Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Влияние озона на процессы липопероксидации и морфофункциональное состояние нормальной и патологически измененной печени (экспериментальное исследование)

БОЛЬШУХИН СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ

На правах рукописи 0

ВЛИЯНИЕ ОЗОНА НА ПРОЦЕССЫ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НОРМАЛЬНОЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОЙ ПЕЧЕНИ

(экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14 коя т

Нижний Новгород 2013

005537886

005537886

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор

Перетяги» Сергей Петрович

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, профессор

Косых Александр Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор

Рыжаков Дмитрий Иванович

Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», г. Нижний Новгород

Заведующий кафедрой общей хирургии имени профессора Н.И. Атясова с курсами отоларингологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБУН Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России, г. Москва.

Защита диссертации состоится «б» декабря 2013 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 208.061.03. при ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России (603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России (603104, г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. За).

Автореферат разослан «_»__2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Е. А. Дурново

доктор медицинских наук, профессор

Беляев Александр Назарович

На правах рукописи

БОЛЬШУХИН СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ОЗОНА НА ПРОЦЕССЫ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НОРМАЛЬНОЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОЙ ПЕЧЕНИ

(экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород 2013

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор

Перетягпн Сергей Петрович

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, профессор

Косых Александр Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор

Рыжаков Дмитрий Иванович

Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», г. Нижний Новгород

Заведующий кафедрой общей хирургии имени профессора Н.И. Атясова с курсами отоларингологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБУН Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России, г. Москва.

Защита диссертации состоится «6» декабря 2013 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 208.061.03. при ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России (603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России (603104, г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. За).

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Е. А. Дурново

доктор медицинских наук, профессор

Беляев Александр Назарович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Заболевания печени представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения, как в России, так и в мире в целом. В их структуре наибольшую распространенность получили гепатиты вирусной этиологии и алкогольное поражение печени [Савина Н.С., 2007; Буеверов А.О., 2008; Жаров С.Н., Санин Б.И., 2009]. Рассматриваемая патология имеет большое клинико-социальное значение вследствие инвалидизации и высокой смертности в основном трудоспособного населения, больших финансовых затрат, связанных с лечением и реабилитацией пациентов [Мехтиев С.Н. с соавт., 2008]. Наряду с этим, наблюдается увеличение частоты тяжелых форм течения гепатитов с высоким риском формирования хронического поражения печени [Волчкова Е.В., Потекаева С.А., 2004; Ярошенко Е.Б. с соавт. 2008].

Возникновение и развитие патологических процессов, как отмечают Ю.А. Владимиров с соавт. (2000, 2009), зависит от этиологических факторов, но имеет единый механизм повреждения - активацию процессов липопероксидации. Хотя начальные этапы генерации активных форм кислорода при разных заболеваниях могут отличаться, но далее сдвиги свободнорадикальных процессов теряют свою специфичность и зависят только от состояния и степени мобилизации антиоксидантной защиты [Сологуб Т.В. с соавт., 2008; Потемина Т.Е., Рыжаков Д.И., 2009; Loguercio С., Federico А., 2003]. Это подтверждают и другие авторы, которые рассматривают перекисное окисление липидов как один из универсальных механизмов повреждения клеток, в том числе печени [Буеверов А.О., 2002; Чеснокова Н.П. с соавт., 2006; Журавлев А.И. с соавт., 2008].

Одним из перспективных путей в решении данной проблемы является разработка методов озонотерапии для комплексного лечения заболеваний печени. Как показали многочисленные исследования [Бояринов Г.А. с соавт., 1999; Яковлев А.Ю. с соавт., 2010; Масленников О.В. с соавт., 2012; Wolff

H.H., 1999], парентеральное применение озона обладает системными метаболическими эффектами: антибактериальным и противовирусным действием, антагапоксическим, иммуномодулирующим, обезболивающим, противовоспалительным, детоксикационным, модулирующим действием на процессы липопероксидацин, антиоксидантную систему, а также систему гемостаза и реологии крови [Перетягин С.П. с соавт., 2003, 2011; Конторщикова К.Н. с соавт., 2005,2011; Rilling S., 1996; Bocci V., 1997].

Однако применение озонотерапии в комплексном лечении различных заболеваний, в том числе печени, сопряжено с немалыми трудностями. Так, остаются до конца не решенными вопросы выбора оптимальных лечебных доз озона и методов контроля эффективности лечения озоном. Большинство доз озона в клинических условиях подбираются эмпирически, не учитывая исходного функционального состояния организма и стадии развития заболевания, создавая сложности в оценке результатов озонотерапии [Перетягин С.П. с соавт., 2007, 2010]. Все это определяет актуальность изучения влияния озона на процессы липопероксидацин в зависимости от активности патологического процесса в печени.

Цель исследования.

Изучить эффекты озона в отношении процессов липопероксидацин и морфофункционального состояния печени в норме и при интоксикации тетрахлорметаном.

Задачи исследования.

1. Оценить влияние озона на интенсивность процессов липопероксидацин в плазме и эритроцитах крови, ткани печени и её морфофункциональных показателей здоровых крыс.

2. Исследовать динамику параметров перекисного окисления липидов в крови и ткани печени крыс, а также ее функционально-метаболический статус и морфологическую структуру при экспериментальном поражении тетрахлорметаном.

3. Дать оценку эффективности применения озона в дозах 1. 10 и 100 мкг/кг на процессы липопероксидации и морфофункциональное состояние печени в зависимости от тяжести токсического поражения.

Научная новизна.

Впервые описаны дозозависимые эффекты озона на процессы липопероксидации в плазме и эритроцитах крови, гомогенате печени и её морфофункциональные параметры у здоровых животных, проявляющиеся активацией антиоксидантной системы и митотической активности гепатоцитов на малых дозах (1 мкг/кг) и в формировании умеренного окислительного стресса при использовании высоких доз озона (100 мкг/кг).

Доказано, что введение озона при остром экспериментальном (тетрахлорметановом) гепатите в дозе 1 мкг/кг массы тела не вызывает значимых изменений показателей липопероксидации, но сопровождается увеличением активности антиоксидантной системы и стимуляцией митотической активности гепатоцитов печени крыс.

Показано, что на фоне хронического гепатита наиболее действенными были высокие дозы озона (10 и 100 мкг/кг массы тела), которые проявлялись саногенетическими эффектами в виде увеличения антиоксидантной активности и улучшения морфологической картины печени.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты экспериментальных исследований показали, что озон является эффективным, дозозависимым и патогенетически обоснованным средством лечения острых и хронических заболеваний печени. Применяемые дозы озона оказывают саногенетическое действие на активность процессов ЛПО и морфофункциональные показатели печени крыс. При этом эффективность озонотерапии зависит как от тяжести токсического поражения печени, так и от дозы вводимого озона.

Результаты исследований дополняют экспериментальные и клинические данные по вопросам индивидуального подбора доз озона и методик контроля эффективности и безопасности озонотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

У интактных животных введение озона в дозе 1 мкг/кг не вызывает значимой стимуляции процессов липопероксидации в крови и ткани печени, но приводит к увеличению активности антиоксидантной системы (АОС) и митотической активности гепатоцитов. Более высокие дозы озона (10 и 100 мкг/кг) способствуют у здоровых животных нарастанию интенсивности процессов липопероксидации, сопровождающемуся снижением резервов

антиоксидантной защиты.

Эффективность системного применения озона при остром токсическом гепатите заключается в преимущественной стимуляции системы антиоксидантной защиты малыми дозами соединения (1 мкг/кг). В условиях хронического токсического гепатита более предпочтительными являются высокие дозы озона (100 мкг/кг), обеспечивающие снижение интенсивности процессов липопероксидации, стимуляцию антиоксидантной системы и восстановление морфологической структуры печени.

Внедрение результатов исследования.

Материалы исследований внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу на кафедрах медицинской биологии и генетики; гистологии, цитологии и эмбриологии; физики и информатики ГБОУ ВПО Кировская ГМА, в цикл последипломной подготовки специалистов по озонотерапии, проводимый Ассоциацией российских озонотерапевтов.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на I научно - практ. конф. «Медицина третьего тысячелетия глазами молодых ученых» (Йошкар-Ола, 2003); на III Укр. научно-практ. конф. с межд. участием «Местное и парентеральное применение озонотерапии в медицине» (Харьков, 2003); на

VII Всеросс. научно-практ. конф. с междунар. участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2007), на VIII Всеросс. научно-пракг. конф. с межд. участием «Озон, активные формы кислорода и методы интенсивной

терапии в медицине» (Нижний Новгород, 2009).

Диссертация апробирована 28 февраля 2013 года на межкафедральном заседании, кафедр патофизиологии, нормальной физиологии, химии, биологии, физики и медицинской информатики, гистологии, эмбриологии и цитологии, патологической анатомии, анатомии ГБОУ ВПО Кировская ГМА Минздрава России (протокол №2 от 28.02.2013 г.).

Личный вклад автора заключался в планировании и проведении патофизиологических экспериментов, в подготовке экспериментального биологического материала для лабораторных исследований, в анализе и статистической обработке полученных данных, в написании научных статей.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 4 -в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 152 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 57 рисунков (микрофотографии, графики и диаграммы). Диссертация состоит из введения, трех глав собственных данных, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя и приложения. Список литературы включает 238 источника, в том числе 170 отечественных и 68 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на 152 белых линейных крысах - самцах линии Вистар, массой 180 - 210 г. Подробная характеристика распределения животных по группам представлена в таблице 1.

Все животные содержались в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем ГОСТ «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (1978). Исследования одобрены Локальным этическим комитетом Кировской ГМА. Ддя воспроизведения патологии печени животным вводили подкожно четыреххлористый углерод (ССЦ) в виде 66% масляного раствора в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела животного. Из эксперимента животных выводили путем декапитации под эфирным наркозом.

Таблица 1.

Общая характеристика эксперимента и распределение по группам

Серия опытов Группы животных Количество животных 12

1 .Здоровые животные 2 Контрольная (введение физ.раствора №10) 10

Л «> Й 3 § " а о Ё ° В £ >-* 3.Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 1 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

4.Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 10 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

5.0пытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 100 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

II. Модель острого гепатита (8 инъекций ССЬ) 1.Контрольная 1 (выведение из эксперимента через 1 сутки после отмены СС14) 10

2.Контрольная 2 (выведение из эксперимента через 10 суток после отмены ССЬ|) 10

3. Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 1 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки №10) 10

4. Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 10 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

5. Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 100 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

III. Модель хронического гепатита (20 инъекций СС14) 1.Контрольная 1 (выведение из эксперимента через 1 сутки после отмены ССЬ) 10

2.Контрольная 2 (выведение из эксперимента через 10 суток после отмены ССЦ) 10

3. Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 1 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

4. Опытная (внутрибрюшинно в дозе озона 10 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10) 10

5. Опытная (внутрибрюшинно ОФР в дозе озона 100 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки № 10)_

Общее количество животных

152

В работе для получения озоно-кислородной смеси использовались озонаторы «Озон-М-50» (сертификат RU.C.32.001.A. № 7452). Озонированный физиологический раствор готовили методом барботажа озоно-кислородной смесью. Концентрацию озона в растворе контролировали двумя методами: йодометрического титрования и спеюрофотометрическим (на спектрофотометре СФ-46 на длине волны 254,5 нм).

Биохимические методы. Для изучения процессов перекисного окисления липидов использовалось определение содержания малонового диальдегида (МДА) в плазме крови (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972) и содержание диеновых конъюгатов (ДК) в плазме крови крыс (Середин С.Б. с соавт., 1989, Львовская Е.И. с соавт., 1991). В мембранах эритроцитов и гомогенате печени крыс содержание МДА и ДК определяли методом, модифицированным Цапок П.И. с соавт. (1999).

Оценку интенсивности перекисного окисления производили путём измерения хемилюминесценции (ХЛ), инициированной Н202 в присутствии избытка ионов двухвалентного Fe, на хемилюминометре EMILITE EL 1105 [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Цапок П.И., Галкин А.А., 1998].

Исследовали содержание общего холестерина в плазме крови по методу Златкиса-Зака (Zlatkis A. et al., 1953) в модификации (Цапок П.И. с соавт., 1997), в эритроцитах методом в модификации (Цапок П.И. с соавт., 1999). Общие липиды плазмы крови определяли по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982). Липидную фракцию для определения общих липидов в эритроцитах экстрагировали из эритроцитарных мембран гептан-изопропаноловой смесью (Кулагин Ю.И. с соавт., 1989), методом, модифицированным Цапок П.И. с соавг. (1999). В гептановой фазе количество общих липидов определяли по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом при длине волны 540 нм.

Изучали содержание церулоплазмина модифицированным методом Ревина (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982), общего билирубина в сыворотке крови методом Йендрашика-Грофа, активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлAT) методом Райтмана - Френкеля.

Морфологические методы. Парафиновые срезы ткани печени толщиной 6-8 мкм окрашивали Суданом III для определения количества и объемной плотности жировых включений. Гистологические препараты окрашивали по методу Фельгена для изучения количества митозов в гепатоцитах. Морфометрические исследования в соответствии с принципами стереологии (Автандилов Г.Г., Яблучинский Н.И., Губенко В.Т., 1981), проводили на микроскопе Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия).

Статистические методы. Полученный цифровой материал подвергнут обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Вычисляли следующие показатели: среднюю арифметическую (М), ошибку средней (т). Для определения статистической значимости различий сравниваемых групп использовали непараметрический критерий Мапп-Whitne, учитывались результаты со степенью достоверности не ниже 95% (р<0,05). Анализ проводился с использованием стандартной программы "Microsoft Excel'" и статистических пакетов SPSS for Windows (версия 12.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние озона на процессы липопероксидации и морфофункциональные показатели печени здоровой крысы

Экспериментальные исследования показали, что курсовое введение озона в дозе 1 мкг/кг массы тела не вызывало значимых изменений показателей МДА и ДК в исследуемых биосредах, но увеличивало антиоксидантную активность в плазме крови и ткани печени крыс, повышая коэффициент Imax/S на 23%. С увеличением дозы вводимого озона (10 и 100 мкг/кг) наблюдалась активация процессов липопероксидации, которая

сопровождалась повышением уровня МДА в эритроцитах по отношению к контролю на 43,2% (р=0,027) и 70,7% (р=0,014) соответственно, а введение озона в дозе 100 мкг/кг вызывало увеличение данного показателя на 58,3% (р=0,02) в гомогенате печени крыс (рис. 1). На фоне повышения содержания МДА с нарастанием дозы озона наблюдалась тенденция к снижению содержания первичных продуктов липопероксидации - ДК (г = -0,49). Кроме того, данные изменения ДК наблюдались и в плазме крови крыс. Разнонаправленность изменений МДА и ДК можно объяснить активным расходованием последних в реакциях перекисного окисления липидов.

МДА эр МДА гом

; ОИктактные ^Контроль а Доза 1 мкг/кг ВДоза 10 мкг/кг в Доза 100 мкг/кг V

Рис. 1. Изменение МДА в эритроцитах и гомогенате печени крыс в зависимости от дозы вводимого озона.

Следует отметить, что отрицательным моментом применения высоких доз озона (100 мкг/кг), кроме активации перекисного окисления липидов, выявлено снижение активности антиоксидантной системы, которое проявилось уменьшением коэффициента 1шах/8 в плазме крови на 27,8% (р=0,042), а в гомогенате печени крыс - на 21,9% (р=0,028).

В ходе эксперимента установлено дозозависимое повышение содержания общего билирубина в плазме крови при введении озона в дозах 10 мкг/кг (22.2%, р=0,032) и 100 мкг/кг (47,3%, р=0,01), что на фоне отсутствия изменений в активности цитолитических ферментов и

церулоплазмина рассматривается нами как проявление билирубином антиоксидантных свойств. Выдвинутое предположение согласуется с данными М.И. Гульмана и Ю.С. Винника (2003), которые отмечают, что в процессе озонолиза и усиления ЛПО в клетке наряду с увеличением активности ферментов, участвующих в антиоксидантной защите (глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, супероксиддисмутаза, катадаза и др.), включаются и неферментативные антиокислительные системы.

Применение озона в дозах, обуславливающих сдвиги активности процессов ЛПО, приводит и к изменениям липидного обмена. Нами установлены дозозависимые тенденции к нарастанию содержания общих липидов в плазме крови крыс (г = +0,45) и к снижению их в эритроцитах (г =-0,54), а также к увеличению содержания общего холестерина в мембранах эритроцитов (г = +0,52), при этом статистически значимые отличия данного показателя (29,7%, р=0,049) и коэффициента ОХС/ОЛ (73,5%, р=0,048) обнаружены лишь в случаях использовании высокой дозы озона (100 мкг/кг). В целом данные изменения имеют вторичный характер, являясь неспецифической реакцией клеток на повреждение.

Морфометрический анализ ткани печени не показал значимых изменений количества и объемной плотности липидных включений. Наряду с этим, выявлено увеличение митотической активности гепатоцитов в 3,6 раза по отношению к контрольному уровню только при введении озона в дозе 1 мкг/кг, что является объективным критериев активации регенерационных процессов в печени.

Оценка токсичности тетрахлорметана в отношении перекисного окисления липидов и морфофункционального состояния печени крыс

Известно, что тетрахлорметан и продукты его метаболизма являются мембранотропными ядами (Могка М. е! а!., 2009). Следовательно, поражение тетрахлорметаном приводит к дисбалансу в системах липопероксидации и антирадикальной защиты организма. Поэтому он, обладая выраженным

прооксидантным действием, является удобной моделью для изучения процессов ЛПО (Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 1999).

В ткани печени крыс в условиях поражения СС14 нами выявлены выраженные изменения процессов ЛПО, что проявилось увеличением содержания ДК и МДА, зависящим от тяжести повреждения печени.

По нашим данным, через 10 суток после отмены гепатотоксина содержание ДК в гомогенате органа при всех вариантах токсического поражения печени снижалось до нормы, в то время как уровень МДА в нем нормализовался меньшими темпами, не достигая физиологического уровня, причем скорость снижения определялась глубиной токсического поражения печени.

Содержание ДК в плазме и эритроцитах, напротив, обратно коррелировало со степенью тяжести токсического поражения печени. Статистически значимое снижение уровня данного параметра в плазме крови регистрировали при моделировании как острого, так и хронического гепатита на 60,9% (р=0,021) и на 76% (р=0,01) соответственно. Через 10 суток после создания модели хронического гепатита в эритроцитах восстановления содержания ДК не происходило, оставалось сниженным на 77,9% (р=0,006).

Результаты исследований хемилюминесценции плазмы крови в динамике токсического гепатита показали увеличение интенсивности максимальной фотовспышки и светосуммы общей хемилюминесценции, снижение коэффициента Imax/S с достоверными изменениями при хроническом гепатите. В целом обнаруженные изменения показателей ЛПО в исследуемых биосредах зависели от тяжести токсического поражения тетрахлорметаном.

Нами установлено, что действие тетрахлорметана, приводящее к дозозависимой активации ЛПО, дополнительно стимулирует неферментное звено антиоксидантной системы, представленное, в частности, церулоплазмином. На это указывает значимое увеличение содержания

церулоплазмина в плазме крови при хроническом гепатите в 4,1 раза (р=0,004), что носит компенсаторный характер вследствие снижения активности СОД и каталазы, развивающихся в условиях экспериментального токсического гепатита (Конторщикова К. Н., Солопаева И. М., 1996). Важно, что церулоплазмин может защищать липидсодержащие структуры клеток от супероксидных радикалов, действуя как быстрый «циркулирующий» антиоксидант, и имеет сопряженный с СОД механизм антиоксидантной защиты (Логинов А. С., Матюшин Б. Н., 1999).

В условиях токсического поражения тетрахлорметаном через 1 сутки после его отмены наблюдается значимое увеличение содержания общего билирубина в плазме крови крыс с максимальным значением при остром гепатите. К 10 суткам содержание билирубина в плазме крови снижалось, но статистически значимо превышало норму. Многие авторы отмечают, что билирубин обладает антиоксидантными свойствами, и повышение его уровня у больных с гепатитами является компенсаторной реакцией, направленной на усиление репарационных процессов печени и снижение патогенного эффекта токсичных продуктов липопероксидации (Блюгер А.Ф., Дудник Л.Б., 1985; Чиркин А.А., 2002; Clark J.E et al., 2000; Otani К. et al., 2001). Это подтверждает наличие обратной зависимости между содержанием общего билирубина и ДК плазмы крови.

В плазме крови крыс при интоксикации тетрахлорметаном наблюдали увеличение активности маркеров цитолиза (АлАТ и АсАТ). Повышенную активность ферментов отмечали через 1 сутки после отмены введения токсического агента с максимумом в условиях хронического гепатита. Установлено, что содержание общего билирубина и активность цитолитических ферментов зависели от степени тяжести интоксикации.

Анализ показателей процессов ЛПО в условиях поражения ССЬ выявил изменения липидного обмена со стороны плазмы и эритроцитов, которые связаны с изменениями процессов липопероксидации. Так, нарастание

уровня общих липидов в плазме крови определялось тяжестью смоделированной патологии, причем через 1 сутки после отмены СС14 значимые изменения выявлены уже при остром гепатите. Через 10 суток на модели хронического гепатита уровень показателя снижался, не достигая нормы (р=0,016). Это согласуется с данными К.Н. Конторщиковой и И.М. Солопаевой (1996), которые на фоне аналогичного токсического поражения тетрахлорметаном выявили увеличение содержания общих липидов в сыворотке крови крыс. А.Ф. Блюгер, Л.Б. Дудник (1985) отметили схожую динамику параметра у пациентов с острыми гепатитами, коррелирующую с тяжестью заболевания. На модели хронического гепатита через 1 сутки после отмены СС14 в эритроцитах крыс также обнаружено увеличение содержания общих липидов. Уровень общего холестерина и коэффициент ОХС/ОЛ эритроцитов в случае острого гепатита значимо нарастали.

Морфологическое исследование ткани печени через 1 сутки после отмены тетрахлорметана выявило увеличение митотической активности гепатоцитов во всех опытных группах животных с максимумом, соответствующим острому гепатиту, что является ответной реакцией организма на острое повреждение. Через 10 суток индекс митотической активности снижался, кроме животных с хроническим гепатитом, у которых он резко увеличивался. Динамика митотической активности коррелировала с изменениями содержания общего билирубина в плазме и общего холестерина в эритроцитах. Установлено, что количество и объемная плотность липидных включений зависели от тяжести поражения тетрахлорметаном с максимальным увеличением при хроническом гепатите.

В целом, введение тетрахлорметана вызывает выраженные дозозависимые нарушения структурно-функционального состояния печени, триггерным механизмом которых является окислительный стресс.

Коррекция тетрахлорметановой интоксикации озоном

Установлено, что на модели острого токсического гепатита введение озона в дозе 1 мкг/кг массы тела вызывало снижение интенсивности максимальной фотовспышки в гомогенате печени на 23% (р=0,035), светосуммы ХЛ в плазме крови и гомогенате печени крыс на 48,7% (р=0,004) и на 26,4% (р=0,002) соответственно, увеличение коэффициента 1тах/8 в плазме крови крыс на 73,9% (р=0,017), в гомогенате печени на 42,3% (р=0,042). Таким образом, это можно рассматривать как позитивный эффект, отражающий снижение процессов ЛПО и нарастание антиоксидантного потенциала относительно животных контрольной группы (рис. 2).

Интактные Контроль Доза 1 Доза 10 Доза 100

____________мкг/кг____мкг/кг мкг/кг

и I тах/Э плазмы □ I тах/Э гомогената печени

Рис. 2. Изменение коэффициента 1тах/8 у крыс при введении озона в условиях острого гепатита

Введение озона в дозе 10 мкг/кг крысам в данной модели токсического поражения менее обосновано, так как, наряду с признаками снижения оксидативного стресса (снижение содержания МДА на 25,6% (р=0,045) и ДК на 36,6% (р=0,009) в эритроцитах, светосуммы ХЛ в плазме крови на 48,2% (р=0,003), общего билирубина на 25,3% (р=0,043), увеличение коэффициента 1шах/8 в плазме крови крыс на 71,3% (р=0,020)), отмечались и негативные эффекты (увеличение светосуммы хемилюминесценции на 59,8% (р=0,003) в

гомогенате печени) (рис. 2). Это указывает на то, что при остром токсическом гепатите данная доза озона является предельно допустимой.

Дальнейшее увеличение дозы озона (100 мкг/кг) приводило к формированию недостаточности антиоксидантной системы (снижению коэффициента 1шах/5 в плазме и гомогенате печени в среднем на 25%) и гиперактивации процессов ЛПО, что проявлялось увеличением МДА на 41,3% (р=0,036) в гомогенате печени, увеличением светосуммы ХЛ на 53,6% (р=0,012) и увеличением общего билирубина в 2 раза (р=0,004).

Рассматривая механизм саногенетического действия озона в данном случае, можно предположить, что умеренная стимуляция про- и антиоксидантной системы низкими дозами озона (до 10 мкг/кг), не вызывая значимой активации ПОЛ, приводит к нарастанию активности АОЗ преимущественно за счет ее ферментативного звена - СОД и каталазы [Конторщикова К. Н., Солопаева И. М., Перетягин С. П. (1996)]. Превышение максимально допустимой дозы озона (100 мкг/кг) инициирует выраженную активацию процессов ЛПО, сопровождающуюся истощением резервов АОС.

Применение озона в качестве лечебного фактора на модели хронического гепатита оказывало положительное действие, причем наибольшим позитивным эффектом обладали дозы 10 и 100 мкг/кг массы тела. Он проявлялся снижением активности процессов ЛПО с максимальным эффектом при дозе 100 мкг/кг, на что указывает падение уровня ДК в плазме на 89,1% (р=0,004) и МДА в эритроцитах на 33,6% (р=0,016) и гомогенате печени на 37,2% (р=0,004), снижением активности максимальной фотовспышки на 43,5% (р=0,037) и светосуммы ХЛ на 18,4% (р=0,037) в плазме крови и на 21,6% (р=0,004) в гомогенате печени крыс. Кроме того, отмечалось увеличение активности АОС, включающее нарастание коэффициента 1тах/8 в гомогенате печени на 26,9% (р=0,038) и снижение концентрации церулоплазмина в плазме крови на 31,3% (р=0,006).

С учетом того, что сдвиги липидного метаболизма, возникающие при интоксикации тетрахлорметаном, ассоциированы с изменениями уровня ПОЛ, динамика их коррекции озоном аналогична. В частности, при озонотерапии острого токсического гепатита значимые изменения выявлены лишь в эритроцитах. Использование низких доз озона (1 и 10 мкг/кг) позволило восстановить уровень ОХС до контрольных значений. Введение озона в дозе 100 мкг/кг, напротив, способствовало повышению содержания ОХС в мембранах эритроцитов крови на 41,9% (р=0,012).

На модели хронического гепатита введение озона в дозах 1 и 10 мкг/кг вызывало снижение содержания ОХС в плазме и эритроцитах на 35,3 % (р=0,008) и 29,3% (р=0,006) к контролю соответственно, а при введении 100 мкг/кг озона данный показатель увеличивался, приближаясь к норме. Нами установлено, что все изучаемые дозы озона способствовали нормализации содержания ОЛ в плазме крови. В эритроцитах крыс всех опытных групп содержание ОЛ снижалось, кроме животных, которым вводили 100 мкг/кг озона, где данный показатель оставался повышенным на 38,7% (р=0,004).

Введение озона в дозе 100 мкг/кг на модели острого гепатита вызывало резкое увеличение в 2 раза (р=0,004) содержания общего билирубина в плазме крови, при этом динамика цитолитических ферментов отсутствовала. Следует отметить, при введении озона в дозе 1 мкг/кг крысам с острым гепатитом нами также выявлено увеличение активности АсАТ на 26,8% (р=0,023), коррелирующее с митотической активностью гепатоцитов и свидетельствующее о повышении проницаемости мембран гепатоцитов (Колесова О. Е. с соавт., 1995). В условиях хронического гепатита применение озона не вызывало значимых сдвигов содержания общего билирубина в плазме крови, повышенного у животных контрольной группы в данной модели. При этом активность цитолитических ферментов снижалась до нормы и не зависела от дозы озона.

По данным морфометрии, введение озона крысам с острым гепатитом не вызывает значимых изменений количества нейтрального жира и объемной плотности липидных включений, но поддерживает на высоком уровне митотическую активность гепатоцитов. При хроническом гепатите митотическая активность гепатоцитов снижалась, хотя и оставалась в несколько раз выше нормы. Количество и объемная плотность липидных включений снижались практически до полной нормализации при введении озона в дозе 100 мкг/кг

ГГ 0,75

- 0,6

ч

I х

В 0,45

л -

«8, о,з ! ^ ! £

1 Ь 0,15

□ Интактные О Контроль И Дом 1 мкг/кг 0 Доза 10 мкг/кг В Доза 100 мкг/кг

Рис. 3. Количество липидных включений в зависимости от дозы озона

В целом, резюмируя результаты проведенных исследований и сведений литературы, схему влияния озона на молекулярные механизмы развития патологии печени при поражении тетрахлорметаном можно представить следующим образом (рис. 4). Так, по данным наших экспериментов, саногенетический механизм действия озона проявляется активацией антиоксидантной системы с вовлечением ее неферментативного звена, обеспечивающей коррекцию оксидативного стресса. Кроме того, происходит устранение энергодефицита за счет стимуляции утилизации липидов, о чем косвенно свидетельствует уменьшение жировой дистрофии. Морфологическим результатом этого является активация процессов регенерации - увеличение митотической активности гепатоцитов.

(рис. 3).

| активности АОС -

торможение и распад синтеза белковых компонентов: СОД, КТ, ГП. ГР

Угнетение митохондриального окисления и фосфорилирования

Угнетение цикла Кребса, | р - окисления ЖК, НАД-зависимых оксдаз (дегидрогеназ), ¿ФАД-зависимых сукцинатоксидаз)

Увеличение анаэробного гликолиза

| активности

лпо

Повреждение мембран лизосом и митохондрий. Активация фосфолипаз, протинкиназ, нуклеаз, и т.д.

Рис. 4. Влияние озона на молекулярные механизмы повреждения печени

выводы

1. Низкие дозы озона (1 мкг/кг) у здоровых животных не изменяют уровень процессов липопероксидации в плазме и эритроцитах, гомогенате печени, стимулируют антиоксидантную систему (увеличивается коэффициент 1тах/8 в плазме и ткани печени на 28,9% и 17,6%) и митотическую активность гепатоцитов в 3,6 раза. Увеличение дозы озона инициирует процессы липопероксидации, снижая антиоксидантную активность и формируя умеренный оксидативный стресс при дозе озона 100 мкг/кг.

2. Введение тетрахлорметана вызывает выраженные дозозависимые нарушения структурно-функционального состояния печени (интенсификацию липопероксидации, угнетение резервов антиоксидантной системы, сдвиги липидного обмена, нарастание билирубина и активности трансаминаз, резкое увеличение митотической активности печени, количества липидных включений и их объемной плотности), триггерным механизмом которых является окислительный стресс.

3. Экспериментальная терапия острого токсического гепатита озоном в низких дозах (1 мкг/кг) не вызывала значимых изменений липопероксидации, но сопровождалась активацией антиоксидантной системы (увеличение коэффициента 1шах/8 в плазме и ткани печени на 73,9% и 41,7% соответственно) и высокой митотической активностью гепатоцитов.

4. Высокие дозы озона (100 мкг/кг) на модели осгрого гепатита увеличивали уровень МДА на 41,3% и показатель светосуммы хемилюминесценции на 53% в ткани печени крыс. На этом фоне снижалась антиоксидантная активность в ткани печени (1шах/8) на 60,7%, увеличивались общий билирубин в 2 раза, общий холестерин на 41,9% и коэффициент ОХС/ОЛ эритроцитов на 56,4%.

5 При экспериментальном хроническом гепатите введение озона в дозе 100 мкг/кг оказывало саногенетический эффект: падение уровня МДА в эритроцитах и гомогенате печени (на 33,6 и 37,2% соответственно),

21

уменьшение светосуммы хемилюминесценции и увеличение антиоксидантной активности (1тах/8) в гомогенате печени (на 21,6 и 26,9% соответственно), снижение количества и объёмной плотности жировых включений вплоть до полной нормализации с сохранением повышенной митотической активности гепатоцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оценка уровня церулоплазмина, общего билирубина и общих липидов в плазме и эритроцитах крови, а также коэффициента ОХС/ОЛ эритроцитов крови может быть использована для индивидуализации и контроля безопасности озонотерапии.

2. Экспериментально обоснована целесообразность применения низких (1 мкг/кг) доз озона при остром токсическом гепатите, а при хроническом гепатите - более высоких доз озона (100 мкг/кг).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Большухин С.Ю. Растворимость озона в физиологическом растворе / Большухин С.Ю., Кудрявцев В.А. // Мат. VII итоговой научно-практ. конф. студентов и молодых ученых КГМА. Киров, 2001. - С. 4 - 5.

2. Большухин С.Ю. Влияние озона на содержание продуктов перекисного окисления липидов и антиоксидантную активность в плазме крови в эксперименте / Большухин С.Ю., Кудрявцев В.А., Цапок П.И., Косых A.A., Козвонин В.А. // Международный медицинский журнал. - 2003. -Приложение «Озонотерапия». - С. 43.

3. Большухин С.Ю. Регенерационная терапия: экспериментальное обоснование / Косых A.A., Цапок П.И., Кудрявцев В.А., Зубков И.В, Козвонин В.А., Большухин С.Ю. // Вятский медицинский вестник. - 2003. -№3. - С. 60-65^

4. Большухин С.Ю. Влияние озона на содержание продуктов ПОЛ и АОА в плазме крови на различных стадиях патологического процесса / Кудрявцев В.А., Косых A.A., Цапок П.И., Большухин С.Ю. // Мат. научно-практ. конф. студентов и молодых ученых. Йошкар-Ола, 2003.- С. 100.

5. Большухин С.Ю. Влияние озона на репарационные процессы в печеночной ткани / Козвонин В.А., Большухин С.Ю. // Сб.: «Материалы научной сессии». - Киров, 2004,- С. 88-90.

6. Большухин С.Ю. Влияние озона на регенерацию нормальной и патологически измененной печени / Козвонин В.А., Арасланов С.А.,

Большухин С.Ю. // Мат. научн. конф. «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии». СПб, 2004. - С. 114-115.

7. Большухин С.Ю. Влияние озонотерапии на выраженность жировой дистрофии и количество соединительнотканных элементов в патологически измененной печени / Козвонин В.А., Большухин С.Ю., Арасланов С.А. // Сб. научн. тр. «Актуальные проблемы морфологии» Красноярск: Изд. КрасГМА, 2004,- С. 135-136.

8. Большухин С.Ю. Применение озонотерапии при циррозе печени в эксперименте / Арасланов С.А., Козвонин В.А., Большухин С.Ю. // Мат. Межд. научн. конф., поев. 100-летию со дня рождения академика П.Я. Герке «Фундаментальные проблемы морфологии». Минск, 2004. - С. 12-13.

9. Большухин С.Ю. Влияние озонотерапии на выраженность жировой дистрофии и количество соединительнотканных элементов в патологически измененной печени / Козвонин В.А., Большухин С.Ю., Арасланов С.А. // Тез. докл. Всеросс. научно-практ. конф. с межд. участием «Эфферентная, иммунокорригирующая и интенсивная терапия в клинической практике». - Ижевск: ИжГМА, 2004. - С. 130-132.

10. Большухин С.Ю. Влияние озона на резорбцию соединительной ткани патологически измененной печени / Козвонин В.А., Арасланов С.А., Болыпухнн С.Ю. // Морфологические ведомости. -2004. - № 3-4. - С. 105-106.

11. Большухин С.Ю. Влияние озона на показатели перекисного окисления липидов в условиях хронической интоксикации четыреххлористым углеродом / Большухин С.Ю., Галкин A.A., Кудрявцев В.А., Косых A.A. // Нижегородский медицинский журнал. Приложение «Озонотерапия». -2005. - С.31-32.

12. Большухин С.Ю. К вопросу озонирования растворов натрия хлорида / Кудрявцев В.А., Большухин С.Ю. // Нижегородский медицинский журнал. Приложение «Озонотерапия». - 2005. - С.44 — 45.

13. Большухин С.Ю. Влияние озона на соединительную ткань нормальной и патологически измененной печени / Косых A.A., Кудрявцев В.А., Козвонин В.А., Большухин С.Ю. //Фундаментальные исследования. -2006.-№7,- С.38-41.

14. Большухин С.Ю. Влияние озона на процессы липопероксидации и биополимеры печени в норме и при патологии / Кудрявцев В.А., Большухин С.Ю., Косых A.A., Цапок П. И. // Казанский медицинский журнал. - 2007,- T.LXXXVIII.- №4,- С.14-16.

15. Большухин С.Ю. Влияние озона на жировой обмен при поражении печени тетрахлорметаном / Косых A.A., Козвонин В.А., Большухин С.Ю. // Казанский медицинский журнал. - 2007.- T.LXXXVIII.-№4.-С.16-17.

16. Большухин С.Ю. Эпителио-соединителыютканные взаимоотношения в печени в процессе озонотерапии хронического гепатита и цирроза в эксперименте / Косых A.A., Кудрявцев В.А., Козвонин В.А.,

Большухин С.Ю. // Мат. III Межд. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов н/Д, 2009,- С. 90.

17. Большухин С.Ю. Реакция соединительной ткани на резекцию и введение озона / Косых A.A., Козвонин В.А., Кудрявцев В.А., Большухин С.Ю. // Revista Espaniola de Ozonoterapia.- 2009. - Vol.3, №1-. - С. 29-32.

18. Большухин С.Ю. Экспериментальное изучение состояния липопероксидации при введении озона в условиях острой и хронической интоксикации / Большухин С.Ю. Косых A.A., Перетягин С.П., Мартусевич A.A. // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9. - С. 15-20.

19. Большухин С.Ю. Экспериментальная токсикология тетрахлорметана: оценка влияния на систему липопероксидации / Перетягин С.П., Большухин С.Ю., Мартусевич А.К. // Теоретическая и прикладная экология. - 2012. - № 3 - С. 55-60.

20. Большухин С.Ю. Изучение дозозависимых эффектов озона в отношении процессов липопероксидации и антиоксидантной системы крови и печени крыс / Перетягин С.П., Большухин С.Ю., Мартусевич A.A., Мартусевич А.К. // Медицина и образование Сибири (электронный журнал) - 2012. - № 6.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДК - диеновые конъюгаты МДА - малоновый диальдегид ОЛ - общие липиды

ОФР - озонированный физиологический раствор ОХС - общий холестерин

ОХС/ОЛ - коэффициент отношения общего холестерина к общим липидам I шах - интенсивности максимальной фотовспышки хемилюминесценции 8 - интенсивность общей светосуммы хемилюминесценции

Подписано в печать Усл. печ. л. 1 Бумага офсетная. Заказ № Тираж 100 экз.

Текст напечатан с оригинал макета, предоставленного автором.