Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Влияние натрия гипохлорита на состояние мембран клеток крови и эндотелия сосудов при желчном перитоните

ООБОДЭ**'-

На правах рукописи

ДОЛГОВ Владимир Николаевич

ВЛИЯНИЕ НАТРИЯ ГИИОХЛОРИТА НА СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН КЛЕТОК КРОВИ И ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ПРИ ЖЕЛЧНОМ ПЕРИТОНИТЕ

(экспериментальное исследование)

14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

- 7

Краснодар - 2012

005045422

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России).

Научный руководитель: заслуженный изобретатель РФ,

лауреат премии Правительства РФ и РАМН, доктор медицинских наук профессор Петросян Эдуард Арутюнович

Научный консультант: доктор медицинских наук

Лайпанов Хаджи Ислам Хаджи Мекерович.

Официальные оппоненты:

Гуменюк Сергей Евгеньевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой хирургии педиатрического и стоматологического факультетов

Виниченко Алексей Викторович, доктор медицинских наук, ГУЗ Краевого онкологического диспансера №1 департамента здравоохранения Краснодарского края, врач

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздравсоцразвития России).

Защита состоится 20 июня 2012 г. в 10.00 часов на заседании

диссертационного совета Д208.038.01 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ

Минздравсоцразвития России (350063, Краснодар, ул. Седина, 4, тел (861)262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « И? 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета профессор

Шейх-Заде Юрий Решадович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время желчнокаменная болезнь (ЖКБ) является чрезвычайно распространенной патологией органов пищеварения во всех странах и регионах мира. Так, П.С.Ветшев и др. (1998) считают, что холелитиаз встречается более чем у 10% населения земного шара, а количество больных каждое десятилетие удваивается. В сложившейся ситуации количество хирургических вмешательств на желчевыводящей системе существенно увеличилось и достигло около 2.5 млн. По образному выражению В.И.Малярчука и др. (1999), калькулезный холецистит является "эпидемией века". Тяжесть течения, возможность развития серьезных осложнений, выключение пациента из активной трудовой деятельности позволяют расценивать ЖКБ как проблему не только медицинскую, но и социальную.

Согласно данным Э.И.Гальперина (2009), частота повреждений внепеченочных желчных протоков при открытой холецистэктомии составляет от 0,1% до 0,8%, в то время, как при лапароскопической холецистэктомии в период освоения метода и накопления опыта их количество возрастает до 3%. В результате данных повреждений у 94,5% пациентов развивается желчный перитонит (Э.И.Гальперин, А.Ю.Чевокин, 2009; О.Ыагс1еПо е1 а1., 2003).

Отсюда, проблема диагностики и лечения желчного перитонита (ЖП) на фоне роста количества больных с ЖКБ становится крайне актуальной (Э.И.Гальперин, П.С.Ветшев, 2006; Ю.И.Галлингер, 2007; И.Н.Григорьева, С.К.Малютина, М.И.Воевода, 2010; МЛ .Сиге! е1 а!., 2002).

В последнее годы накоплены факты, указывающие о перспективности изучения неспецифической реакции организма на повреждение в виде синдрома системной воспалительной реакции (ССВР), сопровождающегося структурно-функциональной перестройкой мембран клеток крови и эндотелия сосудов (Е.Ю.Гусев, В.А.Черешнев, Л.Н.Юрченко, 2007).

Одной из причин гибели больных при перитоните различного генеза является почечная недостаточность, при которой нарушения наступают раньше клинических проявлений и исчезают позже последних (А.В.Назаров, Т.В.Жданова, В.А.Багин, О.В.Добрынина, 2010). Подобное состояние проблемы требует проведения поиска диагностических критериев и лечебных мероприятий, способных с одной стороны - объективно охарактеризовать состояние регуляторно-адаптивных возможностей организма, а с другой -повысить эффективность лечения желчного перитонита.

В настоящее время особый интерес по-прежнему представляет метод непрямого электрохимического окисления крови с использованием натрия гипохлорита (НГХ), имитирующего функцию нейтрофильных гранулоцитов и цитохрома Р-450 печени (В.И.Сергиенко, 1987; В.К.Гостищев, Н.М.Федоровский, 1991).

Цель исследования - повысить эффективность лечения экспериментального желчного перитонита.

Задачи исследования.

1. Оценить эффективность влияния натрия гипохлорита на структурно-функциональное состояние мембран клеток крови у животных с экспериментальным желчным перитонитом.

2. Изучить эффективность применения натрия гипохлорита на состояние эндогенной интоксикации при экспериментальном желчном перитоните.

3. В опытах на животных с экспериментальным желчным перитонитом изучить влияние натрия гипохлорита на метаболизм оксида азота.

4. У животных с экспериментальным желчным перитонитом установить влияние натрия гипохлорита на характер нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза.

5. На основании морфогистохимических и морфометрических изменений в почках у животных с экспериментальным желчным перитонитом оценить эффективность применения натрия гипохлорита

Новизна исследования. В результате проведенных исследований впервые:

1) определён комплекс наиболее информативных клинико-лабораторных и морфофункциональных показателей для ранней диагностики и оценки эффективности лечения животных с экспериментальным желчным перитонитом;

2) установлено более раннее восстановление структурно-функциональной организации мембран клеток крови при комплексном применении натрия гипохлорита у животных с экспериментальным желчным перитонитом;

3) обнаружено повышение продукции оксида азота при комплексном применении натрия гипохлорита;

4) установлено повышение эффективности лечения экспериментального желчного перитонита при комплексном применении натрия гипохлорита путем двукратного снижения летальности животных;

5) расширены и углублены современные представления механизма действия натрия гипохлорита на структурно-функциональную организацию мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните.

Научно-практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы обоснована тем, что полученные данные углубляют представления о патогенезе и морфогенезе желчного перитонита, а также раскрывают механизм непрямого электрохимического окисления крови с использованием натрия гипохлорита на состояние мембран клеток крови и эндотелия сосудов. Полученный материал может служить

основой для оптимизации известных схем лечения больных с желчным перитонитом.

Практическая значимость исследования заключается в обосновании применения выявленного комплекса наиболее информативных клинико-лабораторных и морфофункциональных показателей для ранней диагностики желчного перитонита и оценки эффективности его лечения. Полученные результаты доказывают целесообразность комплексного применения натрия гипохлорита для повышения эффективности лечения желчного перитонита.

Структура и объем работы.

Работа изложена на 175 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, характеристика материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, литературного указателя, включающего 441 источника (258 отечественных и 183 иностранных) и приложения. Работа иллюстрирована 23 микрофотографиями, 7 таблицами и 11 диаграммами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 50 беспородных собаках-самцах, весом 15,3+ 1,1 кг. Все животные были разделены на четыре группы: в 1-ю контрольную группу для определения лабораторных показателей нормы включены 50 животных, 5 из которых выводились из эксперимента для забора биоптатов почки; во 2-ю группу вошли оставшиеся 45 животных, которым создавали модель 24-часового экспериментального желчного перитонита, суть которой заключалась в том, что предварительно на наружной поверхности задней лапы собаки создавали очаг деструкции мягких тканей введением 10% раствора хлористого кальция из расчета 0,25 мл/кг. Через 48 часов после создания очага деструкции в брюшную полость троекратно, каждые 8 часов вводили аптечную желчь из расчета 1,5 мл/кг (Э.А.Петросян и др., «Способ моделирования желчного перитонита», Патент РФ № 2175784, Бюл., 2001,

№31). После создания модели 24-часового экспериментального желчного перитонита во 2-ой группе из опыта выводили также 5 собак для забора биоптатов. Оставшиеся 40 животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом были распределены еще на две группы: 3-я - группа сравнения и 4-я - опытная группа, по 20 животных в каждой.

Схема лечение животных с экспериментальным желчным перитонитом заключается в следующем: животным 3-ей группы сравнения и 4-ой опытной группы проводили лапаротомию, интрапоперационную санацию с последующим введением в брюшную полость 0,04% раствора НГХ в качестве бактерицидного средства и зашиванием краев раны. Далее животным 3-ей группы сравнения проводили инфузию 0,9% раствора натрия хлорида в качестве средства дезинтоксикации, а животным 4-ой опытной группы -инфузию 0,04% раствора НГХ в качестве средства детоксикации. Инфузию растворов проводили сразу и через 12 часов после санации брюшной полости из расчета '/,0 ОЦК (С.А.Шалимов и др., 1989). НГХ получали электролизом 0,9% раствора натрия хлорида в аппарате ЭДО-4.

Определение клинико-лабораторных показателей крови проводили на автоматическом анализаторе «Мес1отс 620» (Швеция). Качественный состав лейкоцитов определяли унифицированным методом (В.В.Меньшиков, 1987). Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) изучали по методике Я.Я.Кальф-Калифа. (1941).

Определение тиоловых (БН-групп) в крови (И.В.Веревкина, А.И.Точилкина, Н.А.Попова, 1977).

Определение сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) (А.А.Тогайбаев и др., 1988).

Определение диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах (В.С.Камышников, 2000).

Определение концентрации метаболитов оксида азота (N0) (нитраты/нитриты) в плазме и тромбоцитах (П.П.Голикова и др., 2000).

Определение активности аланинаминотрансаминазы (AJIT) и аспартатаминотрансаминазы (ACT) проводили с использованием набора для лабораторной диагностики собак продукции компании «Cusabio Biotech» Canine Elisa Assay Kit на аппарате Stat Fax 4200 (США) в соответствии с протоколами фирмы разработчика.

Определение сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза (СТЗ) проводили путем подсчёта количества тромбоцитов (Тр) в крови и определения агрегационной активности тромбоцитов с использованием гемолизат-агрегационного теста («Технология-Стандарт», г. Барнаул).

Гистологическое исследование почек проводили на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином.

Гистохимические исследования почек проводили на срезах, окрашенных по методу Пикро-Маплори (Д.С.Саркисов , 1996).

Морфометрические исследования параметров среднего размера (CP, мкм2) и объемной доли (ОД, %) «зрелого» фибрина, проводили на срезах почки с использованием светового микроскопа Olympus (Япония) и окулярной сетки (Г.Г.Автандилова, 2002).

Исследования проводили до, после создания модели желчного перитонита, на 1, 3, 7, 10 и 30 сутки. В 3-ей группе сравнения и 4-ой опытной группе на каждый срок выводили из эксперимента по 4 собаки для забора биоптатов почки.

Выполненные эксперименты руководствовались основными принципами, заложенными в Конституции РФ и Хельсинской декларации (1964); Рекомендациями комитетов по этике, проводящих экспертизу биомедицинских исследований ВОЗ и EF GCP; Федеральным законом «Об обращении лекарственных средств» (№ 61-ФЗ от 12.04.2010г.); утвержденным приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27.09.2005г. №232-ст; правилами

лабораторной практики, утвержденными пр. Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации №708н от 23.08.2010г.

Статистические исследования выполнены с помощью пакета прикладных программ "Microsoft Exel" и "Statistica 6,0" для "Windows" (StatSoft.Inc). Оценку достоверности различий для нормально распределенных признаков проводили с использованием t-критерия Стьюдента (В .Госсета), а в противном случае - критериев Манна-Уитни и Вилкоксона (для зависимых и независимых признаков, соответственно). При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони. Для оценки достоверности межгрупповых различий применялся непараметрический критерий Манна-Уитни. Данные в тексте и таблицах представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего М+ш. Для всех проведенных анализов различия считались достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При лапаротомии у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом определялось до 250 мл серозно-фибринозного экссудата с примесью желчи. При осмотре брюшной полости отмечалась гиперемия брюшины с очагами геморрагии и фибринозным налетом. Петли кишечника паретически расширены, покрыты геморрагическими очагами с фибринозным налётом. Сосудистый рисунок брыжейки тонкой кишки резко выражен. Вышеописанная макроскопическая картина брюшной полости соответствует острому серозно-фибринозному желчному перитониту.

У животных с 24-часовым желчным перитонитом наблюдалось увеличение в 7,2 раза ЛИИ (р<0,05), который в последующие сроки постепенно снижался, приходя к исходным величинам в 3-ей группе сравнения на 30-е сутки (р>0,05), а в 4-ой опытной группе - уже на 10-е сутки (р>0,05) (рис.1). Полученный эффект в опытной группе объясняется детоксицирующими свойствами натрия гипохлорита.

25,0

24-час ЖП ЕЖ фуппа сравнения і.,, і опытная гоуппа_—»— контрольная группа

Рис. 1. Динамика ЛИИ при лечении экспериментального желчного перитонита.

Нарушение процессов СРО считается неспецифическим механизмом повреждения, который у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом характеризуется ростом в 2,5 раза уровня ДК в плазме (р<0,05) и в 3,9 раза в эритроцитах (р<0,05). Дальнейшее окисление ДК приводит к образованию вторичных продуктов (МДА) рост которого превышает показатели в плазме контрольных животных в 2,2 раза и в эритроцитах в 1,74 раза, соответственно (р<0,05) (табл. 1).

Таблица 1

Первичные и вторичные продукты свободнорадикального окисления в плазме и эритроцитах у контрольных животных и животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом_

Исследуемый показатель Исследуемые группы

Контрольная группа Животные с 24-часовым ЖП

ДКпл, отн. ед. 6,65±0,98 16,51±1,77*

ДКэр, отн. ед. 2,95±0,49 11,50+1,09*

МДАпл, мкмоль/л 4,64±0,38 10,11+0,84*

МДАэр, мкмоль/л 5,00±0,23 8,70±0,76*

Примечание:* - достоверность отличий от показателя в контроле (р<0,05).

Таким образом, поскольку реакции СРО протекают на мембранах эритроцитов АОС которых на фоне эндотоксикоза нарушена, высокий уровень ДК эритроцитов - результат снижения АОС мембран эритроцитов, а

менее интенсивный рост МДА эритроцитов - результат подавления процессов СРО на уровне первичных продуктов.

На 1-е сутки лечения в группе сравнения отмечался достоверный рост ДК плазмы до 20,96+1,21 отн. ед. против 16,51±1,77 отн. ед. у животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05), в то время, как показатели ДК эритроцитов снижались (р<0,05), что может быть связано с высоким уровнем липопероксидации. Оба показателя на 10-е сутки уже не отличались от контроля (р>0,05) (табл. 2). В 4-ой опытной группе ДК плазмы уже на 3-й сутки, а ДК эритроцитов на 7-е сутки не отличались от показателей контрольных животных (р>0,05). Начиная с 1-х суток лечения в исследуемых группах концентрация МДА плазмы снижалась, но при этом оставалась высокой в 3-ей группе сравнения вплоть до 10-х суток (р<0,05) относительно контрольных животных, а в опытной группе до 7-х суток (р<0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Динамика первичных и вторичных продуктов СРО в плазме и эритроцитах при лечении экспериментального желчного перитонита_

Исследуемые Сроки Исследуемые показатели

ДКпл, отн.ед. | ДКэр, отн.ед. | МДАпл,мкмоль/л | МДАэр,мкмоль/л

Группа сравнения

1 сутки 20,96±1,41*" 6,72±0,78* 8,05±1,02* 10,01+0,78*

3 сутки 15,86±1,35 * 5,94±0,32* 8,35+0,87* 8,82±0,75*

7 сутки 10,24±0,86 * 5,28+0,94* 5,63±0,52* 7,76+0,66*

10 сутки 7,32±0,56 3,12±0,24 5,02+0,20 4,88+0,36

Опытная группа

1 сутки 18,44+1,12 8,16±0,69* 9,84+0,75 * 13,59+1,32 *"

3 сутки 12,14+0,94* 5,12±0,32* 7,60±0,57 * 8,73+0,58 *

7 сутки 7,22±0,71 4,02±0,27 8,02+0,77 4,87+0,67

10 сутки 6,22±0,95 3,23+0,34 5,07±0,44 5,14+0,41

Примечание: * - достоверность отличий показателей от контрольной группы (р<0,05); "-достоверность отличий от показателя с 24-часовым ЖП (р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют, что в группе сравнения помимо интенсивно протекающих процессов СРО имеет место и задержка выведения гидрофобных токсинов. В пользу этого указывает наблюдаемая у животных опытной группы уже на 3-й сутки нормализация МДА плазмы за счет

детоксицирующих свойств натрия гипохлорита. В группе сравнения напротив на 1-е сутки лечения отмечается недостоверный рост концентрации МДА эритроцитов (р>0,05), в то время, как в опытной группе его рост был достоверно значим относительно животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05), что объясняется деблокирующим эффектом натрия гипохлорита токсинов на мембранах эритроцитов. В дальнейшем происходит снижение МДА, которое в 3-ей группе сравнения приходит к контрольным цифрам на 30-сутки (р>0,05), а в 4-ой опытной - на 7-е сутки (р>0,05).

Таким образом, полученные результаты можно объяснить процессами СРО, сопровождающиеся деструктивными изменениями белково-липидного комплекса мембран эритроцитов с нарушением их транспортной составляющей. Исходя из этого, становится понятно, почему в группе сравнения нормализация показателей МДА эритроцитов происходит позже, чем в основной группе.

Известно, что эндогенная интоксикация сопровождается повреждением структурно-функциональной организации мембран клеток крови, что подтверждается двукратный ростом количества БН-групп в плазме у животных с 24-часовым ЖП по сравнению с контролем (р<0,05) (рис. 2). Не исключено, что выход в БН-групп эта защитная реакция организма, направленная на нейтрализацию АФК.

Рис. 2. Динамика 8Н-групп при лечении экспериментального желчного перитонита.

На 1-е сутки лечения в 3-ей группе сравнения содержание БН-групп в плазме уже не отличается от животных с 24-часовым желчным перитонитом (р>0,05), в то время, как в 4-ой опытной группе оно было достоверно ниже (р<0,05). В последующие сроки содержание БН-групп приходило к контрольным цифрам в группе сравнения на 10-е сутки (р>0,05), а в опытной группе на 7-е сутки (р>0,05). Лечебный эффект натрия гипохлорита, по-видимому, можно объяснить окислением 8Н-групп в плазме.

Общеизвестно, что токсины сорбируются на гликокаликсе эритроцитов для их доставки к органам детоксикации. Для определения степени эндогенной интоксикации мы изучали ССЭ, которая у животных с 24-часовым желчным перитонитом снижалась в 1,8 раза относительно контрольных данных (р<0,001) (рис. 3).

Рис. 3. Динамика ССЭ при лечении экспериментального желчного перитонита.

На фоне лечения в 3-ей группе сравнения в течение первых трех суток заболевания наблюдается тенденция к росту ССЭ, которая однако остается достоверно низкой относительно контрольных данных (р<0,05). В 4-ой опытной группе уже на 3-й сутки ССЭ не отличается от исходных данных (р>0,05), что объясняется, окислением НГХ элиминационного пула ВНСММ и тем самым деблокированием мембран эритроцитов.

Несмотря на большое количество экспериментальных данных об активации синтеза N0 эндотелиоцитами, нейтрофилами, моноцитами,

тромбоцитами и клетками Купфера в условиях эндотоксинемии, остается малоизученным вопрос синтеза N0 при перитоните вообще и при желчном перитоните в частности.

Так, у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом наблюдается рост содержания метаболитов N0 плазмы 1,36 раза относительно контроля (р<0,05) (рис. 4), как ответная реакция на боль. На 1-е сутки лечения наблюдается дальнейший рост содержания N0. При этом в 3-ей группе сравнения данный рост не превышает значения у животных с 24-часовым желчным перитонитом (р>0,05), в то время как в 4-ой опытной группе он был в 1,26 раза выше (р<0,05). В последующие сроки в группе сравнения происходит снижение содержания N0, которое к 7-м суткам уже не отличается от контроля (р>0,05). В опытной же группе продолжается его рост, который достигает своего максимума на 3-й сутки, превышая в 1,32 раза показатели животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом (р<0,05) с последующим возвращением к контрольным данным на 10-е сутки (р>0,05).

Рис. 4. Динамика содержания метаболитов N0 плазмы при лечении экспериментального желчного перитонита.

Таким образом, возможным механизмом нарушения метаболизма оксида азота при желчном перитоните является повреждение мембран клеток крови и дисфункция эндотелия, как отражение ССВР с нарушением дисбаланса медиаторов. Не исключено, что рост метаболитов оксида азота в

опытной группе животных имеет антитромбогенный механизм действия, направленный на ингибирование экспрессии адгезивных молекул эндотелия.

Сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза представляет собой один из этапов свертывающей системы крови, где происходит не только активация тромбоцитов и образование фибрина, но и активация эндотелия и лейкоцитов.

Так, у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом обнаружено достоверное повышение количества тромбоцитов до 301,28+36,04 хЮ9/л против 207,07+20,08 х109/л в контрольной группе (р<0,05), что является отражением активации сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза за счет перераспределения тромбоцитов в сосудистом русле и их участия в процессах воспаления и репарации.

На фоне проводимого лечения в исследуемых группах отмечается достоверное снижение количества тромбоцитов относительно животных с 24-часовым желчным экспериментальным перитонитом (р<0,05), которое в 3-ей группе сравнения приходило к контролю на 3-й сутки, а в 4-ой опытной группе только на 7-е сутки (р>0,05), что может свидетельствовать о скрытом механизме действия натрия гипохлорита на красный костный мозг.

В ходе исследования у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом наблюдается укорочение времени агрегации тромбоцитов до 8,83+0,65 сек против 12,54+0,82 сек в контроле (р<0,05)

(рис.6), что может быть результатом экспрессии адгезивных молекул сосудистым эндотелием.

Анализ времени агрегации тромбоцитов в исследуемых группах на фоне проводимого лечения показал достоверное удлинение времени агрегации тромбоцитов (р<0,05) относительно животных контрольной группы, которое в 3-ей группе сравнения приходило к исходным цифрам уже на 3-й сутки (р>0,05), а в 4-ой опытной группе продолжалось до 7-х суток.

Рис. 6. Динамика времени агрегации тромбоцитов при лечении экспериментального желчного перитонита.

При этом в группе сравнения удлинение времени агрегации может быть связано с ростом концентрации метаболитов оксида азота тромбоцитов, способных ингибировать агрегацию тромбоцитов, а в 4-ой опытной группе агрегационная активность тромбоцитов была более низкой, как результат взаимодействия метаболитов оксида азота с гипохлорит анионом (ОС1 ).

Таким образом, применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита приводит к ингибированию активности сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза в результате взаимодействия метаболитов оксида азота с гипохлорит анионом, что предотвращает риск развития ДВС-синдрома.

В патогенезе и морфогенезе желчного перитонита почкам отводится

главная роль.

Так, при исследовании препаратов почки у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом выявлены изменения, характеризующиеся отеком межуточной ткани, лейкоцитарной инфильтрацией, дистрофическими и некробиотическими изменениями эпителиальных и соединительнотканных структур., полнокровием сосудов, стазами, агрегацией эритроцитов (рис. 7,а), эритроцитарными и гиалиновыми тромбами (рис. 7, б).

Рис. 7. Гистологическая (а) и гистохимическая (б) картина почек у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом. Ув. х280.

На 1-е сутки в группе сравнения наблюдались очаги кровоизлияния в корковом слое почек, лейкоцитарная инфильтрация, ярко выраженная гиалиново-капельная дистрофия эпителия канальцев и клубочков, в то время как в опытной группе данные процессы были менее выраженными. В исследуемых группах прогрессировали явления дистрофии стенок сосудов в виде мукоидного и фибриноидного набухания, выполненных «зрелым» фибрином с тенденцией к некробиозу в группе сравнения.

На 3-й сутки исследуемых групп в почках сохранялась сосудистая реакция на воспаление в виде полнокровия капилляров, стаза, агрегации эритроцитов, очагов дистрофии и некробиоза эпителия канальцев и клубочков (рис.8,а-б) с преобладанием процесса в группе сравнения (рис.8,б).

а б

Рис. 8. Гистологическая картина почек в группе сравнения (а) и в опытной группе (б) на 3-й сутки при лечении экспериментального желчного перитонита. Ув. х280.

Гистохимически в просвете капилляров у животных группы сравнения выявляются эритроцитарные, гиалиновые и фибриновые тромбы, выполненные в основном «зрелым» фибрином (рис.9, а), в то время как в опытной группе в основном «старым» фибрином (рис. 9, б).

Рис. 9. Отложение «зрелого» и «старого» фибрина в капиллярах клубочков почки в группе сравнения (а) и опытной группы (б) на 3-е сутки при лечении экспериментального желчного перитонита. У в. х280.

На 30-е сутки у животных группы сравнения в почках оставался слабо выраженный отек, периваскулярная лимфогистиоцитарная инфильтрация коркового слоя и очаговый фиброз (рис. 10, а), в то время как в опытной группе наблюдалось практически полное восстановление морфрологической структуры почки (рис. 10, б).

Рис. 10. Гистологическая картина почек в группе сравнения (а) и в опытной группе (б) на 30-е сутки при лечении экспериментального желчного перитонита. Ув. х280.

При гистохимическом исследовании почек у животных в группе сравнения определяются участки фиброза с активной коллагенезацией по типу очагового нефросклероза с инкапсулированными фрагментами «старого» фибрина (рис. 11, а), в то время, как в опытной группе отложение «старого» фибрина отсутствует (рис. 11,6).

а б Рис. 11. Отложение «старого» фибрина в участках фиброза канальцев почки в группе сравнения (а) и его отсутствие в опытной группе (б) на 30-е сутки при лечении экспериментального ЖП. Ув. х280.

Для подтверждения морфологических изменений в почках у животных с экспериментальным желчным перитонитом проведены морфометрические измерения СР и ОД «зрелого» фибрина.

Так, у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом выявлено достоверное увеличение СР «зрелого» фибрина до 1647,0±242,0 мкм2 (р<0,001) и ОД до 63,2±2,0% (р<0,001) относительно животных контрольной группы, что подтверждают наличие маркеров ДВС-синдрома в микроциркуляторном русле почки.

На 1-е сутки лечения в группе сравнения наблюдался дальнейший достоверный рост параметров СР и ОД «зрелого» фибрина относительно показателей животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом (р<0,05), в то время как в опытной группе рост параметров был не достоверным (р>0,05). Полученные результаты свидетельствуют о прогрессировании гемокоагуляционных расстройств на микроциркуляторном

уровне почек в группе сравнения. Подобные морфометрические изменения в группе сравнения можно объяснить, продолжающейся экспрессией эндотелиальными клетками адгезивных молекул, запускающих процесс свертывания крови и блокаду растворения фибрина. В опытной же группе на фоне комплексного применения натрия гипохлорита, изменения морфометрических параметров были резко замедлены, что может быть обусловлено прерыванием преобразования фибриногена в нерастворимый фибрин натрия гипохлоритом за счет вступления его в реакцию гидроксилирования с растворимыми фибрин-мономерными комплексами. В последующие сроки в исследуемых группах отмечалось снижение параметров СР и ОД «зрелого» фибрина относительно животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом (р<0,05), которое было более значимо в опытной группе. Эти данные согласуются с данными гистохимических исследований, которые свидетельствовали о более раннем купировании гемокоагуляционных расстройств у животных опытной группы.

Подтвержденный морфогистохимическими и морфометрическими исследованиями положительный эффект комплексного применения натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита нашел подтверждение в двукратном снижении процента летальности животных в опытной группе по сравнению с группой сравнения.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита способствует ранней стабилизации структурно-функциональной организации мембран клеток крови, что проявилось увеличением сорбционной способности эритроцитов, снижением суммарного содержания тиоловых групп и падением активности трансаминаз в крови.

2. В ходе комплексного применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита происходит нормализация

процессов первичной и вторичной липопероксидации на трое суток раньше, чем в группе сравнения.

3. У животных с экспериментальным желчным перитонитом при комплексном применении натрия гипохлорита наблюдается повышение продукции метаболитов оксида азота, имеющие антитромбогенный механизм действия, направленный на ингибирование экспрессии адгезивных молекул эндотелия.

4. Применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита приводит к ингибированию активности сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза в результате взаимодействия метаболитов оксида азота с гипохлорит анионом, что предотвращает риск развития ДВС-синдрома.

5. Эффективность комплексного применения натрия гипохлорита у животных с экспериментальным желчным перитонитом отражается в полном восстановлении морфогистохимической структуры почек и морфометрических параметров «зрелого» фибрина.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*1. Боташев, A.A. Состояние мембран эритроцитов при экспериментальном желчном перитоните / А.А.Боташев, О.А.Терещенко, М.А.Хасаева, В.Н.Долгов, В.Е.Рыкунова, Э.А.Петросян // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №3-4. - С. 36-39.

*2. Терещенко, O.A. Метаболические нарушения при экспериментальном желчном перитоните / О.А.Терещенко, А.А.Боташев, В.Н.Долгов, М.А.Хасаева, Э.А.Петросян // Кубанский научный медицинский вестник. -2010.-№3-4.-С. 178-183.

3. Долгов, В.Н. Морфогистохимические изменения почек при экспериментальном желчном перитоните / В.Н.Долгов, О.А.Терещенко, А.А.Боташев, А.С.Багдасарьян, Э.А.Петросян // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга: Материалы 7-й научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 25-26 ноября). - 2010. - №4. - С. 9.

4. Долгов, В.Н. Морфометрические изменения параметров структур почек при лечении экспериментального желчного перитонита / В.Н.Долгов,

О.А.Терещенко, А.А.Боташев, А.С.Багдасарьян, Э.А.Петросян // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга: Материалы 7-й научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 25-26 ноября). - 2010. - №4. - С. 9.

*5. Петросян, Э.А. Влияние натрия гипохлорита на некоторые звенья гомеостаза при лечении экспериментального желчного перитонита / Э.А.Петросян, В.В.Иванов, В.Н.Долгов, О.А.Терещенко, А.А.Боташев // Фундаментальные исследования. - 2010. - №11. - С. 98-103.

*6. Петросян, Э.А. Экстра- и интракорпоральная гемокоррекция синдрома эндогенной интоксикации при желчном перитоните / Э.А.Петросян, О.А.Терещенко, А.А.Боташев, В.Н.Долгов, М.А.Хасаева // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2011. -№1.-С. 284-286.

7. Боташев, A.A. Состояние процессов про- и антиоксидантной системы крови при желчном перитоните / А.А.Боташев, О.А.Терещенко, Э.А.Петросян, М.А.Хасаева, В.Н.Долгов // XI съезд хирургов Российской Федерации. Волгоград, 25-27 мая 2011 г. - Волгоград, 2011, С. 58.

8. Боташев, A.A. Интегральные показатели крови, характеризующие состояние окислительного стресса при желчном перитоните / А.А.Боташев, О.А.Терещенко, Э.А.Петросян, М.А.Хасаева, В.Н.Долгов // XI съезд хирургов Российской Федерации. Волгоград, 25-27 мая 2011 г. - Волгоград, 2011, С. 58-59.

9. Петросян, Э.А. Лечение натрия гипохлоритом коагулопатических нарушений при желчном перитоните / Э.А.Петросян, О.А.Терещенко, А.А.Боташев, В.Н.Долгов, М.А.Хасаева // XI съезд хирургов Российской Федерации. Волгоград, 25-27 мая 2011 г. - Волгоград, 2011, С. 274-275.

10. Петросян, Э.А. Комплексное лечение синдрома эндогенной интоксикации при желчном перитоните / Э.А.Петросян, Ю.В.Помещик, О.А.Терещенко,

A.А.Боташев, В.Н.Долгов // Вестник хирургической гастроэнтерологии. -2011. - №3. - С. 49-50.

11. Петросян, Э.А. Гемокоррекция синдрома эндогенной интоксикации при желчном перитоните / Э.А.Петросян, О.А.Терещенко, А.А.Боташев,

B.Н-Долгов, М.А.Хасаева // Вестник хирургической гастроэнтерологии. -2011. - №3. - С. 50-51.

*- опубликовано в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендуемых ВАК при Минобрнауки России для опубликования материалов докторских и кандидатских диссертаций.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансаминаз АОС - антиоксидантная система АСТ - аспартатаминотрансаминаза АФК - активные формы кислорода

ДВС - диссеминированный внутрисосудистый синдром свертывания

ДК -диеновые коньюгаты

ЖП - жёлчный перитонит

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации

МДА - малоновый диальдегид

НГХ - натрия гипохлорит

ОД - объемная доля

ПОЛ - перекисное окисление липидов

CP - средний размер

СРО - свободнорадикальное окисление

ССВР - синдром системной воспалительной реакции

ССЭ - сорбционная способность эритроцитов

СТЗ - сосудисто-тромбоцитарное звено

NO — оксид азота

SH - тиоловые группы

ДОЛГОВ Владимир Николаевич

ВЛИЯНИЕ НАТРИЯ ГИПОХЛОРИТА НА СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН КЛЕТОК КРОВИ И ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ПРИ ЖЕЛЧНОМ ПЕРИТОНИТЕ

Подл, в печать 14.05.2012 г. Бумага офсетная. Формат 60/84 1/16 Зак. № 127экз . Усл. печ. лист 1,0. Тираж 100 экз.

Цех оперативной полиграфии СНИИЖК г. Ставрополь, пер. Зоотехнический

Актуальность темы. Современное развитие хирургии, несмотря на все свои успехи, сопровождается рядом осложнений, с которыми в прежние времена практически не сталкивалось. Новые медицинские технологии с одной стороны, сокращают сроки лечения больных, а с другой - существенно влияют на частоту ятрогенных осложнений, одним из которых является желчный перитонит (Э.И.Гальперин, А.Ю.Чевокин, 2009; Л.А.Левин, 2009; M.Amendolara et al., 2001). Ярким примером такой тенденции является широкое внедрение малоинвазивных вмешательств в современную хирургическую гепатологию (С.А.Совцов, 2001; А.Г.Бебуришвили, Е.Н.Зюбина, Е.П.Строганова, Веденин Ю.И., 2008; Благитко Е. М., Толстых Г. Н., Добров С.Д., 2008). При этом проблема желчного перитонита продолжает оставаться практически вне поля зрения исследователей, хотя смертность при этом заболевании по данным различных авторов колеблется от 10 до 34% (Брискин Б.С., 2006; Amorotti С., Mosca D., Di Blasio P., 2002).

В последнее годы накоплены факты, указывающие о перспективности изучения неспецифической реакции организма на повреждение в виде синдрома системной воспалительной реакции (ССВР), сопровождающийся тотальной структурно-функциональной перестройкой эндотелия сосудов, который затрагивает интересы практически всех органов, сопровождающиеся появлением избыточного количества недоокисленных продуктов обмена (Е.В.Карякина, С.В.Белова, 2004; Е.Ю.Гусев, В.А.Черешнев, Л.Н.Юрченко, 2007; D.Sun, N.Aikawa, 1999).

Неспособность физиологических систем организма обеспечить их выведение, обуславливают необходимость применения специальных средств и методов эфферентной терапии.

В настоящее время в хирургии положительно зарекомендовал себя метод непрямого электрохимического окисления с использованием натрия гипохлорита, способный моделировать бактерицидную функцию фермента миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов и детоксицирующую функцию цитохрома Р-450 печеночных клеток (В.И.Сергиенко, 1987; В.К.Гостищев, Н.М.Федоровский, 1991).

Подобное состояние проблемы требует проведения поиска диагностических критериев и лечебных мероприятий, способных с одной стороны - объективно охарактеризовать состояние регуляторно-адаптивных возможностей организма, а с другой - повысить эффективность лечения желчного перитонита.

С учетом всего вышеизложенного, представляется актуальным изучение комплексного влияния натрия гипохлорита на развитие системной воспалительной реакции при лечении экспериментального желчного перитонита.

1. Цель исследования - повысить эффективность лечения экспериментального желчного перитонита.

Задачи исследования.

1. Оценить эффективность влияния натрия гипохлорита на структурно-функциональное состояние мембран клеток крови у животных с экспериментальным желчным перитонитом.

2. Изучить эффективность применения натрия гипохлорита на состояние эндогенной интоксикации при экспериментальном желчном перитоните.

3. В опытах на животных с экспериментальным желчным перитонитом изучить влияние натрия гипохлорита на метаболизм оксида азота.

4. У животных с экспериментальным желчным перитонитом установить влияние натрия гипохлорита на характер нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза.

5. На основании морфо-гистохимических и морфометрических изменений в почках у животных с экспериментальным желчным перитонитом оценить эффективность применения натрия гипохлорита

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

1) определён комплекс наиболее информативных клинико-лабораторных и морфофункциональных показателей для ранней диагностики и оценки эффективности лечения животных с экспериментальным желчным перитонитом;

2) установлено более раннее восстановление структурно-функциональной организации мембран клеток крови при комплексном применении натрия гипохлорита у животных с экспериментальным желчным перитонитом;

3) обнаружено повышение продукции оксида азота при комплексном применении натрия гипохлорита;

4) установлено повышение эффективности лечения экспериментального желчного перитонита при комплексном применении натрия гипохлорита путем двукратного снижения летальности животных;

5) расширены и углублены современные представления механизма действия натрия гипохлорита на структурно-функциональную организацию мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Комплексное применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита сопровождается стабилизацией структурно-функциональной организации мембран клеток крови, купированием гемокоагуляционных расстройств и восстановлением морфологической структуры почки.

2. Расширены современные представления о механизме действия натрия гипохлорита на структурно-функциональную организацию мембран клеток крови и эндотелий сосудов при экспериментальном желчном перитоните.

Теоретическая значимость исследования

Теоретическая значимость работы обоснована тем, что полученные данные углубляют представления о патогенезе и морфогенезе желчного перитонита, а также раскрывают механизм непрямого электрохимического окисления крови с использованием натрия гипохлорита на состояние мембран клеток крови и эндотелия сосудов. Полученный материал может служить основой для оптимизации известных схем лечения больных с желчным перитонитом.

Практическая значимость исследования

Практическая значимость исследования заключается в обосновании применения выявленного комплекса наиболее информативных клинико-лабораторных и морфофункциональных показателей для ранней диагностики желчного перитонита и оценки эффективности его лечения. Полученные результаты доказывают целесообразность комплексного применения натрия гипохлорита для повышения эффективности лечения желчного перитонита.

Сведения о практическом использовании результатов исследования

Основные научные положения работы включены в план лекционного материала и практических занятий на кафедрах госпитальной хирургии, клинической иммунологии и Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России. Разработанный алгоритм комплексной диагностики и лечения больных с желчным перитонитом внедрен в работу: МУЗ «Краснодарская городская больница скорой медицинской помощи», МУЗ «Петровская ЦРБ» (г. Светлоград, Ставропольский край), МУЗ «Красногвардейская ЦРБ» (с.Красногвардейское, Ставропольский край) и ЦНИЛ ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России.

По результатам исследования опубликованы 11 печатных работах, из них 4 в журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание учёных степеней доктора и кандидата наук (см. приложение 2).

Считаю своим долгом выразить искреннюю признательность и глубокую благодарность моему учителю и научному руководителю, заведующему кафедрой топографической анатомии и оперативной хирургии Кубанского государственного медицинского университета заслуженному изобретателю РФ, лауреату премии Правительства РФ и РАМН, доктору медицинских наук профессору Эдуарду Арутюновичу Петросяну и научному консультанту доктору медицинских наук Лайпанову Хаджи Ислам Хаджи Мекеровичу за ежедневную помошь в выполнении работы. л. * ^ > лг

Выражаю благодарность и признательность коллективу кафедры топографической анатомии и оперативной хирургии за оказанную помощь и дружескую поддержку в выполнении диссертационной работы.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита способствует ранней стабилизации структурно-функциональной организации мембран клеток крови, что проявилось увеличением сорбционной способности эритроцитов, снижением суммарного содержания тиоловых групп и падением активности трансаминаз в крови.

2. В ходе комплексного применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита происходит нормализация процессов первичной и вторичной липопероксидации на трое суток раньше, чем в группе сравнения.

3. У животных с экспериментальным желчным перитонитом при комплексном применении натрия гипохлорита наблюдается повышение продукции метаболитов оксида азота, имеющие антитромбогенный механизм действия, направленный на ингибирование экспрессии адгезивных молекул эндотелия.

4. Применение натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита приводит к ингибированию активности сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза в результате взаимодействия метаболитов оксида азота с гипохлорит анионом, что предотвращает риск развития ДВС-синдрома.

5. Эффективность комплексного применения натрия гипохлорита у животных с экспериментальным желчным перитонитом отражается в полном восстановлении морфогистохимической структуры почек и морфометрических параметров «зрелого» фибрина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современное развитие хирургии, несмотря на все свои успехи, сопровождается рядом осложнений, с которыми в прежние времена практически не сталкивалось. Новые медицинские технологии с одной стороны, сокращают сроки лечения больных, а с другой - существенно влияют на частоту ятрогенных осложнений, одним из которых является желчный перитонит (Э.И.Гальперин, А.Ю.Чевокин, 2009; Левин Л.А., 2009; M.Amendolara et al., 2001). Ярким примером такой тенденции является широкое внедрение малоинвазивных вмешательств в современную хирургическую гепатологию (С.А.Совцов, 2001; А.Г.Бебуришвили, Е.Н.Зюбина, Е.П.Строганова, Ю.И.Веденин, 2008; Е.М.Благитко, Г.Н.Толстых, С.Д.Добров, 2008). При этом проблема желчного перитонита продолжает оставаться практически вне поля зрения исследователей, хотя смертность при этом заболевании по данным различных авторов колеблется от 10 до 34% (Б.С.Брискин, 2006; C.Amorotti, D.Mosca, P.Di Blasio, 2002).

В последнее время накоплены факты, свидетельствующие о перспективности изучения роли системной воспалительной реакции при перитоните, включающие метаболические и функциональные нарушения практически всех органов и систем организма (Е.В.Карякина, С.В.Белова, 2004; D.Sun, N.Aikawa, 1999). При этом повышение уровня эндотоксемии в совокупности с признаками эндотелиальной дисфункции должно рассматриваться в рамках целостного представления о системном воспалении. Поэтапная диагностика биологических эффектов работы воспалительных механизмов уже сейчас позволяет вовремя провести адекватное патогенетическое лечение и не допустить развития катастрофических событий (В.С.Козлов, В.В.Шиленкова, О.Д.Чистякова, 2003; R.Stolarek, P.Kulf, Z.Kurmanowska, 1998; M.Numata et al., 2003).

Подобное состояние проблемы делает необходимым проведение поиска диагностических критериев и лечебных мероприятий, способных с одной стороны - объективно охарактеризовать состояние регуляторно-адаптивных возможностей организма, а с другой - повысить эффективность лечения желчного перитонита.

Стремление создать более эффективные способы лечения больных перитонитом, требует поиска новых концептуальных подходов.

В качестве средства лечения желчного перитонита использован натрия гипохлорит, который является естественным метаболитом нейтрофильных гранулоцитов, способный моделировать бактерицидную функцию фермента миелопероксидазы и детоксицирующую функцию цитохрома Р-450 печеночных клеток (Н.А.Лопаткин, Ю.М.Лопухин, 1989; В.И.Сергиенко, 1987; Э.А.Петросян, 1989; В.К.Гостищев, Н.М.Федоровский, 1991).

Используемая модель 24-часового жёлчного перитонита на собаках макроскопически характеризовалась картиной острого серозно-фибринозного воспаления с множественными очагами геморрагии и налётом фибрина на стенках тонкой кишки, полнокровием сосудов брыжейки тонкой кишки, явлениями стаза, многочисленными очагами геморрагии и характерными признаками микроциркуляторных расстройств.

Анализ летальности в исследуемых группах у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом выявил, что в опытной группе, где в лечении желчного перитонита использовали санационную лапаротомию с внутривенной инфузией 0,04% раствора натрия гипохлорита, отмечалось почти двукратное снижение летальности относительно животных группы сравнения и более благоприятная макроскопическая картина со стороны органов брюшной полости.

В условиях системной воспалительной реакции нейтрофильные лейкоциты, способны функционировать в условиях гипоксии благодаря системы анаэробного гликолиза и выполнять функцию неспецифической защиты организма.

Общеизвестно, что системный характер воспаления брюшины приводит к мобилизации костномозгового резерва и пристеночного пула нейтрофильных лейкоцитов периферической крови, что подтверждается почти двукратным повышением количества лейкоцитов у животных с 24-часовым желчным перитонитом относительно контрольных животных. На 1-е и 3-й сутки количество лейкоцитов у животных в группе сравнения оставалось, по-прежнему, достоверно высоким (р<0,001-^0,05), в то время, как у животных опытной группы начиная с 3-х суток количество лейкоцитов не отличалось от контрольных величин (р>0,05).

Таким образом, динамика изменения количества лейкоцитов в периферической крови в опытной группе при лечении экспериментального желчного перитонита натрия гипохлоритом способствует более раннему восстановлению его содержания.

Важным показателем при оценке степени выраженности воспалительной реакции у животных с желчным перитонитом является изучение относительного соотношения клеточных элементов лейкоцитарной формулы.

Так, у животных с 24-часовым желчным перитонитом наблюдался достоверный рост в 2,6 раза относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов относительно контрольных животных (р<0,05) и достоверное снижение содержания лимфоцитов в 1,9 раза соответственно (р<0,05). В то же время содержание сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов оставалось в пределах исходных величин. <■

В процессе лечения желчного перитонита было выявлено, что в течение первых трех суток, как в группе сравнения, так и в опытной группе, по-прежнему, отмечался сдвиг лейкоцитарной формулы влево, выражающийся в достоверно низком содержании сегментоядерных нейтрофилов (р<0,05) и достоверно высоком содержание палочкоядерных нейтрофилов (р<0,05). Необходимо отметить, что если в группе сравнения максимальный рост содержания палочкоядерных нейтрофилов приходился на 3-й сутки, то в опытной группе данный рост приходился на 1-е сутки (р<0,05). В последующие сроки мы наблюдали нормализацию содержания сегментоядерных нейтрофилов в группе сравнения на 7-е сутки (р>0,05), а палочкоядерных - на 30-е сутки, в то время, как в опытной группе они приходили к исходным цифрам на 10-е сутки (р>0,05).

При изучении количества агранулоцитов в группе сравнения было ч отмечено достоверное снижение содержания лимфоцитов в течение трех суток (р<0,05), а в опытной группе - суток (р<0,05). В то же время, содержание моноцитов в группе сравнения в течение всего периода наблюдения оставалось без изменений (р>0,05), а в опытной группе на 3-й сутки отмечался достоверный его рост в 1,5 раза (р<0,05).

Таким образом, при желчном перитоните на фоне развития системной воспалительной реакции, происходило «омоложение» лейкоцитарной формулы, как за счет мобилизации пристеночного пула нейтрофильных гранулоцитов, так и за счет активации красного костного мозга. В то же время, отмеченное снижение содержания лимфоцитов, можно объяснить перемещением клеток из сосудистого русла в ткани. Лечение желчного перитонита показало, что в опытной группе, где использовалась инфузия 0,04% раствора натрия гипохлорита, происходила более ранняя нормализация содержания палочкоядерных нейтрофилов и стимуляция специфического иммунитета (лимфоцитов, моноцитов).

В процессе развития желчного перитонита со стороны белого ростка крови были выявлены не только количественные, но и качественные изменения, которые нашли свое отражение в ЛИИ 1

Так, у животных с 24 -часовым желчным перитонитом ЛИИ увеличивался в 7,2 раза относительно контрольных животных. В последующие сроки происходило его снижение, которое в группе сравнения приходило к контрольным данным только на 30-е сутки (р>0,05), а в опытной группе - уже на 10-е сутки (р>0,05).

Полученный эффект более раннего снижения состояния эндотоксикоза в опытной группе животных, можно объяснить за счет детоксицирующих свойств натрия гипохлорита.

Свободнорадикальные процессы протекают во всех органах и тканях, являясь нормальной метаболической реакцией, которая важна для регуляции транспорта веществ через мембраны, синтеза простагландинов, лейкотриенов, обмена стероидных гормонов и катехоламинов. Нарушения стационарной скорости свободнорадикального окисления считается ранним, универсальным и неспецифическим механизмом повреждения, лежащим в основе различных заболеваний (И.А.Зборовская, М.В.Банникова, 1995).

У животных с 24-часовым желчным перитонитом отмечался достоверный рост первичных (диеновые коньюгаты, ДК) и вторичных продуктов (малоновый диальдегид, МДА) ПОЛ в плазме и эритроцитах. Так, уровень ДК в плазме в 2,5 раза превышал уровень животных контрольной группы (р<0,05), а в эритроцитах - в 3,9 раза (р<0,05), соответственно. Поскольку реакции ПОЛ на клеточном уровне протекают, прежде всего, на мембранах эритроцитов, антиоксидантная защита которых нарушена, можно полагать, что рост ДКЭр у животных с желчным перитонитом происходит в основном в клетках с нарушенным структурно-функциональным состоянием не способных к выполнению своих функций.

Дальнейшее окисление ДК приводит к образованию вторичных продуктов ПОЛ, наиболее важным из которых является МДА. Если рост ДК в клетке можно отнести в разряд адаптивных реакций, то появление большого количества МДА является не только результатом и показателем активизации свободно-радикального окисления, но и фактором, влияющим на дальнейшую интоксикацию. Именно это мы наблюдали ■ у животных с 24-часовым желчным перитонитом, когда рост МДА в плазме в 2,2 раза превышал уровень контрольных животных (р<0,05). При этом повышение вторичных продуктов в плазме происходило более интенсивно, чем в эритроцитах, где концентрация МДА в 1,74 раза превышала уровень контрольных животных (р<0,05). Менее интенсивный рост МДА в эритроцитах по сравнению с ДК объясняется большей устойчивостью антиоксидантной системы эритроцитов, тормозящей свободнорадикальное окисление в основном на уровне первичных, малотоксичных продуктов.

На фоне проводимого лечения на 1-е сутки в группе сравнения отмечался дальнейший рост ДК плазмы до 20,96±1,21 отн. ед. против 16,51+1,77 отн. ед. у животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05), в то время, как показатели ДК эритроцитов снижались вплоть до 10-х суток, когда уже не отличались от контрольных данных (р<0,05). В опытной группе показатели ДК плазмы уже 1-е сутки стабилизировались и достоверно не отличались от показателей животных с 24-часовым желчным перитонитом (р>0,05) и на 3-й сутки от показателей контрольных животных (р>0,05), в то время, как показатели ДК эритроцитов начиная с 1-х суток начали падать и к 7-м суткам не отличались он контрольных цифр (р>0,05). Подобные изменения ДК эритроцитов возможно связано с тем, что эритроциты на фоне предельно высокого уровня перексидации разрушаются и элиминируются из кровотока, поддерживая при этом высокий уровень плазматических продуктов ПОЛ.

Изменения МДА в целом соответствуют общей тенденции и тяжести интоксикационного процесса при желчном перитоните. Начиная с 1-х суток лечения концентрация МДА в плазме, в исследуемых группах снижалась, но при этом, по-прежнему, оставалась высокой относительно контрольных данных вплоть до 10-х суток в группе сравнения и до 3-х суток в опытной группе (р<0,05).

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что в группе сравнения у животных с желчным перитонитом помимо интенсивного протекания процессов свободнорадикального окисления, вероятно, имеет место и задержка выведения гидрофобных токсинов из-за нарушения функции транспортной составляющей детоксикационной системы организма. В пользу подобного предположения говорит, наблюдаемая у животных опытной группы уже на 3-й сутки за счет детоксицирующего действия натрия гипохлорита нормализация концентрации МДА в плазме. При изучении концентрации МДА эритроцитов на фоне проводимого лечения на 1-е сутки в группе сравнения отмечен недостоверный его рост (р>0,05), в то время, как в опытной группе рост концентрации МДА был достоверно значим относительно животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05). В дальнейшем в исследуемых группах происходило постепенное снижение его концентрации, которая приходила в группе сравнения к исходным цифрам на 30-сутки, а в опытной - на 7-е сутки.

Полученные результаты, по-видимому, можно объяснить проходящими свободно-радикальными процессами в мембранах эритроцитов, приводящие к высокой концентрации цитотоксичного МДА, деструктивным изменениям белково-липидного комплекса мембран, и нарушению таких свойств эритроцитов, как эластичность, прочность и деформабельность, а отсюда нарушению транспортной составляющей эритроцитов. Исходя из данных объяснений, можно понять, почему в группе сравнения нормализация показателя МДА эритроцитов происходила позже, чем в основной группе, где был использован натрия гипохлорит.

Общеизвестно, что нарастающая эндогенная интоксикация приводит к образованию избыточного количества АФК, под действием которых происходит повреждение структурных элементов клеточных мембран и нарушение метаболизма клеток (G.Bartosz, 1990; P.Caprary et al., 1995). В работах многих авторов установлена высокая корреляция между изменениями свойств мембран эритроцитов и клеточными мембранами внутренних органов, что позволяет использовать эритроцитарные мембраны в качестве естественной модели для исследования общих характеристик, в том числе и проницаемости, всех биомембран (Е.А.Черницкий, A.B.Воробей,

1981; Я.Кагава, 1985).

В нашем исследовании в качестве маркера проницаемости мембран эритроцитов был выбран показатель определяющий общее количество тиоловых групп (SH-) в крови.

Исследование SH- групп в крови у животных с 24-часовым желчным перитонитом показал двукратный рост его содержания относительно животных контрольной группы (р<0,05), что свидетельствовало о структурно-функциональной дестабилизации барьерной функции мембран эритроцитов. При этом нее исключено, что выход в общий кровоток SH-групп при разрушении части эритроцитов, во-первых, может быть защитной реакцией, направленной на нейтрализацию АФК и тем самым, блокаду процессов ПОЛ с образованием наиболее токсичных конечных форм, что подтверждается полученными данными о менее интенсивном росте цитотоксичных вторичных продуктов перекисного окисления липидов (МДА) по сравнению с первичными (ДК). Во-вторых, через взаимодействие SH-групп с оксидом азота может осуществляться активация клеточного фермента гуанилатциклазы с образованием циклического гуанозина моно фосфата (цГМФ), который и опосредует все эффекты NO.

Таким образом, интенсификация процессов ПОЛ у животных с желчным перитонитом инициирует целый ряд физико-химических изменений в мембранах эритроцитов и ведет к возникновению зон повышенной ионной проницаемости, что может быть связано со снижением активности эритроцитарных антиоксидантных ферментов. Полученные данные позволяют обосновать кластерный механизм повышения проницаемости мембран эритроцитов у животных с желчным перитонитом, согласно которому модифицированные молекулы фосфолипидов под действием процессов свободно-радикального окисления объединяются во внешнем и во внутреннем монослое мембраны в перекисные кластеры и становятся причиной образования полярных каналов проницаемости.

На 1-е сутки лечения в группе сравнения содержание 8Н-групп в плазме крови не отличалось от показателя у животных с 24-часовым желчным перитонитом (р>0,05), в то время, как в основной группе содержание 8Н-групп было уже достоверно ниже (р<0,05). В последующие сроки наблюдения содержание 8Н-групп в группе сравнения приходило к контрольным цифрам только на 10-е сутки, в то время, как в основной группе содержание 8Н-групп уже не отличалось от показателей животных контрольной группы на 7-е сутки. Положительный эффект применения натрия гипохлорита в опытной группе возможно объяснить, окислительным повреждением части мембран эритроцитов и выход в кровь БН-групп, что является компенсаторным механизмом, направленным на блокаду процессов свободнорадикального окисления в плазме. Не исключено, что степень деструкции мембран эритроцитов зависит также от концентрации используемого раствора натрия гипохлорита в крови и от степени нарушения структурно-функциональной целостности эритроцита. Следовательно, отсюда можно предположить, что первыми будут подвергаться повреждению функционально «старые» эритроциты.

Таким образом, в целом механизм предполагаемого процесса повреждения эритроцитов, возможно, заключается в том, что при применении натрия гипохлорита на первом этапе происходит освобождению мембран эритроцитов от сорбированных на гликокаликсе ВНСММ, а на втором этапе - проявляется повреждающее действие натрия гипохлорита, как мощного окислителя. При этом чем функционально «старше» клетка (эритроцит), тем более подвержено нарушению белок-липидное соотношение в сторону роста липидных молекул на поверхности эритроцитов и поэтому будет более выраженным цитолитический (окислительный) эффект натрия гипохлорита. Именно в этом механизме, можно видеть положительную роль натрия гипохлорита при эндотоксикозе - возможность элиминировать из кровеносное русла эритроциты со сниженной резистентностью и их замену, на молодые эритроциты из костномозговых и других депо.

Общеизвестно, что ВСНММ сорбируются на гликокаликсе эритроцитов с целью их доставки к органам функциональной системы детоксикации. Длительное же воздействие продуктов эндогенной интоксикации на эритроциты приводит к конформации белкового и фосфолипидного слоев мембраны, патологическому ее уплотнению с резким снижением транспортных возможностей эритроцита - формируется так называемая жесткая мембрана. На основании вышеизложенного, можно предположить, что сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) может служить основным, обобщающим критерием при определении тяжести эндогенной интоксикации.

Исследование ССЭ у животных с 24-часовым желчным перитонитом показало её снижение в 1,8 раза относительно животных контрольной группы, что является объективным отражением степени тяжести эндогенной интоксикации и обусловлено структурно-функциональными повреждениями эритроцитарных мембран.

На фоне проводимого лечения у животных группы сравнения в течение первых трех суток заболевание наблюдалось достоверное снижение ССЭ относительно животных контрольной группы (р<0,05), в то время, как в опытной группе подобное снижение ССЭ отмечался только на первых сутках (р<0,05). В последующие сроки в исследуемых группах происходила нормализация ССЭ.

Таким образом, более раннее восстановление ССЭ у животных желчным перитонитом в опытной группе, явилось результатом, во-первых, детоксикационного эффекта раствора натрия гипохлорита за счет элиминационного пула ВНСММ и, во-вторых, деблокированием мембран эритроцитов от катаболического пула ВНСММ и ростом ССЭ.

В качестве традиционного способа изучения проницаемости мембран, нами было рассмотрено состояние клеточных ферментов аланинаминотрансферазы (AJIT) и аспартатаминотрансферазы (ACT).

При изучении состояния данных ферментов у животных с 24-часовым желчным перитонитом был обнаружен рост в 2,5 раза активности AJIT и в 1,5 раза ACT относительно животных контрольной группы, т.е. баланс между ACT и AJIT «переваливает» с катаболической (ACT) на анаболическую (AJIT) сторону для поддержания метаболического равновесия.

На 1-е сутки лечения желчного перитонита в исследуемых группах изменения со стороны показателей активности ACT и AJIT по-прежнему достоверно превышали уровень животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05). В последующие сроки лечения, наблюдалось падение активности ACT и AJIT, которое в группе сравнения уже на 10-е сутки, а в опытной группе - на 7-е сутки достоверно не отличались от исходных данных (р>0,05). Ранние сроки снижения ферментемии у животных опытной группы можно связать с окислительными свойствами натрия гипохлорита.

Таким образом, обнаруженная нами высокая активность AJIT над ACT определяется доминированием при экспериментальном желчном перитоните анаболических процессов, над катаболическими за счет интенсивности глюконеогенеза. Фактически мы можем констатировать, что повышение активности трансаминаз на фоне развития синдрома эндогенной интоксикации, связано либо с необходимостью отведения продуктов гликолиза от органов, оказавшихся в условиях гипоксии, либо с повышением энергетических затрат печенью на выполнение ею функции детоксикации. Комплексное использование натрия гипохлорита в процессе лечения экспериментального желчного перитонита способствовало снижению ферментемии.

Известно, что отношение трансаминаз ACT/AJIT - отражает физиологическую координированность катаболического и анаболического пула, которая в норме равна 1,5 (И.М.Рослый, Е.Г.Белова, В.Б.Вакуленко, 1999]. Поэтому, оценка ферментемии должна производиться, прежде всего, с позиций метаболических изменений, а не только цитолитических проявлений.

Исследование соотношения АСТ/АЛТ (коэффициента де Ритиса) у животных с 24-часовым желчным перитонитом, свидетельствует о его снижении в 1,1,7 раза относительно животных контрольной группы, что отражает сдвиг метаболических процессов в сторону интенсификации глюконеогенеза (анаболический вариант) через глюкозо-аланиновый шунт с использованием АЛТ, который необходим для поддержания адекватного уровня глюкозы в условиях эндогенной интоксикации. В ходе лечения в исследуемых группах уже на 1-е сутки и в дальнейшем, коэффициент де Ритиса не отличался от исходных данных (р>0,05).

Таким образом, оценивая показатели ферментемии при экспериментальном желчном перитоните, необходимо учитывать, что исследуемые ферменты катализируют определенные биохимические реакции и участвуют в важнейших метаболических процессах, являясь одним из проявлений общего адаптационного синдрома. Все это позволяет исследуемые показатели рекомендовать для оценки направленности и интенсивности важнейших метаболических процессов при состояниях, сопровождающихся синдромом системной воспалительной реакции. Кроме того, полученные результаты при исследовании активности аминотрансфераз позволяют расширить сложившееся представление об активности и направленности метаболических процессов при желчном перитоните.

Среди факторов повреждения, ведущих к запуску синдрома системной воспалительной реакции при перитонитах, одно из главных мест отводится эндотоксикозу. Эндотоксин, взаимодействуя с рецепторами семейства ТЫ1, экспрессированными на мембранах моноцитов/макрофагов, нейтрофилов, тромбоцитов, активирует в них синтез первичных медиаторов воспаления -цитокинов. К числу таких соединений с полным основанием можно отнести оксид азота (NO), который синтезируется не только в эндотелиоцитах, но и в тромбоцитах (L.Mazzanti, B.Mutus, 1997).

Общеизвестно, что эндотелий сосудов представляет собой функциональный барьер между сосудистой стенкой и кровью, состоящий из одного слоя клеток (M.Onder, B.Barutcuoglu, 2006). Учитывая площадь и вес эндотелия в организме человека, его считают самым большим эндокринным органом, дисфункция которого связана с нарушением продукции метаболитов NO (Н.Н.Петрищев, Т.Д.Власов, 2007).

Несмотря на большое количество экспериментальных данных об активации синтеза N0 эндотелиоцитами, нейтрофилами, моноцитами, тромбоцитами и клетками Купфера в условиях эндотоксинемии, как in vitro, так и in vivo остается малоизученным вопрос синтеза NO при перитоните вообще и при желчном перитоните в частности.

При исследовании содержания метаболитов NO в плазме у животных с 24-часовым желчным перитонитом наблюдалось достоверное повышение их концентрации в 1,36 раза относительно животных контрольной группы, что может быть связано с выраженной активностью воспалительного процесса в брюшной полости и окислительным стрессом. Не исключено, что полученные результаты можно объяснить и антитромбогенным действием оксида азота, направленного на ингибирование экспрессии адгезивных молекул эндотелия.

На 1-е сутки в исследуемых группах в ходе проводимого лечения наблюдался дальнейший рост содержания метаболитов NO в плазме. При этом в группе сравнения данный рост достоверно не превышал значения у животных с 24-часовым желчным перитонитом (р>0,05), в то время, как в опытной группе он был достоверно значим в 1,26 раза (р<0,05). В последующие сроки в группе сравнения содержание метаболитов N0 в плазме постепенно снижалось и к 7-м суткам уже не отличалось от уровня животных контрольной группы (р>0,05). В опытной же группе, где использовали комплексное применение натрия гипохлорита, продолжался рост уровня метаболитов N0, достигая своего максимума на 3-й сутки, превышая в 1,32 раза показатели животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05). И только к 10-м суткам исследования содержание метаболитов N0 в плазме в опытной группе животных приходило к исходным цифрам (р>0,05).

Общеизвестно, что в динамике желчного перитонита повышается проницаемость стенки капилляров, которая приводит к выходу защитных агентов в очаг воспаления. Эти процессы регулируются наряду с гистамином, кининами, лейкотриенами и оксидом азота, тромбоксаном, простациклином, что свидетельствует о тесном взаимодействии эндотелия сосудов и тромбоцитов (М.ЯасЬтзку, К.Ра1тег, Б.Мопсаёа, 1990; Я.А^аг, 1993; М.ТчГопб й а1., 1996). Данные межклеточные взаимоотношения регулируют не только сосудистые эффекты, но процессы агрегации тромбоцитов и их адгезии к сосудистой стенке (А.Р.Хамидуллина, 2010; Р.Кпол^е^, 8.Мопсас1а, 1994). В отличие от простациклина, известного в качестве мощного антиагрегационного фактора, продуцируемого сосудистым эндотелием, таким же эффектом, обладает оксид азота, синтезирующийся в тромбоцитах (Р.Муегз ег а1., 1990; Б.Мопсаёа, А.Ь^б, 1993; Р.КполуеЬ, Б.Мопсаёа, 1994; 1.Беппт§ег, М.МапеПа, 1999].

Все это позволяет исследовать тромбоцит в качестве клетки, несомненно, влияющем не только на выраженность воспалительного процесса при желчном перитоните, но и на его исход.

Исследование содержания метаболитов N0 в тромбоцитах животных с 24-часовым желчным перитонитом показало достоверное их повышение в 1,43 раза относительно животных контрольной группы (р<0,05), которую можно объяснить, как защитную реакцию организма.

На 1-е сутки лечения в исследуемых группах наблюдалось дальнейшее повышение содержания метаболитов N0 тромбоцитов, которое в опытной группе, где использовали натрия гипохлорит был в 1,3 раза выше, чем у животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05), в то время как в группе сравнения данный рост был незначим (р>0,05). Необходимо также отметить, что гиперпродукция метаболитов N0 тромбоцитов в опытной группе было достоверно выше, чем в группе сравнения (р<0,05). В последующие сроки содержание метаболитов N0 тромбоцитов в группе сравнения продолжало снижаться и приходило к исходным цифрам на 10-е сутки (р>0,05), в то время, как в опытной группе оно продолжало расти и достигло максимальных величин на 7-е сутки, превышая показатели животных с 24-часовым желчным перитонитом в 1,39 раза. Так же как и в группе сравнения, содержание метаболитов N0 тромбоцитов приходило к исходным данным только к 10-м суткам (р>0,05).

Таким образом, возможным патогенетическим механизмом нарушения метаболизма оксида азота при экспериментальном желчном перитоните является эндотелиальная и клеточная дисфункция, как отражение системной воспалительной реакции организма с нарушением дисбаланса между медиаторами, обеспечивающими оптимальное течение молекулярных процессов. Наблюдаемая гиперпродукция метаболитов оксида азота в плазме и тромбоцитах в опытной группе животных, где в комплексной терапии желчного перитонита использовали внутривенные инфузии натрия гипохлорита, по-видимому, является результатом его воздействия на эндотелий сосудистой стенки и клеточные мембраны тромбоцитов с активацией синтеза индуцибельной Ж)-синтазы (ТМ08).

Учитывая тот факт, что система гемостаза, особенно система тромбоцитов, одна из первых реагирует на самые различные повреждающие воздействия, разумно предположить наличие изменений сосудисто-тромбоцитарного звена (СТЗ) гемостаза в динамике развития синдрома системной воспалительной реакции при экспериментальном желчном перитоните.

СТЗ гемостаза представляет собой один из этапов гемостаза, он не только обеспечивает формирование направленного тромбообразования и поддержание жидкого состояния крови. В данном процессе происходит не только активация тромбоцитов и образование фибрина, но также активация эндотелия и лейкоцитов. Взаимодействие между воспалительными клетками крови и тромбоцитами является важным в генерации тромбина, поскольку блокирование этого взаимодействия препятствует тромбообразованию.

Общеизвестно, что эндотелиальные клетки влияют на процессы коагуляции и тромбоза, но только недавно выяснилось, что этот процесс зависит от оксида азота. Механизм антитромбогенного действия NO обусловлен ингибированием экспрессии адгезивных молекул сосудистого эндотелия (J.S.Stamler, D.I.Simon, J.A.Osbome et al., 1991), вследствие чего снижается адгезия форменных элементов крови к сосудистому эндотелию (J.N.Bates, D.G.Harrison, P.Myers, 1991; J.R.Lancaster, 1992) и подавляется действие тромбоцитарных вазоконстрикторов (тромбоксана А2 и серотонина) (A.Mugge, U.Forestermann, P.R.Lichtlen, 1991).

У животных с 24-часовым желчным перитонитом обнаружено достоверное повышение количества тромбоцитов до 301,28+36,04 х109/л против 207,07120,08 х109/л в контрольной группе животных (р<0,05), которое отражает интенсивный и часто скрытый механизм активации тромбоцитов, играющий важную роль в нарушении микроциркуляции и тромбообразования.

Изучение количества тромбоцитов в исследуемых группах на фоне проводимого лечения показало снижение их содержания относительно животных с 24-часовым желчным перитонитом. Однако, данное снижение в группе сравнения на протяжении всего периода наблюдения оставалось достоверно не значимым относительно животных контрольной группы (р>0,05), в то время, как в опытной группе на 1-е сутки количество тромбоцитов еще достоверно превышало цифры животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05).

Полученный результат является отражением системной воспалительной реакции в виде активации эндотелиальных клеток, экспрессии на их поверхности отрицательно заряженных мембранных фосфолипидов, активации СТЗ гемостаза за счет перераспределения тромбоцитов в сосудистом русле и их участия в процессах воспаления и репарации.

При изучении времени агрегации тромбоцитов у животных с 24-часовым желчным перитонитом наблюдалось усиление агрегационных свойств тромбоцитов до 8,83±0,65 сек против 12,54±0,82 сек у контрольных животных (р<0,05), что может быть результатом экспрессии адгезивных молекул сосудистым эндотелием.

Анализ времени агрегации тромбоцитов у животных с желчным перитонитом на фоне проводимого лечения показал, что в группе сравнения уже на 3-й сутки показатели времени агрегации тромбоцитов достоверно не отличались от контрольных величин (р>0,05), что может быть связано выявленной нами гиперпродукцией метаболитов N0 тромбоцитов, способных ингибировать агрегацию тромбоцитов. В то же время в опытной группе, определялось устойчивое увеличение агрегационной активности тромбоцитов, достигшее своих максимальных значений на 3-й сутки, относительно животных контрольной группы (р<0,05), что может быть связано с взаимодействием метаболитов N0 тромбоцитов с гипохлорит анионом (ОСГ) и таким образом, модулированием воспалительного процесса в сосудистой стенке и внутрисосудистым свертыванием крови, либо указывать на активизацию натрия гипохлоритом экспрессии адгезивных молекул сосудистым эндотелием с развитием внутрисосудистой тромбофилии.

Таким образом, свободнорадикальные процессы при развитии экспериментального желчного перитонита вызывают метаболические и функциональные расстройства практически всех органов и систем, проявлением которых является клеточная и эндотелиальная дисфункция, сопровождающаяся увеличением количества тромбоцитов и угнетением агрегационной способности тромбоцитов, что указывает на активацию сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза, который может играть существенную роль в развитии ДВС-синдрома, а так же являться фактором нарушения микроциркуляции и тромбообразования. При этом общая направленность свертывающей системы носит тромбофилический характер, что проявляется увеличением количества тромбоцитов и активацией их агрегационных свойств. Подобные изменения в системе гемостаза при отсутствии коррекции могут привести к развитию тромбозов в раннем или позднем периоде заболевания, или перейти в развернутую клиническую картину ДВС-синдрома. Учитывая вышеизложенное, можно утверждать, что срочная коррекция выявленных гемокоагуляционных нарушений - одно из главных требований для успешного лечения желчного перитонита.

В настоящее время патогенез желчного перитонита рассматривается с точки зрения эндотоксикоза с угрозой развития необратимых морфофункциональных изменений в органах функциональной системы детоксикации. Во многом развитие эндотоксикоза связано с несоответствием между образованием токсических субстанций и способностью органов, входящих в функциональную систему детоксикации трансформировать и элиминировать их (В.В.Кирковский, 1997).

Среди органов функциональной системы детоксикации почкам отводится ведущая роль в поддержании гомеостаза (М.Я.Малахова, 2000). Снижение экскреторной функции почек при перитоните является универсальной патофизиологической реакцией организма (К.С.Симонян, 1971; А.И.Струков, 1990), причиной которой являются системные расстройства гемодинамики и связанная с ними гипоперфузия почек (В.В.Кирковский, 1997]. В эндотелии почек, гладкомышечных клетках почечных сосудов, мезангиальных клетках клубочка и эпителиальных клетках канальцев происходит постоянный синтез оксида азота, который регулируют почечный кровоток, перфузионное давление, а также влияет на реабсорбцию ионов канальцами и собирательными трубочками (Х.М.Марков, 1996; С.ВауПБ, .Г.В1осЬ, 1996). Возникающие расстройства в почках являются одной из основных предпосылок развития коагулопатических нарушений, ведущих к почечной недостаточности (А.П.Симоненков, В.Д.Федоров, 1998). Именно предупреждение развития почечной, а в последующем и полиорганной недостаточности является одним приоритетных направлений в своевременной диагностики и адекватной коррекции выявленных расстройств при желчном перитоните.

Учитывая, что развитие перитонита сопровождается снижением функциональной способности органов детоксикации, стрессовым истощением эндокринных органов и гемокоагуляционными расстройствами мы поставили задачу получить сведения, касающиеся морфофункциональных изменений происходящих в почках на уровне микроциркуляции, которые позволили бы расширить современные представления о морфогенезе желчного перитонита.

В отличие от гистологической картины препаратов почек животных контрольной группы у животных с 24-часовым желчным перитонитом определялся отек капсулы Шумлянского-Боумена и клубочков, что являлось отражением компенсаторных реакций клубочкового аппарата. В корковом и мозговом веществе определялось значительное расширение и полнокровие сосудов со стазами и агрегацией эритроцитов, в капиллярах выявлялись эритроцитарные и гиалиновые тромбы, а также различной степени выраженности кровоизлияния в тубулярную ткань. Эпителий извитых канальцев находился в состоянии белковой и гиалиново-капельной дистрофии с участками некроза и некробиоза. Встречались канальцы, в которых вследствие десквамации эпителия не определялся просвет.

Наблюдалась выраженная полиморфноклеточная инфильтрация стромы с преобладанием нейтрофильных гранулоцитов.

При гистохимическом исследовании в отдельных капиллярах клубочков выявлялись гиалиновые тромбы, вакуольная дистрофия, слущивание эпителия канальцев. В просвете канальцев определялись гиалиновые цилиндры, дающие положительную реакцию на «зрелый» фибрин. Стенки сосудов и почечных канальцев находились в состоянии фибриноидного пропитывания с отложением «зрелого» фибрина и их частичного фибриноидного некроза.

Таким образом, морфофункциональные исследования препаратов почек у животных с 24-часовым желчным перитонитом обнаружили картину серозно-фибринозного воспаления, характеризующиеся альтеративными и сосудисто-экссудативными проявлениями в виде отека межуточной ткани, лейкоцитарной инфильтрацией стромы, очаговыми дистрофическими и некробиотическими изменениями, расширением и полнокровием сосудов, различной степени выраженности кровоизлияниями, стазами, агрегацией эритроцитов, эритроцитарными и гиалиновыми тромбами в просветах капиллярах, что свидетельствовало о наличие гемокоагуляционных расстройств имеющими гиперкоагуляционную направленность.

На 1-е сутки в группе сравнения, по-прежнему, сохранялись очаговые кровоизлияния в корковом слое и в капсуле Шумлянского-Боумена, лейкоцитарная инфильтрация с преобладанием нейтрофильных гранулоцитов, ярко выраженная гиалиново-капельная дистрофия эпителия канальцев с очагами некроза и некробиоза, в то время как в опытной группе данные процессы были выражены в меньшей степени и характеризовались массивной полиморфноклеточной инфильтрацией, захватывающей капсулярную ткань, область канальцев коркового и мозгового вещества. В составе инфильтрата находились моноциты, лимфоидные клетки, единичные нейтрофильные гранулоциты, гистиоциты и фибробласты, что свидетельствует о начале репаративных процессов. Помимо этого в изучаемых группах сохранялась реакция сосудистого русла на воспаление в виде полнокровия сосудов, стаза и агрегации эритроцитов.

При гистохимическом исследовании в исследуемых группах прогрессировали явления дистрофии стенок сосудов в виде мукоидного, фибриноидного набухания и некроза, выполненного «зрелым» фибрином с тенденцией к некробиозу в группе сравнения. Кроме того, у животных группы сравнения в артериолах коркового вещества определялись единичные гиалиновые тромбы, а в капиллярах гиалиновые мембраны.

На 3-е сутки в исследуемых группах сохранялась реакция микроциркуляторного русла на воспаление в виде расширения, полнокровия сосудов клубочков, стаза и агрегации эритроцитов. Одновременно в почечной паренхиме выявлялись очаговые и диапедезные кровоизлияния, дистрофические и некробиотические процессы эпителия канальцев и клубочков разной степени выраженности с преобладанием процесса у животных группы сравнения. Полиморфноклеточная инфильтрация была выражена как в группе сравнения, так и в опытной группе, но если в опытной группе клеточная инфильтрация распространялась на все тканевые структуры почки и имела ярко выраженный лимфоидно-макрофагальный компонент, то в группе сравнения лимфоцитарные инфильтраты обнаруживались в основном в клубочковом аппарате почки и периваскулярных пространствах межуточного вещества коркового и мозгового слоя. В обеих исследуемых группах выявлялись небольшие участки грануляционной ткани. В опытной группе кроме того наблюдалась активная пролиферация фибробластов.

При гистохимическом исследовании в группе сравнения в сосудистом русле выявлялись эритроцитарные, гиалиновые и фибриновые тромбы из «старого» фибрина, в то время как в опытной группе они отсутствовали. Как в группе сравнения, так и в опытной группе в стенках сосудов, соединительно-тканных структурах канальцев и клубочков выявлялись различной степени выраженности участки, выполненные «зрелым» и «старым» фибрином.

На 10-е сутки у животных группы сравнения сохранялась сосудистая реакция на воспаление с редкими эритроцитарно-фибриновыми тромбами, массивная лейкоцитарная и лимфоидно-фибробластическая инфильтрацией канальцев и клубочков, определялись некробиотические и геморрагические изменения в гломерулярном аппарате почки, атрофия нефроцитов и фиброзные очаги в системе канальцев и клубочков. В отличие от группы сравнения в опытной группе, где в комплексном лечении экспериментального желчного перитонита использовали натрия гипохлорит, реакция сосудистого русла на воспаление практически отсутствовала, отмечались пролиферативные процессы в стромально-сосудистых и эпителиальных структурах в виде гипертрофированных кубически измененных двуядерных нефроцитов с одновременным сохранением гиалиново-капельной дистрофии эпителия канальцев и клубочков. Нейтрофильная инфильтрация была незначительной и в большей части локализовалась в корковом и мозговом слоях. В обеих изучаемых группах наблюдались очаги грануляционной ткани разной степени зрелости с дифференцировкой клеток и образованием молодых сосудов, а опытной группе дополнительно определялась активная пролиферация фибробластов.

Гистохимическое исследование, проведенное в группе сравнения и в опытной группе, выявляли участки фибриноидного некроза в канальцевом и клубочковом аппарате почек. При этом в группе сравнения в зонах фибриноидного некроза выявляется «зрелый» и «старый» фибрин, в то время как в опытной группе в этих участках выявлялись редкие отложения «старого» фибрина.

На 30-е сутки у животных группы сравнения определялся слабо выраженный отек и периваскулярная лимфогистиоцитарная инфильтрация коркового слоя, отек дистального и проксимального отделов канальцев, очаговый фиброз и дистрофия эпителия клубочков и тубулярного аппарата. В опытной группе животных на фоне применения натрия гипохлорита в почках наблюдалась мелкоочаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация периваскулярных пространств коркового слоя, очаговая пролиферация эпителия клубочков и канальцев, наличие двуядерных эпителиоцитов.

При гистохимическом исследовании почек у животных в группе сравнения определялись участки фиброза с активной коллагенезацией по типу очагового нефросклероза с инкапсулированными фрагментами «старого» фибрина, в то время как в опытной группе в этих участках отсутствовали отложения «старого» фибрина.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что комплексное лечение экспериментального желчного перитонита с применением натрия гипохлорита приводит к нормализации морфологической структуры почки к 30-м суткам и практически полному купированию гемокоагуляционных расстройств к 7-м суткам. Элективный метод определения фибрина, использованный в работе, позволил обнаружить ранние проявления гемокоагуляционных расстройств в микроциркуляторном русле почки и стал надежным критерием адекватности проводимой терапии.

Вместе с тем многие важные аспекты патоморфологии почки при желчном перитоните остаются неизученными. В частности, практически отсутствует количественная оценка морфологических изменений в почках в динамике развития желчного перитонита и на фоне применения различных схем лечения, хотя необходимость ее очевидна.

Для подтверждения полученных морфофункциональных изменений в почках у животных с желчным перитонитом дополнительно были проведены морфометрические измерения параметров среднего размера (СР) и объёмной доли (ОД) «зрелого» фибрина.

Морфометрические исследования проведенные у животных с

24-часовым желчным перитонитом выявили достоверное увеличение среднего размера «зрелого» фибрина до 1647,0±242,0 мкм (р<0,001) и объемной его доли до 63,2±2,0% (р<0,001), которые подтверждают наличие маркеров ДВС-синдрома в микроциркуляторном русле почки.

На 1-е сутки в группе сравнения на фоне проводимого лечения наблюдался достоверный рост параметров СР и ОД «зрелого» фибрина относительно показателей животных с 24-часовым желчным перитонитом (р<0,05), в то время как в опытной группе рост параметров был достоверно незначим (р>0,05). Полученные результаты свидетельствуют о прогрессировании гемокоагуляционных расстройств на микроциркуляторном уровне почек в группе сравнения, в то время, как в опытной группе данные изменения на фоне применения натрия гипохлорита были приостановлены. Подобные морфометрические изменения параметров «зрелого» фибрина можно объяснить, продолжающейся экспрессией эндотелиальными клетками молекул, запускающих процесс свертывания крови и блокирование растворения фибрина.

Таким образом, источником развития системной воспалительной реакции при экспериментальном желчном перитоните являются эндотоксины широкого химического и биологического спектров, накопление которых приводит к ответной реакции организма в виде эндотелиальной дисфункции.

В последующие сроки в исследуемых группах отмечалось существенное снижение морфометрических параметров СР и ОД «зрелого» фибрина (р<0,05), которое было более значимо в опытной группе. Эти данные согласуются с данными гистохимических исследований, которые свидетельствовали о более раннем купировании гемокоагуляционных нарушений в опытной группе, где в комплексном лечении использовали натрия гипохлорит. Проведенный анализ морфометрических параметров степени зрелости фибрина в совокупности с биохимическими показателями гемостаза позволяют объективно оценить степень тяжести заболевания и определить эффективность проводимой терапии. Таким образом, выявленные морфометрические изменения параметров среднего размера и объёмной доли «зрелого» фибрина у животных с экспериментальным желчным перитонитом в группе сравнения могут свидетельствовать о тромбинемии с нарушением процессов полимеризации фибрин-мономеров и образованием неполноценного фибрина. В отличие от группы сравнения в опытной группе на фоне применения натрия гипохлорита наблюдалось ингибирование факторов гемокоагуляционного каскада, которые, прежде всего, имели фосфолипидную структуру (преимущественно факторы «внешнего» пути), что приводило к их окислению и тем самым улучшению морфометрических параметров, как критериев гемокоагуляционных расстройств.

Подтвержденный морфофункциональными и морфометрическими исследованиями положительный эффект комплексного применения натрия гипохлорита при лечении экспериментального желчного перитонита нашел подтверждение в двукратном снижении процента летальности животных в опытной группе по сравнению с группой сравнения.

Таким образом, описанные структурно метаболические повреждения ткани почек отражают особенности морфогенеза и патогенеза почечной дисфункции при экспериментальном желчном перитоните. Патогенез почечной дисфункции при желчном перитоните во многом обусловлен развитием эндотоксемии и морфофункциональными изменениями в микроциркуляторном русле почек. Очевидно, что без глубоких знаний морфофункциональных изменений, протекающих на уровне гемомикроциркуляции в почках при эндотоксикозе и после его устранения, не может быть качественного улучшения патогенетической терапии больных, осложняющей течение перитонита. Выяснение основных этапов формирования морфофункциональных изменений, а также морфометрических показателей перестройки внутриорганных сосудов в почках позволит расширить представления о механизмах адаптации системы кровообращения, что имеет теоретическое и практическое значение для неотложной хирургии.

Завершая обсуждение полученных результатов, необходимо подчеркнуть, что изучение синдрома системной воспалительной реакции и сопряженной с ней эндогенной интоксикацией, вместе с детализацией паренхиматозно-стромальных и межклеточных взаимоотношений при желчном перитоните - заслуживают дальнейшего изучения. По нашему мнению, это должно способствовать расширению арсенала лечебных воздействий и, в итоге - повышению эффективности лечения пациентов в клинике.