Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Ранние постреанимационные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга: патогенетическая значимость и коррекция

На правах рукописи

РАЗУМОВ ПАВЕЛ СЕРГЕЕВИЧ

РАННИЕ ПОСТРЕАНИМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЦЕССОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ В КОРЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И КОРРЕКЦИЯ

(экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК-2004

Работа выполнена в Кемеровской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Кемерово)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Евтушенко Александр Яковлевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Колосова Наталья Гориславовна

доктор медицинских наук, профессор

Шарапов Виктор Иванович

Ведущая организация:

Омская государственная медицинская академия Министерства здраво -охранения Российской Федерации (г. Омск)

диссертационного совета Д 001.048.01 в Научном центре клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117, Тел./факс 8 (3832) 33-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Автореферат разослан_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Кутина С. Н.

Защита состоится.

2004 г. в

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ишемические и реперфузионные повреждения головного мозга являются одним из ведущих патогенетических факторов в развитии постреанимационной энцефалопатии, соответственно, инвалидизации и летальности после перенесенного терминального состояния [Алексеева Г.В., 1989,2002; Кирсанова А. К., 1996; Кожура В. Л., 2000, 2003; Семченко В.В. и соавт., 1999; Brymer С. et al., 1993].

В качестве одного из механизмов ишемических и реперфузионных повреждений нейронов рассматривается неконтролируемая активация пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) [Хаспеков Л.Г., 1992, 1993; Долгих В.Т. и соавт., 2000; Разумов А.С. и соавт., 2001, 2003], что предопределяет необходимость применения антиоксидантных препаратов.

Однако не все авторы наблюдали увеличение липопероксидацион-ной активности при ишемии и реперфузии головного мозга [Викторов И. В. и соавт., 1995; Кализатова А. С. и соавт., 2000; Chan P. H. et al., 1998; Hall E. D. et al., 1993], а подавление активности свободно-радикальных процессов в ряде случаев приводило к уменьшению выживаемости животных с экспериментальными нарушениями мозгового кровообращения [Федорова Т. Н., 1995; Halliwell В., 1992]. Сложившаяся ситуация усугубляется и трудностью интегральной оценки состояния процессов липопероксидации [Дубинина Е. Е., 1998; Зайцев В. Г., Закревский В. И., 1998; Клычникова Е. В. и соавт., 2000; Федорова Т. Н., 2000], особенно в условиях быстро изменяющихся гемодинамических параметров, что имеет место при терминальных состояниях. Исходя из этого, становится очевидным, что одним из условий повышения эффективности терапевтических мероприятий при терминальных состояниях является разработка адекватных способов оценки интенсивности процессов ПОЛ и патогенетически обоснованной их коррекции.

Цель исследования. Оценить в эксперименте значение ранних постреанимационных изменений процессов липопероксидации в коре головного мозга в развитии постреанимационной болезни и способы их коррекции.

Задачи исследования

1. Изучить процессы липопероксидации в коре головного мозга кошек при умирании от пролонгированной кровопотери и в раннем постреанимационном периоде.

2. Оценить в сравнительном аспекте влияние фридокса и эмоксипина in vitro на ишемические и ранние постреанимационные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга.

3. Сравнить влияние антиоксидантных препаратов и ограничения репер -фузии на ранние постреанимационные изменения процессов липоперок-сидации в коре головного мозга, восстановление жизнедеятельности и выживаемость животных, перенесших клиническую смерть.

Научная новизна исследования. Впервые произведена оценка изменений про- и антиоксидантной активности в коре головного мозга при умирании и в раннем постреанимационном периоде с помощью определения динамических показателей липопероксидации. Установлено, что при умирании и последующем оживлении происходит активация прооксидант-ных систем, истощение систем антиоксидантной защиты и субстратов ли-попероксидации. Показано, что эти изменения in vivo не сопровождаются накоплением продуктов ПОЛ в тканях и выявляются только in vitro при инкубации гомогенатов.

Установлено, что фридокс (6 мг/кг) и эмоксипин (7 мг/кг) эффективно ограничивают in vitro и in vivo ишемическую и реперфузионную активацию процессов липопероксидации в коре головного мозга.

Показано, что ограничение избыточной реперфузии предупреждает чрезмерную активацию процессов липопероксидации при возобнов-

лении кровообращения, в результате чего нормализация соотношения про- и антиоксидантной активности происходит быстрее, чем при использовании в комплексе реанимационных мероприятий антиокси-дантных препаратов фридокса и эмоксипина.

Установлено, что ограничение избыточной реперфузии является более эффективным способом коррекции ранних постреанимационных нарушений процессов липопероксидации - выживаемость животных увеличивается с 29% до 63%, тогда как при использовании антиоксидантных препаратов - до 43% (фридокс) и 53% (эмоксипин).

Теоретическая и практическая значимость. Показана патогенетическая значимость избыточной активации процессов липопероксидации в коре головного мозга в развитии постреанимационной болезни — нарушается восстановление функций ЦНС.

Показано, что дополнительное определение динамических показателей липопероксидации — накопления продуктов ПОЛ в инкубируемых го-могенатах, позволяет повысить объективность и информативность оценки нарушений соотношения про- и антиоксидантной активности в тканях при быстро изменяющихся параметрах гемодинамики.

Положительные результаты фармакологической и гемодинамической коррекции ранних постреанимационных нарушений процессов липоперок-сидации в коре головного мозга являются патогенетическим обоснованием для разработки способов повышения эффективности реанимационных мероприятий и защиты головного мозга при экстремальных и терминальных состояниях.

Работа (№ госрегистрации 01.2.00 100462 от 01.01.17) выполнена в рамках проблем, координируемых ПК 33.05 «Экстремальные и терминальные состояния» (МНС № 33 РАМН) и ПК 53.02 «Нормальная и патологическая физиология» (МНС № 53 СО РАМН).

Основные положения, выносимые на защиту

1. При умирании и последующем оживлении активация прооксидантных систем в коре головного мозга сопровождается мобилизацией и быстрым истощением систем антиоксидантной защиты, развивается дефицит субстратов ПОЛ. Эти изменения не проявляются накоплением продуктов ПОЛ in vivo и выявляются только in vitro - при инкубации гомогенатов коры головного мозга в течение двух часов.

2. Включение в комплекс реанимационных мероприятий фридокса (6 мг/кг) или эмоксипина (7 мг/кг) достаточно эффективно ограничивает, а уменьшение избыточной реперфузии - предупреждает чрезмерную активацию процессов липопероксидации в коре головного мозга в первые минуты после возобновления кровообращения и истощение антиокси-дантных систем и субстратов ПОЛ в динамике постреанимационного периода, в результате улучшается восстановление функций ЦНС и повышается выживаемость животных, перенесших клиническую смерть.

3. Предупреждение избыточной активации процессов липопероксидации в первые минуты после оживления с помощью ограничения избыточной реперфузии является более адекватным способом повышения эффективности реанимационных мероприятий по сравнению с ограничением чрезмерной липопероксидации с помощью антиоксидантных препаратов.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в учебный процесс по темам «Обмен липидов», «Биологическое окисление» на кафедре биохимии и по теме «Экстремальные и терминальные состояния» на кафедрах патофизиологии, анестезиологии и реаниматологии Кемеровской государственной медицинской академии, а также в научно-исследовательскую работу ЦНИЛ, кафедр биохимии и патофизиологии.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследования доложены и обсуждены на: Всероссийских научно-практических конференциях «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 1998, 2001, 2002); Международном симпозиуме «Теоретические и клинические проблемы современной реаниматологии» (Москва, 1999); VIII и X Российско-Японских международных медицинских симпозиумах (Благовещенск, 2000; Якутск, 2003); Российской научной конференции «Фундаментальные науки - практике здравоохранения» (Омск, 2001); II Российском конгрессе по патофизиологии «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 2002); IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы обезболивания и интенсивной терапии тяжелой черепно-мозговой травмы» (Новокузнецк, 2003); научно-практической конференции «Сочетанная шо-когенная травма в аспекте концепции травматической болезни» (Санкт-Петербург, 2003), Международной конференции «Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению нейродегенеративных заболеваний» (Новосибирск, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 14 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 147 отечественных и 68 зарубежных источников. Диссертация содержит 6 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками.

Личный вклад. Сбор, обработка и анализ материала проведены лично автором. Эксперименты с анализом влияния коррекции постреанимационных нарушений липопероксидации на выживаемость выполнены совместно с А.С. Разумовым, Ю.А. Пегановой, Е.И. Паличивой.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 303 беспородных кошках обоего пола массой 2,2 - 4,1 кг. Общая характеристика экспериментального материала представлена в таблице 1.

Таблица I

Распределение экспериментального материала

№ Раздел исследования Количество животных

Опыт Контроль

1 Изучение ишемических и постреанимационных изменений липопероксидации в коре головного мозга 27 18

2 Изучение влияния фридокса и эмоксипина на ишемические и постреанимационные изменения про- и антиоксидантной активности в коре головного мозга in vitro

3 Влияние фридокса на постреанимационные изменения липопероксидации в коре головного мозга* и результаты реанимации" 9+54** 9+83

4 Влияние эмоксипина на постреанимацяонные изменения липопероксидации в коре головного мозга и результаты реанимации 9+22"

5 Влияние ограничения избыточной реперфузии на постреанимационные изменения липопероксидации в головном мозге и результаты реанимации 13*+40**

6 Оценка дозозависимых эффектов фридокса in vitro 19

ВСЕГО: 303

Наркотизированное животное (этаминал натрия, 45 мг/кг внутри-брюшинно) фиксировали на операционном столе, интубировали трахею, выделяли и катетеризировали левую бедренную артерию (кровопускание и реинфузия, измерение артериального давления) и вену (регистрация центрального венозного давления), правую бедренную вену (введение гепарина - 500 ЕД/кг, взятие крови). После завершения подготовительной части эксперимента и 30-минутного периода стабилизации производили регистрацию исходных показателей.

Клиническую смерть (5 минут) вызывали пролонгированным кровопусканием из бедренной артерии. С этой целью, используя принцип гемо-баростата Уиггерса, предварительно воспроизводили геморрагическую гипотензию (АД 50 мм рт. ст.) и через 30 минут осуществляли смертельное обескровливание. Реанимационные мероприятия включали в себя внутри-артериальное нагнетание выпущенной крови и искусственное дыхание в режиме умеренной гипервентиляции, при необходимости проводили непрямой массаж сердца. В качестве контроля использованы животные, перенесшие аналогичные оперативные вмешательства, наркоз и фиксацию без моделирования терминального состояния.

Антиоксидантные препараты фридокс (тирилазада мезилат) или эмоксипин (3-окси-6-метил-2-этилпиридин) вводили во время проведения реанимационных мероприятий в составе реинфузируемой крови из расчета 6 и 7 мг/кг соответственно.

Для оценки роли реперфузии в развитии постреанимационных нарушений ПОЛ выполнены эксперименты с ограничением гиперперфузии в рамках ранее установленного адаптивного диапазона - увеличение не менее чем на 10% и не более чем в 2,4 раза от исходных значений (Будаев А.В., 1996). С этой целью в течение первой мшгуты после возобновления кровообращения исключали из циркуляции часть крови до стабилизации АД на уровне 80-85% от исходного (гемобаростат Уиггерса) и поддерживали его в течение 30 минут. Первоначально объем крови, поступающей в резервуар, увеличивался, затем кровь постепенно возвращалась в сосудистое русло. Если к 30-й минуте в резервуаре еще оставалась кровь, то ее, умеренно повышая давление в гемобаростате, вводили в кровеносное русло животного.

В экспериментах с анализом выживаемости за животными наблюдали в течение 10 суток после реанимации, оценивая характер видимого неврологического восстановления по модифицированной 100-бальной шкале Todd М.М. et al. (Евтушенко А.Я., 1989).

Определение показателей липопероксидации. Изъятие головного мозга для оценки интенсивности ПОЛ осуществляли на 5-й минуте клинической смерти, 5-й и 180-й минуте постреанимационного периода, то есть во время полной ишемии, гиперперфузии и гипоперфузии соответственно. Мозг отмывали от крови 0,89% раствором хлорида натрия (0-4°С) с помощью пульсирующей перфузии через катетеры, введенные в общие сонные артерии. Выделяли серое вещество передней супрасильвиевой извилины и готовили гомогенаты (1/15 М фосфатный буфер, рН 7,4; разведение 1:9) на льду в холодовой комнате (0-4°С).

Анализ различных способов оценки интенсивности липопероксида-ции показал, что определение концентрации продуктов ПОЛ или активности антиоксидантных ферментов не всегда позволяет выявить и адекватно оценить начальные изменения липопероксидации при острых нарушениях кровообращения. Вместе с тем, при изучении накопления продуктов ПОЛ в гомогенатах во время их инкубации можно выявить те изменения про- и антиоксидантной активности, которые в силу своей незначительности или действия различных факторов не проявляют себя изменениями концентрации продуктов ПОЛ in vivo (Архипенко Ю.В., Диденко В.В., 1989; Львова С.П. и соавт., 1993). Поэтому в данной работе, наряду с определением концентрации продуктов ПОЛ и активности СОД в неинкубируемых гомоге-натах, была изучена динамика их накопления при инкубации гомогенатов в течение двух часов при 37°С.

Для определения концентрации продуктов ПОЛ выбран тест с тио-барбитуровой кислотой (ТБК). Оптическую плотность измеряли в бута-нольном экстракте при длине волны 535 нм (спектрофотометр СФ-46). Рассчитывали концентрацию ТБК-активных продуктов (ТБК-ап) и дискретные значения скорости их накопления в инкубируемых гомогенатах.

Активность СОД в гомогенатах определяли по степени блокирования восстановления нитросинего тетразолия (НСТ):

% блокирования восстановления НСТ (усл. ед.) = [CEIIU,-Eon)/ElMl х 100%, где Е-м экстинкция холостой пробы (без гомогената),

Е«п - экстинкция опытной пробы (гомогенат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 540 нм.

Статистический анализ результатов исследования выполнен с использованием пакета программ «STATISTICA 5.5». Рассчитывали среднюю арифметическую величину (М) и ошибку средней (т). Выбор критерия оценки значимости парных различий проверяли на основании соответствия формы распределения нормальному. Нулевую гипотезу отвергали в случае р<0,05. Оценку разности между генеральными долями (частотами), проводили с помощью t-критерия Стьюдента и Т-критерия Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга при умирании и в раннем постреанимационном периоде

Установлено, что при умирании от пролонгированной кровопотери накопление продуктов липопероксидации (ТБК-ап) в коре головного мозга было весьма незначительным и к 5-й минуте клинической смерти (2 серия) их концентрация увеличивалась по сравнению с таковой у контрольных животных (1 серия) в среднем на 12% (табл. 2). Однако с возобновлением кровообращения содержание продуктов ПОЛ увеличивалось значительнее и через 5 минут реперфузии (3 серия) превышало таковое на 5-й минуте клинической смерти в среднем на 30%.

При последующей инкубации накопление ТБК-ап в гомогенатах ишемического мозга (5-я минута клинической смерти) было больше, чем в контроле. Через 5 минут после оживления, несмотря на увеличение содержания продуктов ПОЛ in vivo, их накопление в инкубируемых гомогенатах уменьшалось, в среднем на 30% по сравнению с 5-й минутой клинической смерти и на 15% по сравнению с контролем.

Таблица 2

Динамика концентрации ТБК-ап в инкубируемых гомогенатах коры головного мозга (нмоль/мл, М ± т)

Серия lies. (in vivo) Время инкубации (мин)

15 30 60 90 120

1 (п=9) 0,94 ±0,07 2,50 ±0,28 5,26 ±0,35 10,45 ±0,38 13,42 ±0,37 15,34 ±0,56

2 (п=9) 1,05 ±0,10 3,78 ±0,22* 6,73 ±0,28* 12,95 ±0,36* 16,79 ±0,31* 18,59 ±0,58*

3 (п=9) 1,39 ±0,08* 3,48 ±0,23* 7,35 ±0,27* 13,65 ±0,37* 17,03 ±0,32* 19,57 ±0,64*

4 (п=9) 1,43 ±0,09 3,66 ±0,20 6,94 ±0,24 12,03 ±0,27 14,36 ±0,30 15,60 ±0,38

5 (п=9) 1,52 ±0,08 3,20 ±0,22 6,84 ±0,31 10,86 ±0,30 13Д6 ±0,27 14,08 ±0,33

Примечание:

I серия - контроль для 5-й минуты клинической смерти и 5-й минуты ПРП (аналогичные наркоз и фиксация без моделирования терминального состояния); 2 серия - 5-я минута клинической смерти; 3 серия - 5-я минута ПРП; 4 серия - контроль для 3-го часа ПРП (аналогичные наркоз и фиксация без моделирования терминального состояния); 5 серия — 3-й час ПРП. * - р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем (по критерию Вил-коксона).

Полученные данные позволяет заключить, что при умирании происходит активация прооксидантных систем, которая не сопровождается адекватной мобилизацией антиоксидантной защиты. С возобновлением кровообращения прооксидантная активность еще больше возрастает, тогда, как увеличение антиоксидантной активности in vivo запаздывает и реализуется только при последующей инкубации гомогенатов - замедляется накопление продуктов липопероксидации в инкубируемых гомогенатах. Более наглядно изменения соотношения про- и антиоксидантной активности отражали изменения динамики скорости накопления продуктов ПОЛ в инкубируемых гомогенатах (рис. 1). На 5-й минуте клинической смерти стартовая скорость (первые 15 минут инкубации) увеличивалась на 75% (контроль - 0,104 нмоль/мл/мин). При этом средняя скорость (расчет за 2 часа инкубации) увеличивалась на 24% (контроль - 0,125 нмоль/мл/мин).

%

200 150

100 50

0 -,-,-,-

0-15 15-30 30-60 60-90 90-120

Время инкубации (мин)

Рис. 1. Динамика скорости накопления ТБК-ап в гомогенатах коры головного мозга (в % от соответствующих контрольных значений). К - контроль (наркоз и фиксация). А - 5-я минута клинической смерти; В - 5-я минута после оживления; С - 3-й час после оживления. Темные маркеры - р<0,05 по сравнению с контролем.

В совокупности эти изменения отражали недостаточную мобилизацию антиоксидантной защиты по сравнению с активацией прооксидантных систем. Через 5 минут после оживления стартовая скорость уменьшалась и не превышала контрольные значения более чем на 35%, т.е. проявления мобилизации антиоксидантных систем были более значительными, чем на 5-й минуте клинической смерти.

Вместе с тем средняя скорость оставалась больше контрольных значений (0,161 и 0,125 нмоль/мл/мин, соответственно), что отражало скрытую недостаточность антиоксидантной защиты. Более того, в заключительный период инкубации (90-120 мин) скорость накопления продуктов липопероксидации возрастала и превышала контрольные значения в среднем в 1,3 раза, тогда как на 5-й минуте клинической смерти уменьшалась и не отличалась от таковой в контроле.

Таким образом, выявленные изменения позволяют заключить, что возобновление кровообращения сопровождается не только выраженной активацией прооксидантных систем, но и мобилизацией антиоксидантной защиты, которая в этих условиях весьма быстро истощается.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) к 5-й минуте клинической смерти уменьшалась в среднем на 15% (контроль - 50,1 ±1,68 усл. ед) и тенденция к ее уменьшению сохранялась через 5 минут после оживления (рис. 2). %

К

А.- В*- -Л—1

Исх. 15 30 60 90 120

Время инкубации (мин)

Рис. 2. Динамика активности СОД инкубируемых гомогенатах коры головного мозга (в % от соответствующих контрольных значений). К - контроль (наркоз и фиксация); А - 5-я минута клинической смерти; В - 5-я минута после оживления; С - 3-й час после оживления. Темные маркеры - р<0,05 по сравнению с контролем.

В течение 2-х часов инкубации изменения активности СОД имели фазный характер. При этом уменьшение активности к 60-й минуте инкубации было более выраженным в гомогенатах головного мозга, изъятого на 5-й минуте после оживления по сравнению с 5-й минутой клинической смерти. При дальнейшей инкубации активность СОД повышалась, но ко 2-му часу оставалась меньше контрольных значений, что в определенной степени подтверждало мобилизацию и последующее истощение систем антиоксидантной защиты.

К 3-му часу после оживления (5 серия, табл. 2) содержание ТБК-ап в коре головного мозга незначительно превышало таковое у животных соответствующей контрольной серии. При инкубации гомогенатов скорость накопления продуктов ПОЛ первоначально (первые 15 минут) была в среднем на 25% меньше контрольных значений. В дальнейшем она повышалась (в интервалах 15-30 и 60-90 минут), однако сколько-нибудь значимо не превышала таковую в контроле, а в заключительный период (90-120мин) уменьшалась в среднем на 30% (рис. 1).

Активность СОД in vivo достоверно не отличалась от таковой в контроле (43,8+2,95 и 44,5+2,34 усл. ед. соответственно). Вместе с тем при инкубации гомогенатов она уменьшалась, особенно с 30 по 60 минуту, и, несмотря на последующее увеличение, через 2 часа оставалась меньше контрольных значений (рис. 2).

Таким образом, через 3 часа после оживления уменьшение накопления продуктов липопероксидации в инкубируемых гомогенатах происходит в условиях сохраняющейся, хотя и скрытой, недостаточности антиок-сидантной защиты. Это позволяет заключить, что к 3-му часу ПРП развивается дефицит субстратов ПОЛ вследствие повышенного их расходования при умирании и в первые минуты постреанимационного периода.

Влияние антиоксидантных препаратов и ограничения гиперперфузии на постреанимационные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга

Предварительно были изучены антиоксидантные эффекты фридокса in vitro в дозах 3, 6 и 9 мг/кг. Установлено, что при добавлении к гомоге-натам фридокса в дозах 3 и 6 мг/кг средняя скорость (расчет за 2 часа инкубации) накопления ТБК-ап уменьшалась на 15% и 25% от таковой в гомогенатах без препарата (0,20 нмоль/мл/мин). Однако дальнейшее

увеличение дозы до 9 мг/кг не сопровождалось дополнительным сколько-нибудь значимым уменьшением скорости.

Наряду с ограничением скорости накопления ТБК-ап при добавлении фридокса изменялась и ее динамика (рис. 3). В гомогенатах с фри-доксом в дозах 6 и 9 мг/кг изменения были однотипными и отличались от таковых в гомогенатах с добавлением фридокса в дозе 3 мг/кг.

Рис. 3. Дозозависимое влияние фридокса на динамику скорости накопления продуктов ПОЛ в инкубируемых гомогенатах коры головного мозга (в % от контроля - К, гомогенаты без препарата). Темные маркеры -р<0,05 по сравнению с контролем.

Учитывая отсутствие сколько-нибудь значимых качественных и количественных различий эффектов фридокса в дозах 6 и 9 мг/кг и более низкую антиоксидантную активность в дозе 3 мг/кг, для дальнейшего исследования была выбрана доза 6 мг/кг.

Установлено, что средняя скорость накопления ТБК-ап в гомогена-тах ишемического мозга (5-я минута клинической смерти) при добавлении фридокса снижалась до значений, достоверно меньше контрольных, а при добавлении эмоксипина - до значений, незначительно превышающих контрольные (рис. 4).

%

ISO -

5-я минута КС 5-я минута ПРП 3-й час ПРП

Рис. 4. Влияние фридокса (Ф) и эмоксипина (Э) на скорость накопления ТБК-ап в инкубируемых гомогенатах (в % от контроля). К - контроль, гомогенаты контрольных животных, инкубируемые без препаратов. Б/п — гомогенаты опытных животных, инкубируемые без препаратов. р<0,05 по сравнению с контролем.

Через 5 минут после оживления интибирующий эффект эмоксипина был менее выражен, скорость накопления ТБК-ап хотя и уменьшалась, но оставалась на 15% больше контрольных значений. При добавлении фридокса скорость уменьшалась до значений, не достигающих контрольных. Через 3 часа после оживления скорость накопления ТБК-ап в инкубируемых гомогенатах была на 10% меньше таковой в контроле (вследствие истощения субстратов ПОЛ при умирании и последующей реанимации). При добавлении антиоксидантных препаратов она еще больше уменьшалась, особенно под влиянием фридокса - до 60% от контрольных значений.

Таким образом, фридокс и эмоксипин in vitro достаточно эффективно ограничивают ишемическую и реперфузионную активацию липопероксида-ции в коре головного мозга. При этом антиоксидантное действие фридокса более выраженное и, возможно, избыточное, так как скорость накопления продуктов ПОЛ уменьшается до значений меньше контрольных.

Под влиянием фридокса и эмоксипина изменялась динамика активности СОД в инкубируемых гомогенатах (рис. 5).

1B

Эти изменения были разнонаправленными и в целом отражали увеличение мощности антиоксидантной защиты, особенно при добавлении эмоксипина. Через 3 часа после оживления увеличение активности СОД в инкубируемых гомогенатах при добавлении фридокса или эмоксипина было менее выраженным.

При включении фридокса (6 мг/кг внутриартериально) в комплекс реанимационных мероприятий содержание продуктов липопероксидации в коре головного мозга к 3-му часу после оживления было в среднем на 20% меньше, чем у животных с обычной реанимацией (1,24+0,12 и 1,52+0,36 нмоль/мл соответственно). При использовании эмоксипина (7 мг/кг) уменьшение содержания продуктов ПОЛ было менее выраженным и практически не отличалось от такового у контрольных животных (1,46+0,19 и 1,43+0,30 нмоль/мл соответственно).

Стартовая и средняя скорости накопления продуктов ПОЛ в инкубируемых гомогенатах животных с использованием во время реанимации эмоксипина увеличивались и практически не отличались от контрольных значений (рис. 6). При использовании фридокса увеличение было весьма незначительным, и скорости сколько-нибудь значимо не отличались от таковых у животных с обычным ведением ПРП. В совокупности с уменьшением содержания продуктов ПОЛ в коре головного мозга in vivo до значений меньше контрольных это позволяет заключить, что при использовании фри-докса происходит несколько избыточное угнетение, липопероксидации в раннем постреанимационном периоде. Вместе с тем, при использовании более мягкого антиоксиданта эмоксипина, к 3-му часу после оживления восстанавливается исходное соотношение про- и антиоксидантной активности.

В экспериментах с ограничением избыточной гиперперфузии в рамках адаптивного диапазона, содержание продуктов лилопероксидации в коре головного мозга к 3-му часу после оживления сколько-нибудь значимо не изменялось по сравнению с таковым при обычном ведении ПРП (1,54+0,18 и 1,52+0,36 нмоль/мл соответственно).

Однако при инкубации гомогенатов стартовая скорость накопления продуктов ПОЛ увеличивалась в среднем в 1,5 раза, в результате чего превышала таковую в контрольной серии на 15-20%. Увеличение средней скорости бышо менее выраженным (на 15%) и сколько-нибудь значимо от контрольный значений она не отличалась. Вполне возможно, что ограничение избыточной гиперперфузии предупреждало чрезмерную активацию липопероксидации, в результате уменьшалось потребление субстратов ПОЛ, что и проявлялось увеличением скорости накопления продуктов липопероксидации в инкубируемых гомогенатах.

Активность СОД в коре головного мозга к 3-му часу после оживления и при инкубации гомогенатов животных с использованием антиокси-дантиых препаратов и ограничением избыточной гиперперфузии достоверно не изменялась по сравнению с таковой у животных с обычной реанимацией.

Влияние фармакологической и гемодинамической коррекции процессов липопероксидации на результаты реанимации

При включении в комплекс реанимационных мероприятий фридокса раньше появлялся первый вдох, восстанавливались самостоятельное ритмичное дыхание и болевая чувствительность по сравнению с животными с обычной реанимацией (табл. 3). Вместе с тем, возрастало число безуспешных реанимаций - у 19 из 54 животных не удалось возобновить эффективную сердечную деятельность (35%). В экспериментах с обычным ведением ПРП - у 13 из 83 (16%, р<0,05). В случае успешной реанимации сердечные сокращения появлялись достоверно позже, чем при обычном оживлении и использовании эмоксипина.

Таблица 3

Ранние показатели восстановления жизнедеятельности

Серия Сердечные сокращения (сек) Время от возобновления кровообращения (минуты)

Первый Ритмичное Роговичный Болевая

вдох дыхание рефлекс чувствительность

1 49,0 3,6 21,7 24,3 37,2

(п =70) ±4,95 ±0,55 ±2,05 ±2,27 ±3,43

2 68,7 2,7 17,2 22,1 25,4

(п =35) ±7,32* ±0,27* ±1,24* ±2,19 ±3,00*

3 (п=17) 40,9 ±10,6 5,0 ±2,7 9,5 ±4,2* 23,2 ±3,32 26,3 ±3,82*

4 48,8 3,4 183 22,4 28,9

(п=40) ±4,90 ±0,48 ±1,37 ±2,14 ±3,06*

Примечание:

1 — обычное оживление; 2 — введение фридокса; 3 - введение эмоксипина; 4 - ограничение гиперперфузии. * - р<0,05 в сравнении с обычным оживлением.

При включении в комплекс реанимационных мероприятий эмокси-пина происходила задержка первого вдоха, тогда как сердечные сокращения и ритмичное дыхание восстанавливались достоверно раньше, чем при использовании фридокса. Уменьшалось число безуспешных реанимаций (23%), однако оставалось несколько больше чем при обычном оживлении.

При ограничении гиперперфузии достоверно раньше восстанавливалась болевая чувствительность, тогда как остальные показатели сколько-нибудь значимо не улучшались. Вместе с тем дальнейшее восстановление функций ЦНС происходило быстрее. К исходу первых суток неврологический дефицит был на 50% меньше, чем у животных с обычной реанимацией. При использовании фридокса и эмоксипина он уменьшался на 35 и 30% соответственно.

На третьи - четвертые сутки все животные с коррекцией постреанимационных нарушений липопероксидации по поведению, двигательной активности и другим показателям мало отличались друг от друга и от контрольных животных, перенесших наркоз и фиксацию без моделирования терминального состояния. У животных с обычным оживлением в эти сроки еще сохранялись серьезные неврологические нарушения. Выживаемость животных после перенесенной клинической смерти при включении в комплекс реанимационных мероприятий фридокса увеличивалась на 14%, эмоксипина - на 24% и при ограничении гиперперфузии - на 34%. При обычной реанимации выживаемость составляла 29%.

Таким образом, ограничение избыточной активации процессов липо-пероксидации при выведении из состояния клинической смерти улучшает течение восстановительных процессов и выживаемость животных, перенесших терминальное состояние. Однако избыточное угнетение проокси-дантной активности под влиянием фридокса по сравнению с эмоксипином не способствует более быстрому и полноценному восстановлению функций ЦНС оживляемого организма. Наиболее оптимальным является не столько ограничение чрезмерной активации липопероксидации с помощью антиоксидантных препаратов, сколько ее предупреждение посредством ограничение избыточной реперфузии.

ВЫВОДЫ

1. При умирании от пролонгированной кровопотери и в раннем постреанимационном периоде (3 часа) увеличение прооксидантной активности в коре головного мозга сопровождается мобилизацией и быстрым истощением систем антиоксидантной защиты. Эти изменения не сопровождаются накоплением продуктов ПОЛ в тканях in vivo и выявляются только in vitro при определении скорости накопления продуктов липо-пероксидации в инкубируемых гомогенатах коры головного мозга.

2. Фридокс в дозе 6 мг/кг и эмоксипин в дозе 7 мг/кг эффективно ограничивают in vitro и in vivo ишемическую и раннюю постреанимационную активацию процессов липопероксидации в коре головного мозга.

3. Ограничение избыточной реперфузии предупреждает чрезмерную активацию липопероксидации при возобновлении кровообращения, в результате чего нормализация соотношения про- и антиоксидантной активности происходит быстрее, чем при использовании в комплексе реанимационных мероприятий антиоксидантных препаратов фридокса и эмоксипина.

4. Чрезмерная активация перекисного окисления липидов в коре головного мозга является одним из патогенетических факторов постреанимационной болезни. В результате ограничения (антиоксидантные препараты) или предупреждения (ограничение избыточной реперфузии) чрезмерной активации перекисного окисления липидов улучшается восстановление функций ЦНС и повышается выживаемость животных, перенесших клиническую смерть.

5. Коррекция ранних постреанимационных нарушений процессов липопе-роксидации в коре головного мозга с помощью ограничения избыточной реперфузии в рамках адаптивного диапазона является более адекватным способом повышения эффективности реанимационных мероприятий — выживаемость животных увеличивается с 29% до 63%, тогда как при использовании фридокса - до 43% и эмоксипина—до 53%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Антиоксидантная эффективность фридокса в корковых и подкорковых структурах головного мозга / А.Я. Евтушенко, А.С. Разумов, П.С. Разумов и др. // Проблемы медицины и биологии: Материалы Всероссийской конф.-семинара с международным участием. - Кемерово, 1998. - С. 119-120.

2. Особенности ишемических и ранних реперфузионных изменений процессов перекисного окисления липидов в таламусе и коре головного мозга / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов и др. // Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга: Материалы науч. конф. - М., 1999. - С. 85.

3. Разумов, П.С. Влияние фридокса на процессы липопероксидации в коре и таламусе головного мозга в раннем постреанимационном периоде / А.Я. Евтушенко, А.С. Разумов, П.С. Разумов // Теоретические и клинические проблемы современной реаниматологии: Материалы Междунар. симп.-М., 1999.- С. 57.

4. Модификация процессов перекисного окисления липидов в восстановительном периоде после временной остановки сердца как способ повышения эффективности реанимационных мероприятий / А.Я. Евтушенко, А.С. Разумов, П.С. Разумов и др. // Материалы VIII Российско-Японского Междупар. медицинского симп. - Благовещенск, 2000. - С. 449-450.

5. Методологические аспекты оценки ишемических и ранних реперфу-зионных изменений процессов липопероксидации / Ю.А. Пеганова, Е.И. Паличева, П.С. Разумов и др. // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы: Материалы II Российского конгресса по патофизиологии. - М., 2000. - С. 197.

6. Методологические аспекты оценки и коррекции постреанимационных нарушений липопероксидации в головном мозге / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов // Арх. клин, и эксперим. медицины. - 2001. -Т.1О.-№2.-С.2О8.

7. Роль постишемической гиперперфузии в развитии ранних постреанимационных нарушений процессов липопероксидации / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов и др. // Фундаментальные науки -практике здравоохранения: Материалы Российской науч. конф. - Омск, 2001.-С. 32-35.

8. Адаптивный характер ранних постреанимационных изменений интенсивности гемоперфузии и липопероксидации в коре головного мозга / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов и др. // Тез. докл. IV Съезда физиологов Сибири. - Новосибирск, 2002. - С. 233.

9. Повышение эффективности реанимационных мероприятий с помощью антиоксиданта нового поколения фридокса / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов и др. // Человек и лекарство: Тез. докл. IX Российского национального конгресса. - М., 2002. - С. 684.

10. Разумов, П.С. Влияние фридокса и эмоксипина in vitro на ранние постреанимационные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга / П.С. Разумов, А.С. Разумов // Здоровье и образование в XXI веке: Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. - М., 2002. - С. 336.

11. Некоторые аспекты применение антиоксидантных препаратов для защиты мозга в раннем постреанимационном периоде / А.Я. Евтушенко, А.С. Разумов, П.С. Разумов и др. // Человек и лекарство: Тез. докл. X Российского национального конгресса. - М, 2003. - С. 713-714.

12. Ишемические и ранние реперфузионные изменения активности супероксиддисмутазы в коре головного мозга / А.С. Разумов, П.С. Разумов, А.Я. Евтушенко и др. // Человек и лекарство: Тез. докл. X Российского национального конгресса. - М., 2003. - С. 747.

13. Патогенетическая и прогностическая оценка постреанимационной гиперперфузии / А.Я. Евтушенко, А.В. Будаев, П.С. Разумов и др. // Актуальные вопросы обезболивания и интенсивной терапии тяжелой черепно-мозговой травмы: Материалы Всероссийской конф., посвящ. 60-летию образования РАМН. - Новокузнецк, 2003. - С. 46-51.

14. Патогенетическая значимость постреанимационной гиперперфузии и централизации кровообращения / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов и др. // Здоровье и образование: Материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Пермь-Анталия, 2003. - С. 224-227.

15. Патогенетическое обоснование необходимости управления кровообращением оживляемого организма / А.С. Разумов, А.Я. Евтушенко, П.С. Разумов и др. // Здоровье семьи — XXI век: Материалы VII Междунар. науч. конф. - Пермь - Валетта, 2003. - С. 161-162.

16. Ранние постишемические изменения соотношения про- и антиок-сидантной активности в органах и тканях / А.С. Разумов, П.С. Разумов, С.Г. Долгова и др. // Тезисы докладов X Российско-Японского Междунар. медицинского симп. - Якутск, 2003. - С. 691-692.

17. Проблемы и перспективы коррекции ишемических и ранних ре-перфузионных нарушений процессов липопероксидации / А.С. Разумов, П.С. Разумов, Е.И. Паличева и др. // Скорая медицинская помощь. -2003. - Т. 4. - № 4. - С.86-88.

18. Липопероксидационный статус при терминальных и экстремальных состояниях / А.Я. Евтушенко, А.С. Разумов, П.С. Разумов и др. // Анестезиология и реаниматология. - 2003. - № 6. - С. 52-55.

19. Разумов, П.С. Перспективы применения фридокса для защиты головного мозга во время реанимации / П.С. Разумов // Медицина в Кузбассе. - 2004. - Вып. 5. - С. 88.

Соискатель

Разумов П.С.

Список сокращений

АД - артериальное давление;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

ПРП - постреанимационный период;

СОД - супероксиддисмутаза;

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота;

ТБК-ап -карбонильные продукты ПОЛ, реагирующие с

2-тиобарбитуровой кислотой: ТБК - активные продукты.

Отпечатано редакционно-издательскям отделом ГОУ ВПО КемГМА Минздрава России

Подписано в печать 21.04.2004

ТелУ^аксР°^5734856; ' ШШ ' Гарнитура тайме. Тираж 100 экз.

1__..._____'____» Mlj® Усл. печ. листов - 1

«ровтвмя.ги ' i«r—.

' о.1

Отпечатано с готового оригинал-макета Лицензия ЛР №21244 от 22.09.97

Актуальность проблемы. Ишемические и реперфузионные повреждения головного мозга являются одним из ведущих патогенетических факторов в развитии постреанимационной энцефалопатии, соответственно инвалидизации и летальности после перенесенного терминального состояния [1,2, 24, 69, 72, 122, 148].

В качестве одного из механизмов ишемических и реперфузионных повреждений нейронов рассматривается неконтролируемая активация пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) [3, 95, ИЗ, 121, 139, 140], что предопределяет необходимость применения антиоксидантных препаратов для защиты головного мозга при терминальных состояниях.

Однако, несмотря на многочисленные и разносторонние исследования ишемических и реперфузионных изменений процессов липопероксида-ции в головном мозге, в настоящее время нет достаточно ясного и однозначного представления о необходимости и эффективности применения ингибиторов ПОЛ при терминальных состояниях. В частности, не все авторы наблюдали увеличение липопероксидационной активности при ишемии и реперфузии головного мозга [66, 121, 169, 194, 215], а подавление активности свободно-радикальных процессов в ряде случаев приводило к уменьшению выживаемости животных с экспериментальными нарушениями мозгового кровообращения [135, 170].

Сложившаяся ситуация усугубляется и трудностью интегральной оценки состояния процессов липопероксидации [8, 22, 32, 46, 56, 64, 138], особенно в условиях быстро изменяющихся гемодинамических параметров при развитии терминальных состояний и выведении из них [70, 105] .

Исходя из этого, становится очевидным, что одним из условий повышения эффективности реанимационных мероприятий при терминальных состояниях является разработка адекватных способов оценки интенсивности процессов ПОЛ и патогенетически обоснованной их коррекции.

Вместе с тем, отсутствие однозначного представления о характере и патогенетической значимости ранних постреанимационных изменений процессов ПОЛ в головном мозге, зависимости их от интенсивности ре-перфузии, необходимости и эффективности применения антиоксидантных препаратов является серьезным препятствием для разработки адекватных способов профилактики и лечения ишемических и реперфузионных нарушений ЦНС. Совокупность этих обстоятельств и определила цель и задачи данного исследования.

Цель исследования. Оценить в эксперименте значение ранних постреанимационных изменений процессов липопероксидации в коре головного мозга в развитии постреанимационной болезни и способы их коррекции.

Задачи исследования

1. Изучить процессы липопероксидации в коре головного мозга кошек при умирании от пролонгированной кровопотери и в раннем постреанимационном периоде.

2. Оценить в сравнительном аспекте влияние фридокса и эмоксипина in vitro на ишемические и ранние постреанимационные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга.

3. Сравнить влияние антиоксидантных препаратов и ограничения реперфу-зии на ранние постреанимационные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга, восстановление жизнедеятельности и выживаемость животных, перенесших клиническую смерть.

Научная новизна исследования. Впервые произведена оценка изменений про- и антиоксидантной активности в коре головного мозга при умирании и в раннем постреанимационном периоде с помощью определения динамических показателей липопероксидации. Установлено, что при умирании и последующем оживлении происходит активация прооксидант-ных систем, истощение систем антиоксидантной защиты и субстратов ли-попероксидации. Показано, что эти изменения in vivo не сопровождаются накоплением продуктов ПОЛ в тканях и выявляются только in vitro при инкубации гомогенатов.

Установлено, что фридокс (6 мг/кг) и эмоксипин (7 мг/кг) эффективно ограничивают in vitro и in vivo ишемическую и реперфузионную активацию процессов липопероксидации в коре головного мозга.

Показано, что ограничение избыточной реперфузии предупреждает чрезмерную активацию процессов липопероксидации при возобновлении кровообращения, в результате чего нормализация соотношения про- и антиоксидантной активности происходит быстрее, чем при использовании в комплексе реанимационных мероприятий антиоксидант-ных препаратов фридокса и эмоксипина.

Установлено, что ограничение избыточной реперфузии является более эффективным способом коррекции ранних постреанимационных нарушений процессов липопероксидации - выживаемость животных увеличивается с 29% до 63%, тогда как при использовании антиоксидантных препаратов - до 43% (фридокс) и 53% (эмоксипин).

Теоретическая и практическая значимость. Показана патогенетическая значимость избыточной активации процессов липопероксидации в коре головного мозга в развитии постреанимационной болезни - нарушается восстановление функций ЦНС.

Показано, что дополнительное определение динамических показателей липопероксидации — накопления продуктов ПОЛ в инкубируемых го-могенатах, позволяет повысить объективность и информативность оценки нарушений соотношения про- и антиоксидантной активности в тканях при быстро изменяющихся параметрах гемодинамики.

Положительные результаты фармакологической и гемодинамической коррекции ранних постреанимационных нарушений процессов липоперок-сидации в коре головного мозга являются патогенетическим обоснованием для разработки способов повышения эффективности реанимационных мероприятий и защиты головного мозга при экстремальных и терминальных состояниях.

Работа (№ госрегистрации 01.2.00 100462 от 01.01.17) выполнена в рамках проблем, координируемых ПК 33.05 «Экстремальные и терминальные состояния» (МНС №33 РАМН) и ПК 53.02 «Нормальная и патологическая физиология» (МНС № 53 СО РАМН).

Основные положения, выносимые на защиту

1. При умирании и последующем оживлении активация прооксидантных систем в коре головного мозга сопровождается мобилизацией и быстрым истощением систем антиоксидантной защиты, развивается дефицит субстратов ПОЛ. Эти изменения не проявляются накоплением продуктов ПОЛ in vivo и выявляются только in vitro - при инкубации гомогенатов коры головного мозга в течение двух часов.

2. Включение в комплекс реанимационных мероприятий фридокса (6 мг/кг) или эмоксипина (7 мг/кг) достаточно эффективно ограничивает, а уменьшение избыточной реперфузии - предупреждает чрезмерную активацию процессов липопероксидации в коре головного мозга в первые минуты после возобновления кровообращения и истощение антиоксидантных систем и субстратов ПОЛ в динамике постреанимационного периода, в результате улучшается восстановление функций ЦНС и повышается выживаемость животных, перенесших клиническую смерть.

3. Предупреждение избыточной активации процессов липопероксидации в первые минуты после оживления с помощью ограничения избыточной реперфузии является более адекватным способом повышения эффективности реанимационных мероприятий по сравнению с ограничением чрезмерной липопероксидации с помощью антиоксидантных препаратов.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в учебный процесс по темам «Обмен липидов», «Биологическое окисление» на кафедре биохимии и по теме «Экстремальные и терминальные состояния» на кафедрах патофизиологии, анестезиологии и реаниматологии Кемеровской государственной медицинской академии, а также в научно-исследовательскую работу ЦНИЛ, кафедр биохимии и патофизиологии.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследования доложены и обсуждены на: Всероссийских научно-практических конференциях «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 1998, 2001, 2002, 2004); Международном симпозиуме «Теоретические и клинические проблемы современной реаниматологии» (Москва, 1999); VIII и X Российско-Японских международных медицинских симпозиумах (Благовещенск, 2000; Якутск, 2003); Российской научной конференции «Фундаментальные науки - практике здравоохранения» (Омск, 2001); II Российском конгрессе по патофизиологии «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 2002); IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы обезболивания и интенсивной терапии тяжелой черепно-мозговой травмы» (Новокузнецк, 2003); научно-практической конференции «Сочетанная шо-когенная травма в аспекте концепции травматической болезни» (Санкт-Петербург, 2003), Международной конференции «Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению нейродегенеративных заболеваний» (Новосибирск, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 14 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 147 отечественных и 68 зарубежных источников. Диссертация содержит 6 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками.

ВЫВОДЫ

При умирании от пролонгированной кровопотери и в раннем постреанимационном периоде (3 часа) увеличение прооксидантной активности в коре головного мозга сопровождается мобилизацией и быстрым истощением систем антиоксидантной защиты. Эти изменения не сопровождаются накоплением продуктов ПОЛ в тканях in vivo и выявляются только in vitro при определении скорости накопления продуктов липопероксидации в инкубируемых гомогенатах коры головного мозга.

Фридокс в дозе 6 мг/кг и эмоксипин в дозе 7 мг/кг эффективно ограничивают in vitro и in vivo ишемическую и раннюю постреанимационную активацию процессов липопероксидации в коре головного мозга.

Ограничение избыточной реперфузии предупреждает чрезмерную активацию липопероксидации при возобновлении кровообращения, в результате чего нормализация соотношения про- и антиоксидантной активности происходит быстрее, чем при использовании в комплексе реанимационных мероприятий антиоксидантных препаратов фридокса и эмоксипина.

Чрезмерная активация перекисного окисления липидов в коре головного мозга является одним из патогенетических факторов постреанимационной болезни. В результате ограничения (антиоксидантные препараты) или предупреждения (ограничение избыточной реперфузии) чрезмерной активации перекисного окисления липидов улучшается восстановление функций ЦНС и повышается выживаемость животных, перенесших клиническую смерть.

Коррекция ранних постреанимационных нарушений процессов липопероксидации в коре головного мозга с помощью ограничения избыточной реперфузии в рамках адаптивного диапазона является более адекватным способом повышения эффективности реанимационных мероприятий -выживаемость животных увеличивается с 29% до 63%, тогда как при использовании фридокса - до 43% и эмоксипина - до 53%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарушения процессов перекисного окисления липидов рассматриваются многими исследователями в качестве ведущего механизма ишемиче-ских и реперфузионных повреждений головного мозга, приводящих к развитию постреанимационной энцефалопатии, соответственно инвалидиза-ции и высокой летальности после перенесенного терминального состояния [1, 2, 24, 72, 95, 122, 123, 148]. Вместе с тем в настоящее время отсутствует достаточно однозначное представление о характере и патогенетической значимости ранних постреанимационных нарушений про- и антиоксидантной активности в головном мозге, что препятствует разработке адекватных способов их коррекции. Это обусловлено тем, что интенсивность липопероксидации оценивали, в основном, по изменению содержания в ткани мозга различных продуктов ПОЛ и на основании их увеличения делалось заключение об усилении липероксидации, а было ли это усиление адаптивным или избыточным, то есть патологическим, как правило, не анализировалось. Поэтому оставался открытым вопрос о целесообразности и необходимости применения антиоксидантных препаратов. Более того использование ингибиторов ПОЛ при экспериментальных нарушениях мозгового кровообращения сопровождалось в некоторых случаях увеличением летальности животных.

Анализ результатов многочисленных экспериментальных и клинических исследований показал, что содержание продуктов ПОЛ не всегда адекватно отражает интенсивность липопероксидации, так как зависит не только от скорости их образования, но и от скорости дальнейшего метаболизма и элиминации в кровеносное русло. Последние, в свою очередь, во многом определяются интенсивностью гемоперфузии, которая при развитии терминальных состояний и выведении из них весьма быстро и существенно изменяется - от полной остановки кровотока во время клинической смерти до двухкратного увеличения по сравнению с исходными значениями в первые минуты постреанимационного периода. При столь быстро изменяющихся параметрах гемоперфузии изменения соотношения про- и антиоксидантной активности могут и не проявлятся сколько-нибудь значимыми изменениями содержания продуктов ПОЛ в тканях.

Исходя из этого, при планировании данного исследования были учтены результаты исследований, выполненных Архипенко Ю.В., Диденко В.В. (1989), Львовой С.П. и соавт. (1993), которые показали, что определение характера накопления продуктов ПОЛ в гомогенатах во время их достаточно продолжительной инкубации позволяет выявить те изменения про- и антиоксидантной активности, которые в силу своей незначительности или действия различных факторов не проявляют себя изменениями содержания продуктов ПОЛ in vivo. Поэтому в данной работе, наряду с определением содержания продуктов ПОЛ и активности СОД в неинкубируемых гомогенатах, была изучена динамика их накопления при инкубации гомогенатов в течение двух часов при 37°С. Предварительно было установлено, что при меньшей продолжительности инкубации не всегда удается выявить истощение антиоксидантной защиты и субстратов липопероксидации.

Использование данного методологического подхода позволило установить, что при умирании от пролонгированной кровопотери и последующей реанимации в коре головного мозга повышение прооксидантной активности не сопровождается адекватной мобилизацией антиоксидантной защиты, которая в этих условиях весьма быстро истощается. К 3-му часу после оживления развивается дефицит легкодоступных субстратов липопероксидации вследствие их повышенного потребления при умирании и в первые минуты после возобновления кровообращения. В результате, несмотря на недостаточность антиоксидантной защиты, накопление продуктов ПОЛ при инкубации гомогенатов реанимированных животных уменьшается по сравнению с таковым в гомогенатах контрольных животных.

Таким образом, изменения соотношения про- и антиоксидантной активности при умирании и в раннем постреанимационном периоде, характеризующиеся увеличением прооксидантной активности и недостаточностью антиоксидантной защиты и постепенным развитием дефицита субстратов ПОЛ, первоначально имеют скрытый характер и выявляются в полном объеме только при инкубации гомогенатов в течение не менее двух часов. Сколько-нибудь значимое увеличение содержания продуктов ПОЛ в коре головного мозга in vivo было только на 5-й минуте после возобновления кровообращения, когда активность СОД уменьшалась на 10-15% от контрольных значений.

Принимая во внимание, что в первые минуты после оживления кровоток в коре теменной доли возрастал в 2 раза по сравнению с исходным, увеличение содержания продуктов ПОЛ в коре головного мозга было, скорее всего, результатом их повышенного образования, а не уменьшения элиминации в кровеносное русло [16]. Недостаточная мобилизации антиоксидантной защиты при умирании, которая с возобновлением кровообращения хотя и реализуется в большей степени, но быстро истощается, подтверждается менее выраженным увеличением стартовой и несколько большим увеличением средней скорости накопления продуктов ПОЛ в гомогенатах по сравнению с таковыми на 5-й минуте клинической смерти.

Через 3 часа после возобновления кровообращения, когда, напротив, развивалась выраженная гипоперфузия (кровоток в коре теменной доли уменьшался на 50% от исходного [16], содержание ТБК-ап в коре головного мозга лишь незначительно превышало контрольные значения - на 5-10%. Однако накопление продуктов ПОЛ в инкубируемых гомогенатах уменьшалось, причем стартовая скорость снижалась больше, чем средняя, что в совокупности с признаками недостаточности антиоксидантной защиты отражало развитие дефицита субстратов липопероксидации.

Таким образом, вследствие повышения прооксидантной активности в коре головного мозга при умирании и в первые минуты после оживлении развиваются недостаточность антиоксидантной защиты и дефицит субстратов ПОЛ.

Вполне очевидно, что выявленные изменения процессов липопероксидации в коре головного мозга в раннем постреанимационном периоде в определенной степени являются результатом изменений соотношения про-и антиоксидантной активности при умирании. Вместе с тем ведущее значение в их развитии имеет реперфузия, особенно избыточная, что наглядно подтверждается результатами экспериментов с ограничением ее интенсивности.

При ограничении интенсивности начальной реперфузии (с помощью исключения из гемоциркуляции части крови) до значений, не превышающих исходные более чем на 30-35%, статические и динамические показатели липопероксидации изменялись таким образом, что к 3-му часу ПРП их различия с контролем становились минимальными.

При использовании в комплексе реанимационных мероприятий анти-оксиданта нового поколения фридокса подобной нормализации изучаемых показателей липопероксидации не происходило. К 3-му часу после оживления содержание продуктов липопероксидации в коре головного мозга in vivo и их накопление в инкубируемых гомогенатах сколько-нибудь значимо не увеличивались по сравнению с таковыми при обычном ведении ПРП и оставались меньше контрольных значений. Однако в отличие от обычного ведения ПРП, низкие значения статических и динамических показателей липопероксидации при использовании фридокса были обусловлены не дефицитом субстратов ПОЛ, а отражали избыточное угнетение прооксидантной активности, чего не наблюдалось при использовании более мягкого ан-тиоксиданта эмоксипина. Это подтверждается и результатами изучения влияния фридокса и эмоксипина in vitro на ишемические (5-я минута клинической смерти) и реперфузионные (5-я минута и 3-й час ПРП) изменения процессов липопероксидации. Было установлено, что фридокс, в отличие от эмоксипина, весьма существенно ограничивает образование продуктов ПОЛ в инкубируемых гомогенатах не только при повышенной интенсивности липопероксидации, но и при ее уменьшении, в частности, вследствие дефицита субстратов ПОЛ.

Таким образом, ограничение гиперперфузии предупреждает в первые минуты после реанимации избыточную активацию прооксидантных систем, соответственно, и избыточное образование продуктов липопероксидации, обладающих выраженным деструктивным действием, и способствует более быстрой нормализации соотношения про- и антиоксидантной активности после перенесенного терминального состояния.

Фридокс и эмоксипин ограничивают чрезмерную активацию прооксидантных систем в первые минуты после оживления. Однако под влиянием мощного антиоксиданта фридокса происходит избыточное подавление прооксидантной активности, в результате чего образование продуктов ПОЛ уменьшается до значений, достоверно меньше таковых у контрольных животных. Вместе с тем продукты липопероксидации, как известно, принимают участие в регуляции таких жизненно важных процессов, как модификация клеточных мембран, окислительное фосфорилирование, экспрессия генов, внутриклеточная регенерация и репарация [19, 46, 93]. Поэтому недостаточное образование продуктов липопероксидации в восстановительном периоде после перенесенной клинической смерти может быть не менее опасным для нейронов, чем их избыточная продукция. Данное предположение подтверждается результатами сравнительного анализа влияния коррекции ранних постреанимационных нарушений липопероксидации с помощью фридокса, эмоксипина и ограничения гиперперфузии на ранние показатели восстановления жизнедеятельности, видимого неврологического статуса и выживаемость животных после перенесенной клинической смерти.

Прежде всего, отметим, что при предупреждении (ограничение избыточной гиперперфузии) или уменьшении (реанимация с использованием антиоксидантных препаратов) чрезмерной активации липопероксидации в коре головного мозга улучшается восстановление функций ЦНС и снижается летальность животных, перенесших клиническую смерть. Следовательно, нарушения процессов липопероксидации в головном мозге являются одним из патогенетических факторов развития постреанимационной болезни.

Однако при использовании антиоксидантных препаратов и ограничении гиперперфузии некоторые животные все-таки погибали в течение первых суток после реанимации. Следовательно, коррекция ранних постреанимационных нарушений процессов ПОЛ не могла предупредить у них гибели определенных популяций нейронов. Вполне возможно, что, вследствие индивидуальных особенностей, первичные ишемические и реперфузи-онные повреждения этих нейронов были настолько выраженными, что заканчивались их быстрой гибелью, которую невозможно было предотвратить ограничением вторичных повреждений с помощью коррекции нарушений процессов ПОЛ.

Вместе с тем установлено, что при использовании фридокса выживаемость животных увеличивается меньше, чем при ограничении гиперперфузии и использовании более мягкого антиоксиданта эмоксипина. Не исключено, что наряду с другими благоприятными факторами ограничения гиперперфузии (уменьшение внутричерепного давления, экстравазации жидкости и белка, отека мозга, улучшение дренажа спинномозговой жидкости и оттока лимфы и др.) это связано с избыточным угнетением процессов липопероксидации при введении фридокса, соответственно устранением их от участия в регуляции жизненно важных функций нейронов. Вполне очевидно, что подобная ситуация не способствует более быстрому и полноценному восстановлению функций нейронов и других клеток после перенесенного терминального состояния.

В определенной степени это подтверждается тем, что при включении фридокса в комплекс реанимационных мероприятий увеличивалось число безуспешных реанимаций, в среднем в 2 раза, а в случае успешной реанимации сердечные сокращения появлялись достоверно позже, чем у животных с обычной реанимацией и с использованием эмоксипина. Возможно, вследствие чрезмерного угнетения процессов липопероксидации в мембранах нервных клеток и кардиомиоцитов под влиянием фридокса, замедлялось восстановление механизмов генерации и проведения нервных импульсов. Уменьшением образования продуктов липопероксидации в первые часы после оживления, как вследствие избыточного угнетения прооксидант-ных систем под влиянием ингибиторов ПОЛ, так и в результате развития дефицита субстратов липопероксидации, по-видимому, объясняются более выраженные проявления неврологического дефицита и летальность в первые 24 часа реанимации у животных с использованием фридокса и с обычным ведением ПРП по сравнению с таковыми при ограничении гиперперфузии и использовании эмоксипина.

Негативный эффект дефицита субстратов ПОЛ и уменьшения интенсивности липопероксидации подтверждается результатами клинических и экспериментальных исследований.

Дубинина Е.Е. и соавт. (1998), изучая изменения процессов липопероксидации у пожилых людей с деменцией, пришли к заключению, что истощение пула ненасыщенных жирных кислот как результат интенсификации их окислительной деструкции влечет за собой глубокие структурно-функциональные изменения в мозговой ткани и является одной из возможных причин возникновения психических расстройств.

Hollan S. и соавт. (1998) в качестве одной из причин гибели нейронов и усиления нейродегенеративных процессов рассматривают дефицит плаз-малогенов.

Murray С.A., Lynch М.А. (1998) установили, что возрастное уменьшение устойчивости к длительной электростимуляции головного мозга крыс происходит на фоне уменьшения содержания арахидоновой кислоты, являющейся одним из основных субстратов липопероксидации [190].

При активации свободнорадикальных процессов в синаптосомах коры мозга уменьшается содержание полиеновых жирных кислот в составе аминофосфолипидов, наиболее подверженных окислению [59, 62]. По данным Lukacova N. (1998) через 15 минут реперфузии после 30-минутной тотальной ишемии головного мозга крыс увеличивается деградация аминофосфолипидов, а через 30 минут и 3 часа в коре уменьшается интенсивность липопероксидации, что согласуется с результатами данной работы -уменьшение интенсивности процессов ПОЛ в коре головного мозга кошек к 3-му часу постреанимационного периода.

Таким образом, в результате выполненного исследования установлено, что в раннем постреанимационном периоде в коре головного мозга повышается прооксидантная активность, вследствие чего развивается недостаточность антиоксидантной защиты и дефицит субстратов липопероксидации. Ведущим фактором, определяющим характер ранних постреанимационных изменений процессов перекисного окисления липидов в коре головного мозга является интенсивность начальной реперфузии.

83