. 1, p. 309.

Принято к исполнению 28/09/2006 Исполнено 28/09/2006

Заказ № 682 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

1 Актуальность проблемы.

Кроветворение представляет собой процесс образования, по меньшей мере, 10 видов зрелых клеток крови, выполняющих совершенно разные функции. Клетки крови имеют короткий жизненный цикл и погибают в течение нескольких дней или месяцев. Основная масса клеток крови представлена конечными специализированными, неспособными к делению клетками. Поэтому в течение всей жизни происходит новообразование и созревание клеток крови в специальных кроветворных тканях - в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах. Известно, что в основе гемопоэза лежит стволовая кроветворная клетка (СКК). Большинство СКК находятся в стадии покоя клеточного цикла, и в каждый момент времени только несколько клеток поддерживают гемопоэз. Основополагающими свойствами СКК являются способность к самоподцержанию, под которым понимают высокий пролиферативный потенциал, и к дифференцировкам в предшественники каждого из ростков клеток крови. Главным кроветворным органом млекопитающих является костный мозг (КМ), который обеспечивает специфическое микроокружение, необходимое для развития и поддержания пула стволовых клеток на протяжении жизни организма, а кроме этого регулирует процессы дифференцировки СКК. В норме гемопоэз поддерживается за счет взаимодействий между стволовыми клетками и стромой КМ (17,44,46). К строме КМ относят разные типы клеток: фибробласты, адипоциты, гладкомышечные клетки, остеобласты, хондроциты, эндотелиальные клетки, а также вырабатываемый ими внеклеточный матрикс. Все эти элементы формируют кроветворные «ниши» (131), регулирующие функциональное состояние СКК и препятствующие потере их высокого пролиферативного потенциала. В настоящее время очень актуальна возможность воздействия на кроветворные «ниши» или на молекулы сигнальных путей взаимодействия СКК с микроокружением для стимуляции их роста, т.к. задача получения большого количества полноценных СКК имеет важное значение для лечения больных, нуждающихся в пересадке таких клеток.

Не так давно было установлено, что основным структурным элементом ниши являются остеобласты, количество и активацию которых можно регулировать с помощью паратиреоидного гормона (ПТГ). В организме ПТГ регулирует обмен кальция и остеогенез. В зависимости от дозы и условий введения он может вызывать как увеличение массы кости (благодаря активации остеобластов), так и ее резорбцию (активируя остеокласты). Показано, что СКК локализуются на эндостальной поверхности губчатой кости (49,106) и контактируют с веретеновидными остеобластами. Недавние эксперименты показали, что после инъекций небольших количеств ПТГ, сопоставимых с используемыми для лечения остеопороза (43), число самых ранних полипотентных СКК увеличивалось в 2 раза, а мыши, восстановленные после летального облучения обработанным ПТГ костным мозгом, лучше выживали (15). Этот эффект связан с повышением экспрессии Jagged 1 - лиганда, локализованного на поверхности остеобластов, который взаимодействует с рецептором Notch 1, экспрессированным на поверхности СКК. Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию СКК.

Таким образом, впервые был выявлен системный регулятор кроветворных ниш -паратиреоидный гормон. В связи с этим, появилась возможность: во-первых -воздействовать на ранние кроветворные клетки-предшественники, чего раньше не удавалось, во-вторых - воздействовать на ниши СКК, и в-третьих - изучать регуляторные механизмы задействованные в этих процессах. Полученные результаты могут быть использованы в экспериментальной гематологии и работах по экспансии стволовых кроветворных клеток in vivo.

2 Цель работы.

Изучение влияния паратиреоидного гормона на кроветворные клетки-предшественники из отделов поли- и олигопотентых стволовых кроветворных клеток, на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения и на их потомков, in vivo и в длительных культурах костного мозга (ДККМ) мыши и человека.

3 Основные задачи.

1. Оценить основные характеристики кроветворения in vivo и изменения происходящие in vitro, в ДККМ мыши и человека под воздействием паратиреоидного гормона.

2. Изучить влияние паратиреоидного гормона на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных органов.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии некоторых важных генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток, маркеров дифференцировок, молекул адгезии и ростовых факторов в стромальных клетках после воздействия паратиреоидного гормона.

4 Научная новизна и практическое значение работы.

В данной работе in vivo впервые было функционально показано, что применение паратиреоидного гормона (ПТГ), приводит к увеличению количества ранних полипотентных стволовых кроветворных клеток (СКК) в 2-4 раза, однако не оказывает действия на более поздние мультипотентные стволовые кроветворные клетки. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем может объясняться отсутствие экспансии зрелых клеток крови. Аналогичное действие паратгормона наблюдалось в модельной системе кроветворения - длительной культуре костного мозга человека и мыши. Добавление ПТГ не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних полипотентных предшественников увеличивается в 9-10 раз.

Полученные в работе данные выявили, что ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на стромальные остеобласты и длительно репопулирующие СКК, что говорит в пользу возможного практического использования ПТГ в качестве фармакологического метода воздействия на СКК и стромальные клетки. На основе поученных данных, в настоящее время, в лаборатории физиологии кроветворения ведется работа по изучению влияния паратиреоидного гормона на стволовые клетки, в модельной системе, доноров и больных гематопролиферативными заболеваниями. Результаты работы применяются для изучения повреждений стромального микроокружения у больных апластической анемией в ГУ ГНЦ РАМН.

5 Материалы и методы исследования.

Получение длительных культур костного мозга мыши и человека и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.

Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клональных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на 12 день (КОЕ-С 12)) в сублетально облученных мышах-реципиентах, подсчет колониеобразующих единиц культуры (КОЕ-К) в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника (КООБ), с использованием метода Пломахера. Интенсивность пролиферации клетокпредшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков.

Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через 24 часа (Ф-24).

Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузерн-блот гибридизации.

6 Основные положения, выносимые на защиту.

1. Паратиреоидный гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение.

2. Введение паратиреоидного гормона не влияет на более зрелые мульти- и олигопотные клетки-предшественники.

3. Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию паратиреоидного гормона.

4. Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромального микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние СКК, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трансплантации.

7 Содержание работы по главам.

Оглавление;

Основные обозначения и сокращения; Введение;

1 Выводы

1. Применение паратиреоидного гормона (ПТГ), вызывающего активацию и пролиферацию остеобластов, приводит к увеличению в 2-4 раза количества ранних стволовых кроветворных клеток (СКК), способных длительно поддерживать кроветворение.

2. После введения ПТГ в костном мозге животных концентрация более поздних поли- и олигопотентных клеток-предшественников (КООБ 7, КОЕс, КОЕ-К) не изменяется.

3. Добавление ПТГ в длительную культуру костного мозга человека и мыши не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников (КОЕ-К) увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) увеличивается в 9-10 раз.

4. На обработанных паратиреоидным гормоном стромальных подслоях длительных культур костного мозга мыши и человека адгезия и выживание кроветворных клеток улучшается, что отражается в увеличении числа ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) в 2-2,5 раза. Вместе с тем, отмечается увеличение уровня экспрессии гена BMI-1, отвечающего за самоподдержание СКК.

5. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем объясняется отсутствие экспансии зрелых клеток крови.

6. ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на их потомки - стромальные остеобласты.

Печатные работы

По теме диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Дризе Н.И., 2004. Влияние паратиреоидного гормона /ПТГ (1-34)/ на кроветворные и стромальные стволовые клетки. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 138, №12, с. 645-648.

2. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2005. Экспансия кроветворных клеток-предшественников ex vivo на подслое, обработанном паратиреоидным гормоном. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 140, №9, с. 320-324.

3. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2006. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. Бюлл.экспер.биол.мед., Том. 142, №7, с. 97-101.

4. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2005. Действие паратиреоидного гормона на кроверворные и стромальные стволовые клетки. Научные труды I Съезда Физиологов, Том 1, с. 215.jSvinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. РТН treatment induce alterations in murine Long-Term Bone Marrow Culture. The Hematology Journal, vol. 5, Suppl. 3, S68.

6. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. Mesenchymal stem cells capable to transfer hematopoietic microenvironment did not change their behavior after PTH treatment. Experimental Hematology, Vol 32, N7, Suppl. 1, p. 89.

7. Nina Drize, Daria Svinareva, Irina Nifontova, Joseph Chertkov, 2004. Parathyroid Hormone (1-34) Treatment Induces Hematopoietic Precursor Cells Expansion in Murine Long-Term Bone Marrow Culture. Blood, Vol 104, N11, part 2, p. 127b.

8. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Momotuk K.S., Savchenko V.G., Chertkov J.L., Drize N.J., 2005. Effect of PTH on hematopoiesis in human and murine Long-Term Bone Marrow Cultures. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 90: Suppl. 3, S2., p. 120. 9. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2005. Effect of parathyroid hormone on hematopoietic and stromal precursor cells. Experimental Hematology, Vol. 33, №7, Suppl. 1, p.121.

Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2006. Effect of PTH (1-34) on homing of hematopoietic stem cells. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 91, Suppl. l,p. 309.

Заключение