Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние нового концентрата N-3 полиненасыщенных жирных кислот"Эпадена" на свертывающую систему крови

»по с;

1 5 №

На правах рукописи

КАЛУГИН Сергей Александрович

УДК: 612.115; 615.273.52; 577.125.3; 665.211/.214

ВЛИЯНИЕ НОВОГО КОНЦЕНТРАТА N-3 ПОЛ1ШЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ "ЭПАДЕНА" НА СВЕРТЫВАЮЩУЮ СИСТЕМУ

КРОВИ

14.00.25 - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Научные руководоггсшк

- доктор медицинских наук, профессор В .А. Макаров;

- кандидат медицинских наук Г.Н.Петрухнна,

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор В.С.Ефимов;

Ведущее учреждение:

- доктор медицинских наук, профессор Е.Г.Изюмов.

- Московская медицинская академия им.И.М. Сеченова.

Защита состоится " ^ " 199^" г. в /£ часов на заседании

диссертационного совета Д 084.08.01 в Московском медицинском стоматологическом институте (103433, Москва, ул. Долгоруковская, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского медицинского стоматологического института (ул. Вучстича, 10а).

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Л Л. Кирсподт

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы: Тромбозы и нарушения микроциркуляшот, вызывая итологнческие изменения функций органов и систем, занимают значительное место в линике многих заболеваний (атеросклероз, нарушения мозгового кровообращения, ппемическая болезнь сердца, сахарный диабет и другие) и могут быть [епосредственной причиной гибели больного. При этом увеличивается склонность ромбоцитов к агрегации, уменьшается продукция внутренним слоем сосудистой тенки простациклина и эндотелиального фактора расслабления, активируются ромбоцитарно-сосудистые взаимодействия (Герасимова E.H./1989, Fox J.C./1992, Joodnigth S.H./1982, Goodnigth S.H./1990, Saynor R./1984.). В последние годы в странах :НГ наблюдается учащепие тромбо-эмболических осложнений при различных аболеваниях, рост смертности при состояниях, в генезе которых нарушения икроциркуляции и тромбоз играют ведущую роль. Несмотря на определенные успехи изучении физиологии и патологии системы гемостаза и патогенеза тромбозов, а акже внедрение в практическое здравоохранение антиагреганггов, антикоагулянгов и ибринолигических средств, эта проблема по прежнему остается актуальной. Таким бразом, возникает необходимость поиска новых эффективных и удобных в рименении средств коррекции функций гемостаза, влияющих на различные звенья зертывания крови.

В последнее время внимание исследователей всего мира было обращено на ммоасное применение п-3 полиненасыщенных жирных кислот в качестве средств туштеган микроциркуляция и предотвращения тромбозов. Предпосылками для зучения влияния этих агентов на функции системы гемостаза послужили сообщения ада авторов, занимающихся эпидемиологическими исследованиями, о низком уровне ¡рдечно-сосудистых заболеваний и тромбозов у коренных жителей прибрежных шонов Японии, Севера Америки и других регионов, население которых употребляет в ищу большое количество рыбы и морепродуктов (Bjerregaard Р./1988, Dyerberg J./1979, yerberg J./ 1987, Hamazaki Т./ 1986, Innis S.M./1989, Naughton J.M./ 1986, Pisa Z./ 1982). представителей этих этнических групп концентрация трнглнцеридов, тромбоксана 2, холестерина в липопротеидах низкой и очень низкой плотности, функциональная пгивноегь тромбоцитов ниже, а уровень холестерина в липопротеидах высокой точности, соотношение эйтозапснтасновая кислота/ арахидоновая кислота выше, по >авнснию с лицами, придерживающимися традиционной европейской диеты (Bang .0./1971, Dyerberg J./1979, Harris W.S./1989, Schmidt E.B./1991). Кроме того, включение

в рацион больших количеств морских продуктов приводит к экскреции метаболитов простатлацдаша Ъ и тромбоксана Аз, что также свидетельствует о более низкой степени риска развитая у них тромбозов (Fisher S./1986, Hamazaki Т./1986).

Показано, что подобные особенности связаны с различиями в составе потребляемых жиров, а именно со сниженным содержанием в рыбе и морепродуктах насыщенных, мононенасыщенных и п-6 полиненасыщенных (особенно арахддоновой) жирных кислот и большим содержанием в них n-З полиненасыщенных жирных кислот (n-З ПНЖК) (Bang Н.О./1976, Nordoy А./1992).

Опыт применения n-З ПНЖК, в клинике также свидетельствует о возможности их использования с превентивной и лечебной целью при ИБС (Борников В.Т./ 1989, Карагодина З.В./ 1992, Пыж М.В./ 1993, Самсонов М.А./ 1992, Mehta J.L./ 1988), стенокардии (Калинкина О.М./ 1990), гипертонической болезни (Карагодина З.В./ 1992, Самсонов М.А./ 1992, Schmidt Е.В./ 1994), гипертриглицеридемии (Harris W.S.1 1993, Liebich Н.М./ 1991), атеросклерозе (Hay C.R.M./ 1982, Levine Р.Н./ 1989) и других заболеваниях (Burns С.Р./ 1994, Henneickevonsepelin H.H./1993).

Эти данные послужили основой для проведения работ по созданию лекарственных препаратов, в состав которых включены n-З полиненасыщенные жирные кислоты, обладающих способностью предупреждать развитие и снижать степень выраженности тромбофилических проявлений атеросклероза, ишемичсской болезни сердца, нарушений мозгового кровообращения, сахарного диабета и других заболеваний. Следует, однако, отметить, что в России и других странах СНГ нет подобных лекарств, тах как выпускаемые концентраты n-З ПНЖК (полнен, эйконол, и некоторые другие) являются пищевыми добавками. Таким образом, представляется чрезвычайно важным поиск новых отечественных высокоэффективных лекарственных препаратов на основе n-З ПНЖК для коррекции гемостазиологических нарушений.

Цель работы: Целью работы явилось определение специфической фармакологической активности и изучение механизма действия нового отечественного концентрата n-З полиненасыщенных жирных кислот "Эпадсна".

Основные задачи исследования: Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

1. Оценка влияния нового отечественного концентрата n-З ПНЖК "Эпадена" на агрегационную функцию тромбоцитов in vitro.

2. Изучение влияния "Эпадена" на высвобождение стимулированными ромбоцитами тромбоцигарного фактора 4 и ингибитора активатора плазминогена каневого типа in vitro.

3. Исследование фармакодинамнки "Эпадена" в экспериментах на кроликах при ведении внутримышечно или перорально высоких разовых доз.

4. Изучение фармакодинамики "Эпадена" при длительном пероральном зедении кроликам средних доз.

5. Исследование влияния "Эпадена" на процессы депонирования активатора тазштогена тканевого типа в тканях.

6. Изучение способности "Эпадена" предупреждать развитие тромбофилических теиений при моделировании иммобшшзациошюго шока.

Научная новизна: В соответствии с целями и задачами исследования впервые лло изучено влияние "Эпадена" на свертывающую систему крови. Было выявлено {гибирующее воздействие этого средства на функциональную активность юмбоцитов in vitro и in vivo. Проведенные эксперименты позволили уточнить «дологическую роль п-З полиненасыщенных жирных кислот в регуляции функций мостаза, а также дали возможность получить новые данные о механизме действия их биорегуляторов. Было изучено влияние одпоразового введения больших доз п-З мтненасыщенвых жирных кислот на свертывающую систему крови. Впервые были »лучены данные о влиянии п-З ПНЖК на реакцию высвобождения из тромбоцитов твертого тромбоцигарного фактора и ингибитора активатора плазминогеиа аневого типа in vitro. Впервые была показана способность п-З ПНЖК вызывать понирование активатора плазминогена тканевого типа в клетках эндотелия. Была [енена профилактическая активность "Эпадена", проявляющаяся в снижении [раженпости гемостазиологических нарушений, развивающихся при [мобилизационном шоке.

Практическая ценность: Настоящая работа является составной частью мплексных исследований по Государственной программе "Создание новых карственных средств методами химического и биологического синтеза", проводимых Гематологическом Научном Центре РАМН, Московском медицинском патологическом институте им. Н.А.Семашко и других учреждениях.

В результате проведенного исследования было показано, что новый счественный концентрат п-З ПНЖК "Эпаден" обладает выраженным действием на нкциональную активность тромбоцитов in vitro и коагулологический потенциал

крови in vivo, препятствуя развитию активации процесса свертывания npi неблагоприятных воздействиях, а кроме того, вызывая накопление активатор! плазминогеца тканевого типа в клеточных депо и снижая плазменный уровеш фибриногена. Спектр выявленных фармаходипамических эффектов "Эпадена' позволил предполагать, что он явится эффективным средством профилактики и борьбь с прсдгромботнческими состояниями.

Новый отечественный концентрат п-3 полиненасыщенных жирных кисло: "Эпаден" разрешен Фармкомитетом МЗ России для клинических испытаний протокол № 22 от 22 января 1996 г.

Апробация работы: Диссертационная работа доложена на заседанш Проблемной комиссии "Патология гемостаза" ГНЦ РАМН. Отдельные фрагмента работы были представлены иа II (1995 г.) и III (1996 г.) Российском национально* конгрессе "Человек и лекарство", а также на других отечественных и международны} конференциях и симпозиумах, указанных в списке трудов по теме диссертации.

Объем и структура дисссртапии: Диссертация объемом 129 страниц состоит и: введения, 4-х глав, в которые входят обзор литературы, материалы и метода исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы. Диссертациоипаз работа содержит 28 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает IS отечественных и 286 иностранных работ.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ в отечественных i зарубежных журналах, сборниках, тезисах конференций.

Положения, выносимые на защиту:

1. Новый отечественный концентрат п-3 полиненасыщенных жирных кислсп "Эпаден" обладает способностью снижать агрегацию тромбоцитов in vitro,

2. "Эпаден" in vitro способен предупреждать высвобождение тромбоцигарногс фактора 4 и ингибитора активатора пяазминогеыа тканевого типа из тромбоцитов npii стимуляции их проагрегантами.

3. Разовое введение больших доз "Эпадена" кроликам приводит к достоверные изменениям ряда коагулолошческих показателей, причем спектр и стелет выраженности этих изменений в определенной степени зависит от путей поступлснш п-3 ПНЖК в организм.

4. Хроническое введение кроликам "Эпадена" в эксперименте индуцирует] изменения как клеточного, так и плазменного звеньев гемостаза.

5. "Эпдден" способен вызывать накопление активатора плазминогена тканевого тша в клетках.

6. "Эпаден" может снижать выраженность тромбофшшческих проявлений при юделировании нммобшшзанионного шока у животных, предварительно получавших тот концентрат n-З ПНЖК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Кровь доноров для работы получали путем пункции кубитальной вены и табилизировали 3,8%-ым раствором цитрата натрия в соотношении 9+1. У кроликов образцы крови для оценки коагулологических параметров забирали из краевой вены ха методом свободного падения капель. Богатую и бедную тромбоцитами плазму голучали центрифугированием в течение 7 мин при 1000 об/мин и 20 мин при ООО об/мин соответственно. Суспензию тромбоцитов в буфере получали гсль-ишьтрацией богатой тромбоцитами плазмы на колонке с гелем Sepharosa 2В по методу >.Tangen, et al, (1971).

При изучении изменений активности клеточного звена свертывающей системы рови степень агрегации тромбоцитов определяли по методу G.V.Born (1962) в [одифшеации, число тромбоцитов в плазме - по методу B.Walkowiak (1989), величину дгезии тромбоцитов к коллагену - по методу АЛ.Смоляницкого и со авт. (1991), ровень четвертого тромбощггарного фактора (ГФ-4) - иммуно-ферммпным методом LPelzer et al. (1984), уровни активатора плазминогена тканевого типа СТАЛ) по I.Wiman et al. (1983) в модификации и ингибитора активатора плазминогена тканевого ипа (ИТАГТ) фотометрическим методом T.W.Stief et al. (1988). Для измерения уровня 'АП получали растворимый дез-АА-фнбрнн из фибриногена и плазминоген из плазмы оноров по методу D.G.Deutsch and E.T.Mertz (1970). Раствор плазминогена вотировали на содержание в нем тромбина, плазмина и плазминогена по реакциям асщепленпя хромогенных субстратов.

Для регистрации изменений свертывающего потенциала плазменного звена емостаза определяли активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) по .Caen et al. (1968), концентрацию фибриногена по A.Clauss (1957), прогрессивную и офакторную антитромбиновые активности по AAbilgaard et al. (1976,1977) и уровень 'II фактора свертывания крови по методу, основанному на использовании 'II-дефицитной плазмы.

Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием коэффициента Стьюдеигга по методу для сопряженных и для нссопряженных величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Повышенная функциональная активность тромбоцитов играет важную роль в развитии атеросклероза и тромбо-эмболических осложнений при различных заболеваниях (В.П.Бапуда/1992, Scharf R.E./1987). Поэтому представляется актуальным поиск новых препаратов, обладающих антиагрегационным эффектом. С этой цепью в лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ГНЦ РАМН совместно с АО "ЭРИ МАРИН" (В.Г.Гандель) и кафедрой фармакологии ММСИ им.Н.А.Семашко (И.Б.Любимов, А.Г.Муляр, Ю.Ф.Крылов) был разработан новый анготромботический концентрат Q-3 полиненасыщенных жирных кислот "Эпадсн", представляющий собой смесь эйкозапентаеновой (20:5 п-3) и дохозагексаеновой (22:6 п-3) кислот в соотношении 2+1 соответственно, полученную из жира нескольких видов промысловых рыб н являющуюся побочным продуктом при производстве кормовой рыбной муки. "Эпаден" производится акционерным обществом 'ЭРИ МАРИН" и по внешнему виду представляет собой маслянистую жидкость желтовато-коричневого цвета с характерным запахом рыбьего жира и горьковатым специфическим вкусом. В чистом виде этот продукт может храниться 1,5 года при -18°С, 1 год при -10°С и 6 месяцев при 0°С во флаконах темного стекла, наполненных доверху и герметично укупоренных. Включенный в желатиновые капсулы "Энаден" может сохранять свои свойства в течение 3-х лет при +5°С и 5-и лет при -18°С. В настоящее время концентрат прошел доклинические испытания и рекомендован Фармакологическим комитетом МЗ России для клинических испытаний, протокол № 22 от 22 января 1996 г.

N-3 ПНЖК, вошедшие в состав "Эпадена", не растворяются в воде и буферах, используемых в коагулологпческих исследованиях, но могут связываться с белками плазмы и транспортироваться ими к клеткам крови (Fox P.L./1988, Stremmel W./1992). Поэтому, для проведения испытаний in vitro, мы получали суспензию "Эпадена" путем инкубирования его с бедной тромбоцитами плазмой в течение 30 мипут при комнатной температуре и постоянном перемешивании, которую затем добавляли к богатой тромбоцитами плазме.

Учитывая, что при отмывании тромбоцитов от плазмы путем многократного центрифугирования, являющегося достаточно жестким методом, возможны частичная

ютивация этих клеток и высвобождение из них биологически активных веществ 'GearA.R.L.//1991), мы сочли целесообразным для оценки влияния "Эпадена" на громбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов получить их суспензию в буфере •ель-фильтрацией.

Изучение специфической фармакологической активности "Эпадена" показало, гго он in vitro достоверно снижал АДФ- и коллаген-индуцированную агрегацию ромбоцитов (табл.1), причем в наибольшей степени этот эффект был выражен при тпользовании "Эпадена" в конечной концентрации 20 мг/мл при исследовании его ошяния на тромбоциты человека и 10 мг/мл при использовании богатой тромбоцитами шазмы интактных кроликов. Оптимальное время инкубации реактивной смеси было >авно 30 минутам вне зависимости от видовой принадлежности тромбоцитов. Было акже показано, что "Эпаден" способен ингибировать АДФ-, коллаген- и тромбин-идуцированную агрегацию тромбоцитов, освобожденных от плазмы методом гель->ильтрации и ресуспензированных в буфере (табл.1). Следует отметить, что >ункциональная активность отмытых тромбоцитов была ингибированз в наибольшей тепени при внесении "Эпадена" непосредственно в суспензию после гель-фильтрации. 1ри инкубации богатой тромбоцитами плазмы с n-З ПНЖК до гель-фильтрации тепень выраженности антиагрегационного эффекта "Эпадена" была ниже, что [аиболее отчетливо проявлялось при использовании в качестве индуктора процесса ромбипа (табл. 1). Эти данные в определенной степени свидетельствовали о наличии у -3 ПНЖК, входящих в состав исследуемого концентрата, лигаццных свойств. )чевидно, что за достаточно короткий срок инкубации мало вероятно включение в о став тромбоцитов такого количества ЭПК и ДГК, которое обеспечило бы синтез Физиологически значимых количеств ТХАз. Кроме того известно, что при инкубации с ромбоцитами in vitro n-З ПНЖК мало влияли на процесс включения арахидоновой ислоты в фосфолипиды тромбоцитарных мембран (Schick Р.К./1987). С другой тороны, в ряде исследований было показано, что n-З ПНЖК, в частности, ЭПК и ДГК, пособны оказывать прямое избирательное действие на рецепторы TXA2/PGH2 (Parent :.А./1992, Swann P.G./1989, Swann P.G./1990). Также весьма вероятно, что проявление Эпаденом" ангиагрегационных свойств in vitro связано с наличием у п-ЗПНЖК пособностп снижать синтез продуктов арахидонового каскада в тромбоцитах за счет нгибирования фосфолипазы Аг (Kobayaski J./1995) и циклооксигеназы (Goodnigth .Н./1991, Kapp J.H./1991, Swann P.G./1990 и др.).

Таблица 1

Влияние "Эпадена" на величину агрегации тромбоцитов in vitro (Уо)

агрега- агрега- агрегация агрегация тром- агрегация тром-

объект индук- ция без ция после тромбоци- боцитов, инку- боцитов, инку-

иссле- тор инкуба- инкуба- тов после бированных с бированных с

дова- агрега- ции с циис гель-филь- "Эпаденом" 'Эпаденом" до

ния ции "Эпа- "Эпа- трации после гель-филь- гель-филь-

деном" деном" трации трации

25±3 4,0±2,0 9,0±2,0

Ч АДФ 57±3 Pi <0,05 22,0±6,0 Р1<0,05 Р1<0,05

Е Р2>0,05

Л кол- 17±1 2,3±0,9 6,0±2,0

О лаген 54±2 Pi <0,05 1б,0±4,0 Р1<0,05 Р1<0,05

в Р2>0,05

Е тром- 5,0±0,9 39,0±б,0

К бин - — 57,0±2,0 Р1<0,05 Р1<0,05 Р2<0,05

К 22,0±1,0 6,7±0,5 9,7±1,2

Р АДФ 42,0±1,0 Pi <0,05 12,4±0,9 Р1<0,05 Р1>0,05

О Р2<0,05

л кол- 25,0±1,0 2,3±0,8

и лаген Pi <0,05

к тром- 30,0±2,0 6,7±0,7 25,0±4,0

и бин - - Р)<0,05 Р1>0,05 Р2<0,05

Р1 - достоверность по отношению к исходной агрегации;

Р2 - достоверность по отношению к агрегации после инкубации с "Эпадсном".

Известно, что ТФ-4 является специфической для тромбоцитов макромолекулой, юкализованной преимущественно в а-гракулах этих клеток и поступающей в экружающую среду лишь в результате реакции высвобождения или при разрушении громбоцитов (Kaplan K.L./1981, Levine S.P./1990). ИТАП также в значительных голичествах накапливается в a-гранулах тромбоцитов откуда может высвобождаться три воздействии на эти клетки проагрегационпыми стимулами (Kruithof Е.К.О./1986). Учитывая приведенные данные, мы сочли адекватным использовать изменения в :одержащей тромбоциты реакционной смеси уровней ТФ-4 и ИТАП до и после чроведення агрегации для оценки выраженности реакции высвобождения. В результате зроведенных исследований бьшо показано, что "Эпаден" способен достоверно снижать штенсивность высвобождения этих субстанций из тромбоцитов (табл.2), причем шраженность этого ингибирующего эффекта находилась в обратной зависимости от зеличины максимальной амплитуды агрегации тромбоцитов.

Таким образом, результаты исследования влияния "Эпадена" на агрегацию громбоцитов и реакцию высвобождения из них при этом биологически активных »еществ свидетельствовали о том, что in vitro "Эпаден" ингибировал функциональную жгивность этих клеток, причем наибольшей выраженности этот эффект достигал лишь зри непосредственном присутствии п-3 ПНЖК в реакционной смеси. Кроме того было юказано, что на свертывающую систему крови кроликов "Эпаден" оказывает влияние, ;ходное с его действием на гемостаз человека, а следовательно, этот вид животных .южст служить достаточно адекватной экспериментальной моделью для оценки юздействия исследуемого вещества на коагулологические параметры при введении его п vivo.

Для изучения влияния "Эпадена" на свертывающую систему крови ex vivo были мгользованы кролики породы "Шинпгалла".

В литературе имеются данные, что п-3 полиненасыщенные жирные кислоты, в хчучае введения их в больших дозах, могут быть эффективны при коррекции острых громботических состояний (Bairati I./1992, Dehmer G.J./1988, Kaul U./1992), что дает возможность предположить наличие быстрого развития ответной реакции организма и введение этих веществ. С целью изучения влияния поступления в организм высоких эазовых доз "Эпадена" на гемостатический потенциал, в первой серии экспериментов ,ш вводили кроликам по 0,8 г/кг "Эпадена" peros, что соответствовало 0,4г/кг ¡йкозапенгаеновой и 0,2 г/кг докозагексаеновой кислот. Забор крови для оценки

коагулологических параметров производили до введения, через 4 и через 24 часа после введения концентрата. Были изучены следующие параметры: АДФ- и коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов, уровень прогрессивной антигромбпновой активности, кофакторная активность антитромбина III (AT III) и уровни плазменного фактора VII, ТАЛ и ИТАП.

Было показано, что введение кроликам "Эпадена" peros вызывало снижение функциональной активности тромбоцитов животных ex vivo. Через 4 часа после поступления в организм п-3 Т1НЖК АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов достоверно снижалась на 4,8%, а через 24 часа возвращалась к исходному уровню, однако, достоверных различий между величинами агрегации тромбоцитов, вызванной коллагеном, во всех трех исследованных точках обнаружено не было. В данной постановке опыта "Эпаден" не влиял на прогрессивную н кофакторную активности антитромбина III.

Оценка динамики возможных изменений уровня плазменного фактора VII при введении кроликам высокой дозы "Эпадена" per os показала, что через 4 часа после начала эксперимента не было выявлено каких-либо достоверных нарушений этого показателя, а через 24 часа уровень фактора VII достоверно увеличился со 143±10% до 172±12% (Р<0,05).

При измерении уровня ТАП было найдено, что в данной постановке опыта этот показатель не изменялся через 4 часа после начала эксперимента по сравнению с периодом до введения "Эпадена", а через 24 часа достоверно возрастал с 0,91±0,05 ЕД/мл до 1,31±0,11 ЕД/мл (Р<0,05). Уровень ИТАП достоверно повышался через 4 часа после введения животным концентрата п-3 ПНЖК со 100% до 141±14 % (Р<0,05), а затем, через 24 часа возвращался к исходным значениям.

Масляные растворы (каковым является "Эпаден") могут быть введены в организм и внутримышечно. В этом случае п-3 ПНЖК попадают в кровоток значительно быстрее и, что немаловажно, минуя при этом печень. Это послужило основанием для проведения второй серии экспериментов, где "Эпаден" вводили кроликам однократно внутримышечно в дозе 1,5 г на 1 кг веса животного. Это обеспечивало поступление 0,8 г/кг эйкозапентаеновой и 0,4 г/кг докозагексаеновой кислот. Кровь для анализа забирали до введения, через 4 часа и через 24 часа после введения. Оценку влияния "Эпадена" на свертывающую систему крови проводили с использованием тех же тестов, что и в предыдущем фрагменте работы.

Таблица 2

Влияние "Эпадена" на высвобождение биологически активных веществ после агрегации тромбоцитов in vitro

объ- опреде- индук- высво- высво- высво- высвобож- высвобож-

ект ляемое тор бождение бождение бождение дение из дение из

ис- вещес- агрега- при при при агрега- тромбоци- тромбоци-

сле- тво ции агрега- агрега- ции тром- тов, инкуби- тов, инкуби-

ДО- ции без ции после боцитов рованных с рованных с

ва- инкуба- инкуба- после гель- Эпаденом Эпаденом

нш ции с цннс филь- после гель- до гель-

Эпаденом Эпаденом трации фильтрации фильтр ации

481±3б 2б7±52 198±18

АДФ 1598±123 Pi <0,05 489±9б Р1 >0,05 Pi <0,05

Ч ТФ-4 Рз>0,05

Е (мкг/л) тром- 425±44 83б±85

Л бин - - 950±39 Р1<0,05 Pi >0,05

О Р2<0,05

В АДФ 119£14 65±7 1б±2 9±1 12±3

Е Pi <0,05 Р1<0,05 Pi >0,05

К ИТАП колла- 10Ш7 67±18 12±2 8±1 14±3

(%) ген Pi >0,05 Р1>0,05 Pi>0,05

тром- 11±2 8+1 15±4

бин Р1>0,05 Pi>0,05

АДФ 205+51 123+32 14±3 8±2 14+3

сро- ИТАП Pi>0,05 Р1>0,05 Pi >0,05

яик С/о) коллаген 90±28 112±13 Pi >0,05 - - -

Pi - достоверность по отношению к высвобождению

при агрегации без инкубапии с "Эпаденом"; Pi - достоверность по отношению к высвобождению при агрегации после инкубации с "Эпаденом",

Было показано, что через 4 часа после внутримышечной инъекции "Эпадена" АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов кроликов снижалась на 8,6 % (Р<0,05), а через 24 часа этот показатель возвращался к исходным значениям. Кроме того, былс выявлено статистически достоверное увеличение коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов через 24 часа после внутримышечного введения "Эпадена" животным нг 10 % (Р<0,05).

После внутримышечной инъекции "Эпадена" прогрессивная антитромбинова* активность не изменялась через 4 часа, но затем, через 24 часа, сгатнсгачссп достоверно снижалась на 42%, тогда как кофакторная анпгтромбиновая активность так же, как и при введении концентрата п-3 ПНЖК per os, изменялась статисшчеси недостоверно, хоть н имела тенденцию к увеличению.

Внутримышечное введение "Эпадена" вызывало повышение уровня плазменногс фактора VII со 122±4% до введения до 170±6% (Р<0,05) через 24 часа после введения.

В состоянии фибринолишческой системы также были замечены некоторьи изменения. Величина уровня ТАП через 4 часа послс внутримышечного введенш "Эпадена" проявляла склонность к увеличению и достоверно возрастала через 24 час; на 68% (Р<0,05), а активность ИТАП не изменялась на протяжении всегс эксперимента.

Снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов ex vivo при разово* введении больших доз "Эпадена" кроликам, по всей видимости, было обусловлено н< столько изменением спектра метаболитов полиненасыщенных жирных кислот, сколькс другими причинами. Известно, что период созревания тромбоцитов составляет i среднем 8 дней, а продолжительность их пребывания в кровотоке - от 8-и до 11-и дней Так как основное включение п-3 ПНЖК в фосфолшшды тромбоцитарных мембрщ происходит еще на стадии формирования этих клеток ыегакариоцитами (Schicl Р.К./1987), представляется маловероятным, что за 4 часа эксперимента количестве тромбоцитов с измененным жирнохиспотным составом мембран может стал достаточным для продукции ТХАз в физиологически значимых количествах. Однак« известно, что при разовом введении больших доз п-3 ПНЖК имело место изменена жирнокислотного состава плазмы в ранние сроки после введения препарата (Elmadfi I./1993). Повышение плазменного уровня п-3 ПНЖК, в частности, дoкoзaгeкcaeнoвoi кислоты, может приводить к ингнбнрованню цнклоокспгеназы и фосфолипаз Аз и С которые катализируют высвобождение жирных кислот (в том числе и арахидоново1 кислоты) из мембранных фосфолипидов (Rao G./1983). Эти процессы могут им en

своим итогом снижение функциональной активности тромбоцитов. Кроме того, как уже было отмечено, свободные п-3 полиненасыщенные жирные кислоты обладают лигапдпыми свойствами, конкурентно блокируя рецепторы TXA2/PGH2.

Повышение уровня ИТАП при однократном введении "Эпадена" per os вполне согласовывалось с данными других исследователей (Moller J.M./1992), однако, в настоящее время мы не располагаем достаточным объемом сведений, позволяющим определить причину быстрого изменения количества ингибитора активатора плазминогена тканевого типа при поступлении в организм п-3 ПНЖК.

Увеличите активности ТАП после однократного введения "Эпадена" было обнаружено у кроликов независимо от пути поступления п-3 ПНЖК. Нам не удалось найти каких-либо литературных данных, свидетельствовавших о влиянии разового введения п-3 ПНЖК на уровень ТАП. Не исключено, что его повышение в этой постановке опыта явилось ответной реакцией организма на рост содержания ИТАП в крови.

Известно, что п-3 ПНЖК могут увеличивать содержание холестерина в лшюпротеидах высокой плотности (David J.S.K./1987, Jiang Z.R./1993, Zucker M.L./1988). Вероятно именно этот феномен мог стать причиной повышения активности плазменного фактора VII через 24 часа после начала эксперимента, так как показано, что уровень ф. VII тесно связан с концентрацией холестерина в ЛПВП (Wright D./1993).

Таким образом, результаты проведенных исследований влияния "Эпадена" иа систему гемостаза при однократном введении в организм больших доз этого концентрата показали, что свертывающая система крови достаточно быстро реагирует на введение п-3 ПНЖК, а реализация этих эффектов в определенной степени зависит от пути введения полиненасыщенных жирных кислот.

Не оспаривая способности п-3 ПНЖК влиять на ряд биохимических процессов, протекающих в организме, после их однократного введения или назначения короткими курсами, большинство авторов все же полагает, что в наибольшей степени п-3 полиненасьпценные жирные кислоты проявляли свое противосклеротическое и антитромбофилическое действие при достаточно продолжительном их приеме (Вопаа К.Н./1992, Kromhout D./1985, Maderna Р./1992 и др.). В этой связи, нам представилось целесообразным изучить влияние длительного введения "Эпадена" кроликам per os на гемостатический потенциал крови. В первой серии экспериментов животным вводили ежедневно 'Эпадеп" в дозе, содержащей 0,04 г/кг ЭПК и 0,02 г/кг ДГК в течение б-и недель. Кровь для анализа забирали до начала эксперимента, через 2, 4 и 6 недель после

его начала и через 2 недели после отмены п-З ПНЖК. Были изучены АДФ- н коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов, число этих клеток в крови и их адгезия к коллагену, кофакторная активность антнтромбина III, АЧТВ и уровень активатора плазминогсна тканевого типа.

Нами было показано, что при длительном полуторамесячном введешш "Эпадена" кроликам ДЦФ-индуцированная агрегация тромбоцитов ex vivo не менялась со 2-ой по 6-ю неделю эксперимента, в то время как коллаген-индуцированная агрегация снижалась в 2 раза к четвертой неделе исследования и продолжала оставаться низкой до его окончания, а через 2 недели после прекращения введения кроликам п-З ПНЖК возвращалась к исходному уровню. Причины снижения агрегации тромбоцитов под действием п-З ПНЖК при хроническом назначении этих кислот весьма многообразны. Основной из них, по всей видимости, является изменение спектра и количества синтезируемых простаноидов, влияющих на функциональную активность тромбоцитов (Elmadfa I./1993, Madema Р./1992, Prisco D./1995 и др.). Однако, существуют и другие причины антптромбоцнтарного действия этих полиненасыщенных жирных кислот. Так, ЭПК и ДГК способны понижать синтез фактора агрегации тромбоцитов (Holub B.I./1991, Shikano М./1993), усиливать продукцию мощного антиагреганта NO (Shini V.B./1993), изменяя липндный состав плазмы, повышать тем самым стабильность PGIi и NO (Bonaa К.Н./1992, Harris W.S./1993). Снижение коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов при отсутствии изменений со стороны АДФ-шшуцированной агрегации возможно связана с тем, что коллаген-индуцированная агрегация протекает при участии фактора агрегашш тромбоцитов (Kojima S./1990), синтез которого снижается под влиянием п-З ПНЖК (Shikano М./1993). Кроме того, хотя мы и не нашли в литературе прямых доказательств, не исключено, что изменение фосфолшшдного состава тромбоцигарных мембран при хроническом назначении п-З ПНЖК приводит к каким-либо нарушениям со стороны рецепторов тромбоцитов, ответственных за коллаген-индуцированвук агрегацию. С другой стороны, известно, что ЭПК и ДГК не вызывали изменений рецепторов тромбоцитов к фибриногену гликопротеинов Ilb/IIIa (Ciritto F./1993) принимающих непосредственное участие в АДФ-индуцированной агрегации Отсутствие снижения агрегации, вызванной АДФ, в нашей постановке опыта можне также объяснить относительно невысокими разовыми дозами "Эпадена".

Изучение влияния "Эпадена" на число тромбоцитов не выявило каких-либс достоверных изменений этого показателя на протяжении всех 6-и недель эксперимента

Адгезия тромбоцитов, хотя и проявляла некоторую тенденцию к снижению, однако эти нарушения не были достоверными. Это вполне согласуется с рядом исследований, в которых было показано, что снижение адгезии тромбоцитов имело место только при очень длительном введении п-3 ПНЖК в организм и/или использовании очень высоких разовых доз этих препаратов (Ciritto F./1993, Green D./1991, Li Х./1990, Steiner M./1990).

Не получили также в этой постановке опьгга и изменений АЧТВ.

Через 2 недели после начала ежедневного кормления кроликов "Эпаденом" кофакторная антшромбиновая активность снижалась со 174,5±8,5% до 125,6±5,1% (Р<0,05), а через 4 недеян достигала значения 59,0+6,8% (Р<0,05), однако, к шестой неделе эксперимента кофакторпая активность AT III хоть и была достоверно ниже исходного уровня, но, тем не менее, достоверно повысилась относительно величины, которую она имела через 4 недели после начала исследования. После отмены концентрата этот показатель существенно не менялся и через 2 недели также был достоверно ниже исходного значения.

Снижение уровня кофакторной активности AT III явилось весьма неожиданным эффектом "Эпадена". Нам удалось найти ограниченное количество работ, посвященных изучению влияния п-3 ПНЖК на уровень AT III. В ряде из них было отмечено повышение активности AT III (Mortensen J.Z./1983, Stoflersen E./1982) или отсутствие изменений этого показателя (Saynor R./I980) под действием п-3 полинснасышенных жирных кислот, тогда как авторы других исследований выявили снижение уровня AT III после некоторого периода назначения рыбьего жира (Sanders Т.А.В./1981, Schmidt Е.В./1988). Обсуждая снижение активности AT III под влиянием п-3 ПНЖК, E.B.Schmidt и соавторы (1988) указали в качестве возможной причины этого эффекта снижение потребности организма в AT III из-за уменьшения риска развития тромбоза, однако данные авторы не смогли привести каких-либо весомых биохимических или физиологических доказательств этого утверждения.

Таким же неожиданным, как и уменьшение под действием "Эпадена" кофакторной активности AT III, было обнаруженное в ходе исследования резкое снижение уровня ТАП, которое уже через 2 педели было пятикратным (с 1,03±0,19 ЕД/мл до 0,20+0,03 ЕД/мл Р<0,05). Через 4 и 6 недель после начала кормления кроликов "Эпаденом" этот параметр оставался достоверно ниже исходного. Однако, через 2 недели после окончания эксперимента уровень ТАП достоверно

увеличивался до 0,71±0,07 ЕД/мл и не отличался достоверно от первоначальной величины.

Доступная нам литература не содержала достаточных сведений о влиянии п-3 ПНЖК на уровень ТАП. Однако, даже при анализе весьма ограниченного числа исследований можно заключить, что авторы не имеют единого мнения о наличии и направленности этого эффекта (Leaf А./1992, Seljeflot I./1995), хотя L. Iacoviello в соавторы (1992) отмечали снижение уровня антигена ТАП при назначении п-3 ПНЖК в комплексе с аспирином. Так как "Эпаден" по своему составу близок к ряду известных зарубежных антисклеротических и противотромботических препаратов и содержи! преимущественно п-3 ПНЖК, трактовать понижение уровня ТАП как признан увеличения прокоагулянгной активности крови нам показалось неправомерным. Не исключено, что одной из возможных причин снижения уровня ТАП может являяъся высокая активность его специфического быстродействующего ингибитора при приеме п-3 ПНЖК, которая была обнаружена в достаточно большом количестве исследование (Iacoviello L./1992, Maderna Р./1992, Schmidt Е.В./1989).

N-3 ПНЖК не имеют противопоказаний и побочных эффектов и, следовательно могут безопасно применяться с профилактической целью неограниченно длительны! период времени, а иногда даже пожизненно (Пыж М.В./1993, Ciritto/1993, Eritslanc J./1992, Herzberg G.R./1992, Maderna P./1992, Matasanos T.H./1991, Myrup B./1991 Schmidt E.B./1990, Westerfeld H.T./1993). Это обстоятельство позволило нам изучил влияние "Эпадена-' на систему гемостаза при пероральном поступлении в органнзь средних доз в течение 6-и месяцев. В этот период времени кроликам ежедневно вводшп концентрат п-3 ПНЖК в дозе, обеспечивающей суточное поступление в организм 0,04 г/кг ЭПК и 0,02 г/кг ДГК. Кровь для анализа забирали до начала введенш "Эпадена", через 3; 4,5 п 6 месяцев после начала эксперимента и через 1,5 месяца nocni его завершения. В качестве тестов для оценки фармакодинамики 'Эпадена" быш выбраны АДФ- н коллаген-индуццрованная агрегация тромбоцитов, чнеле тромбоцитов, их адгезия к коллагену, АЧТВ, уровень фибриногена, активности плазменного фактора VII, кофакторная активность AT III, прогрессивна; ашшромбиповая активность и уровень ИТАП.

Было показано, что АДФ-индуцырованная агрегация тромбоцитов кроликов получавших "Эпаден" в течение б-и месяцев, не изменилась по отношению к величин этого показателя у контрольных животных. Агрегация тромбоцитов опытны кроликов, вызванная коллагеном, также не претерпела достоверных изменений :

период 3-6 месяцев по сравнению с величиной агрегации тромбоцитов у животных контрольной группы и периодом до начала эксперимента. Это согласуется с данными б-д недельного введения "Эпадена" кроликам, так как через 1,5 месяца приема концентрата n-З ПНЖК животными, коллаген-пндуцпровапная агрегация тромбоцитов, хотя и была снижена по сравнению с исходными значепиямн, однако, ее максимальная амплитуда была выше, чем через 4 недели после начала опыта. Также, как и в предыдущем фрагменте работы не было обнаружено влияния "Эпадена" на способность тромбоцитов проявлять сродство к поверхности коллагена.

Через 4,5-6 месяцев после начала эксперимента у кроликов, получавших "Эпаден", было отмечено снижение чпела тромбоцитов по сравнению с величиной этого показателя у животных контрольной группы (табл.3). Подобное действие n-З ПНЖК отмечалось и другими исследователями (Калинкпна О.М./1990, Van Houwelingen А.С./1988). Авторы полагали, что n-З ПНЖК могут оказывать влияние на клетки-предшественники тромбоцитов, вмешиваясь в процесс их созревания, что приводит к снижению образования тромбоцитов из мегакарноцитов. Кроме того, не исключено усиление процесса секвестрации мегакарпощггов в селезенке под влиянием n-З полиненасыщенных жирных кислот (Goodnigth S.H./1981).

Таблица 3

Влияние 6-и месячного введения "Эпадена" рет оя кроликам на число тромбоцитов в плазме крови (%)

группа До начала Через 3 мес Через 4,5 мес Через 6 мес Через 1,5 мес

животных введения после начала после начала после начала после отмены

введения введения введения "Эпадена"

100,0 92,0±5,0 94,0±5,0 114,0±4,0 110,0±9,0

опытная Р>0,05 Р<0,05 Р<0,05 Р>0,05

Pi >0,05 Pi >0,05 Pi<0,05 Pi >0,05

Р:>0,05 Р;<0,05 Р:>0,05

100.0 94,0+10,0 140,0+8,0 163,0±13,0 115,0+9,0

контрольная Pi>0,05 Pi<0,05 Pi<0,05 Pi>0,05

Р:<0,05 Р2>0,05 Рг<0,05

Р - достоверность относительно контрольного уровня:

Р| - достоверность относительно уровня до начала введения "Эпадена";

Р: - достоверность относительно предыдущего результата.

Достоверных изменений АЧТВ, как и в предыдущем отрезке работы, зарегистрировано не было. Не было выявлено также в данной постановке опыта и достоверных изменений уровня VII фактора свертывания крови и ИТАП.

К очень важным результатам, полученным при изучении влияния п-3 ПНЖК на показатели плазменного гемостаза, можно отнести способность "Эпадена" понижать уровень фибриногена у опытных кроликов по сравнению с величиной этого показателя, зарегистрированной у животных, содержащихся на обычной диете. Так через 4,5 мес после начала эксперимента уровень фибриногена в плазме опытных кроликов не менялся, тогда как в контрольной группе этот показатель увеличивался с 3,9+0.5 г/л до б,4±0,9 г/л (Р<0,05). В ряде работ было показано, что длительное потребление рыбы или рыбьего жира, приводило к снижению уровня фибриногена в плазме (Cobiac L./1991, Hostmark А.Т./1988. Schmidt Е.В./1990). Изучите коагулологического потенциала крови у коренных жителей прибрежных районов Японии также выявило более низкое содержание фибриногена у данной категории лиц по сравнению с таковым у жителей CHIA Gso Н./1993). Не исключая значения генетического фактора при оценке данных эпидемиологических исследований (Thomas А.Е./1991), нельзя не признать, что п-3 ПНЖК способны оказывать гипофибриногенемический эффект. Это подтверждают и данные экспериментов, свидетельствующие о способности п-3 ПНЖК ингибировать шгтерлешяш-б-шшуиироваиную продукцию фибриногена клетками (Zyglewska Т./1991).

Различия величин прогрессивной анпггромбиновой активности п кофакторной активности AT III в обеих группах животных не носили достоверного характера. Это обстоятельство не противоречило ряду литературных данных (Saynor R./1980). При б-и недельном введении кроликам "Эпадена" мы выявили, что через месяц кофакторная активность антитромбина III была снижена по сравнению с исходным уровнем, но уже через 6 недель этот показатель, хотя и оставался ниже, чем до начала опыта, был достоверно больше, чем 2 недели назад. Таким образом, при поступлении в организм 'Эпадена" снижение уровня кофакторной активности антитромбина III в относительно ранние сроки сменялось возвращением этого показателя к исходным значениям через 36 месяцев после начала эксперимента. Известно, что п-3 ПНЖК способны повышать скорость синтеза и утилизации белков (Sohal P.S./1992), Возможно, что на ранния этапах развития эффектов п-3 ПНЖК катаболитическое действие этих кислот преобладало над синтетическим, что и имело своим итогом снижение уровня AT III.

>есспорно, что это предположение является чисто гипотетическим и требует гроведешы дополнительных экспериментов.

Исследование динамики активности ТАП у кроликов, получавших "Эпадсн", (ыявило существештое и быстрое снижение этого показателя. Бьшо высказано [редположение, что причиной развития обнаруженного эффекта п-3 ПНЖК может вляться способность данных полнненасыщенных жирных кислот влиять на процессы 1епонированзи ТАП. Известно, что адреналип способен стимулировать освобождение ТАП эвдотелиальнымл клетками in vivo (Hinsbergh V.W.M./1988, acoviello L./1995), поэтому для изучения возможного влияния "Эпадена" на пособность клеток эндотелия депонировать актпватор плазшшогена тканевого типа роликам, получавшим per os ежедневно в течение 4-х недель 0,08 г/кг исследуемого ещества (0,04 г/ваг энкозапентаеновой кислоты и 0,02 г/кг докозагексаеновой кислоты), водили внутривенно адреналин в дозе 15 мкг/кг веса. В том же количестве вводили дреналин и шггактным животным, включенным в контрольную группу. Образцы рови для регистрации изменений уровня ТАП у всех животных забирали до введения и ерез 2, 15, 30, и 60 минут после введения адреналина.

Приведенные данные (табл.4) свидетельствовали, что введение адренагшна оитролышм животным приводило к достоверному, но весьма кратковременному овышенпю уровня активатора плазшшогена тканевого типа. Так, уже через 15 мин гот показатель у животных, которые не получали "Эпаден", возвращался к исходному ровню. Несмотря на то, что до введения адреналина активность ТАП у опытных ивотных была существенно ниже, чем у контрольных, после внутривенной гимуляшга уровень активатора плазынногена тканевого типа стал одинаковым в беях группах. Однако, уже через 30 минут у опытных животных активность ТАП была эстоверно ниже уровня этого показателя, зафиксированного в контрольной группе, та результаты показали, что, по всей видимости, "Эпаден" способствовал акоплешпо ТАП во внутриклеточных депо. При стимуляции высвобождения ТАП тецпфнчеекпмн либератораыи, к которым относится и естественный стресс-гормон феналпн, повышение уровня активатора плаэминогена тканевого типа было 'шественным и достаточным для резкого увеличения фнбринолитического потенциала >овп. В этой ситуации мы сочли целесообразным выяснить возможность .гсвооождения ТАП из клеточных депо при коагулологических нарушениях, ¡язанных с развитием стрессовых состояний, в частности, с иммобшшзапионпым оком (ИШ). Для этого одной группе кроликов вводили per os по 0.08 г/кг "Эпадена"

ежедневно в течение 6-и месяцев, что обеспечивало суточное поступление в оргашш 0,04 г/кг эйкозапентаеновой и 0,02 г/кг докозагексаеновой кислот. Вторая групп животных была контрольной. Через 1 месяц и 6 месяцев после начала эксперимента кроликов обеих групп моделировали иммобилизационный шок посредство! фиксировался животного на доске в вертикальном положении на 2 часа. Кровь у все: кроликов забирали перед моделированием и после моделирования ИШ.

Таблица■

Влияние адреналина на уровень активатора плазминогена тканевого типа у кроликов, получавших "Эпадсн" per os в течение четырех недель

группа животных Уровень ТАП в плазме (ЕД/мл)

до введения сразу после введения через

15 мин 30 мин 60 мин

опьгг 0,39±0,05 Р<0,05 0,94±0.27 Р>0,05 Pi<0,05 0,78±0,04 Р<0,05 Pi <0,05 0,45±0,03 Р<0,05 Р[>0,05 0,42±0,05 Р<0,05 Pi>0,05

контроль 0,60±0.08 0.92i0.10 Pi <0,05 0,66±0,04 Pi >0,05 0,76±0,08 Pi >0,05 0,72±0,10 Pi >0,05

Р - достоверность относительно уровня в контроле;

Р1 - достоверность относительно уровня до введения адреналина.

В качестве теста, подтверждающего развитие нарушений коагулологическогс потенциала крови при моделировании иммобилшационного шока была выбран; оценка изменения уровня фибриногена. Показано, что количество фибриноген, снижалось как в опытной, так и в контрольной группах животных примерно в 1,5 раз! после экспериментального воспроизведения стрессовой ситуации при ИШ в сроки 1 и ( месяцев после начала введения животным "Эпадсна". Полученные результаты явнлиа подтверждением возможности использования экспериментального ИШ в качеств! воздействия, стимулирующего изменения свертывающей системы крови.

Было показано, что через 1 месяц ежедневного введения "Эпадсна" уровень ТАГ в плазме кроликов после моделирования иммобилизационного шока достовернс увеличивался в 1,4 раза. Через 6 месяцев ежедневного дополнения диеты концентратоь

n-З ПНЖК этот параметр в плазме животных достоверно увеличивался после воспроизведения ИШ в 1.5 раза.

Быстрое возвращение активности ТАП после стимуляции клеток адреналином к исходному уровню, по нашему мнению, могло быть обусловлено взаимодействием активатора плазминогена тканевого тппа с ИТАП и образованием стабильных, но неактивных комплексов. Предположив, что отсутствие увеличения активности ИТАП при длительном введении n-З ПНЖК в нашей постановке опыта могло быть связано с измсненпем его высвобождения из клеточных депо, мы сочли целесообразным определить уровень ингибитора активатора плазминогена тканевого типа у животных контрольной и опытной групп до и посте моделирования иммобилизационного шока. Результаты эксперимента показали, что у кроликов, получавших "Эпален", увеличение этого показателя после стимуляции было много более выраженным, особенно через 6 месяцев после начала приема n-З ПНЖК. Таким образом, можно заключить, что "Эпаден" обладает выраженным влиянием на способность клеток сосудистого эндотелия депонировать и высвобождать биологически активные субстанции.

Таким образом, результаты работы показали, что новый отечественный хонцептрат n-З ПНЖК "Эпаден" по своему действию близок к таким известным зарубежным препаратам, как МахЕРА, SuperEPA. Omega-3, ESKIMO и др., обладает анпгтромбофшпггескнм эффектом а может быть направлен на клинические испытания для профилактики и лечения нарушений микроцпркущщни, предтромботических и тромботнческих состояний.

ВЫВОДЫ:

1. "Эпзден" in vitro в концентрации 20 мг.'мл шпибирует функциональную активность тромбоцитов, снижая величину их агрегации, вызываемой аденозпндпфосфатом (АДФ), коллагеном и тромбином, причем наибольшее воздействие достигается лишь при непосредственном его присутствии в реакционной смеси.

2. В концентрации 20 мг/мл "Эпаден" in vitro тормозит реакцию высвобождения тромбощггарного фактора 4 и ингибитора активатора плазминогена тканевого типа стимулированными тромбоцитами. Махенмальный эффект выявляется при непосредственном присутстзш! n-З полиненасышешгых жирных кислот в реакционной смеси.

3. Одноразовое введение "Энадена" кроликам в дозе 0,8 г/кг per os или 1,5 г/кг внутримышечно индуцирует анплромбофшшчсскис изменения как клеточного, так и плазменного звеньев гемостаза, снижая АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и повышая уровень активатора плазминогена тканевого типа.

4. "Эпаден" при ежедневном пероральном его введении кроликам в дозе 0,08 г/кг в течение месяца ингибирует ex vivo коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, а при более длительном поступлении в организм снижает число тромбоцитов в крови и плазменный уровень фибриногена.

5. Ежедневное пероральное введение кроликам "Эпадена" в дозе 0,08 г/кг в течение месяца вызывает накопление активатора плазминогена тканевого типа в клеточных депо и способствует резкому его высвобождению при внутривенной стимуляции адреналином в дозе 15 мкг/кг.

6. Хроническое введение кроликам "Эпадена" в дозе 0,08 г/кг per os в течение 1-го и 6-ти месяцев вызывает увеличение объема внутриклеточного пула активатора плазминогена тканевого типа, способного высвобождаться из тканевых депо при моделировании иммобилгоанионного шока.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние "Эпадена" на плазменный и клеточный гемостаз.// В кн.: II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. 10-15 апреля 1995 г.-М., 1995, сгр.215. (в соавт. с Петрухина Г.Н., Гандель В.Г., Макаров В.А., Крылов Ю.Ф., Любимов И.Б., Муляр А.Г.),

2. Разработка новых гемостатических и противотромботических средств.// В кн.: Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. Сборник тезисов 1-го Съезда Российского научного общества фармакологов. 9-13 октября 1995 г., г.Волгоград.-М., 1995, с.260. (в соавт. с Макаров В.А., Белозерская Г.Г., Петрухина Г.Н., Дрозд H.H., Мифтахова Н.Т., Олтаржевская Н.Д., Лысун Н.В., Гальбрайх Л.С., Вихорева ГА.., Горбачева И.Н., Абоянц Р.К.).

3. Влияние разового введения высоких доз препарата эпаден на некоторые гемостатические параметры у кроликов.// В кн.: III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. 16-20 апреля 1996 г.-М., 1996. стр.42, (в соавт. с Петрухина Г.Н., Макаров В.А., Гандель В.Г.).

4. Влияние смеси n-3 ПНЖК "Эпаден" на функциональную активность ромбоцитов in vitro.// В кн.: III Российский национальный конгресс "Человек и екарство". Тезисы докладов. 16-20 апреля 1996 г.-М., 1996, стр.43, (в соавт. с 1етрухина Г.Н.. Макаров В.А. Гандель В.Г.).

5. Der Einfluss von Epaden auf einzelne Parameter der Blutgerinnung.// Gefasssystem nd Blutgerinnung. XXXVII Hamburger Symposion über Blutgerinnung am 3. und 4. Juni 994.-p. 169-172. (в соавт. с Pctruehina G.N., Makarov W.A., Gandel W.H.).

6. Effects of new regulators in haemostasis.// Thrombosis and Haemostasis.-1995.-.75,№6.-p. 1322. (в соавт. с Makarov V.A., Petrukhina G.N., Belozerskaya G.G., Drozd I.N., BashkovG.V., Miflahova N.T.).

7. The influence of n-3 polyunsaturated fatty acids on PAI-1 release from platelets in itro.// Fibrinolysis.-1996.-v. 10, №3Suppl.-p.l26. XIHth international congress on brinolysis and thrombolysis, Barcelona, Spain, june 24-28. (в соавт. с Petrukhina G.N., lakarov V.A., Gandel V.H.).

8. The influence of n-3 polyunsaturated fatty acids on PF-4 release in vitro.// Ann. [aematology.-1996.-v.72, Suppl.I.-p.A65 (40th Annual Vccting of the GTH; 14-17 February )9б). (в соавт. с Petrukhina G.N., Makarov V.A., Gandel V.H.).