Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Влияние окислительного стресса на состояние мембран клеток крови и эндотелия сосудов при желчном перитоните перитоните (экспериментальное исследование)

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

4858505

ХАСАЕВА Марина Александровна

ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН КЛЕТОК КРОВИ И ЭНДОТЕЛИЙ СОСУДОВ ПРИ ЖЕЛЧНОМ ПЕРИТОНИТЕ

(экспериментальное исследование) 14.01.17-хирургия

- 3 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Краснодар - 2011

4858505

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России).

Научный руководитель:

Научный консультант: Официальные оппоненты:

Заслуженный изобретатель РФ, лауреат премии Правительства РФ и РАМН, доктор медицинских наук профессор Петросян Эдуард Арутюнович.

доктор медицинских наук Аксенов Игорь Васильевич.

доктор медицинских наук профессор Гуменюк Сергей Евгеньевич;

доктор медицинских наук Виниченко Алексей Викторович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздравсоцразвития России).

Защита состоится « 2011 г. в 10.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.038.01 при ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 350063, Краснодар, ул. Седина, 4, КубГМУ, тел. (861) 262-73-75.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « /Г

Ученый секретарь диссертационного совета профессор

Ю.Р.Шейх-Заде

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время известно, что около 10-15% взрослого населения земного шара имеет желчные камни [Festi D. et al., 1999; Григорьева И.Н., Малютина С.К., 2010]. Масштабные эпидемические исследования последних двух десятилетий привели к пониманию того, что реальная распространенность желчнокаменной болезни у людей в старшей возрастной группе достигает 30% и находится в тесной корреляции с эпидемическим ростом других «болезней цивилизации», протекающих с глубокими метаболическими нарушениями: атеросклерозом, метаболическим синдромом и сахарным диабетом 2-го типа [Вовк Е.И., 2011]. Ежегодно в мире выполняется более 2,5 млн. холецистэктомий поводу желчнокаменной болезни [Ветшев П.С., Ногтев П.В., 2005]. Несмотря на широкое внедрение малоинвазивных методов в современной хирургии печени и желчевыводящих путей, количество ятрогенных осложнений, одним из которых является желчный перитонит (ЖП) не имеет тенденции к снижению [Левин Л.А., 2009; AmendolaraM. et al., 2001]. Согласно данным Э.И.Гальперина [2003], частота повреждений внепеченочных желчных протоков при открытой холецистэктомии составляет 0,1-0,8%, в то время, как при лапароскопической холецистэктомии в период освоения метода и накопления опыта, количество их возрастает до 3%. При этом желчный перитонит развивается у 94,5% пациентов [Nardello О. et al., 2003].

Единичные исследования посвящены цитологической диагностике желчного перитонита [Elsheikh Т.М., et al., 1996], роли окислительного стресса [Карякина Е.В., Белова C.B., 2004; Sun D., Aikawa N.. 1999], печеночно-почечной недостаточности [Козлов B.C. и соавт., 2003; Baylis С., Bloch J., 1996; NumataM. et al., 2003]. До настоящего времени отсутствует единая классификация желчного перитонита [Koch M. et al., 2011]. При этом исследование патогенеза, разработка новых методов диагностики и лечения желчного перитонита продолжают оставаться вне поля зрения

исследователей, несмотря на то, что послеоперационная летальность составляет при желчном перитоните от 10 до 34% [Брискин Б.С., 2006; Курбонов К.М., Даминова Н.М., 2007; Amorotti С. et al., 2002].

Нерешенность приведенных выше проблем делает необходимым проведение дальнейших исследований с целью углубления представления о патогенезе, механизмах развития полиорганной недостаточности, разработки новых методов ранней диагностики и лечения желчного перитонита.

1. Цель исследования - оценить влияние окислительного стресса на состояние мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните.

Задачи исследования.

1. Оценить структурно-функциональные нарушения состояния мембран клеток крови у животных с желчным перитонитом.

2. В опытах на животных с желчным перитонитом охарактеризовать метаболизм оксида азота.

3. У животных с желчным перитонитом установить характер нарушения сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза.

4. Методом многомерного анализа определить наиболее информативные диагностические критерии тяжести течения экспериментального желчного перитонита.

5. В опытах на животных с желчным перитонитом оценить морфофункциональные и морфометрические изменения в почках для определения направленности гемокоагуляционных расстройств.

Научная новизна исследования. В результате проведенных исследований впервые:

- установлено, что при экспериментальном желчном перитоните на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов происходит нарушение структурно-функциональной организации клеточных мембран эритроцитов, сопровождающихся повышением содержания в крови тиоловых групп (SH-

групп), ростом сорбционной способности эритроцитов (ССЭ), повышением активности внутриклеточных ферментов крови (ACT, AJIT), нарушением метаболизма эндотелиального оксида азота (N0) плазмы и тромбоцитарного N0, а также активацией сосудисто-тромбоцитарного звена (СТЗ) гемостаза;

- определён комплекс наиболее информативных лабораторных показателей влияния окислительного стресса на состояние мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните в порядке уменьшения их значимости: ДК < МДА < концентрация лейкоцитов < ЛИИ < ACT < AJIT < метаболиты эндотелиального N0 плазмы < ССЭ < SH-групп < концентрация тромбоцитов.

Теоретическая значимость исследования

Совокупность полученных данных существенно расширяет и систематизируют представления о патогенезе и морфогенезе желчного перитонита, что может служить базой для проведения дальнейших научно-исследовательских работ.

Практическая значимость исследования

Выявленный комплекс наиболее информативных лабораторных показателей крови может быть использован для ранней диагностики желчного перитонита, разработки патогенетически обоснованных методов лечения и оценки их эффективности.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 125 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, материал и методы исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 443 источника (257 отечественных и 186 иностранных) и приложения. Работа иллюстрирована 4 микрофотографиями, 3 таблицами и 20 графиками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 31 беспородных половозрелых собаках-самцах, весом 15,3±1,1 кг. Экспериментальные животные были разделены на две группы: в I контрольную группу для определения лабораторных показателей нормы были включены 31 животное, во 2-ю опытную группу - 26 животных, у которых создавали модель 24-часового желчного перитонита.

Суть модели заключалась в том, что предварительно на наружной поверхности заднего бедра собаки создавали очаг деструкции мягких тканей путем подкожного введения 10% раствора кальция хлорида из расчета 0,25 мл/кг. Через 48 часов после создания очага деструкции животным в брюшную полость троекратно вводили аптечную желчь через каждые 8 часов из расчета 1,5 мл/кг массы [Петросян Э.А. и др. «Способ моделирования желчного перитонита», Патент РФ № 2175784, БИ, 2001, №31].

Определение клинико-лабораторных показателей крови проводили на автоматическом анализаторе «Medonic 620» (Швеция). Качественный состав лейкоцитов изучали унифицированным методом [Меньшиков В.В., 1987]. Для оценки степени эндогенной интоксикации использовали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) Кальф-Калифа Я.Я. [1941].

Определение диеновых конъюгатов (ДК) проводили по регистрации спектра поглощения гептанового слоя экстракта из плазмы или эритроцитарной взвеси по методике, описанной в справочнике В.С.Камышников [2000].

Определение малонового диальдегида (МДА) проводили по методике, описанной в справочнике B.C. Камышников [2000].

Определение SH-rpynn проводили по методу [Веревкина И.В., Точилкина А.И., Попова H.A., 1977].

Определение ССЭ проводили по методу [Тогайбаева A.A., Кургузкина A.B., Рикуна И.В., 1988].

Определение активности внутриклеточных ферментов крови

аланинаминотрансаминазы (AJIT) и аспартатаминотрансаминазы (ACT), проводили унифицированным методом, используя стандартизированный набор реактивов AST-ALT 180 фирмы Lachema.

Определение метаболитов NO (нитраты/нитриты) в плазме и тромбоцитах проводили с использованием реактива Грисса [Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J.G., 1982].

Состояние СТЗ гемостаза оценивалось путем подсчета количества тромбоцитов (Тр) и определения агрегационной активности тромбоцитов набором реактивов (агрескрин-тест, «Технология-Стандарт», Барнаул).

Морфологические исследования биоптатов почек проводили на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для забора морфологического материала на каждый исследуемый срок из эксперимента выводились по 5 животных.

Гистохимические исследования почек проводили на срезах, окрашенных по методу Пикро-Маллори [Саркисов Д.С., 1996] для выявления фибрина, маркера ДВС-крови. Метод основан на изменение тинкториальных свойств фибрина в процессе свертывания крови, который позволяют указать относительное время развития гемокоагуляционных расстройств.

Морфометрические исследования параметров среднего размера (CP, мкм2) и объемной доли (ОД, %) «зрелого» фибрина, проводили планиметрическим методом на срезах почки с использованием светового микроскопа Olympus (Япония) и окулярной сетки [Автандилова Г.Г., 2002]. Оценка морфометрических изменений проводилась визуально в 30 полях зрения для каждого определения. Объектив х90, окуляр х7.

Статистические исследования выполнены в программе «Statistica 6.0 for Windows». Оценку достоверности различий для нормально распределенных признаков проводили с использованием t-критерия

Стьюдента, а в противном случае - критериев Манна-Уитни и Вилкоксона (для зависимых и независимых признаков, соответственно). Для выяснения взаимосвязей между показателями применялся метод корреляционного анализа по Спирмену. Данные в тексте и таблицах представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего М+т, а при непараметрическом характере распределения величин - в виде медианы с указанием 25-го и 75-го квартилей [медиана (25й - 75й- квартиль)].

Все исследования проводили до и после создания у животных модели 24-часового желчного перитонита.

Проведенное исследование руководствовалось следующими основными принципами, действующими в законодательных и нормативных актах РФ: Конституцией РФ; Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации от 1964 года, дополненная в 1975, 1983 и 1989 гг.; Рекомендациями Комитетов по этике, проводящих экспертизу биомедицинских исследований ВОЗ и EF GCP; «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (№5487-1 от 22.07.1993г.); Федеральным законом «Об обращении лекарственных средств» (№ 61-ФЗ от 12.04.2010г.); Национальным стандартом РФ ГОСТ-Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика» (ICH Е6 GCP), утвержденным приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27.09.2005г. №232-ст; правилами лабораторной практики, утвержденными приказом МЗСР №708н от 23.08.2010г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Известно, что количественное и качественное соотношение элементов лейкоцитарной формулы отражает степень воспалительной реакции.

У животных с желчным перитонитом было выявлено двукратное повышение концентрации лейкоцитов в крови, пятикратное -палочкоядерных и двукратное - сегментоядерных нейтрофилов (р<0,05), что

можно объяснить не только за счёт мобилизации пристеночного пула нейтрофильных гранулоцитов, но и активации костномозгового резерва.

Широко используемым методом оценки степени эндотоксикоза, является определение ЛИИ, который у животных с желчным перитонитом достигал 10,6 (9-13,8) ед. против 0,89 (0,8-1,2) ед. в контрольной группе (р<0,01) (рис. 1).

« МесАап I I 25%-75% 1 М1п-Мах

Рис. 1. Показатели ЛИИ у контрольных и опытных животных.

Общеизвестно, что эндогенная интоксикация приводит к образованию избыточного количества активных форм кислорода, повреждению структурных элементов мембран клеток крови и нарушение метаболизма клеток.

Так, у животных с желчным перитонитом уровень первичных продуктов ПОЛ в плазме, а именно ДК оставался практически без изменений относительно животных контрольной группе (р>0,05), в то время, как в эритроцитах наблюдался достоверный рост концентрации ДК до 5,54 (4,856,33) А/мл против 4,26 (3,89-4,46) А/мл в контрольной группе (р<0,05) (рис. 2), что может быть следствием активизации процессов перекисного окисления липидов и ростом вторичных продуктов, более высокой степени окисленности.

ДК, отн. ед.

6

4..............................—....................................-......-............................... ............. ........................................................... a Median

2 . ' —£-■'■ .........О 25%-75%

01_._,_,__,___,_X Min-Max

ПЛ ПЛ24

-час 24-час

Рис. 2. Показатели ДК липидов плазмы и эритроцитов у контрольных и опытных животных.

Подобные изменения находят подтверждение, когда у животных с ЖП наблюдался достоверный рост концентрации МДА в плазме до 5,13 (4,845,39) против 2,89 (2,78-3,01) в контрольной группе (р<0,05), а в эритроцитах -до 15,69 (14,92-16,43) против 11,44 (11,03-12,33) в контроле (р<0,05) (рис. 3).

МДА, мкмоль/л

ГШ ПЛи.*«

ЭР ЭР34.ч

d Median I 125%-75% I Min-Max

Рис. 3. Показатели МДА плазмы и эритроцитов у контрольных и опытных животных.

Таким образом, у животных с ЖП в плазме происходит накопление вторичных продуктов, что свидетельствует не только об интенсивном метаболизме первичных продуктов, но и, вероятно, о замедленном их выведении из организма. Иная динамика наблюдалась в эритроцитах, когда

одновременно отмечался рост, как первичных, так и вторичных продуктов, что является косвенным свидетельством повреждения мембран клеток крови.

В качестве маркера проницаемости мембран эритроцитов использовали показатель определяющий общее количество БН-, который у животных с ЖП повышался до 1119 (1089-1188) мкмоль/л против 650 (547-694) мкмоль/л в контрольной группе (р<0,05) (рис. 4, а), что указывает на дестабилизацию барьерной функции эритроцитов. При этом не исключено, что выход БН-групп, во-первых, может быть защитной реакцией, направленной на нейтрализацию АФК и блокаду процессов ПОЛ и, во-вторых - на активацию клеточного фермента гуанилатциклазы, который при взаимодействии тиоловых групп с оксидом азота, опосредует эффекты последнего.

1300 1200 1100 1000

1 900

0

1 800

2

700 600 500 400

е

т

■ Median I | 25%-75% I Min-Max

т

X

■ Median I 125%-75% I Min-Max

К О

к о б

Рис. 4. Показатели SH-групп (а) и ССЭ (б) у контрольных и опытных животных.

Одним из показателей, позволяющих оценить действие процессов свободнорадикального окисления на мембран клеток крови, является ССЭ, которая у животных с ЖП достоверно повышалась до 12,33 ±1,38 % против 22,18±2,96 % в контрольной группе (р<0,05) (рис. 4, б), что свидетельствует о нарушении физико-химических свойств эритроцитарной мембраны.

У животных с ЖП при изучении состояния внутриклеточных ферментов выявлен рост активности ACT в 1,6 раза, а АЛТ в 1,7 раза, что

является отражением высокой ферментемии, т.е. баланс между ACT и АЛТ «переваливает» с катаболической (ACT) на анаболическую (АЛТ) сторону для поддержания метаболического равновесия (табл. 1).

Таблица 1

Динамика активности внутриклеточных ферментов в контрольной группе

животных и животных с 24-часовым желчным перитонитом

Исследуемые группы ACT, ммоль/л АЛТ, ммоль/л АСТ/АЛТ

Контрольные животные 0,15±0,02 0,26±0,03 0,57±0,09

Животные с 24-час ЖП 0,24±0,02* 0,65±0,06* 0,33±0,06*

Примечание: * - достоверность отличий от показателя животных контрольной группы (р<0,05).

Исследование соотношения АСТ/АЛТ (коэффициента де Ритиса) у животных с 24-часовым ЖП, свидетельствует о достоверном его снижении до 0,33±0,0б против 0,57±0,09 У животных контрольной группы (р<0,05) (табл. 3.1), что отражает сдвиг метаболических процессов в сторону интенсификации глюконеогенеза (анаболический вариант) через глюкозо-аланиновый шунт с использованием АЛТ, который необходим для поддержания адекватного уровня глюкозы в условиях эндогенной интоксикации.

Таким образом, оценивая показатели ферментемии при экспериментальном желчном перитоните, необходимо учитывать, что исследуемые ферменты катализируют определенные биохимические реакции и участвуют в важнейших метаболических процессах, являясь одним из проявлений общего адаптационного синдрома. Все это позволяет исследуемые показатели рекомендовать для оценки направленности и интенсивности важнейших метаболических процессов при состояниях, сопровождающихся синдромом системной воспалительной реакции. Кроме того, полученные результаты при исследовании активности аминотрансфераз

сыворотки крови при экспериментальном желчном перитоните позволяют расширить сложившееся представление об активности и направленности метаболических процессов при желчном перитоните.

В последние годы внимание исследователей привлечено к изучению механизмов возникновения эндотелиальной дисфункции.

При исследовании содержания эндотелиального N0 в плазме у животных с ЖП отмечалось достоверное его повышение до 5,30 (4,65-5,95) мкмоль/л против 4,08 (3,8-4,95) мкмоль/л в контрольной группе (р<0,05) (рис. 6, а), что свидетельствует об экспрессии ¿>Ю-синтазы.

■ МесПап О 25%-75% М|'п-Мах

• МесКап I I 25%-75% Мт-Мах

Рис. 6. Показатели эндотелиального N0 (а) и тромбоцитарного N0 (б) у контрольных и опытных животных.

Исследование содержания метаболитов N0 в тромбоцитах у животных с ЖП показало достоверное его повышение до 2,68 (2,22-3,06) нмоль/0,5х108 против 1,87 (1,63-1,98) нмоль/0,5х108 в контроле (р<0,05) (рис. 6, б), которое можно объяснить, как защитную реакцию организма направленную на ингибирование экспрессии адгезивных молекул сосудистого эндотелия.

В последнее годы концепция процесса гемостаза подверглась пересмотру. Основную роль в запуске всех звеньев гемостаза отводится взаимодействию тканевого фактора, эндотелия сосудов, тромбоцитов и лейкоцитов. Для исследования состояния СТЗ гемостаза была изучена количественная характеристика тромбоцитов и его агрегационные свойства.

Так, у животных с ЖП обнаружено повышение количества Тр до 318 (309,6-321,4) х109/л против 199,7 (194,3-204,8) х109/л в контрольной группе (р<0,05) (рис. 7, а), которое отражает интенсивный и часто скрытый механизм активации тромбоцитов, играющий важную роль в нарушении микроциркуляции и тромбообразования.

■ МесКап I I 25%-75% М'т-Мах

■ МесКап I I 25%-75% Мт-Мах

Рис. 7. Показатели количества тромбоцитов (а) и времени агрегации тромбоцитов (б) у контрольных и опытных животных.

Одновременно у животных с ЖП наблюдалось усиление агрегационных свойств тромбоцитов до 8,1 (6-11) сек против 12,6 (10-15) сек у контрольных животных (р<0,001) (рис. 7, б), которое можно объяснить действием процессов свободнорадикального окисления.

Таким образом, свободнорадикальные процессы при экспериментальном желчном перитоните вызывают метаболические и функциональные расстройства практически всех органов и систем, проявлением которых является повреждение мембран клеток крови и эндотелия сосудов, активация СТЗ гемостаза. При этом общая направленность гемостаза носит тромбофилический характер, что проявляется увеличением количества тромбоцитов и активацией их агрегационных свойств.

Для целостного представления состояния изучаемых показателей в работе был использован один из методов факторного анализа - метод главных компонент (ГК). Исследованию подвергали ГК с собственным значением >1.0. При проведении факторного анализа были использованы 16 показателей, из которых для выявления наиболее значимых переменных были выделены 4 «больших» ГК (табл. 2).

Таблица 2

Величины факторных нагрузок на четыре ГК при анализе

ГК Признаки "— ГК-1 ГК-2 ГК-3 ГК-4

1. Лейкоциты 0,74 0,21 0,12 0,12

2. ЛИИ по Кальф-Калифу 0,71 0,22 0,22 -0,06

3. ДК 0,83 0,70 0,41 0,32

4. МДА 0,81 0,67 0,39 0,10

5. АЛТ 0,07 0,91 0,00 -0,12

6. АСТ -0,06 0,94 0,00 -0,15

7. БН-группы 0,65 0,81 0,12 -0,08

8. ССЭ 0,70 0,83 0,09 -0,1

9. Эндотелиальный N0 Плазмы 0,68 0,85 0,77 0,68

Ю.Тромбоцитарный N0 0,66 0,54 0,78 0,38

11. Тромбоциты 0,10 -0,11 0,05 0,96

12.Эритроциты 0,59 0,36 -0,11 0,18

13.Гематокрит 0,47 0,51 -0,21 0,23

Собственные значения 4,67 3,15 1,83 1,78

Накопленный % объясненной дисперсии 27,46 45,97 56,72 67,16

При этом факторные нагрузки, указанные в ячейках, являлись коэффициентами корреляции между соответствующими исходными признаками и ГК. Физиологический смысл ГК определялся исходными признаками, факторные нагрузки которых были >0,7.

Так, на величину ГК-1 оказывают сильное влияние концентрация ДК и МДА, лейкоцитов и ЛИИ, являющиеся маркерами воспалительной реакции и

эндогенной интоксикации (рис. 8). Всё это позволяет ГК-1 назвать «патогенетическим» фактором, который у животных с ЖП составляет 0,53±0,19 ед. против -0,76±0,18 ед. у животных контрольной группы (р<0,001).

1,5 1,0 0.5 3 0,0 •0,5 •1,0 •1,5

К 24-4. ЖП

Рис. 8. Динамика ГК-1 у контрольной и опытной группы животных.

На величину ГК-2 оказывают влияние активность внутриклеточных ферментов (ACT, AJIT), эндотелиальный NO плазмы, ССЭ и SH-группы (рис. 9), что позволяет её назвать «мембранным» фактором, который у животных с ЖП составляет -0,03±0,10 ед. против -0,49+0,13 ед. в контрольной группе (р<0,01).

0,3 0,2 0,1 0,0 ■0,1 г, -0.2

U -0,4 -0,5 -0,6 -0,7 •0,8 -0,9

Рис. 9. Динамика ГК-2 у контрольной и опытной группы животных.

Полученный результат является отражением роста активности маркерных ферментов крови и косвенно свидетельствует о нарушении барьерной функции клеточных мембран маркерных органов.

На величину ГК-3 сильное влияние оказывают эндотелиальный N0 плазмы и тромбоцитарный N0, что позволило назвать его фактором «метаболитов N0». У животных с ЖП он составляет 0,05±0,27 ед. против -0,08±0,16 ед. в контрольной группе, однако полученный результат не достоверен (р>0,05).

Высокие факторные нагрузки на ГК-4 оказывают - концентрация тромбоцитов, и несколько меньше - эндотелиальный N0 плазмы, что позволило назвать его «тромбоцитарным» фактором. У животных с ЖП он составляет 0,11±0,13 ед. против -0,24±0,09 ед. в контроле (р<0,05) (рис. 10).

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

Т 0,0

С -0,1 -0,2 -0,3 -0,4 -0,5 -0,6

Рис. 10. Динамика ГК-4 у контрольных и опытных животных.

Таким образом, наиболее информативными критериями диагностики ранних нарушений в патогенезе желчного перитонита в порядке уменьшения их значимости являются: ДК < МДА < концентрация лейкоцитов < ЛИИ < АСТ < АЛТ < метаболиты эндотелиального N0 плазмы < ССЭ < ЯН-группы < концентрация тромбоцитов.

Почки относятся к наиболее повреждаемым органам детоксикации, патоморфологические изменения в которых являются отражением

перитонита. При гистологическом исследовании у животных с ЖП определялся отек капсулы Шумлянского-Боумена, в корковом и мозговом веществе полнокровие сосудов со стазами и агрегацией эритроцитов, в капиллярах эритроцитарные и гиалиновые тромбы. Встречались канальцы, в которых не определялся просвет, вследствие десквамации эпителия. Эпителий извитых канальцев находился в состоянии белковой и гиалиново-капельной дистрофии с участками некроза и некробиоза. Наблюдалась полиморфноклеточная инфильтрация стромы (рис. 11).

Рис. 11. Патоморфологическая картина почки в контрольной (а) и опытной группе животных (б). Окраска гематоксилин-эозином.

При гистохимическом исследовании в отдельных капиллярах клубочков выявлялись гиалиновые тромбы, вакуольная дистрофия, слущивание эпителия канальцев (рис. 12).

Рис. 12. Гистохимическая картина почки в опытной группе, а - гиалиновые тромбы в капиллярах клубочков, выполненные «зрелым» фибрином; б -фибриноидное пропитывание стенок канальцев, выполненные «зрелым» фибрином. Окраска Пикро-Маллори.

В просвете канальцев наблюдались гиалиновые цилиндры, дающие положительную реакцию на «зрелый» фибрин. Стенки сосудов и почечных канальцев находились в состоянии фибриноидного пропитывания, выполненные «зрелым» фибрином.

Морфометрический анализ, проведенный на срезах биопатов почек у животных с ЖП выявил достоверное увеличение СР «зрелого» фибрина до 1647,0±242,0 мкм2 (р<0,001) и ОД до 63,2+2,0% (р<0,001), что свидетельствует о наличие объективных признаков ДВС-крови на микроциркуляторном уровне.

Таким образом, у животных с желчным перитонитом выявлены изменения, указывающие на развитие серозно-фибринозного воспаление с выраженными альтеративными и сосудисто-экссудативными проявлениями в виде отека межуточной ткани, лейкоцитарной инфильтрацией, дистрофических и некробиотических изменений. В сосудистом русле наблюдались микроциркуляторные расстройства, имеющие гиперкоагуляционную направленность, проявляющиеся полнокровием капилляров, стазами, агрегацией эритроцитов с образованием эритроцитарно-фибриновых тромбов, дающих положительную реакцию на «зрелый» фибрин и указывающие на наличие объективных признаков ДВС-крови.

ВЫВОДЫ

1. У животных с желчным перитонитом на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов происходит нарушение структурно-функциональной организации мембран клеток крови, что проявляется

достоверным ростом тиоловых групп, сорбционной способности эритроцитов и активности внутриклеточных ферментов.

2. При экспериментальном желчном перитоните наблюдается достоверное повышение содержания в крови метаболитов оксида азота, что является проявлением эндотелиальной дисфункции.

3. Развитие экспериментального желчного перитонита сопровождается активацией сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза, выражающейся увеличением количества тромбоцитов и активацией их агрегационных свойств.

4. Наиболее информативными критериями диагностики ранних проявлений развития синдрома системной воспалительной реакции при экспериментальном желчном перитоните в порядке уменьшения их значимости являются: ДК < МДА < концентрация лейкоцитов < ЛИИ < ACT < АЛТ < метаболиты N0 плазмы < ССЭ < SH-группы < концентрация тромбоцитов.

5. У животных с желчным перитонитом в почках выявлены морфофункциональные изменения, указывающие на развитие серозно-фибринозного воспаления с выраженными альтеративными и сосудисто-экссудативными проявлениями в виде отека межуточной ткани, лейкоцитарной инфильтрации, дистрофических и некробиотических изменений, полнокровия капилляров, агрегацией эритроцитов с образованием эритроцитарно-фибриновых тромбов, дающие положительную реакцию на «зрелый» фибрин с достоверным морфометрическим увеличением параметров его среднего размера и объемной доли, что указывает на наличие объективных признаков ДВС-синдрома.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Боташев A.A., Терещенко O.A., Петросян Э.А., Хасаева М.А. Оценка состояния гормонального баланса при экспериментальном желчном перитоните // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. - 2010. -№3,-С. 31-32.

2. Терещенко O.A., Боташев A.A., Петросян Э.А., Хасаева М.А. Нарушение функциональной системы детоксикации при экспериментальном желчном перитоните // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. -2010. -№3,- С. 85-86.

3. Петросян Э.А., Хасаева М.А., Боташев A.A., Терещенко O.A. Влияние натрия гипохлорита на морфофункциональное состояние структуры почки при экспериментальном желчном перитоните // Вестник морфологии. -2010. -16(2). - С. 285-290.

*4. Боташев A.A., Терещенко O.A., Хасаева М.А., Долгов В.Н., Петросян Э.А. Состояние мембран эритроцитов при экспериментальном желчном перитоните // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. -№3-4. - С. 36-39.

*5. Терещенко O.A., Боташев A.A., Хасаева М.А., Долгов В.Н., Петросян Э.А. Метаболические нарушения при экспериментальном жёлчном перитоните // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №3-4. - С. 178-183.

6. Боташев A.A., Терещенко O.A., Хасаева М.А., Петросян Э.А. Оценка осмотической проницаемости эритроцитов при остром желчном перитоните // Вестник интенсивной терапии. - 2010. - №5. - С. 16-20.

7. Терещенко O.A., Боташев A.A., Хасаева М.А., Петросян Э.А. Оценка состояния белкового и углеводного обмена при остром желчном перитоните // Вестник интенсивной терапии. - 2010. - №5. - С. 34-36.

8. Петросян Э.А., Терещенко O.A., Боташев A.A., Хасаева М.А. Оценка роли оксида азота в нарушении некоторых компонетов гомеостаза при желчном перитоните // XVII Международная конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Ялта-Гурдзуф, 2010. - С. 164-165.

9. Петросян Э.А., Терещенко O.A., Боташев A.A., Хасаева М.А. Роль оксида азота в формировании метаболических нарушений при экспериментальном желчном перитоните // Сбор. тр. XVIII Санкт-Петербургского нефрологического семинара с международным участием «Белые ночи». - Санкт-Петербург, ФОЛИАНТ, 2010. - С. 38-41.

*10. Боташев A.A., Терещенко O.A., Помещик Ю.В., Хасаева М.А., Петросян Э.А. Оценка состояния системной воспалительной реакции при желчном перитоните // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. -№9. - С. 39-42.

*11. Терещенко O.A., Боташев A.A., Помещик Ю.В., Хасаева М.А., Петросян Э.А. Влияние натрия гипохлорита на состояние системной воспалительной реакции и гормональный обмен при лечении желчного перитонита // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №9. -С. 149-153.

12. Петросян Э.А., Терещенко O.A., Боташев A.A., Долгов В.Н., Хасаева М.А., Губаз С.Г. Экстра- и интракорпоральная гемокоррекция

синдрома эндогенной интоксикации при желчном перитоните // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2011. - Приложение №1 (33). С. 284-285.

13. Боташев A.A., Терещенко O.A., Петросян Э.А., Хасаева М.А. Состояние процессов про- и антиоксидантной системы крови при желчном перитоните // XI съезд хирургов Российской Федерации. - Волгоград, 2011. -С.58.

14. Боташев A.A., Терещенко O.A., Петросян Э.А., Хасаева М.А. Интегральные показатели крови, характеризующие состояние окислительного стресса при желчном перитоните // XI съезд хирургов Российской Федерации. - Волгоград, 2011. - С. 58-59.

15. Петросян Э.А., Хасаева М.А., Терещенко O.A., Боташев A.A.. Диагностическая значимость маркеров эндотелиальной дисфункции при экспериментальном желчном перитоните. Сбор, трудов XIX ежегодной международной нефрологической конференции «Белые ночи». - Санкт-Петербург, ФОЛИАНТ, 2011, - С. 47-48.

16. Боташев A.A., Терещенко O.A., Хасаева М.А., Петросян Э.А. Тромбоцитрно-эритроцитарные отношения в диагностике агрегантного состояния крови при желчном перитоните // Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии». - Геленджик. - 2011. - С. 42-43.

*- работы, опубликованные в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных журналов и изданий.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ВНСММ - вещества низкой и средней молекулярной массы ГК - главная компонента ЖП - желчный перитонит ОД - объемная доля СР - средний размер

ССЭ - сорбционная способность эритроцитов СТЗ - сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза iNOS - индуцибельная NO синтаза NO - оксид азота SH-группы - тиоловые группы

Сдано в набор 11.10.2011 г. Подписано в печать 12.10.2011 г. Формат 60x84 1/16. Усл. п.л. 1,4. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Тираж 100. Заказ 99.

Сверстано и отпечатано ИП Купреев В.В. 353240, Краснодарский край, ст. Северская, ул. Народная, 41.

Актуальность проблемы. В европейских странах около 10% взрослого населения имеет желчные камни [Festi D. et al., 1999]. Ежегодно в мире выполняется более 1,5 миллионов холецистэктомий поводу желчнокаменной болезни [Ветшев П.С., Ногтев П.В., 2005]. Несмотря на широкое внедрение малоинвазивных методов в современной хирургии печени и желчевыводящих путей, количество ятрогенных осложнений, одним из которых является желчный перитонит, не имеющих тенденции к снижению [Левин JI.A., 2009; AmendolaraM. et al., 2001]. Желчный перитонит при повреждении внепеченочных желчевыводящих путей во время лапароскопической холецистэктомии развивается у 94,5% пациентов [Nardello О. et al., 2003]. Он также может осложнять течение трансплантации печени, эндоскопических эндобилиарных вмешательств, лапароскопической и чрезкожной пункционной биопсии печени [Капранов С.А., Хачатуров A.A., 2008; Lebeau G., et al., 1996; Bravo A.A., et al., 2001; Orlando R., Lirussi F., 2004; Sanai F.M., Keeffe E.B., 2010].

Желчный перитонит является одним из наиболее тяжелых осложнений острых хирургических заболеваний органов брюшной полости [Совцов С.А., 2001; Журавлев В.Н. и соавт. 2003; Pikoulis Е. et al., 2006; Liess B.D. et al., 2006; Aydin U. et al., 2007; Kang D.O. et al., 2008]. Однако, несмотря на всю серьезность данной патологии, он остается обойденной вниманием хирургов [Thompson R.W., Schuler J.G. 1986; Andersson R. et al., 1990; Sokemen S, et al., 2001; Yang H. et al., 2004; Maghsoudi H. et al., 2005].

Диагностика и лечение желчного перитонита продолжают оставаться сложной клинической задачей (Gabriele R. et al., 2010). Единичные исследования посвящены цитологической диагностике желчного перитонита [Elsheikh Т.М., et al.,1996], роли окислительного стресса [Карякина Е.В.,

Белова C.B., 2004; Sun D., Aikawa N., 1999], печеночно-почечной недостаточности [Козлов B.C. и соавт., 2003; Baylis С., Bloch J., 1996; Numata M. et al., 2003]. До настоящего времени отсутствует единая классификация желчного перитонита [Koch M. et al., 2011]. При этом исследование патогенеза, разработка новых методов диагностики и лечения желчного перитонита продолжают оставаться вне поля зрения исследователей, несмотря на то, что послеоперационная летальность составляет при желчном перитоните от 10 до 34% [Брискин Б.С., 2006; Курбонов K.M., Даминова Н.М., 2007; Amorotti С. et al., 2002].

Нерешенность приведенных выше проблем делает необходимым проведение дальнейших исследований с целью углубления представления о патогенезе, механизмах развития полиорганной недостаточности, разработки новых методов ранней диагностики и лечения желчного перитонита.

1. Цель исследования - оценить влияние окислительного стресса на состояние мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните.

Задачи исследования.

1. Оценить структурно-функциональные нарушения состояния мембран клеток крови у животных с желчным перитонитом.

2. В опытах на животных с желчным перитонитом охарактеризовать метаболизм оксида азота.

3. У животных с желчным перитонитом установить характер нарушения сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза.

4. Методом многомерного анализа определить наиболее информативные диагностические критерии тяжести течения экспериментального желчного перитонита.

5. В опытах на животных с желчным перитонитом оценить морфофункциональные и морфометрические изменения в почках для определения направленности гемокоагуляционных расстройств.

Новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований впервые:

- установлено, что при экспериментальном желчном перитоните на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов происходит нарушение структурно-функциональной организации клеточных мембран эритроцитов, сопровождающихся повышением содержания в крови 8Н-групп, ростом ССЭ, повышением активности внутриклеточных ферментов крови (АСТ, АЛТ), нарушением метаболизма эндотелиального N0 плазмы и тромбоцитарного N0, а также активация сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза;

- наиболее информативными лабораторными показателями влияния окислительного стресса на состояние мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните в порядке уменьшения их значимости являются: ДК < МДА < концентрация лейкоцитов < ЛИИ < АСТ < АЛТ < метаболиты эндотелиального N0 плазмы < ССЭ < БН-групп < концентрация тромбоцитов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Ведущим звеном пато- и морфогенеза экспериментального желчного перитонита является синдромом эндогенной интоксикацией с нарушением структурно-функциональной организации клеточных мембран эритроцитов, ферментемией, нарушением метаболизма эндотелиального и тромбоцитарного N0, расстройством микроциркуляции в виде полнокровия капилляров, стазами, агрегацией эритроцитов с образованием эритроцитарно-фибриновых тромбов, дающие положительную реакцию на «зрелый» фибрин и указывающие на наличие объективных признаков ДВС-крови.

2. Расширены современные представления о пато- и морфогенезе гемокоагуляционных расстройств при экспериментальном желчном перитоните.

Теоретическая значимость исследования

Совокупность полученных данных существенно расширяет и систематизируют представления о патогенезе и морфогенезе желчного перитонита, что может служить базой для проведения дальнейших научно-исследовательских работ.

Практическая значимость исследования

Выявленный комплекс наиболее информативных лабораторных показателей крови может быть использован для ранней диагностики желчного перитонита, разработки патогенетически обоснованных методов лечения и оценки их эффективности.

Сведения о практическом использовании результатов исследования

Внедрение более информативных критериев диагностики в практику лечебных учреждений позволит проводить раннюю диагностику желчного перитонита. Основные научные положения работы включены в план лекционного материала и практических занятий кафедр патологической физиологии и патологической анатомии, клинической иммунологии и лабораторной диагностики Кубанского государственного медицинского университета.

По результатам исследования опубликованы 20 печатных работ (см. приложение 2).

Считаю своим долгом выразить искреннюю признательность и глубокую благодарность моему научному руководителю, заведующему кафедрой топографической анатомии и оперативной хирургии Кубанского государственного медицинского университета доктору медицинских наук профессору Эдуарду Арутюновичу Петросяну и научному консультанту доктору медицинских наук Игорю Васильевичу Аксенову за ежедневную помощь в выполнении работы.

Выражаю благодарность и признательность коллективу кафедры топографической анатомии и оперативной хирургии за оказанную помощь и дружескую поддержку в выполнении диссертационной работы.

ВЫВОДЫ

1. У животных с желчным перитонитом на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов происходит нарушение структурно-функциональной организации мембран клеток крови, что проявляется достоверным ростом тиоловых групп, сорбционной способности эритроцитов и активности внутриклеточных ферментов.

2. При экспериментальном желчном перитоните наблюдается достоверное повышение содержания в крови метаболитов оксида азота, что является проявлением эндотелиальной дисфункции.

3. Развитие экспериментального желчного перитонита сопровождается активацией сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза, выражающейся увеличением количества тромбоцитов и активацией их агрегационных свойств.

4. Наиболее информативными критериями диагностики ранних проявлений развития синдрома системной воспалительной реакции при экспериментальном желчном перитоните в порядке уменьшения их значимости являются: ДК < МДА < концентрация лейкоцитов < ЛИИ < ACT < АЛТ < метаболиты N0 плазмы < ССЭ < SH-группы < концентрация тромбоцитов.

5. У животных с желчным перитонитом в почках выявлены морфофункциональные изменения, указывающие на развитие серозно-фибринозного воспаления с выраженными альтеративными и сосудисто-экссудативными проявлениями в виде отека межуточной ткани, лейкоцитарной инфильтрации, дистрофических и некробиотических изменений, полнокровия капилляров, агрегацией эритроцитов с образованием эритроцитарно-фибриновых тромбов, дающие положительную реакцию на «зрелый» фибрин с достоверным морфометрическим увеличением параметров его среднего размера и объемной доли, что указывает на наличие объективных признаков ДВС-синдрома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время накоплены факты, свидетельствующие о перспективности изучения роли окислительного стресса, включающего метаболические и функциональные расстройства практически всех органов и систем организма [Миронов И.П. и др., 1999]. Известно, что первой ответной реакцией организма на воспаление является нарушение микроциркуляции с развитием гипоксии, нарушением трофики и задержки выведения токсических веществ [Козлов B.C., Шиленкова В.В., Чистякова О.Д., 2003; Numata M. et al., 2003]. Возникающие расстройства являются предпосылками развития коагулопатии на уровне микроциркуляторного русла с развитием ДВС-крови [Козлов B.C., Шиленкова В.В., Чистякова О.Д., 2003; Numata M. et al., 2003]. Возникающие расстройства значительно утяжеляют течение желчного перитонита и зачастую является непосредственной причиной смерти больного [Марусанов В.Е. и др., 1995].

В настоящее время принята концепция неспецифической реакции организма на повреждение в виде синдрома системной воспалительной реакции [Карякина Е.В., Белова C.B., 2004; Sun D., Aikawa N., 1999], проявлением которой являются эндотелиальная дисфункция в результате нарушения синтеза оксида азота [Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997; Stolarek R., Kulf P., Kurmanowska Z., 1998].

Общепризнанно, что основным патогенетическим фактором при развитие перитонита является эндотоксикоз, представляющий собой сложный патогенетический комплекс, включающий метаболические и функциональные расстройства практически всех органов и систем, обусловленный микробной инвазией, накоплением промежуточных и конечных продуктов обмена веществ, угнетением органов функциональной системы детоксикации и изменениями их морфологической структуры [Кирковский В.В., 1997; Миронов И.П. и соавт., 1999; Елютин Д.В. и др., 2002]. Одним из наиболее уязвимых органов при развитии перитонита являются почки, где в эндотелии, гладкомышечных клетках почечных сосудов, мезангиальных клетках клубочка и эпителиальных клетках канальцев происходит постоянный синтез оксида азота [Марков Х.М., 1996; Baylis С., Bloch J., 1996], который регулируют почечный кровоток, перфузионное давление, а также влияет на реабсорбцию ионов канальцами и собирательными трубочками [Марков Х.М., 1996].

Общеизвестно, что системный характер воспаления брюшины приводит к мобилизации костномозгового резерва и пристеночного пула нейтрофильных лейкоцитов, составляющих около 2/з всех лейкоцитов способных функционировать в гипоксических очагах благодаря наличию системы анаэробного гликолиза и выполнять функцию неспецифической защиты организма.

Таким образом, количественное и качественное соотношение лейкоцитов в крови может отражать уровень воспалительной реакции организма и служить оценкой системного характера лейкоцитарной реакции в процессе развития заболевания.

Изучение лейкоцитарного звена неспецифической резистентности организма у животных с 24-часовым желчным перитонитом выявил достоверное повышение концентрации лейкоцитов в периферической крови приблизительно в 2 раза относительно животных контрольной группы (р<0,05). Наиболее выраженные результаты были получены при подсчете абсолютного содержания палочкоядерных нейтрофилов, когда его кратность достоверно возрастала в 5 раз, а сегментоядерных нейтрофилов - более 2 раз (р<0,05).

Важным показателем при оценке степени выраженности воспалительной реакции было изучение относительного соотношения лейкоцитарных фракций, выявившее у животных с 24-часовым желчным перитонитом достоверный рост относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов в 2,58 раза относительно животных контрольной группы р<0,05) и достоверное снижение относительного содержания моноцитов и лимфоцитов в 2 и 2,8 раза соответственно (р<0,05). В то же время содержание сегментоядерных лейкоцитов не отличалось от контрольных цифр (р>0,05).

В процессе развития экспериментального желчного перитонита со стороны белого ростка крови были выявлены не только количественные, но и качественные изменения, которые нашли свое отражение в ЛИИ, который у животных с 24-часовым желчным перитонитом в 10 раз превышал показатели контрольных животных (р<0,001).

Таким образом, у животных с желчным перитонитом наблюдались признаки синдрома системной воспалительной реакции, когда отмечалось более чем двукратное повышение количества лейкоцитов и рост относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов. При этом выраженный лейкоцитоз и «омоложение» лейкоцитарной формулы свидетельствовали в пользу повышения содержания лейкоцитов не только за счёт мобилизации пристеночного пула нейтрофильных лейкоцитов, но и за счёт активации костномозгового резерва гранулоцитов, как ответ на развитие эндогенной интоксикации. В то же время, отмечаемый рост относительного содержания в крови более молодых палочкоядерных форм нейтрофилов и более чем десятикратный рост ЛИИ, являлся признаком напряженности компенсаторных механизмов, обеспечивающий процессы детоксикации организма. Наблюдаемое снижение абсолютного и относительного содержания моноцитов у животных с желчным перитонитом, по-видимому, можно объяснить активным перемещением клеток из сосудистого русла в ткани, а снижение относительного содержания лимфоцитов обусловлено ростом содержания нейтрофильных лейкоцитов.

Общеизвестно, что нарастающая эндогенная интоксикация приводит к образованию избыточного количества АФК, под действием которых происходит повреждение структурных элементов мембран клеток крови и нарушение метаболизма клеток [ВаЛоэг в., 1990; Саргагу Р. Qt а1., 1995].

Так, у животных с 24-часовым желчным перитонитом отмечался достоверный рост первичных (ДК) и вторичных продуктов (МДА) ПОЛ в плазме и эритроцитах. Так, уровень ДК в плазме у животных с 24-часовым желчным перитонитом достигал 16,62 (15,29-17,13) отн. ед. против 6,32 (6,03-6,99) отн. ед. у животных контрольной группы (р<0,05), а в эритроцитах - 11,39 (10,75-12,48) отн. ед. против 3,06 (2,59-3,37) отн. ед. (р<0,05), соответственно.

Поскольку реакции ПОЛ на клеточном уровне протекают, прежде всего, на мембранах эритроцитов, антиоксидантная защита которых нарушена, можно полагать, что рост ДКэр у животных с желчным перитонитом происходит в основном в клетках с нарушенным структурно-функциональным состоянием не способных к выполнению своих функций.

Дальнейшее окисление ДК приводит к образованию вторичных продуктов ПОЛ, наиболее важным из которых является МДА. Если рост ДК в клетке можно отнести в разряд адаптивных реакций, то появление большого количества МДА является не только результатом и показателем активизации свободно-радикального окисления, но и фактором, влияющим на дальнейшую интоксикацию. Именно это мы наблюдали у животных с 24-часовым желчным перитонитом, когда рост МДА в плазме достигал 10,32 (9,60-10,77) мкмоль/л против 4,70 (4,47-4,89) мкмоль/л у контрольных животных (рис. 3.8). При этом повышение вторичных продуктов в плазме происходило более интенсивно, чем в эритроцитах, где концентрация МДА составляла 8,47 (7,93-9,68) мкмоль/л против 4,98 (4,86-5,13) мкмоль/л у контрольных животных. Менее интенсивный рост МДА в эритроцитах по сравнению с ДК объясняется большей устойчивостью антиоксидантной системы эритроцитов, тормозящей свободнорадикальное окисление в основном на уровне первичных, малотоксичных продуктов.

Таким образом, у животных с желчным перитонитом в плазме происходит накопление вторичных продуктов, что свидетельствует не только об интенсивном метаболизме первичных продуктов, но и, вероятно, о замедленном их выведении из организма. Иная динамика наблюдается в эритроцитах, когда одновременно отмечается достоверный рост, как первичных, так и вторичных продуктов, что является косвенным свидетельством повреждения структурно-функционального состояния мембран клеток крови.

Эритроциты представляют собой наиболее удобную модель для исследования механизмов свободнорадикального повреждения структурных компонентов мембран клетки, что и послужило причиной изучения его проницаемости и сорбционной способности.

В качестве маркера проницаемости мембран эритроцитов использовали показатель определяющий общее количество БН-, который у животных с желчным перитонитом повышался приблизительно 2 раза относительно контроля, что указывает на дестабилизацию барьерной функции эритроцитов. При этом не исключено, что выход 8Н-групп, во-первых, может быть защитной реакцией, направленной на нейтрализацию АФК и блокаду процессов ПОЛ и, во-вторых, активацию клеточного фермента гуанилатциклазы, который при взаимодействии тиоловых групп с оксидом азота, опосредует эффекты последнего.

Полученные данные позволяют обосновать кластерный механизм повышения проницаемости мембран эритроцитов у животных с желчным перитонитом, согласно которому модифицированные молекулы фосфолипидов под действием процессов свободнорадикального окисления объединяются во внешнем и во внутреннем монослое мембраны в перекисные кластеры и становятся причиной образования полярных каналов проницаемости.

Общеизвестно, что ВСНММ сорбируются на мембране эритроцитов с целью их доставки к органам функциональной системы детоксикации.

Одним из показателей, позволяющих оценить действие процессов свободнорадикального окисления на мембрану клетки крови, является ССЭ, которая у животных с 24-часовым желчным перитонитом достоверно снижалась до 12,33 (10,9-13,7) % против 22,18 (19,8-25,1) % в контрольной группе (р<0,05), что является объективным отражением степени тяжести эндогенной интоксикации и обусловлено структурно-функциональными повреждениями мембран эритроцитов.

Таким образом, интенсификация процессов перекисного окисления липидов у животных с желчным перитонитом ведет к возникновению зон повышенной ионной проницаемости и инициирует целый ряд физико-химических изменений в мембранах эритроцитов. На основании этого, естественно предположить, что проницаемость мембран эритроцитов и сорбционная способность эритроцитов могут служить основными критериями определения степени тяжести эндогенной интоксикации.

Традиционным способом исследования нарушения проницаемости мембран клеток является изучение активности внутриклеточных ферментов исследование, которых у животных с желчным перитонитом показало увеличение активности ACT в 1,6 раза; а АЛТ в 2,35 раза относительно животных контрольной группы, что является отражением активации анаболических и катаболических процессов.

Таким образом, на фоне развития синдрома эндогенной интоксикации при экспериментальном желчном перитоните одним из основных факторов, обеспечивающих активацию энергетических процессов, является ферментемия.

Известно, что соотношение трансаминаз АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса) — отражает физиологическую координированность катаболического и анаболического пула [Рослый И.М., Белова Е.Г., Вакуленко В.Б., 1999].

Исследование коэффициента де Ритиса у животных с желчным перитонитом показало преобладание роста активности АЛТ над ACT, что приводило к его падению до 0,81 ±0,09 против 1,19±0,09 в контрольной группе. Данный факт свидетельствует о преобладание анаболических процессов, над катаболическими за счет интенсивности глюконеогенеза. Об интенсификации процесса глюконеогенеза у животных с желчным перитонитом свидетельствует не только низкий коэффициент де Ритиса (< 1) (анаболический тип метаболизма), но и высокая активность AJIT. Необходимо также обратить внимание, что анаболический тип метаболизма у животных с желчным перитонитом достаточно интенсивно протекают с катаболическими, что подтверждается высоким ACT. Все это позволяет исследуемые показатели ферментемии рекомендовать для оценки направленности и интенсивности важнейших метаболических процессов при состояниях, сопровождающихся синдромом системной воспалительной реакции.

В последние годы внимание исследователей при перитоните уделяется изучению механизмов возникновения эндотелиальной дисфункции в результате нарушения продукции оксида азота [Davis K.L. et al., 2001]. Несмотря на большое количество опубликованных работ, данные о метаболизме NO при желчном перитоните отсутствуют.

При исследовании содержания NO в плазме крови у животных с желчным перитонитом наблюдалось достоверное его повышение до 5,30 (4,65-5,95) мкмоль/л против 4,08 (3,8-4,95) мкмоль/л в контрольной группе животных (р<0,05). Полученные результаты могут свидетельствовать, что при желчном перитоните происходит экспрессия индуцибельной NO-синтазы и развитие эндотелиальной дисфункции.

Известно, что NO синтезируется не только в эндотелиоцитах, но и в самих тромбоцитах [Mazzanti L, Mutus В., 1997].

При исследовании уровня генерации метаболитов NO в тромбоцитах у животных с 24-часовым желчным перитонитом отмечалось достоверное его повышение до 2,68 (2,22-3,06) нмоль/0,5х108 против 1,87 (1,63-1,98) нмоль/0,5х108 в контрольной группе (р<0,05), которую можно объяснить, как защитную реакцию организма направленную на ингибирование экспрессии адгезивных молекул сосудистого эндотелия.

Таким образом, одним из возможных патогенетических механизмов эндотелиальной и тромбоцитарной дисфункции метаболизма N0 при желчном перитоните, является запуск механизмов повреждения эндотелия сосудов и нарушения функции тромбоцитов с его гиперпродукцией, приводящей к активации свертывающей системы крови.

В последнее десятилетие концепция процесса свертывания крови подверглась значительному пересмотру. В центре внимания оказалось то, что в запуске свертывания крови основную роль играет взаимодействие тканевого фактора, эндотелия сосудов и лейкоцитов. Система свертывания крови - многокомпонентный комплекс.

Сосудисто-тромбоцитарное звено (СТЗ) представляет собой один из этапов гемостаза, он не только обеспечивает формирование направленного тромбообразования и поддержание жидкого состояния крови, но и участвует в репаративных процессах в местах сосудистых и тканевых повреждений. В их осуществлении большую роль играют тромбоциты.

Для объективной оценки состояния СТЗ гемостаза необходима количественная характеристика тромбоцитов и определение их агрегационных свойств.

У животных с 24-часовым желчным перитонитом обнаружено достоверное повышение количества тромбоцитов до 318 (309,6-321,4) х109/л против 199,7 (194,3-204,8) х109/л в контрольной группе (р<0,001). Полученный результат, отражает экстенсивный механизм активации СТЗ гемостаза за счет перераспределения тромбоцитов в сосудистом русле и их участие в процессах воспаления и репарации в качестве источника тромбоцитарных факторов роста, стимулирующих пролиферацию эндотелия и ингибирующих коллагеназы. Подобное повышение содержания тромбоцитов в крови животных с желчным перитонитом может происходить, по-видимому, за счет гемоконцентрации в результате которой повышается показатель гематокрита, содержание эритроцитов и гемоглобина или истинного повышения количества тромбоцитов в крови.

Для решения вопроса о том, какой из механизмов является доминирующим при повышении количества тромбоцитов, нами проведено сравнение средней степени повышения гематокрита, тромботокрита (объемная доля тромбоцитов в крови), эритроцитов и гемоглобина.

Повышение количества тромбоцитов в крови у животных с желчным перитонитом могло произойти, как за счет гиповолемии, которая характеризовалась достоверным ростом гематокрита до 51,8 (48,4-56,3)% против 40,75 (33,7-42,9)% у контрольных животных (р<0,05), так и за счет роста тромботокрита до 0,27 (0,27-0,28)% против 0,19 (0,18-0,20)% (р<0,05) соответственно. Подобную же направленность у животных с желчным перитонитом мы наблюдали, когда отмечали рост количества эритроцитов до 8,17 (7,46-8,91)х1012/л против 6,32 (5,59-6,75)х1012/л у контрольных животных (р<0,05) и концентрации гемоглобина до 179,0 (158-191) г/л против 141,5(121-149) г/л у контрольных животных (р<0,05).

Таким образом, увеличение количества тромбоцитов у животных с желчным перитонитом носит характер истинного увеличения, а не обусловлено исключительно явлением гемоконцентрации, в то время как рост показателей эритроцитов и гемоглобина объяснялось, прежде всего, гемоконцентрацией, а не активацией гемопоэза или выходом эритроцитов из кровяного депо.

При изучении времени агрегации тромбоцитов у животных с желчным перитонитом наблюдалось усиление агрегационных свойств тромбоцитов до 8,1 (6-11) сек против 12,6 (10-15) сек у контрольных животных (р<0,001), что может быть результатом действия продуктов свободнорадикального окисления.

Таким образом, развитие желчного перитонита сопровождается увеличением количества тромбоцитов и усилением их агрегационной способности, которое может играть роль в развитие ДВС-крови.

В настоящее время проведение всестороннего обследования больного не предоставляется возможным, что не позволяет создать целостное представление о состоянии организма [Соловьев М.М., Большаков О.П., 2001]. В то же время не вызывает сомнения тот факт, что исследования должны быть комплексными, так как большинство показателей гомеостаза в той или иной степени взаимозависимы. Анализ таких показателей традиционными статистическими методами должен дополняться различными методами многомерного анализа, позволяющими создать целостное представление об изменениях регуляторных систем организма. Одним из таких методов является факторный анализ, который позволяет одновременно рассматривать большое число взаимозависимых признаков. Метод факторного анализа позволяет выявить латентные факторы и придать им содержательную интерпретацию.

В нашей работе использовали один из методов факторного анализа -метод главных компонент (ГК). В терминах факторного анализа пространство признаков является многомерным (п - мерным), где п - число исходных признаков, взятых для исследования. Каждый объект исследования в каждый момент времени представляется точкой в этом пространстве. Одной из характеристик признакового пространства является существенная неортогональность, которая обусловлена достоверной корреляцией некоторых признаков. В этом случае оси признакового пространства оказываются сильно сближенными. В рамках метода ГК производят построение новой системы координат, в которой главные компоненты являются линейной комбинацией исходных признаков и образуют новые координатные оси. Максимально возможное количество ГК равно числу исходных признаков факторного анализа. Первая ГК проходит вдоль наиболее длинной оси облака данных в признаковом пространстве, выбирая максимум всей изменчивости. В многомерном пространстве все ГК ортогональны друг к другу, причем каждая последующая ГК выбирает максимум оставшейся изменчивости. С ростом порядкового номера ГК уменьшается её информационная нагрузка, что имеет свое отражение в величине собственного значения фактора, которая показывает во сколько раз информативность ГК больше, чем средняя информативность показателя исходных данных. Обычно исследованию подвергают только те ГК, которые обладают собственным значением большим 1.0, т.е. так называемые «большие» ГК. Для выявления содержательной интерпретации ГК использован метод вращения факторов, максимизирующий дисперсию, и, соответственно, улучшающий качество разделения различных групп объектов в факторном пространстве - Varimax row.

При проведении факторного анализа в контрольной группе животных и животных с 24-часовым желчным перитонитом были использованы 16 показателей, из которых для выявления наиболее значимых переменных было выделено 4 «больших» ГК.

При этом факторные нагрузки, указанные в ячейках таблицы, являлись коэффициентами корреляции между соответствующими исходными признаками и главными компонентами. Физиологический смысл главной компоненты определяется исходными признаками, факторные нагрузки которых на данную главную компоненту >0,7 по модулю. Поскольку главные компоненты являются новыми искусственно построенными признаками, то имеет смысл рассмотреть динамику каждой главной компоненты при развитии экспериментального желчного перитонита.

Так, на величину ГК-1 оказывают сильное влияние концентрация ДК и МДА, лейкоцитов и ЛИИ, являющиеся маркерами воспалительной реакции и интоксикационного синдрома. Меньшее влияние на величину ГК-1 оказывают метаболиты эндотелиального NO плазмы, концентрация эритроцитов и гематокрит. Всё это позволяет ГК-1 назвать «патогенетическим» фактором, который у животных с желчным перитонитом составляет 0,53±0,19 ед., что достоверно превышает величину данного показателя у животных контрольной группы - -0,76±0,18 ед. (р<0,001).

Следующая по информативности - ГК-2, на величину которой оказывают влияние активность таких внутриклеточных маркерных ферментов как АСТ, АЛТ, метаболиты эндотелиального N0 плазмы, ССЭ и ЭН-группа, что позволяет её назвать «мембранным» фактором, который у животных с желчным перитонитом составляет -0,03±0,10 ед. и достоверно превышает величину данного показателя у животных контрольной группы - -0,49±0,13 ед. (р<0,01), что является отражением роста активности маркерных ферментов в крови и косвенно свидетельствует о нарушении барьерной функции мембран клеток маркерных органов.

На величину ГК-3 сильное влияние оказывают метаболиты эндотелиального N0 плазмы и тромбоцитарный N0, что позволило назвать его фактором «метаболитов N0». У животных с ЖП он составляет 0,05±0,27 ед. против -0,08±0,16 ед. в контрольной группе, однако полученный результат не достоверен (р>0,05).

Высокие факторные нагрузки на ГК-4 оказывают — концентрация тромбоцитов крови, и несколько меньше - эндотелиальный N0 плазмы, что позволило назвать его «тромбоцитарным» фактором, который у животных с желчным перитонитом составляет 0,11±0,13 ед. против -0,24±0,09 ед. в контрольной группе (р<0,05).

Таким образом, наиболее информативными критериями диагностики ранних нарушений в патогенезе желчного перитонита в порядке уменьшения их значимости являются: ДК < МДА < концентрация лейкоцитов < ЛИИ < АСТ < АЛТ < метаболиты эндотелиального N0 плазмы < ССЭ < БН-групп < концентрация тромбоцитов.

Учитывая, что развитие перитонита сопровождается снижением функциональной способности органов детоксикации, стрессовым истощением эндокринных органов [Кирковский В.В., 1997] и гемокоагуляционными расстройствами [Симоненков А.П., Федоров В.Д., 1998] мы поставили задачу получить сведения, касающиеся морфофункциональных изменений происходящих в почках.

При микроскопическом исследовании препаратов почек у животных с 24-часовым желчным перитонитом отмечалась бледная окраска коркового и полнокровие (темноватая окраска) мозгового слоя, отек капсулы Шумлянского-Боумена, расширение и полнокровие клубочков, а также в различной степени выраженности кровоизлияния в тубулярную ткань почки. Наблюдалась выраженная полиморфноклеточная инфильтрация стромы с преобладанием нейтрофильных гранулоцитов. Эпителий извитых канальцев находился в состоянии гидропической дистрофии с участками некроза и некробиоза. Встречались канальцы, в которых не определялся просвет, вследствие десквамации эпителия.

При гистохимическом исследовании в отдельных капиллярах клубочков выявлялись гиалиновые тромбы, вакуольная дистрофия и слущивание эпителия канальцев, гиалиновые цилиндры в их просвете, дающие положительную реакцию на «зрелый» фибрин. Стенки почечных канальцев находились в состоянии фибриноидного пропитывания, выполненные «зрелым» фибрином. Одновременно определялось фибриноидное набухание стенок сосудов с отложением «зрелого» фибрина.

Для подтверждения полученных морфологических и гистохимических изменений у животных с желчным перитонитом были проведены морфометрические исследования среднего размера (СР) и объёмной доли (ОД) выявленного «зрелого» фибрина в почках.

Морфометрический анализ проведенный у животных с 24-часовым желчным перитонитом выявил достоверное увеличение среднего размера «зрелого» фибрина в почках до 1647,0+242,0 мкм2 (р<0,001) и объемной его доли до 63,2±2,0 (р<0,001), который подтверждает наличие объективных признаков ДВС-крови в почках на микроциркуляторном уровне.

Завершая обсуждение полученных результатов, необходимо подчеркнуть, что на основании проведенных морфофункциональных исследований биоптатов почки у животных с 24-часовым желчным перитонитом были выявлены изменения, указывающие на развитие серозно-фибринозного воспаление, характеризующиеся выраженными альтеративными и сосудисто-экссудативными проявлениями в виде отека межуточной ткани, лейкоцитарной инфильтрацией, дистрофических и некробиотических изменений. В сосудистом русле почек наблюдались выраженные микроциркуляторные расстройства, имеющие гиперкоагуляционную направленность, проявляющуюся полнокровием капилляров, стазами, агрегацией эритроцитов с образованием эритроцитарно-фибриновых тромбов, указывающие на наличие объективных признаков внутрисосудистого свертывания крови. Выявленные нарушения свертывающей системы крови при биохимическом исследовании были созвучны с изменениями, обнаруженными морфологическими и гистохимическими методами, которые свидетельствовали о наличии гемокоагуляционных расстройств, имеющих тромбофилическую направленность.

На основании вышеизложенного изучение синдрома системной воспалительной реакции и сопряженной с ним эндогенной интоксикации, вместе с детализацией паренхиматозно-стромальных и межклеточных взаимоотношений при желчном перитоните, — заслуживают дальнейшего изучения. По нашему мнению, это должно способствовать расширению арсенала лечебных воздействий и, в итоге, — повышению эффективности лечения пациентов в клинике.