Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на кинетику клеточных популяций брыжеечных лимфатических узлов

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

г: - « РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ - ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

1 1 НОЯ к- На правах рукописи

БУГАЕВА Ирина Олеговна

ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КИНЕТИКУ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ

14.00.36 - аллергология, иммунология 14.00.23 - гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САРАТОВ -1996

Работа выполнена на кафедре гистологии Саратовского государственного медицинского университета.

• Научные руководители:

доктор мелицинских наук, профессор Н.В.Богомолова доктор медицинских наук, профессор М.Ю.Ледванов

• Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор И. Г. Дроздов доктор биологических наук, профессор Г. В. Шляхтин

Ведущая организация - Оренбургская Государственная Медицинская Академия

Защита состоится " ¿¿п ¿¿^¿¿^^ 1996 г.

в часов на заседании специализированного Ученого

Совета. .V. ^сг> гъ^^'гЯ*я^ё&^/ЪЬс^иисг селене ск^с^е еЛ^с^с^е. ¿е. /г.

при

• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

• Автореферат разослан " ¿У" 996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук старший научный сотрудник З.Л. Девдариани

Общая характеристика работы

Актуальность прЬблемы

Активная динамика развития лазерных технологий определяет сегодня интенсивный рост лазерной медицины и, в частности, лазерной терапии. Интерес к данной проблеме обусловлен широким спектром медицинских показаний, а также сочетаемостью их с известными традиционными методами лечения. Особое место в современной лазеротерапии занимают мощные импульсные полупроводниковые лазеры, генерирующие в ближнем инфракрасном (И К) диапазоне.

Низкоинтенсивное ИК лазерное излучение с успехом используется в различных областях медицины для получения выраженного терапевтического эффекта. Важнейшее значение при этом может иметь активация иммунной системы. Клинические и экспериментальные исследования дают основание предполагать, при определенных параметрах, возможность стимулирующего действия лазерного света на состояние гуморального и клеточного иммунитета (Мельдеханов Т.Т.,1977; Мороз АМ.,1980; Крюк АС., 1ррЗ; -Меэ1ег Е., №ду1искау Э., 1975; 1976; 1978., и др.). Важное значение &этом аспекте имеют исследования тонких морфофункциональных изменений, происходящих в органах иммунной системы, и в частности в лимфатических узлах, которые принимают участие в развитии разнообразных иммунологических реакций: антигензависимая диффёренцировка Т- и В-лимфоцитов с последующим антителообразованием. В механизме активации иммунной системы определяющую роль играет усиление пролиферативной функции иммунокомпетентных клеток и увеличение синтеза белков. Динамика популяционного и субпопуляционного состава клеток этих органов в ответ на воздействие низкоинтенсивным лазерным светом до настоящего времени недостаточно изучена. Комплексного морфофункционального анализа состояния клеточных элементов органов иммунной системы под влиянием лазерного облучения не проводилось.

Учитывая это обстоятельство мы сочли необходимым изучить действие низкоинтенсивного лазерного света различной импульсной частоты на ряд важнейших механизмов, определяющих морфофункциональное состояние

лимфатических узлов. К числу основных изучаемых

показателей относилось изменение активности хроматина центрального генетического аппарата клетки. Активация его приводит к изменениям содержания ДНК, РНК, белка в лимфоцитах и может рассматриваться как пусковой механизм включения клеток в пролиферацию и активное функционирование (Кару Т.Й., 1990;Брилль Г.Е. 1994; МеБ1ег Е, 1978; МагШса С., 1983).

Другим интегральным показателем пролиферативной активности является характер распределения лимфоцитов по фазам клеточного цикла с определением числа ДНК-синтезирующих клеток, т.е. клеток, находящихся в 3+С32+М фазах митоза (Крюк А.С., Мостовников В.А., Хохлов И.В. с соавт., 1986).

К числу важных функциональных параметров состояния органов иммунной системы относится также электрофоретическая подвижность (ЭФП) лимфоцитов, обусловленная наличием на поверхности клетки

определенного электрического потенциала. По характеру ЭФП лимфоцитов (при разделительном клеточном электрофорезе) можно судить об изменениях в популяционном составе, степени дифференцировки клеток и состоянии архитектоники их мембран.

При исследовании иммуномодулирующих воздействий особо важным является вопрос о функциональном состоянии лизосомального аппарата, посредством которого

осуществляется прямое разрушение генетически чужеродного материала, фрагментация его с последующей презентацией.

Сведения о количественной динамической оценке морфофункционального состояния клеток по вышеуказанным параметрам в комплексе с характеристикой гистологических структур лимфоузлов при лазерном облучении в литературе отсутствуют. В то же время изучение адаптивных реакций лимфоузлов в условиях облучения низкоэнергетическим лазерным светом позволяет оценить степень и механизмы иммуномодулирующего эффекта лазерного воздействия, а также разработать возможные способы повышения резистентности организма при различного рода патологических процессах.

Цель исследования

Изучить характер структурно-функциональных изменений брыжеечных лимфатических узлов крыс в условиях облучения низкоинтенсивным (И К) лазерным светом и определить оптимальный режим воздействия для исследования механизма и динамики иммуномодулирующего эффекта.

Задачи исследования

1. Изучить кинетику популяционного состава клеток брыжеечных лимфатических узлов крыс в условиях различного режима облучения низкоинтенсивным И К лазерным светом.

2. Обосновать оптимальный режим облучения, вызывающий наибольший иммуностимулирующий эффект.

3. В условиях оптимального режима облучения животных И К лазером в мезентериальных лимфатических узлах определить в динамике:

• функциональную активность хроматина по интенсивности флюоресценции комплекса АО-ДНК методом проточной цитофлюориметрии;

• количество ДНК-синтезирующих лимфоцитов и соотношение их по фазам клеточного цикла;

• функциональное состояния лизосомального аппарата по цитофлюориметрическим характеристикам;

• характер изменения величины поверхностного заряда лимфоцитов посредством препаративной элекгрофоретической их сортировки.

4. Исследовать степень влияния ИК лазерного излучения на гистологические структуры и иммуноцитопоэз мезентериальных лимфатических узлов экспериментальных животных.

Научная новизна

Впервые представлена комплексная характеристика структурно-функциональных изменений мезентериальных лимфатических узлов в условиях воздействия низкоинтенсивного лазерного И К излучения. В результате применения гистологических, гистохимических

иммуноморфологических и морфометрических методов

исследования установлены новые закономерности изменения клеточного состава лимфоузлов под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения. Наибольший иммуностимулирующий эффект зарегистрирован при использовании импульсной частоты 1500 Гц., что подтверждалось увеличением малодифференцированных форм лимфоцитов в корковом, а затем и в мозговом веществе лимфоузлов с последующим нарастанием количества антителообразующих клеток в мозговых тяжах. Излучение с частотой 80 Гц. вызывало лишь кратковременную стимуляцию иммуноцитопоэза с быстрым восстановлением исходного клеточного состава лимфоузлов. Импульсная частота 3000 Гц. оказывала ингибирующее действие на пролиферативные процессы клеток лимфоидного ряда во всех структурно-функциональных зонах лимфоузлов.

Получены новые данные о механизмах иммуностимулирующего действия лазерного излучения. Впервые установлено, что низкоинтенсивное И К лазерное излучение с частотой импульсов 1500 Гц. вызывало в лимфатических узлах повышение функциональной активности хроматина лимфоцитов, количества ДНК-синтезирующих клеток, распределение по фазам клеточного цикла в сторону увеличения числа лимфоцитов, находящихся в Б+С2+М фазах клеточного цикла. Новыми являются данные о влиянии лазерного света на пролиферативную активность и степень зрелости лимфоцитов, полученные методом регистрации ЭФП. Повышение ЭФП лимфоцитов свидетельствовало об активации процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.

Впервые установлена динамика

цитофлюориметрических показателей функционального состояния лизосомальной системы в клетках лимфоузлов под влиянием лазерного облучения. Увеличение содержания клеток с большей интенсивностью флюоресценции в красной области спектра свидетельствовало о повышении лизосомальной активности клеток.

Предложены новые методические подходы к оценке влияния лазерного облучения на уровень иммунологической перестройки, основанные на проточном

цитофлюориметрическом тестировании и препаративной злектрофоретической сортировке иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость работы

Определен комплекс информативных количественных и качественных иммуноморфологических, цитофлюориметриче-ских, электрокинетических критериев для использования в научно-исследовательской работе при изучении механизмов действия низкоинтенсивного инфракрасного импульсного лазерного излучения на важнейшее звено иммунной системы организма. Результаты, полученные при исследовании влияния переменного инфракрасного лазерного излучения на состояние периферических органов иммуногенеза экспериментальных животных, могут быть использованы и в клинической практике для выбора оптимальных параметров излучения с целью достижения эффекта стимуляции иммуноцитопоэза. Возможно использование результатов исследования с целью разработки мероприятий по предотвращению отрицательного воздействия лазерного света на организм человека в производственных условиях.

Внедрение в практику.

Материалы диссертации включены в руководство "Иммунология чумы", Саратов (1992), используются при чтении лекций в Саратовском медицинском университете, в Тверской медицинской академии, на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям и усовершенствования врачей бактериологов санитарно-эпидемиологических учреждений России и СНГ (при институте "Микроб"), о чем свидетельствуют соответствующие акты о внедрении.

Апробация работы

Материалы диссертационного исследования доложены:

- на 2-й Всероссийской конференции "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей и клеток человека и животных" (Саратов., 1993);

- на 3-й Всероссийской конференции "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей и клеток человека и животных. (Волгоград., 1995);

-на III съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень., 1994);

- на обществе анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов., 1995);

- на центральной методической комиссии (Саратов., 1996);

- на Международной конференции BiOS'96 (San-Jose, California , USA, 1996);

- на Международной конференции European Biomedical Optics Week (BIOS Europe 96, Vienna, Austria, 1996).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной научной конференции кафедр гистологии, патологической анатомии СГМУ и лаборатории иммунологии Российского НИПЧИ "Микроб".

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Иллюстративный материал

представлен 23 рисунками, 5 фотографиями и 4 таблицами. Указатель цитируемой литературы включает 235 отечественных и 21 зарубежных источников.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Структурно-функциональные изменения, возникающие в мезентериальных лимфатических узлах при облучении инфракрасным лазерным светом имеют дозозависимый характер.

2. Лазерное излучение с импульсной частотой 80 Гц. оказывает кратковременное активирующее действие на иммуноцитопоэз, частота 1500 Гц. вызывает выраженный и наиболее продолжительный иммуностимулирующий эффект, 3000 Гц. напротив, подавляет функциональную активность клеток лимфатических узлов.

3. Воздействие ИК лазерным излучением в оптимальной режиме (1500Гц) приводит к активации хроматина лимфоцитов, увеличению ДНК-синтезирующих клеток, изменениям их ЭФП , обусловленным усилением пролиферативной активности лимфоцитов в мезентериальных лимфоузлах.

4. Влияние И К лазерного излучения приводит к активации лизосомального аппарата клеток мезентериальных лимфоузлов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на крысах-самцах (391) массой 180-200г.

Облучение передней брюшной стенки животных проводилось контактно-зеркальным методом при помощи аппарата АПТ "Узор", генерирующим переменное инфракрасное лазерное излучение с длиной волны 890 нм. Указанный режим позволяет осуществлять биологическое воздействие на ткани, с уровнем проникновения до 5-7 см. (Козлов В.И., Буйлин В.А.,1993).

Облучение проводилось ежедневно в течение 10 дней. Экспозиция составляла 128 сек, импульсная частота -80Гц, 1500Гц, 3000Гц. Средняя мощность лазерного излучения (Р, по паспорту прибора) составляла для частоты излучения 1500 и 3000Гц - 4,2 Вт., а для частоты 80Гц - 4.5 Вт. Плотность энергии. излучения на поверхности кожи животного (Е) рассчитывалась по формулам, приведенным в методических рекомендациях МЗ РФ (Литвин Г.Д., Елисеенко В.И., Буйлин В.А с соавт.,1991). Для частоты излучения 80Гц плотность энергии на поверхности кожи составила 0,72x10-3, поглощенная энергия - 4x10-5 Дж/см2; для частоты 1500 Гц. соответственно 12,6x10-3, и 70x10-5 Дж/см ; для частоты 3000Гц - 25,2x10-3, и 140x10-5 Дж/см2.

Для изучения влияния НИЛИ на цитоархитектонику мезентериальных лимфатических узлов крыс использовались общепринятые гистологические методы:

• окраска метиловым зеленым и пиронином по Браше;

• выявление метахромазии тучных клеток с помощью толуидинового синего (рН 3,0-4,0).

Подсчет клеточных элементов ( малых, средних, больших лимфоцитов, иммунобластов, плазмацитов, макрофагов, тучных клеток, делящихся клеток) в структурно-функциональных зонах мезентериальных лимфатических узлов осуществлялся с использованием стандартной морфометрической сетки Автандилова (1990) и производился в

10 полях зрения на условной единице площади (6400 мкм2) в 3-х серийных срединных срезах органа.

Определение активности хроматина лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов проводилорь по методу Melamed M.R.(1974), Кравцов A.J1.(1989,1990) с использованием флюоресцентного метахроматического красителя акридинового оранжевого (АО). Связывание АО с ДНК лимфоцитов сопровождалось формированием комплекса АО-ДНК, обладающего свечением в области спектра 530-580 нм. Принцип метода основан на представлении о том , что при активации хроматина процессы ацетилирования и фосфорилирования гистонов ведут к ослаблению их контактов с ДНК и ее переходу в более открытую , доступную для осуществления процессов транскрипции конформацию (Кучеренко Н.Е. с соавт. 1993). При этом число молекул ДНК , способных связывать АО увеличивается и, следовательно, повышается интенсивность свечения ядра в зеленой области спектра (Григорович H.A., Алекса Т.Ф.,1984).

Определение состояния лизосомального аппарата лимфоцитов проводилось этим же методом, поскольку краситель связывается с ДНК и поглащается лизосомами одновременно. При окраске цитоплазмы ( преимущественно лизосомных гранул) возникала красная флюоресценция в интервале спектра 630-700 HM.(Melamed M.R.,1974, Кравцов А.Л.,1990,1993).

В дальнейшем клетки в забуференном физиологическом растворе пропускали через цитофлюориметр со средней скоростью 1000 клеток/ сек. Оба параметра измерялись с помощью проточного цитофлюориметра ICP 22 фирмы PHYWE (ФРГ) с использованием анализатора импульсов CANBERRA п программы приема и обработки данных на персональном компьютере, специально разработанной для этих целей.

Регистрация соотношения лимфоцитов, находящихся в различных фазах (G0+G1. S. G2+M) клеточного цикла. проводилась с использованием метода проточной цитофлюориметрии. Принцип метода основан на цитофлюориметрическом определении содержания в клетках ДНК (Barlogie В. et' al.,1976) окрашенной флюорохромами митрамицином и бромидом этидия.

Изучение электрофоретической_подвижности

лимфоцитов проводилось с помощью непрерывного свободного распределительного электрофореза на аппарате Е1р1юг \/ар V.

Популяционнный состав лимфоцитов исследовался с применением моноклональных антител против Т- и С04-лимфоцитов крысы в паре с Р(аЬ) фрагментами антимышиных антител, меченых Р1ТС.

Статистический анализ . Полученные морфометрические данные обрабатывались вариационно-статистическими методами. Для изучаемых параметров определяли минимальное и максимальное значение , среднюю арифметическую (М), ошибку средней арифметической (т), среднее квадратическое отклонение (Э). Совокупности вариант подвергали предварительной обработке на присутствие "выскакивающих" вариант по формуле Г.Ф. Лакина (1990). Достоверность между рядами вариант определяли путем расчета критерия Стъюдента по формуле Г. Г. Автандилова (1990).

Анализ гистограмм проводился, учитывая модальные значения пиков распределения клеток. Высчитывали среднюю арифметическую мод каждого пика и ее ошибку. Определение доверительных интервалов проводилось по методу, описанному Рокицким П.Ф.,1974. Расчет коэффициента вариации пиков гистограмм проводили по Ва1зс11 Н.,1975. Часть расчетов, проведенных в ходе выполнения работы, проводилась с применением специализированных компьютерных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате выполненных исследований получены представленные ниже в обобщенном виде следующие основные результаты.

Сравнительная оценка структурных изменений лимфатических узлов экспериментальных животных, облученных И К лазерным светом в различных режимах (3000, 1500, 80 Гц.), позволила выявить как общие закономерности кинетики клеточных популяций, так и специфические особенности, зависящие от режима облучения. Общая направленность динамики морфофункционального состояния клеточных элементов, при использовании низкоинтенсивного переменного лазерного излучения, свидетельствовала о выраженном иммуномодулирующем эффекте данного

воздействия. Однако степень выраженности такого эффекта зависела от используемого режима частотных модуляций.

Излучение с частотой 3000Гц вызывало незначительное повышение спустя сутки от начала эксперимента и длительное снижение уровня малых лимфоцитов в лимфоидных фолликулах период с 3-х по 15-е сутки (Р<0,01), с последующим приближением к контрольным значениям на 30 сутки наблюдения . Количество средних и больших лимфоцитов снижалось и достигало своих минимальных значений с 3-х по 7-е сутки (Р<0,01). Иммунобласты и митотически делящиеся клетки после кратковременного подъема их численности через 24 часа от начала сеансов облучения, практически не выявлялись к 7-м суткам. В дальнейшем происходило постепенное восстановление клеточного состава лимфатических узлов. Вышеописанные изменения можно трактовать как значительное угнетение процессов иммуноцитопоэза, в целом неблагоприятно отражающееся на функции органа и иммунном статусе животных.

Излучение с частотой 80Гц. вызывало кратковременное повышение количества малых лимфоцитов (1-3 сутки) и достоверное увеличение иммунобластов на 7-е сутки опыта (Р<0,001). Другие клеточные элементы (средние и большие лимфоциты, тучные и митотически делящиеся клетки) слабо реагировали на данный режим воздействия. Результаты свидетельствовали о кратковременной и слабовыраженной реакции лимфоидных элементов лимфатических узлов на лазерное излучение данного режима.

Наиболее выраженный эффект был отмечен в ответ на воздействие лазерным светом с импульсной частотой 1500Гц (Таб.1). Особенно активно реагировали на воздействие малодифференцированные клеточные формы: иммунобласты в лимфоидных фолликулах (с 3-х по 15-е сутки (Р<0,001)), средние и большие лимфоциты в мозговых тяжах . Плазмацитарная реакция в мозговых тяжах была наиболее выражена с 7-х по 15 сутки (Р<0,001). Лазерное воздействие данного режима сопровождалось повышением митотической активности клеток в лимфоидных фолликулах с 3-х по 15-е сутки (Р<0,001) (Таб.1). Тучные клетки регистрировались в мозговых тяжах их количество достигало максимальных значений с 3-х по 15-е сутки (Р<0,001).

Таким образом низкоинтенсивное лазерное излучение с частотой 1500Гц оказывало наиболее выраженный эффект на структуру паренхимы и стромы мезентериапьных лимфатических узлов крыс, активизируя процессы пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток.

Кинетика клеточных популяций брыжеечных лимфоузлов крыс при облучении ИК лазером _______________(1500 Гц) ____

Назв. клеток Зона к 1 с\гг. 3 СУТ; 7 смт. 15 с\гг. 21 ОУТ. ЗОСУТ.

Малые ЛФ 64,2±2,1 83,3±1,7* 83.4±1,3* 71,2±1,2* 70,6±1,5* 52,3+1,6* 60,2±1,0

лимфоциты КП 60,1±1,2 72.4+1,1* 77,2+1,6* 66,2±1,1* 70,2±1,6* 61,2+1,2 60,4±1,4

МТ 20,2+1,3 20,8+0,6 13,3±0,2* 12,6±0,1* 15,4±0,07* 18,3+1,0 18,2±0,9

Средние ЛФ 18.2+0.4 17.1+1.3 30.1+2.1* 35.3+1.0* 17.6±0.1 16.6+1.2 16.2+1.07*

лимфоциты КП 12,1 ±1,1 15,4±1,1* 19,2+0,2* 26,6±0,1* 17,5±1,3* 15,3+0,2 15,1 ±0.9

МТ 10,2±1,7 12,1±0,2 12,7±1,1 22,3±1,2* 22,8±1,2* 15,4+1,0* 13,2±0,1

Большие ЛФ 0 22+0.7* 9.61±1.2* 13.2+0.0*1 8.2+1.7* 1.2+0.2* 0.5+0 01

лимфоциты КП 0,75+0,01 1,21+0,04* 1,2±1,13* 3,3±0,2* 1,2±0,3* 0,75±0,1 0,67±0,4

МТ 0,4+0,1 0,5±0,1 3,6±1,2* 3,9±0,15* 2,6+0,2* 0,5+0,16 0,3+0,1

ЛФ 2.5+0.01 4 8+0.3* 8.2+0.1* 10.4+0.3* 6.6±0.3* 3.1+0.06* 2.9+0.01

Иммунобласты КП 0 0,67±0,1* 2,65±0,4* 2,9±0,1* 2,28±0,1* 0,9±0,01*. • 0

МТ 1,1+0,03 3,5±0,1* 4,8±0,02* 5,2±1,5* 5,1+0,2* 1,3+0,02 1,0±0,01

ЛФ 0 0 0.3±0.05* 1.5+0.3* 0.9+0.04* 0 6+0.01* 0.1+0.02

Плазмоциты КП 0,71±0,01 1,2+0,03* 1,75+0,6* 1,72±0,2* 1,27±0,04* 0 0

МТ 15,3±0,1 16,4+1,3 16,7±1,1 40,5+1,2* 39,3+1,1* 26,4+0,4 17,9±1.2

Тучные ЛФ 0 0 0.9+0.01* 0.8±0.7* 0 0 0

клетки КП 0 1,3±0,3* 0,9±0,03* 2,0±0,6* 0,9+0,03* 0,3±0,01* 0

МТ 0,3±0,01 1,2+0,1* 1,3±0,04* 3,4±0,5* 2,3+0,4* 3,4±0,3* 0,1±0,01

Фигуры ЛФ 02+0.01 1.3+0.2* 4.6+0.07* 5.5+0 7* 4 940.24* 4.0-Ю. 3* 0.7+0.1*

митоза КП 0,8+0,16 1,5±0,12* 2,1±0,16* 1,9±0,1* 1,0±0,01* 1,2±0,03* 0,9±0,2

МТ 0,7+0,01 0,95±0,1 4,2±0,2* 4,6±1,3* 4,4+0,17* 3,5+0,1* 0,9±0,1

Примечание: * - наличие достоверности при уровне значимости Р<0,05 (по сравнению с контролем) ЛФ - лимфоидные фолликулы, КП - корковое плато, МТ - мозговые тяжи

Таблица 1.

При воздействии данного режима облучения (1500 Гц) было проведено исследование активности хроматина лимфоцитов с использованием суправитального окрашивания клеток флюорохромом акридиновым оранжевым (АО) с последующей проточной цитофлюориметрией. Облучение передней брюшной стенки крыс в проекции мезентериальных # лимфатических узлов приводило к усилению зеленой "флюоресценции лимфоцитов, выделенных из этих узлов. Обнаруженное нами увеличение зеленой флюоресценции комплекса АО-ДНК лимфоцитов свидетельствовало об активации хроматина клеток. В основе этого феномена лежит частичное освобождение ДНК от связей с белком и переход ДНК в более открытую, доступную для осуществления процессов транскрипции конформацию. Число участков, способных связывать АО возрастает, вследствие чего увеличивается интенсивность АО - флюоресценции ядра клетки в зеленой области спектра (Григорович H.A., 1984).

Исследование спектра красной флюоресценции лимфоцитов также показало появление в мезентериальных узлах под действием лазерного излучения популяции лимфоцитов с повышенным свечением. Красное свечение лимфоцитов, окрашенных АО, как известно, отражает связывание флюорохрома с цитоплазматическими структурами лизосомальной природы и РНК (Зеленин A.B.,1971). Повышенной способностью к такой флюоресценции обладают активированные иммунокомпетентные клетки (М.Ю.Ледванов, . 1987, Ю.В.Лазовский, 1994). Полученные нами данные подтверждаются работами ряда авторов (Mester E,et а!.1975, 1976, 1978; Крюк A.C. с соавт.,1986), показавшими своими клиническими и экспериментальными исследованиями стимулирующее, при оптимальных параметрах, действие лазерного света на показатели клеточного и гуморального иммунитета.

Изучение содержания ДНК в лимфоцитах облученных в оптимальном режиме (1500 Гц) животных показало (рис.1) увеличение процентного содержания синтезирующих ДНК и находящихся в митозе клеток (8+62+М-лимфоцитов). Максимальное увеличение 3+С2+М-лимфоцитов приходилось на 15 день наблюдения , в то время как максимальная активация хроматина наступала несколько раньше - на 7 день после воздействия лазерным светом. Полученные нами

данные, касающиеся пролиферации лимфоцитов, согласуются с результатами исследований А. С. Крюк с соавторами (1986), показавшими стимуляцию пролиферации различных видов клеток, в том числе лимфоцитов in vivo и in vitro. Аналогичные данные приводят К.Г.Москалик, АП.Козлов, (1979,1980), К.Г.Москалик, В.М.Кравченко, (1981), Н.И.Усов, Л.АЛинник, (1982)._

К 1 3 7 1 5 21 30

Рис. 1. Распределение лимфоцитов по содержанию в них ДНК в синтетическую (S) фазу, в- период интерфазы « непосредственно в митозе (G2+M) при облучении И К

_лазером (1500 Гц).__

Проведенные нами эксперименты свидетельствуют о том, что облучение передней брюшной стенки крыс инфракрасным- лазерным светом (частота следования импульсов 1500 Гц; длина волны 890 нм.; экспозиция 128 сек.) в области проекции мезентериальных лимфатических узлов обеспечивает достаточную глубину проникновения лазерного луча и возможность активации лимфоцитов важнейшего звена иммунной системы. Использование теста определения активности хроматина позволяет объективно судить о характере и степени вовлеченности клеток, иммунной системы, в.ответную реакцию на воздействие лазерного излучения.

В настоящее время хорошо известно (Болдырев АА, Котелевцев C.B., Ланио М.,1990), " что изменение функциональной активности лимфоцитов начинается с модуляции., архитектоники, мембран,., последнее, отражается • на их электрокинетических свойствах. В связи с этим особый

интерес представляло исследование влияния низкоинтенсивного лазерного света на свойства мембран лимфоцитов - их электрофоретическую подвижность.

Показано, что облучение передней брюшной стенки крыс лазерным светом с различной частотой импульсов по разному влияло на ЭФП лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов. Использование режима 80 Гц 'сопровождалось (Рис.2), как правило, повышением ЭФП лимфоцитов в различные сроки исследования (за исключением 7 суток, характеризующихся выраженным снижением изучаемого показателя). Увеличением ЭФП лимфоцитов в большинстве сроков исследования характеризовалось также применение лазера с частотой излучения 1500 Гц (Рис. 3). В то же время, импульсная частота 3000 Гц вызывала снижение ЭФП лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов белых крыс (Рис. 4).

Обнаруженное нами увеличение ЭФП лимфоцитов (при облучении с импульсной частотой 80 и 1500 Гц) возможно было связано с преобладанием в мезентериальных лимфатических узлах экспериментальных животных более зрелых Т-лимфоцитов и В-клеток, утративших поверхностные иммуноглобулины. Использование режима облучения в 3000 Гц приводило к увеличению в лимфузлах содержания молодых Т-клеток и В-лимфоцитов с пониженным отрицательным зарядом. Данное заключение подтверждалось тестированием лимфоцитов с помощью моноклональных антител к поверхностным антигенам зрелых Т-клеток и Т-хелперов.

Полученные результаты свидетельствовали о выраженном иммуномодулирующем действии транскутанного лазерного облучения области проекции мезентериальных лимфатических узлов. Свободный распределительный проточный электрофорез лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов позволял осуществлять эффективный мониторинг иммунобиологической перестройки организма.

$4 5« !1 >0 62 М М !1

К.1

£45853 60 62 64 68 63

К.З

/ ч / *

£аЭЮ®»еОеб!ОП74 7в73

3

10 г Л — - Оы

25

20 •в >' /К

т / у

' / х V/ \

145071 9 1)11121314 В 18 17 * в

К.15

25 А -КЫтрп.

«— • Оъг

20 ' \

15 • Г \

\ /ч

Ю / / / \

5 1 \ А г \

I I \ х V

3 54 58 58 60 62 64 И 63

К.21

545858606264686870

К. 7

К.30

Рис. 2. Гистограммы распределения по электрофоретической подвижности лимфоцитов брыжеечных лимфатических узлов крыс в динамике (1, 3, 7, 15, 21, 30 сутки) при облучении И К лазером с частотой 80 Гц. По оси абсцисс - номера фракций; По оси ординат - процентное содержание лимфоцитов.

\

Рис. 3. Гистограммы распределения по элекгрофоретической подвижности лимфоцитов брыжеечных лимфатических узлов крыс в динамике (1, 3, 7, 15, 21, 30 сутки) при облучении ИК лазером с частотой 1500 Гц. По оси абсцисс - номера фракций; По оси ординат - процентное содержание лимфоцитов.

Рис. 4. Гистограммы распределения по электрофоретической подвижности лимфоцитов брыжеечных лимфатических узлов крыс в динамике (1, 3, 7, 15, 21, 30 сутки) при облучении И К лазером с частотой 3000 Гц. По оси абсцисс - номера фракций; По оси ординат - процентное содержание лимфоцитов.

Обнаруженное нами увеличение ЭФП лимфоцитов (при облучении с импульсной частотой 80 и 1500 Гц) возможно было связано с преобладанием в мезентериальных лимфатических узлах экспериментальных животных более зрелых Т-лимфоцитов и В-клеток, утративших поверхностные иммуноглобулины. Использование режима облучения в 3000 Гц приводило к увеличению в лимфузлах содержания молодых Т-клеток и В-лимфоцитов с пониженным отрицательным зарядом. Данное заключение подтверждалось тестированием лимфоцитов с помощью моноклональных антител к поверхностным антигенам зрелых Т-клеток и Т-хелперов.

Таким образом, в результате применения гистологических, гистохимических, иммуноморфологических, иммунологических, физико-химических и морфометрических методов исследования установлены новые закономерности изменений функциональной активности и клеточного состава лимфоузлов под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения. Предложены новые методические подходы к оценке влияния лазерного облучения на характер и уровень иммунологической перестройки, основанные на проточном цитофлюориметрическом тестировании и препаративной электрофоретической сортировке иммунокомпетентных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Транскутанное облучение передней брюшной стенки экспериментальных животных низкоинтенсивным лазерным светом с длиной волны 890 нм. приводит к выраженным структурно-функциональным изменениям в брыжеечных лимфатических узлах, зависящим от частотного режима облучения.

2. Лазерное излучение с импульсной частотой 80 Гц. оказывает кратковременное активирующее действие на иммуноцитопоэз, что выражается в незначительном увеличении количества малых лимфоцитов и иммунобластов на 3 сутки эксперимента, с последующим восстановлением контрольных показателей.

3. Частота 1500 Гц. вызывает выраженный и наиболее продолжительный иммуностимулирующий эффект, характеризующийся стойким повышением уровня малых,

средних лимфоцитов и иммунобластов в лимфоидных фолликулах на 3-7 сутки с выраженной плазматизацией мозговых тяжей на 7-15 сутки опыта.

4. Частота 3000 Гц. подавляет функциональную активность клеток лимфатических узлов, что проявляется в значительном уменьшении количества лимфоидных элементов в корковой зоне лимфоузлов на 3-7 сутки облучения.

5. Воздействие И К лазерного излучения в оптимальном режиме (1500 Гц.) приводит к повышению функциональной активности хроматина и сопровождается увеличением числа ДНК-синтезирующих и делящихся лимфоидных клеток, тестируемых методом проточной цитофлюориметрии.

6. Характер изменения величины поверхностного заряда лимфоцитов, тестрируемый посредством препаративной электрофоретической их сортировки, объективно отражает динамику популяционного и субпопуляционного состава мезентериальных лимфатических узлов животных, а также увеличения пролиферативной активности лимфоцитов.

7. Облучение мезентериальных узлов в дозе 1500 Гц. увеличивает содержание в них популяции зрелых Т-лимфоцитов с преобладанием Т-хелперов.

8. Под влиянием ИК лазерного излучения с .импульсной частотой 1500 Гц. увеличивается активность лизосомального аппарата клеток лимфоузлов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Влияние гелий-неонового лазерного излучения на клеточные популяции брыжеечных лимфатических узлов./ Сб. научн. работ "Низкоинтенсивные лазеры в эксперименте и клинике". Изд. Сарат. мед. ин-та, 1992,-С.36.

2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на динамику клеточных популяций брыжеечных лимфатических узлов.// М-лы Всеросс. конф. "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных.-Саратов,1993.- С.9.( соавт. И.К.Капиносов)

3. Реакция лимфоидных органов на низкоинтенсивное лазерное излучение.// М-лы III съезда анатомов, гистологов и эмбриологов,- Тюмень,1994.- С.92-93.(соавт. И.К.Капиносов,

Г. Р. Колоколов, Е.Ю.Провозина, Н.В.Ивинская,

С.И.Петровская, М.В.Герасимова, Е.Б.Тупикина.)

4. Реакция лимфоидных органов здоровых крыс на инфракрасное лазерное излучение.// М-лы научно-практ. конф. по законченным научным исследованиям.-Саратов,1994.- С.22.(соавт. И.К.Капиносов, Е.Ю.Провозина, Г. Р. Колоколов, Н.В.Ивинская, С.И.Петровская, Е.Б.Тупикина.)

5. Реакция лимфоидных элементов селезенки в динамике развития экспериментального калового перитонита.// Сб. научн. тр.'Применение низкоинтенсивных лазеров и излучения миллиметрового диапазона в эксперименте и клинике".- Саратов.- Изд. СГМУ.1994.- С.68. (соавт. И.К.Капиносов, Е.Ю.Провозина).

6. Изменение активности хроматина брыжеечных лимфатических узлов крыс при облучении ИК лазером.// Тез.докл. 56-й научн. конф. молодых ученых й студентов.-Саратов, 1995.- С. 159-160.

7. Влияние инфракрасного лазерного излучения на цитоархитектонику брыжеечных лимфатических узлов в условиях экспериментального перитонита.// М-лы III Всероссийской научн. конф. "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных".- Волгоград, 1995.- С.20. (соавт. И.К.Капиносов.)

8. Влияние инфракрасного лазерного излучения на содержание иммунокомпетентных клеток в брыжеечных лимфатических узлах.// Микро- и макроморфология. Межвуз. сб. науч. тр.-Саратов,1995.-С.- 57.(соавт. Н.Ю.Стукова).

9. Изменение клеточного состава брыжеечных лимфатических узлов крыс в условиях экспериментального перитонита и воздействия инфракрасного лазера. // Сб. науч. тр. "Применение низкоинтенсивных лазеров и излучения миллиметрового диапазона в эксперименте и клинике",-Саратов, 1994.-С.51.

10. Effect of low-power laser irradiation on the kinetics of lymphoid cells of immune system organs.// European Biomedical Optics Week. BiOS, Europe 95 p.30 [2630-35] Spain. Barcelona 1995.