Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Характеристика in vitro стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией

ib

tf^KvuK На правах рукописи

□G3485730

Петрова Татьяна Владимировна

Характеристика in vitro стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией.

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 дек 2009

Москва 2009

003485730

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологическом научном центре РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук Нина Иосифовна Дризе; доктор медицинских наук Елена Алексеевна Михайлова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Ивановна Булычева; кандидат медицинских наук Наталья Геннадьевна Тюрина.

Ведущее научное учреждение:

Федеральное Государственное Учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Защита состоится « /6» 2009 г. в ^У часов

на заседании диссертационного Совета Д 001.042.02 при Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологическом научном центре РАМН

по адресу: 125167 Москва, Новозыковский проезд, д.4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан «/3 » к'0# О$ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Приобретенная апластическая анемия (АА) - заболевание системы крови, характеризующееся значительным уменьшением количества кроветворных предшественников, сопровождающимся замещением функционально активного красного костного мозга (КМ) инертной жировой тканью и панцитопенией (уменьшением количества клеток всех ростков кроветворения периферической крови). Существует несколько гипотез о причинах данного заболевания, однако точный механизм возникновения болезни до сих пор остается не ясным. На основании результатов некоторых экспериментов, а также достаточно успешного применения иммуносупрессивной терапии (ИСТ) на данный момент считается, что существенную роль в патогенезе апластической анемии шрает неправильное функционирование иммунной системы. С другой стороны, отсутствие ответа на стандартное лечение у 30% больных и провалившиеся попытки найти аутоантигены, вызывающие неадекватный иммунный ответ, привели к поиску альтернативных гипотез, способных объяснить механизм возникновения данного заболевания.

Известно, что стволовые кроветворные клетки (СКК) функционируют в тесном контакте с кроветворным микроокружением. Важным компонентом кроветворпого микроокружения, регулирующего СКК, являются веретеновидные остеобласты, формирующие вместе с другими клетками функциональную нишу для покоящихся СКК. Регуляция самоподаержания СКК в этой нише происходит, в том числе, за счет взаимодействия молекул Т1Е-2, находящихся на их поверхности, и АКО-1, экспрессированных на остеобластах. Нища для пролиферирующих СКК располагается в синусах костного мозга и связана с эндотелиальными клетками, экспрессирующими различные факторы роста. Одним из важнейших является фактор роста и регуляции клеток эндотелия УЕОИ. Адгезия СКК к нишам является принципиальной для их самоподдержания, и молекулы адгезии, в том числе УСАМ-1, играют здесь значимую роль.

Нарушение взаимодействия стволовой кроветворной клетки со своим микроокружением может приводить к патологическим изменениям пролиферации и дифференцировки СКК. Так, анализ мезенхимных сгромальных клеток (МСК) — одного из клеточных типов, составляющих кроветворное микроокружение, у больных с различными заболеваниями крови, в том числе с миелодиспластическим синдромом (МДС)^ показал их функциональную несостоятельность (Мауаш, Н. 2007). В работе других авторов было показано, что концентрация фибробластов -потомков МСК в костном мозге была изменена у больных лейкозом по сравнению со здоровыми донорами (Ыага, N.1984).

Было выдвинуто предположение, что у больных апластической анемией могут иметь место аналогичные нарушения в морфо-функциональных характеристиках МСК и их потомков. Однако данные о способности стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией поддерживать кроветворные клетки оказались противоречивыми. В исследованиях 2-х групп ученых было продемонстрировано, что в отличие от длительных культур костного мозга доноров на стромальных подслоях больных АА кроветворение практически отсутствует (Marsh, J. 1996; Selleri, С., 1996). В то же время Новицкий Н. и соавторы (1995г.) не выявили различий способности к поддержанию кроветворения стромальными подслоями больных АА и здоровых доноров.

Таким образом, на данный момент отсутствует достаточная информация о роли стромального микроокружения в патогенезе апластической анемией. Исследование кроветворного микроокружения больных АА, а также изучение возможного изменения экспрессии важных для самоподдержания СКК генов (ANG-1, VEGF, VCAM-1) является необходимым для более глубокого понимания патогенеза заболевания, а также для понимания функционирования СКК и ее взаимодействия со стромальным микроокружением костного мозга.

Цель работы:

Охарактеризовать in vitro стромальное микроокружение костного мозга больных апластической анемией.

Задачи исследования:

1. Сравнить способность мезенхимных стромальных клеток к росту и днфференцировкам больных апластической анемией и доноров.

2. Охарактеризовать способность к росту потомков мезенхимных стромальных клеток -колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) больных апластической анемией и доноров.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток (ANG-1), молекул адгезии (VCAM-1) и ростовых факторов (VEGF) в длительных культурах костного мозга (ДККМ) больных апластической анемией и доноров.

Научная новизна:

В данной работе in vitro впервые было продемонстрировано, что стромальное микроокружение больных апластической анемией изменено на уровне предшественников разной степени зрелости.

Были обнаружены изменения в способности МСК больных АА к длительному пассированию, накоплению суммарной клеточной продукции в культуре и скорости деления.

Нами было показано, что потомки МСК - колониеобразующие единицы фибробластов дают увеличенные колонии в культуре, а их концентрация в костном мозге повышена на начальном этапе болезни, что указывает на изменение пролиферативиой активности данных предшественников.

Полученные в работе данные выявили, что при длительной иммуносупрессивной терапии оказывается как положительное, так и негативное воздействие на стромальное микроокружение. В ответ на терапию происходит активация стромы, что сопровождается увеличением уровня экспрессии генов АЫО-1 и УСАМ-1, важных для поддержания кроветворения. У больных АА, получавших иммуносупрессивную терапию более года, наблюдается нормализация параметров роста КОЕ-Ф, с другой стороны, МСК таких больных хуже проходят жировую и костную дифференцировки, что было отмечено в ходе гистохимического анализа, и анализа уровня экспрессии молекулярных маркеров дифференцировки.

Научно-практическое значение работы:

Результаты, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы в экспериментальной гематологии. Полученные данные способствуют пониманию роли стромального микроокружения костного мозга в патогенезе апластической апемии и вносят новый вклад в представлеция о механизме развития данного заболевания.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мезенхимные стромальные клетки больных апластической анемией на первом этапе течения болезни характеризуются увеличенной способностью к росту в культуре по сравнению с донорами.

2. На этапе длительной иммуносупрессивной терапии способность мезенхимных стромальных клеток больных апластической анемией к костной и жировой дифференцировкам изменепа по сравнению с донорами.

3. Основные характеристики колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) больных апластической анемией на начальном этапе течения болезни отличаются от таковых у допоров.

4. У больных апластической анемией, получающих продолжительную иммуносупресспвпую терапию возможна нормализация параметров роста КОЕ-Ф.

5. На фоне длительной терапии может происходить активация стропильного микроокружения, отражающейся в значимом увеличении экспрессии генов, участвующих в регуляции стволовых кроветворных клеток.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 19 октября 2009 года на заседании проблемой комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологического научного центра РАМН.

Материалы работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

1. " Нарушения экспрессии генов, регулирующих стволовые кроветворные клетки, в стромальных клетках больных апластической анемией XXX Международная Гематологическая Школа "Лейкозы. Терапия и фундаментальные исследования", Москва, 28-29 июня, 2006.

2. "Improvement of Hematopoietic and Stromal Cells Interaction after PTH Treatment of Long-Term Bone Marrow Cultures from Patients with Aplastic Anemia." The American Society of Hematology. 48th Annual Meeting and Exposition December 9-12,2006.

3. "Alterations in osteoblastic and vascular niches revealed in adherent cell layers of long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia." 12th Meeting of the European Hematology Association, Vienna, Austria, June 7-10,2007.

4. Neutralization of supressive effect of blood serum from aplastic anemia patients on donor stromal cells by PTH treatment. 36th Annual Scientific Meeting, ISEH, Hamburg, Germany, September 28-30,2007.

5. "Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia". 27th Meeting in Wilsede «Modem trends in human leukemia», Wilsede, Germany, June 14-18,2008.

6. "Пролиферативный потенциал человеческих мезенхимных стромальных клеток (МСК) доноров и больных апластической анемией." Всероссийская научная школа-конференция Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования.

Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.ВЛомоносова, Сентябрь 21-26. Москва 2009.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора научной литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста и включают 41 рисунок, 8 таблиц н список литературы из 169 источников.

Работа выполнена в лаборатории физиологии кроветворения Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологического научного центра РАМН (зав. лаборатории - д.б.н. Дризе Н.И.). За помощь и содействие в проведении работы автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам отделений и лабораторий ГУ ГНЦ РАМН: к.б.н. Шипуновой И.Н., к.б.н Свинаревой ДА., к.б.п. Эршлеру М.А., к.б.н. Сац Н.В., к.м.н. Момотюк К.С., к.б.н Мисюрииу A.B., к-м.н. Виноградовой МЛ., к.б.н. Розову Федору Николаевичу и проф. Черткову И.Л.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использовали образцы костного мозга здоровых доноров и больных апластической анемией. Доноры и больные апластической анемией были информированы о проведении экспериментального исследования. Костный мозг получали в отделении Высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГУ ГНЦ РАМН при пупкции подвздошных костей и помещали его в стерильные пробирки с гепарином (50 ед./мл). Всего был получен материал от 70 доноров (медиана - 26 лет), и от 45 больных АА (медиана — 22 года).

Полученный КМ стерильно разводили средой аМЕМ (ICN) с 0,2% метилцеллулозы (1500 сП, Sigma) в соотношении 1:1 и оставляли на 40 минут при комнатной температуре. Далее взвесь, содержащую мононуклеары, собирали и осаждали центрифугированием при 1500 об./мин. в течение 10 минут. Количество ядерных клеток в суспензии костного мозга определяли путем подсчета в камере Горяева с генциап-виодетом (1% раствор на 3% уксуспой кислоте).

Для получения культуры МСК имплантировали по 2,5-3x106 ядерных клеток, выделенных из костного мозга, на флакон с площадью дна 25 см2 в среде альфаМЕМ с 10% специально отобранной эмбриональной телячьей сыворотки (HycJone) (ЭТС), 2 мМ L-глутамина (ICN), 100 ед/мл пенициллина (Ферейн), 50 мкг/мл стрептомицина (Ферейн). Культуры помещали в инкубатор с температурой 37°С и 5% СОг. Среду полностью меняли 2 раза в педелю. После

формирования конфлуентного монослоя клетки снимали 0,25% раствором трипсина, пассировали 1 к 3 или по 4000 клеток на см2 поверхности дна культурального флакона.

Для получения жировой дифференцировки использовали МСК, прошедшие 2-3 пассажа. Клетки помешали по 20-35 хЮ3 клеток на ячейку в 6-ячеечные платы и добавляли среду для культивирования, а также 0,5 мМ З-изобутил-1-метилксантина (Sigma), 1 мкМ дексаметазона (Sigma), 0,2 мкМ индометацина (Sigma) и 10 мкг/мл инсулина (Sigma). Клетки культивировали в течение 10-14 дней. Костную дифференцировку МСК индуцировали добавлением 0,1 мкМ дексаметазона, 0,15 мМ 2-фосфата аскорбиновой кислоты тринатриевой awH(Sigma) и 3 мМ NaH2P04 (Sigma) в среду для культивирования клеток. Методика и условия культивирования были аналогичны таковым для жировой дифференцировки.

Жировую дифференцировку визуализировали с помощью окрашивания раствором красителя Oil Red О (Sigma) в течение 10-12 минут. Окрашенные стекла с клетками отмывали дважды по 20 секунд в дистиллированной воде, затем 10 минут в проточной воде и заключали в Mowiol 4-88 (Calbiochem). Костную дифференцировку клеток выявляли по наличию в них кальция, образующего оранжево-красные комплексы с ализариновым красным. Стекла с клетками, прошедшими костную дифференцировку, фиксировали 10% раствором формалина в течение 10 минут, затем отмывали в фосфатном буфере и высушивали. Полученные препараты промывали в дистиллированной воде, а затем окрашивали свежеприготовленным раствором ализаринового красного S от 30 сек. до 5 минут, контролируя под микроскопом появление оранжево-красного цвета. Избыток краски стряхивали с препарата и окунали его сначала 20 раз в ацетон, затем 20 раз в смесь ацетона-ксилола (1:1), затем в ксилол. Окрашенные препараты заключали в канадский бальзам. Полученные препараты костной и жировой дифференцировки изучали с помощью светового микроскопа Nikon, оборудованного дополнительно камерой Electronic Eyepiece.

Для получения колоний КОЕ-Ф ядерные клетки, выделенные из костного мозга, в количестве 0,5-1х106 помещали во флакон с площадью дна 25 см2 в среде аМЕМ с 20% специально отобранной эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone), 2 мМ L-глутамина и антибиотиками (100 ед./мл пенициллина (Ферейн), 50 мкг/мл стрептомицина (Ферейн)). Клетки культивировали 14 дней без смены среды. Полученные колонии окрашивали 0,1% раствором кристалл-виолета (Sigma), приготовленным на 20% метаноле. Матрасы с фибробластными колониями фотографировали. Размер колоний определяли по цифровым фотографиям с использованием программы Scion Image.

Длительные культуры костного мозга человека получали по методу Декстера: на 1 ячейку 24-х луночной платы имплантировали 106 ядерных клеток костного мозга в полной питательной среде, состоящей из 80% аМЕМ (Sigma), 10% ЭТС, 10% сыворотки лошади (Gibco BRL), 2 мМ L-глутамина (ICN), 100 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2х10"5М ß-меркаптоэтанола

(Sigma) и Ю^М гидрокортизона. Первые трое суток ДККМ человека культивировали при 37°С и 5%СОг, затем продолжали культивирование при 33°С с еженедельной сменой половины среды без возвращения удаляемых клеток.

Для эксперимента по изучению воздействия сыворотки больных АА на стромальные подслои ДККМ доноров получали сыворотку от больных апластической анемией следующим образом. Кровь брали в сухие пробирки, помещали на 30 минут в инкубатор с температурой 37°С для формирования сгустка, затем обводили и помещали на несколько часов в холодильник для ретракции сгустка. После формирования сгустка сыворотку откручивали при 3000 оборотах/мин.

Экспрессию интересующих нам генов определяли путем выделения РНК из клеток ДККМ, КОЕ-Ф и МСК, индуцированных и неиндуцированных к жировой дифференцировке с последующей реакцией обратной транскрипции и полимеразной цепной реакций со специфичными праймерами для оценки уровня экспрессии искомых генов.

Для выделения РНК прикрепленную культуру клеток отмывали фосфатным буфером (ФБ). Затем добавляли денатурирующий раствор /ДР/ ( 25 мМ цитрата натрия (Sigma), 0,5% N-лаурил саркозина (ICN), 4M гуанидана изотиоциаиата (ICN) и 0,1М ß-меркаптоэтаиола (Sigma)). Лизированные клетки переносили в 2 мл пробирки. В каждую пробу добавляли по 1/10 от исходного объема ДР 2М ацетата натрия (pH 4,0, Sigma). Добавляли равный объему ДР объем кислого фенола (ICN), перемешивали и оставляли на льду на 15 минут. Добавляли хлороформ (Sigma) (20% от объема ДР), тщательно перемешивали, оставляли на льду на 10 минут. Пробы центрифугировали при 4°С, 12000 оборотах/мин 20 минут. Отбирали верхнюю водную фазу и переносили в новые центрифужные пробирки. Добавляли равный объем изопропанола (ЗАС «Экос-1») к каждой пробе и оставляли пробы при -20°С на 40 минут и более. Вымороженные пробирки центрифугировали при 4°С и 12000 оборотах/мин 10 мин. Осадок ресуспендировали в ДР до полного растворения. Добавляли равный объем изопропанола и оставляли при -20°С на 40 минут. Пробы центрифугировали при 4°С и 12000 оборотах/мин. 20 минут. Осадок промывали 1 мл ледяного 75° этанола, разбивая осадок па приборе для встряхивания проб (Vortex-2 Genie, Scientific Industries). Пробы откручивали при 4°С и 12000 оборотах/мин. 10 минут. Осадок высушивали. Полученную РНК растворяли в 100 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (ДЭПК, Sigma). Брали 1/10 объема на определение концентрации РНК на спектрофотометре. К оставшейся пробе добавляли 1/10 объема ацетата натрия (ЗМ, pH 5,2) и 2,5 объема 96% этанола. Пробы хранили при -20°С.

Чтобы получить кДНК образцы РНК осаждали центрифугированием при 12000 оборотах/мин, 4°С 10 минут. Осадок промывали 1 мл ледяного 75° этанола. Пробы откручивали при 4°С и 12000 оборотах/мин. 10 мипут. Осадок высушивали. РНК растворяли в воде,

обработанной ДЭГПС, исходя из того, чтобы получился 1 мкг РНК/мкл воды. Отбирали 2 мкл РНК для построения первых цепей кДНК. Проводили отжиг праймеров: 2 мкл РНК (1мкг/мкл), 1,5 мкл праймеров Т13 (20пмоль/мкл) или Random 6 (Синтол) и 5,5 мкл обработанной ДЭПК воды смешивали, инкубировали на водяной бане при 70°С в течение 5 минут, затем охлаждали на льду 10 минут. В каждую пробу добавляли 5 мкл пятикратного буфера для ревертазы (Promega), 2,5 мкл смеси dNTP (ЮмМ), 0,5 мкл Рназина (Promega), 1 мкл ревертазы M-MLV (Promega) и 6 мкл воды. Перемешивали и инкубировали на водяной бане при 42°С в случае использования Т13 праймеров и при 37°С - в случае использования Random 6 праймеров 1 час. Пробы охлаждали, добавляли 75 мкл воды, и использовали в качестве раствора кДНК соответствующего образца.

Полуколичественную оценку продукта реакции в зависимости от задач проводили с помощью методов Саузерн-блот гибридизации, метода полимеразной цепнй реакции (ПЦР) в реальном времени, непосредственной оценки яркости ПЦР продуктов в геле в программе Gel Pro.

Полимеразную цепную реакцию проводили проводили в следующем временном режиме: денатурация - 30 секунд 94°С , отжиг - 30 секунд (температура подбирается индивидуально в зависимости от нуклеотидного состава), синтез -1 минута 72°С.

Оценку экспрессии генов с помощью программы GelPro (наиболее быстрый и экономичный метод) использовали для оценки уровня экспрессии генов-маркеров в культурах МСК, стимулированных к жировой и костной дифференцировкам. После электрофореза полученных ПДР продуктов в 1,5% агарозном геле в программе GelPro 4.0 количественно оценивали яркость свечения полос в условных единицах (у.е.) программы. Нормировали полученные значения по гену домашнего хозяйства GAPDH.

Для более точной оценки относительного уровня экспрессии генов в длительпых культурах костного мозга, проводили Саузерн-блот-гибридизацию (Maniatis) ПЦР фрагментов соответствующих генов и последующий анализ на Фосфоимаджере (Phospholmager Cyclone, Packard Bell), либо ПЦР в реальном времени в зависимости от доступности методов для использования в нашей лаборатории.

В случае использования метода Саузерн-блот-гибридизации: после электрофореза агарозный гель с ПЦР фрагментами промывали дистиллированной водой и помещали в денатурирующий буфер на 15 минут (0,5М NaOH, 1,5М NaCl), где двухцепочечные фрагменты ПЦР денатурировали и образовались одноцепочечные фрагменты. Перенос фрагментов проводили в 10-ти кратном буфере SSPE (1,8М NaCl, 0ДМ NaH2P04,0,02М ЭДТ А, pH 7,7) на нейлоновые фильтры Hybond N или Hybond N+ (Amersham) в течение 18 часов. Фильтры высушивали на воздухе и фиксировали на приборе UV Stratalinker (Stratagene, USA) при стандартных условиях фиксации (120мДж/см2, Х=254нм, 30 сек).

Гибридазовали радиоактивно меченый зонд с одноцепочечиыми ПЦР фрагментами, закрепленньши на нейлоновом фильтре, фильтры накрывали специальными экранами. На 20 минут - 1 час, в зависимости от силы сигнала. Экраны помещали в прибор фосфоимаджер (Cyclon, Packard, USA) для измерения сигнала.

ПЦР в реальном времени проводили в следующем временном режиме: предварительная денатурация 95°С - 10 мин, циклические денатурация при 95°С - 15 секунд, отжиг праймеров и пробы 60°С - 45 с. Для нормирования количества кДНК в исходных пробах использовали гены IIPRT, B-ACTIN, RPL13A, UBC (убиквитин С), ABL.

Достоверность отличий между данными, полученными в экспериментах определялась по t-критерию Стьюдента для двух независимых выборок.

Результаты работы

В данной работе получали культуры мезенхимных стромальных клеток из костного мозга больных АА и доноров с одинаково эффективно. Нами было установлено, что в равных с МСК доноров условиях культивирования МСК от части больных АА, участвовавших в исследовании, были способны дольше пролиферировать и накапливать в 2 раза большую клеточную продукцию (рис 1 .А,Б).

■ Доноры

Больные АА

5 7 9 Номер пассажа

■»■Доноры

Больные АА

5 7 9 11 Номер пассажа

Рис.1 .А Доля, способных к пассированию культур МСК, полученных от больных АА и доноров. Б. Суммарная продукция МСК, полученных от больных АА и доноров, при длительном пассировании в культуре.

В то же время, у доноров на первом пассаже индекс пролиферации равнялся 10 условным единицам, а у МСК больных АА - всего лишь 4, т.е. был в 2,5 раза ниже (Рис.2А). Это согласовывалось с полученными нами данными по экспрессии гена основного фактора роста фибробластов (ГОР-2). отвечающего за пролиферацию и выживание мезенхимных стромальных

клеток. Уровень экспрессии РбР-2 равнялся 6,5 условным единицам в МСК доноров и был в 2,5 раза выше, чем в МСК больных АА (р=0,04) (Рис. 2Б).

-Доноры

Больные АА

Доноры 13 Больные АА

5 7 Номер пассажа

Рис,2.А. Индекс пролиферации МСК, полученных от больных АА и доноров, при длительном пассировании. Б. Относительный уровень экспрессии гена РвР-2 в МСК, полученных от больных АА и доноров.

Очевидно, что МСК больпых АА, с одной стороны, делятся реже донорских, а с другой -дольше пролиферируют, за счет этого и возможно получение большего суммарного количества стромальиых клеток от больных АА. Кроветворный плацдарм в организме строго ограничен, и можно предположить, что малоэффективное кроветворение индуцирует потенциальную возможность расширения кроветворных территорий у больных АА.

Изменения з параметрах роста МСК у больных на первом этапе течения болезни (период от постановки диагноза до начала специального лечения - до 3 месяцев) свидетельствуют о том, что данные изменения связаны с патогенезом апластической анемии, а не представляют собой результат побочного действия комбинированной ИСТ, либо продолжительного течения болезни (рис З.А,Б).

А Б

В Доноры

3 больные АА 1 этап течения болезни

-»-Доноры

на- Больные АА, 1 этап течения болезни

5 7 Номер пассажа

3 5 7 Номер пассажа

Рис.3.А. Доля способных к пассированию культур МСК, полученных от больных АА на 1 этапе течения болезни и доноров. Б. Суммарная продукция МСК, полученных от больных АА на 1 этапе течения болезни и доноров.

Поскольку наступление гематологической ремиссии (показатели крови в норме, отсутствует потребность в заместительной терапии компонентами крови) не вело, как мы ожидали, к нормализации способности МСК больных АА к длительному пассированию, а также сохранялись изменения в накоплении клеточной продукции можпо утверждать, что строма на уровне ранних предшественников существенно медленнее отвечает на успешную терапию, чем кроветворная ткань (рис 4.А,Б). А В

Доноры ^ - Больные АА, ремиссия

3 5 7 9 Номер пассажа

5 7 Номер пассажа

Рис.4.А. Доля способных к пассированию культур МСК, полученных от больных АА на этапе ремиссии и доноров. Б. Суммарная продукция МСК, полученных от больных АА на этапе ремиссии и доноров.

Из литературных источников известно, что в ряде гематологических заболеваний присутствуют изменения параметров роста потомков МСК - колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф), поэтому было очевидно, что изучение их свойств у больных АА могло бы прояснить некоторые механизмы заболевания.

При анализе наших данных от больных АА и доноров оказалось, что площадь колоний, полученных из КОЕ-Ф, а также концентрация КОЕ-Ф у больных АА на начальных этапах течения болезни в 2-3 раза (р=0,002) превышают значения изучаемых параметров у доноров.

Доноры

начальный этап болезни

Ремиссия

Больные АА

Доноры

Больные АА

Рис.5.А. Концентрация КОЕ-Ф в КМ доноров и больных АА на разных этапах течения болезни. Б. Размер колоний, образованных КОЕ-Ф доноров и больных АА, на разных этапах течения болезни.

Под данным Роеланда Г. (2009г.) подобное увеличение размера фибробластных колоний было отмечено им у МСК, прошедших опухолевую трансформацию (у трансформированных МСК была сильно увеличена пролифсративная способность, изменены морфологические характеристики и фенотип, нарушена способность к дифференцировкам). Длительное лечение способствовало уменьшению концентрации КОЕ-Ф в костном мозге. А у больных АА, находящихся в периоде ремиссии размер колоний КОЕ-Ф и концентрация данных предшественников совпадали с таковыми у доноров (Рие.5.А,Б). Уровень экспрессии РОР-2 в фибробластных колониях был снижен в 7 раз по сравнению с донорами (р=0,022) и не коррелировал с их размерами и концентрацией КОЕ-Ф в КМ больных, что говорило о том, что не этот фактор отвечает за регуляцию их размера и количества (Рис. 6).

□ Доноры ш Больные АА

Начальный этап течения болезни

Ремиссия без ИСТ

Рис.6. Экспрессия в колониях, образованных КОЕ-Ф больных АА и доноров.

Увеличение концентрации КОЕ-Ф и размера образуемых ими колоний, видимо, происходило за счет дополнительных делений, т.е. повышения пролиферативного потенциала. Вероятно, существует взаимная зависимость качества кроветворения и активности большинства стромальных предшественников в организме больных АА. Таким образом, совокупность данных говорит о физиологической активации стромального микроокружения у больных АА, что может быть связано с ответом организма па угнетение кроветворения.

Выяснить, являются ли изменения в параметрах роста МСК и КОЕ-Ф причиной заболевания, или они вторичны и возникают за счет воздействия угнетенного кроветворения на строму или аутоиммунной реакции организма в рамках данной работы не представлялось возможным. Однако понятно, что эти изменения не являются следствием побочных эффектов ИСТ, хотя она и способна оказывать влияние на строму.

В работе Хирата Д. (1989г.) было продемонстрировано, что у больных ХМЛ в фазе акселерации и при бластном кризе присутствует нарушение способности к жировой дифференцировке КОЕ-Ф из КМ, чего не происходит в хронической фазе и при других миелопролиферативных заболеваниях - эритремии и эссенциалыюй тромбоцитемии. По-видимому, нарушение жировой дифференцировки происходит в период наибольшего угнетения нормального кроветворения. Поскольку жировые клетки необходимы для поддержания нормального кроветворения, а при АА имеет место длительное угнетение кроветворепия была исследована способность МСК к жировой дифференцировке у больных АА.

Было показано, что в зависимости от этапа течения болезни способность МСК к жировой дифференцировке была различной. Если у больных АА, на 1-м этапе течения болезни, доля культур МСК, у которых была индуцирована морфологически нормальная или частичная дифференцировка, была сравнима с донорами, то у больных, находящихся в ремиссии способность к морфологически нормальной дифференцировке культур МСК падала в 1,8 раза, зато в 4 раза увеличивался процент культур, дифференцировавшихся частично (Рис.7.А).

16 Б

□ МСК после жировой дифференцировки

Больные АА

Рис.7.А. Морфология жировой дифференцировки МСК у доноров и больных АА. 1 - Изменена морфология клеток, есть крупные жировые капли в культуре, 2 - изменена морфология клеток, ИЛИ есть крупные жировые капли в культуре, 3 - не изменена морфология клеток, НЕТ крупных жировых капель в культуре. Е. Экспрессия гена-маркера жировой дифференцировки РРАЯ§атта в культурах МСК больных АА и доноров.

Эти данные согласовывались с данными по экспрессии гена РРАЯу - молекулярного маркера жировой дифференцировки. В продифференцировавшихся культурах МСК на ! этапе течения болезни уровень РРАЯу увеличивался в 1,7 раза (р=0,04) аналогично донорам, а в культурах МСК больных в ремиссии он не изменялся, что подтверждает данные о возникновении нарушений в жировой дифференцировке в ходе длительной ИСТ и сохраняющегося продолжительное время угнетения гемопоэза (Рис.7Б).

Поскольку ЮР-1 является одним из важных генов, участвующих в регуляции жировой дифференцировки мы предположили, что с изменением его экспрессии в МСК и их потомках КОЕ-Ф могут быть связаны отличия в жировой дифференцировке на морфологическом и молекулярном уровнях у больных АА по сравнению с донорами. Хотя на уровне МСК отличий в уровне экспрессии данного гена выявить не удалось, оказалось, что в КОЕ-Ф у больных АА он экспрессирован в 3,2 раза слабее (р=0,003) (Рис. 8.А,Б).

0,10 В Доноры В Больные АА-0,08

.1 о 0,06

2 Я

X ®

5 О- 0,04

§ |

£ * 0,02 и

I 0,00

0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00

ш

Доноры

ЮМ

1-й этап Ремиссия

АА Группа

Рис.8.А Экспрессия КИЧ в МСК больных АА и доноров. Б. Экспрессия ЮР-1 в колониях, образованных КОЕ-Ф больных АА и доноров.

Имелась тенденция к снижению КИМ у больных АА в ремиссии по сравнению с больными на 1 этапе АА, что согласовывалось с описанными выше данными. Можно утверждать, что в основе нарушения способности МСК больных АА к жировой дифференцировке лежит, в том числе, изменение уровня экспрессии гена ЮР-1.

Таким образом, получаемая больными АА длительная ИСТ, а также продолжительное угнетение кроветворения ^оказывают, по-видимому, негативное влияние на способность МСК к жировой дифференцировке, что видно как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях.

Учитывая ведущую роль остеобластов в регуляции функционирования ранних СКК, дефект именно в костной линии дифференцировки может играть немалую роль в угнетении кроветворения, наблюдаемом при АА.

Оцениваемая морфологически способность МСК больных АА и доноров к индукции костной дифференцировки оказалась схожей (Рис.9).

зг 100 -

Доноры Больные АА

Группа

Рис.9. Морфология костной дифференцировки МСК больных АА и доноров. 1 - нормальная костная дифференцировка, 2 - костную дифференцировку индуцировать не удалось.

Проведенное исследование экспрессии 2-х генов-маркеров остеогенной дифференцировки выявило отличия в характере экспрессии одного из них у больных АА и доноров. У больных АА, профиль экспрессии щелочной фосфатазы - раннего маркера костной дифференцировки, стимулирующего отложение внеклеточного кальция не отличался от доноров как в МСК, так и после индукции в них костной дифференцировки (Рис.Ю.А).

пмск

В МСК после костной дифференцировки х 2,0

» 1,5

а

| л 1.0 о л О X

а

* 0,0

I

1

„т i

й * 0

ПМСК

В МСК после костной дифференцировки 4,0 -

Доноры Больные АА Группа

х 3,0 ш 01

0 2,0

■I с 1,0

1 «

ё &0.0 | 2

5 «

о о х

6

Т

Т

я

Доноры начальный этап болезни Больн Ремиссия ые АА

Рис.Ю.А. Экспрессия гена-маркера костной дифференцировки ALP в культурах МСК больных А А и доноров. Б. Экспрессия гена-маркера костной дифференцировки PTHR в культурах МСК больных АА и доноров.

В то же время, анализ уровня экспрессии позднего гена-маркера костной дифференцировки - рецептора паратиреоидного гормона показал, что уровень его экспрессии хоть и существенно увеличивался в индуцированных к костной дифференцировке МСК больных АА, но все же был меньше в 1,5 раза (незначимо р=0,13), чем у доноров (Рис.Ю.Б). Разный этап течения болезни у исследуемых больных влиял на уровень экспрессии этого гена в индуцированных к костной дифференцировке МСК: у больных в ремиссии ген экснрессировался в 2 -3 раза хуже, чему у больных на начальном этапе АА и у доноров (р=0,02). Отличная от доноров экспрессия позднего маркера дифференцировки и сравнимая с донорами экспрессия раннего маркера дифференцировки может указывать на аномальную реакцию МСК больных АА на индукцию костной дифференцировки, причем не на ранней, а на уже более поздней стадии костной дифференцировки. Продолжительная ИСТ, оказывая положительное влияние на гемопоэз, в то же время, вероятно, способна усиливать данный отрицательный эффект. Однако нельзя исключать отрицательного воздействия на костную дифференцировку и факта очень продолжительного угнетения кроветворения. Поскольку ВМР-4 участвует в процессе остеогенеза, мы предположили, что изменение его экспрессии может лежать в основе наблюдаемых изменений в экспрессии гена-

маркера РТНЛ. Однако на уровне МСК никаких отличий выявлено не было (Рис.11.А). В то же время было показано, что на уровне КОЕ-Ф его экспрессия увеличена в 2 раза по сравнению с донорами (р=0,02) (Рис. 11.Б).

О Доноры (3 Больные ДА

а

т г

0 4

>. | 4

>5 О

1 ё з 5 5 2

Ш V-?,п1

"" В Доноры □ Больные АА

--

1 1

ВМР-4

ВМР-4

Рис. 11. А Экспрессия гена ВМР-4 в культурах МСК больных АА и доноров. Б. Экспрессия гена ВМР-4 в колониях, образованных КОЕ-Ф больных АА и доноров.

Данные по динамике изменения уровня экспрессии генов маркеров дифференцировки до начала ИСТ и на стадии лечения на примере больного №29 говорят о том, что свойства МСК меняются (Рис.12).

1 ЕМОК контроль

■ МСК. индуцированные к дифференцировке

Рис.12. Относительный уровень экспрессии генов маркеров дифференцировок у больного АА

№29.

В процессе терапии меняется чувствительность клеток-предшественников стромального микроокружения к индукции как адапогенной, так и остегенной дифференцировки. Сильное повышение относительного уровня экспрессии проанализированных генов в МСК до и после индукции дифференцировок говорит об изменении состояния кроветворного микроокружения по мере лечения. Однако поскольку на момент исследования ремиссия у этого больного не была достигнута, можно утверждать, что повышение экспрессии генов- маркеров дифференцировки в

ходе ИСТ не связано прямо со способностью микроокружения к поддержанию кроветворения. Так как группа больных АА гетерогенна, возможны индивидуальные различия в реакции кроветворных и стромальных клеток на иммуносупрессивную терапию.

В экспериментах на модели ДККМ было показано, что уровень экспрессии гена ростового фактора АЫО-1, являющегося одной из ключевых молекул сохранения СКК в состоянии стволовости и секретирующегося остеобластами, и уровень экспрессии гена молекулы адгезии УСАМ-1, были увеличены у больных АА в 2,5-3 раза (р=0,03; р=0,003) по сравнению с донорами.

Наблюдаемые изменения в экспрессии указанных выше генов отсутствовали у больных на 1 -м этапе болезни и появлялись в ходе длительного лечения (Рис. 13.А,Б).

о

Ь

>5 и

3 "

Я Доноры

ЕЭ Больные АА начальный этап течения болезни

АЖЗ-1

« о

3 Й х 2

■ Доноры

3 Больные АА более 12 мес

ж 1

й

А 1*3-1 УСАМИ \ZEGF Гены

Рис.13 А,Б. Экспрессия генов АШ-1, УСАМ-), УШИ в подслоях ДККМ больных АА, на разных этапах болезни, через 3 недели культивирования.

Это свидетельствует о том, что существенной являлась именно длительность, а не успешность терапии. В то же время необходимо подчеркнуть, что все больпые рефрактерной апластической анемией, у которых уровень экспрессии данных генов был повышен, позже выходили в ремиссию. В процессе длительной терапии, по-видимому, активируется кроветворное микроокружение, что сопровождается увеличением экспрессии АЫО-1 и УСАМ-1. Однако процесс является обратимым, поскольку у больных, длительно находящихся в периоде ремиссии и не получающих сопроводительную терапию циклоспорином А, экспрессия данных генов нормализуется (в случае АЫО-1 у 6 из 6 проанализированных больных, в случае УСАМ-1 у 3-х из 6 больных).

Основываясь на том, что в ходе лечения происходит активация стромального микроокружения, возникло предположение, что сыворотка от больных АА может оказывать подобное активирующее действие на стромальные подслои здоровых доноров.

Добавление сыворотки больных АА к ДККМ доноров в течение 3 недель приводило к изменению уровня экспрессии АКО-1, УСАМ-1 и УЕОР. Хотя не все сыворотки воздействовали на стромальные подслои доноров одинаково, в среднем 60-70% сывороток больных АА вызывали увеличение экспрессии исследуемых генов (Рис. 14.А). Отмена добавления сыворотки больных АА в течение следующих 3 недель культивирования приводила к нормализации уровня экспрессии исследованных генов в 40-60% стромальных подслоев ДККМ доноров (Рис. 14.Б).

АЖИ УСАМ-1 \ЛЕС> АМС-1 УСАМИ \ZEGF

Гены Гены

Рис.14.А,Б. Воздействие сьшороток больных АА на генную экспрессию в ДККМ доноров. 1 -Экспрессия гена увеличена, 2 - Экспрессия гена уменьшена, 3 - Экспрессия гена не изменена.

Полученные данные указывают на то, что в сыворотке больных АА содержится субстанция, изменяющая экспрессию генов кроветворного микроокружения, важных для поддержания кроветворения.

В заключение можно просуммировать, что выявленные в данной работе изменения стромального микроокружения носят сложный характер и присутствуют в трех отделах иерархии стволовой кроветворной клетки: отделе мезенхимных стромальных клеток, отделе их потомков -полипотентных колониеобразующих единиц фибробластов и отделе дифференцированных клеток стромы. Изменения на уровне первых 2-х отделов (МСК и КОЕ-Ф) связаны с патогенезом заболевания, поскольку присутствуют уже на этапе начального течения болезни. Изменения касаются таких характеристик МСК, как способность к пассированию, накопление суммарной клеточной продукции, индекс пролиферации, экспрессия фактора роста фибробластов. В отделе КОЕ-Ф изменены концентрация предшественников и размер образуемых ими колоний. Эти изменения являются обратимыми в различной степени, что зависит от того, насколько ранними являются стромальные предшественники.

В отделе дифференцированных клеток стромы. нами были выявлены изменения в уровне экспрессии генов АШ-1 и УСАМ-1, регулирующих функционирование СКК, что было связано с

проведением иммуносупрессивной терапии. По-видимому, ИСТ способна активировать стромальное мякроокружение.

Таким образом, выявленные в работе отличия в параметрах роста и способности к дифференцировке стромальных элементов КМ у больных АА могут бьпь поделены на 2 класса. К первому классу относятся отличия, которые непосредственно связаны с патогенезом заболевания. Ко второму классу относятся изменения, связанные с влиянием на строму, с одной стороны ^ проводимой ИСТ, с другой - длительно сохраняющегося неэффективного кроветворения. Данная работа вносит вклад в изучение патогенеза апластической анемии и функционирования стромального микроокружения КМ, регулирующего СКК.

Выводы

1. У больных апластической анемией выявлены изменения в клетках, находящихся на разном уровне иерархии мсзенхимных стволовых клеток: 1) на уровне мезенхимных стромальных клеток (МСК); 2) их потомков полипотентных клеток, образующих колонии фибробластов (КОЕ-Ф); и 3) функционирования зрелых клеток стромы костного мозга.

2. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) больных апластической анемией на начальном этапе болезпи способны к более длительному пассированию и накоплению большей клеточной продукции в культуре, чем МСК доноров.

3. На этапе длительной иммуносупрессивной терапии в МСК больных апластической анемией после индукции жировой дифференцировки происходят аномальные морфологические изменения и снижение экспрессии гепа РРАК^атта в 3 раза по сравнению с донорами; после индукции костной дифференцировки в МСК больных в 4 раза слабее эксдрессируегся ген РТНЯ по сравнению с донорами.

4. Концентрация колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) в костном мозге больных апластической анемией на первом этапе болезни достоверно повышена по сравнению с донорами, при этом КОЕ-Ф образуют колонии в 2 раза большего размера.

5. У большинства больных апластической анемией в ремиссии происходит нормализация концентрации КОЕ-Ф и размера образуемых ими колоний.

6. После длительной иммуносупрессивной терапии у больных увеличивается экспрессия генов АЫО-1 и УСАМ-1 в 3 раза по сравнению с донорами, что свидетельствует об активации стромального микроокружения.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Петрова Т.В.. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Момотюк К.С., Савченко В.Г., Дризе Н.И., 2006. Стромальная регуляция стволовых кроветворных клеток в длительных культурах костного мозга человека под действием паратиреоидного гормона. Клеточные технологии в биологии и медицине, №4, с.218-223.

2. Петрова Т.В.. Нифонтова И.Н., Свинарева Д.А., Виноградова М.А., Михайлова Е.А., Дризе Н.И., 2008. Нарушение экспрессии генов, регулирующих гомеостаз стволовых кроветворных клеток, в стромальных клетках больных апластической анемией. Терапевтический архив, Том 80, №1, с. 61-65.

3. Герасимова Л.П., Дризе Н.И., Лубкова О.Н., Манакова Т.Е., Нифонтова И.Н., Петрова Т.В.. Свинарева Д.А., Момотюк К.С., Михайлова Е.А., Ольшанская Ю.В., Соколова М.А., Туркина А.Г., Цветаева Н.В., 2008. Нарушения стромального микроокружения у больных с различными заболеваниями системы крови. Гематология и трансфузиология, Том 53, №5, с. 59-62.

4. Shipounova I.N, Petrova Т.У.. Svinareva D.A., Moraotuk K.S., Mikhailova E.A., Drize NJ, 2009. Alterations in Hematopoietic Microenvironment in Patients with Aplastic Anemia. Clinical and Translalional Science, Vol. 2, issue 1, p. 67-74.

5. Petrova Т. V.. Svinareva D.A., Nifontova ].N.,Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2006. Alterations of gene expression in PTH(l-34) treated long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia Hematologica/The hematology journal, Vol. 91(sl), p. 393.

6. Petrova Т. V.. Nifontova I.N. Svinareva D. A., Vinogradova M. A., Michaylova E. A., Drize N. J., 2006. Improvement of Hematopoietic and Stromal Cells Interaction after PTH Treatment of Long-Term Bone Marrow Cultures from Patients with Aplastic Anemia Blood, Vol. 108, №11, part 1, p. 407a

7. Петрова T.B.. Нифонтова И.Н., Свинарева Д.А., Виноградова М.А., Михайлова Е.А., Дризе Н.И., 2007. Изменение экспрессии генов, регулирующих взаимодействие стволовых кроветворных клеток со стромальными элементами, остеобластной и сосудистой ниш у больных апластической анемией. Вестник гематологии, Том 3, №2, с. 59-60.

8. Petrova T.V., Svinareva D.A., Nifontova I.N.,Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2007. Alterations in osteoblastic and vascular niches revealed in adherent cell layers of long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia Hematologica/The hematology journal, Vol. 92, Suppl.l, p. 27.

9. Petrova T.V.. Svinareva DA, Nifontova I.N., Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2007. Neutralization of supressive effect of blood serum from aplastic anemia patients on donor stromal cells by PTH treatment. Experimental Hematology, Vol. 35, №9, Suppl.2, p. 114.

10. Petrova T.V.. Nifontova I.N., Mikhaylova E.A. Drize N.J., 2008. Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia. Haematologica, Vol. 93(s), p. 21.

11. Petrova T.V..Nifontova I.N., Michaylova E.A., Drize N.J., 2008. Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia. Modern Trends in Human Leukemia XVII. p. 158

12. И. Н.Шипунова, Т.В.Петрова. Д.А. Свинарева, H.B. Сац, Н.И. Дризе, 2009 Пролиферативный потенциал человеческих мезенхимных стромальных клеток (МСК) доноров и больных апластической анемией. Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования. Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В Ломоносова, Москва 2009, стр. 63

Подписано в печать:

12.11.2009

Заказ № 3021 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1.1 Актуальность проблемы.

Приобретенная апластическая анемия (АА) - это заболевание системы крови, характеризующееся значительным уменьшением количества кроветворных предшественников, сопровождающееся замещением функционально активного красного костного мозга (КМ) инертной жировой тканью и панцитопенией (уменьшением количества клеток всех ростков кроветворения периферической крови). Существует несколько гипотез о причинах данного заболевания, однако патогенез до сих пор остается неясным. На основании результатов некоторых экспериментов, а также достаточно успешного применения иммуносупрессивной терапии (ИСТ) на данный момент считается, что существенную роль в патогенезе апластической анемии играет неправильное функционирование иммунной системы (168, 161). С другой стороны отсутствие ответа на стандартное лечение у 30% больных и провалившиеся попытки найти аутоантигены, вызывающие неадекватный иммунный ответ привели к поиску альтернативных гипотез, способных объяснить механизм возникновения данного заболевания.

Известно, что стволовые кроветворные клетки (СКК) функционируют в тесном контакте с кроветворным микроокружением. Важным компонентом кроветворного микроокружения, регулирующего СКК, являются веретеновидные остеобласты, формирующие вместе с другими клетками функциональную нишу для покоящихся СКК (17). Регуляция самоподдержания СКК в этой нише происходит, в том числе, за счет взаимодействия молекул TIE-2, находящихся на их поверхности, и ANG-1, соответственно, экспрессированных на остеобластах (9). Ниша для пролиферирующих СКК располагается в синусах костного мозга и связана с эндотелиальными клетками, экспрессирующими различные факторы роста. Одним из важнейших является фактор роста и регуляции клеток эндотелия VEGF (70). Адгезия СКК к нишам является принципиальной для их самоподдержания, и молекулы адгезии, в том числе VCAM-1 играют здесь значимую роль (38).

Нарушение взаимодействия стволовой кроветворной клетки со своим микроокружением может приводить к патологическим изменениям пролиферации и дифференцировки СКК. Так, анализ мезенхимных стромальных клеток (МСК) - одного из клеточных типов, составляющих кроветворное микроокружение, у больных с различными заболеваниями крови, в том числе с миелодиспластическим синдромом (МДС) показал их функциональную несостоятельность (93). В работе других авторов было показано, что концентрация фибробластов - потомков МСК в КМ была изменена у больных лейкозом по сравнению со здоровыми донорами (100).

Было выдвинуто предположение, что у больных апластической анемией могут иметь место аналогичные нарушения в морфо-функциональных характеристиках МСК и их потомков. Однако данные о способности стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией поддерживать кроветворные клетки оказались противоречивыми. В исследованиях 2-х групп ученых было продемонстрировано, что в отличие от длительных культур костного мозга доноров на стромальных подслоях больных АА кроветворение практически отсутствует (91, 122). В то же время Новицкий и соавторы не выявили различий в способности поддерживать кроветворение стромальными подслоями больных АА и здоровых доноров (104).

Таким образом, на данный момент наблюдается недостаток в информации о роли стромального микроокружения в патогенезе апластической анемии. Исследование кроветворного микроокружения больных АА, а также изучение возможного изменения экспрессии важных для самоподцержания СКК белков (ANG-1, VEGF, VCAM-1) является необходимым для более глубокого понимания патогенеза заболевания, а также для понимания функционирования СКК и ее взаимодействия со стромальным микроокружением костного мозга.

1.2 Цель работы.

Охарактеризовать in vitro стромальное микроокружение костного мозга больных апластической анемией.

1.3 Основные задачи.

1. Сравнить способность мезенхимных стромальных клеток к росту и дифференцировкам больных апластической анемией и доноров.

2. Охарактеризовать способность к росту потомков мезенхимных стромальных клеток - колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) больных апластической анемией и доноров.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток (ANG-1), молекул адгезии (VCAM-1) и ростовых факторов (VEGF) в длительных культурах костного мозга (ДККМ) больных апластической анемией и доноров.

Выводы

1. У больных апластической анемией выявлены изменения в клетках, находящихся на разном уровне иерархии мезенхимных стволовых клеток: 1) на уровне мезенхимных стромальных клеток (МСК); 2) их потомков полипотентных клеток образующих колонии фибробластов (КОЕ-Ф); и 3) функционирования зрелых клеток стромы костного мозга.

2. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) больных апластической анемией на начальном этапе болезни способны к более длительному пассированию и накоплению большей клеточной продукции в культуре, чем МСК доноров.

3. На этапе длительной иммуносупрессивной терапии в МСК больных апластической анемией после индукции жировой дифференцировки происходят аномальные морфологические изменения и снижение экспрессии гена PPARgamma в 2,8 раза по сравнению с донорами; после индукции костной дифференцировки в МСК больных в 4 раза слабее экспрессируется ген PTHR по сравнению с донорами.

4. Концентрация колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) в костном мозге больных апластической анемией на первом этапе болезни достоверно повышена по сравнению с донорами, при этом КОЕ-Ф образуют колонии в 2,2 раза большего размера.

5. У большинства больных апластической анемией в ремиссии происходит нормализация концентрации КОЕ-Ф и размера образуемых ими колоний.

6. После длительной иммуносупрессивной терапии у больных увеличивается экспрессия генов ANG-1 и VCAM-1 в 3 раза по сравнению с донорами, что свидетельствует об активации стромального микроокружения.

Печатные работы

По теме диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. Петрова Т.В., Свипарева Д.А., Нифонтова И.Н., Момотюк К.С., Савченко В.Г., Дризе Н.И., 2006. Стромальная регуляция стволовых кроветворных клеток в длительных культурах костного мозга человека под действием паратиреоидного гормона. Клеточные технологии в биологии и медицине, №4, с.218-223.

2. Петрова Т.В. Нифонтова И.Н., Свинарева Д.А., Виноградова М.А., Михайлова Е.А., Дризе Н.И., 2008. Нарушение экспрессии генов, регулирующих гомеостаз стволовых кроветворных клеток, в стромальных клетках больных апластической анемией. Терапевтический архив, Том 80, №1, с. 61-65.

3. Герасимова Л.П., Дризе Н.И., Лубкова О.Н., Манакова Т.Е., Нифонтова И.Н., Петрова Т.В. Свипарева Д.А., Момотюк К.С., Михайлова Е.А., Ольшанская Ю.В., Соколова М.А., Туркина А.Г., Цветаева Н.В., 2008. Нарушения стромального микроокружения у больных с различными заболеваниями системы крови. Гематология и трансфузиология, Том 53, №5, с. 59-62.

4. Shipounova I.N, Petrova T.V., Svinareva D.A., Momotuk K.S., Mikhailova E.A., Drize N.J., 2009. Alterations in Hematopoietic Microenvironment in Patients with Aplastic Anemia. Clinical and Translational Science, Vol. 2, issue 1, p. 67-74.

5. Petrova T.V. Svinareva D.A., Nifontova I.N.,Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2006. Alterations of gene expression in PTH(l-34) treated long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia Hematologica/The hematology journal, Vol. 91(sl), p. 393.

6. Petrova Т. V. Nifontova I.N. Svinareva D. A., Vinogradova M. A., Michaylova E. A., Drize N. J., 2006. Improvement of Hematopoietic and Stromal Cells Interaction after PTH Treatment of Long-Term Bone Marrow Cultures from Patients with Aplastic Anemia. Blood, Vol. 108, №11, part 1, p. 407a.

7. Петрова T.B. Нифонтова И.Н., Свинарева Д.А., Виноградова М.А., Михайлова Е.А., Дризе Н.И., 2007. Изменение экспрессии генов, регулирующих взаимодействие стволовых кроветворных клеток со стромальными элементами, остеобластной и сосудистой ниш у больных апластической анемией. Вестник гематологии, Том 3, №2, с. 59-60.

8. Petrova T.V. Svinareva D.A., Nifontova I.N.,Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2007. Alterations in osteoblastic and vascular niches revealed in adherent cell layers of long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia Hematologica/The hematology journal, Vol. 92, Suppl.l, p. 27.

9. Petrova T.V., Svinareva D.A., Nifontova I.N., Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2007. Neutralization of supressive effect of blood serum from aplastic anemia patients on donor stromal cells by PTH treatment. Experimental Hematology, Vol. 35, №9, Suppl.2, p. 114.

10. Petrova T.V. Nifontova I.N., Mikhaylova E.A. Drize N.J., 2008. Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia. Haematologica, Vol. 93(s), p. 21.

11. Petrova Т.V.,Nifontova I.N., Michaylova E.A., Drize N.J., 2008. Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia. Modern Trends in Human Leukemia XVII. p. 158

12. И. Н.Шипунова, Т.В.Петрова. Д.А. Свинарева, Н.В. Сац, Н.И. Дризе, 2009 Пролиферативный потенциал человеческих мезенхимных стромальных клеток (МСК) доноров и больных апластической анемией. Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования, факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва 2009, стр. 63