Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Влияние нейропротекторной терапии на факторы апоптоза при глаукоматозной оптической нейропатии

На правах рукописи

МОРОЗОВА НАТАЛЬЯ СТЕПАНОВНА

ВЛИЯНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ ТЕРАПИИ НА ФАКТОРЫ АПОПТОЗА ПРИ ГЛАУКОМАТОЗНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ

14.01.07 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 и и;< г гт

Москва - 2013

005534678

Работа выполнена на кафедре глазных болезней Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Фролов Михаил Александрович

доктор биологических наук,

профессор Слепова Ольга Семёновна

Официальные оппоненты:

Егоров Евгений Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ, заведующий кафедрой офтальмологии имени академика А.ГШестерова лечебного факультета

Ермолаев Алексей Павлович, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук, старший научный сотрудник отдела глаукомы

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика СЛ. Федорова» Министерства здравоохранения РФ.

диссертационного совета Д 001.040.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук по адресу: 119021, Москва, ул. Россолимо, д. 11, корп. Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИГБ» РАМН.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук М.Н. Иванов

Защита состоится

2013 г. в 14.00 на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Глаукоматозная оптическая иейропатня (ГОН) -прогрессирующее заболевание, морфологически характеризующееся гибелью ганглиозных клеток сетчатки и приводящее к постепенной потере зрительных функций [Bautista R.D., 1999]. Патогенез ГОН заключается в дегенеративном процессе, поражающем нервную ткань, как в подкорковых центрах, так и в аксонах, а затем и в телах ганглиозных клеток, и связан с нарушением аксонального транспорта Потеря трофической поддержки и выход цитокинов остаётся общей причиной в патогенезе повреждения нервной клетки и возможной её гибели через апоптоз [Нестеров А.П., 2000]. Проблема разработки стратегии и выбора препарата фармакотерапии ГОН является одной из наиболее актуальных и, вместе с тем, самых сложных задач современной офтальмофармакологни [Егоров Е.А., 2002, Еричев В.П., 2005]. Оптимальным является воздействие на патогенетические механизмы, приводящие к поражению зрительного нерва и развитию специфической оптической нейропатии [Фламмер Дж., Моцаффари М., 2007].

В этом аспекте интерес представляет цитиколин (Ceraxon®, «Nycomed», Австрия), который активизирует биосинтез структурных фосфолипидов мембран нейронов, увеличивает синтез фосфадилхолина и улучшает мозговой метаболизм. По данным зарубежных исследователей на модели глаукомы у животных цитиколин уменьшал апоптоз и увеличивал регенерацию нейронов [Oshitari Т., Fujimoto N., Adachi-Usami Е., 2002]. Основанием для выбора цитиколина в качестве нейропротектора явились данные о том, что указанный препарат способствовал подавлению экспрессии белков, участвующих в развитии апоптоза после ишемии [Parisi V., 1999, Pecori G. J., 2011]. Цитиколин снижает синаптическую концентрацию глутамата, свободных жирных кислот и свободных радикалов, а также повышает выживаемость нейронов в условиях гипоксии [Rao A.M., 1999, Mir С., 2003]. Эффекты цитиколина, выявленные в экспериментальных исследованиях, непосредственно связаны с воздействием на отдельные этапы апоптоза, в

процессе которого учас-гвует целый комплекс факторов, обладающих как апоптогенным потенциалом, так и их антагонистов. Запуск апоптоза опосредуется специфическими взаимодействиями по типу рецептор - лиганд [Стадников A.A., 2011; Farkas R.H., 2001; Garcia-Valenzuela Е., 1995]. Одним из мембранных клеточных рецепторов, ответственных за контролируемый тканевой гомеостаз и иммунный ответ, является белок Fas/Apo-1 (Fas-рецептор); ключевым индуктором гибели клетки - его лиганд (FasL). Нарушение физиологического равновесия между ними обусловливает участие данной системы (Fas/FasL), обладающей мощным апоптогенным потенциалом, в развитии многих патологических состояний. Важным антиапоптогенным фактором является мембраносвязанный белок Вс1-2, который выполняет функцию негативного регулятора апошгоза. Установлено, что уменьшение концентрации Вс1-2 приводит к апоптотической гибели клеток, тогда как сверхэкспрессия его защищает их от смерти [Park J.R., 1996; Quigley H.A., 1998; Cottet S., 2008]. В отечественной литературе отсутствуют работы по данному аспекту проблемы.

Разработка данного направления имеет не только научное, но и практическое значение для прогнозирования прогрессировать ГОН и патогенетически обоснованного назначения нейропротекции [Ling Z.H., 2012; Takahashi А., 2003]. Доказательная база эффективности цитиколина при лечении ГОН, основанная на комплексных клинико-лабораторных исследованиях, на сегодняшний день отсутствует.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение влияния нейропротектора цитиколин на факторы апоптоза и клинико-функцнональные показатели при глаукоматозной оптической нейропатии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1. Оценить клиническую эффективность нейропротектора цитиколин в лечении больных с ГОН с нормализованным (до среднестатистического нормального диапазона значений) внутриглазным давлением и нестабильными зрительными функциями;

2. Изучить роль факторов Раз-апоптоза (зАро-1/Ра5, БравЬ) и антиапоптозного белка Вс1-2 в патогенезе ПОУГ по результатам исследования количественного содержания их растворимых форм в слёзной жидкости и сыворотке крови;

3. Изучить влияние минимальной терапевтической дозы цитиколина (500 мг/сутки) на содержание эАро-^/Раз, эРазЬ и Вс1-2 в слёзной жидкости и сыворотке крови у больных ПОУГ;

4. Разработать клинико-иммунологические критерии прогнозирования течения глаукоматозного процесса на основе определения содержания маркёров апоптоза до и после применения цитиколина у больных с разными стадиями ПОУГ;

5. Оценить связь между улучшением клинико-функциональных показателей (периметрии и ретинотомографии) и изменением маркёров апоптоза (на местном и системном уровнях) в условиях применения цитиколина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые у больных с разными стадиями ПОУГ предпринято исследование вРазЬ, и зАро-1/Раз (индуктора апоптоза и его рецегггора) и Вс1-2 в слёзной жидкости и сыворотке крови. В результате динамических наблюдений до и на фоне лечения цитиколином установлена взаимосвязь между периметрическими показателями (светочувствительность, средний дефект) и локальными маркёрами апоптоза, что указывает на участие последних в патогенезе ГОН.

2. Разработан способ прогнозирования прогрессирования ПОУГ путём определения уровней белка Вс1-2 в слёзной жидкости и/или сыворотке крови (приоритетная справка по заявке на патент РФ № 2012149809 от 22.11.12). Выявлены взаимосвязи между клинико-функциональными показателями и содержанием маркёров апоптоза при ПОУГ (5раа/АРО-1, вРайЬ и Вс1-2), что указывает на их участие в процессах гибели (атрофии) волокон зрительного нерва у больных с ГОН.

3. Впервые установлены иммунокорригарующие свойства цитиколина и их роль в механизме терапевтического действия препарата при ПОУГ. Показано, что эффективность лечения цитаколином зависит от стадии глаукомы, исходных показателей апоптоза и их изменениях после лечения. Установлено, что улучшение клинико-функциональных показателей на фоне терапии с применением цитиколина сопровождается изменениями маркёров апоптоза (повышение уровней Брав/АРСМ и антиапоптозного белка Вс1-2, снижение индуктора апоптоза вРаБЬ в слёзной жидкости), что может иметь позитивное прогностическое значение.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Результаты проведённых клинико-иммунологических исследований позволит расширить представления об общих и местных патоиммунологических процессах, протекающих при глаукоматозной оптиконейропатии, предложить иммунологические тесты прогнозирования и динамического контроля заболевания, в частности препаратами, ограничивающими активность индукторов и регуляторов апоптоза: аАро-1/Раз, яРаэЬ и Вс1-2. Предложенное в этом аспекте использование цитиколина для лечения и профилактики п регрессирования глаукоматозной оптиконейропатии является патогенетически направленным и обоснованным.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Применение при ПОУГ нейропротекгора цитиколин приводит к стабилизации зрительных функций, улучшению периметрических индексов (МБ-средкий дефект, МБ-светочувствительность).

2. Растворимые формы Вс1-2, Аро-^аэ и РэбЬ, обнаруживаемые в слёзной жидкости и сыворотке крови человека, могут служить индикаторами развития апоптотического процесса на местном и системном уровнях. Подтверждённые статистически изменения маркёров апоптоза (особенно явные при исследовании слёзной жидкости) в зависимости от стадии ПОУГ и выраженности клинико-функциональных признаков ГОН свидетельствуют об участии исследованных факторов в патогенезе

заболевания.

3. Эффективность применения цитиколина для лечения и профилактики прогрессировать ГОН зависит от стадии заболевания, исходных показателей апоптоза и их динамики на фоне терапии.

4. Разработаны иммунологические критерии неблагоприятного течения глаукоматозного процесса на основании тестирования факторов апоптоза в слёзной жидкости и сыворотке крови. Наиболее информативными индикаторами апоптотического процесса, связанного с прогрессированием ГОН, является отсутствие Вс1-2 в обеих тест-пробах и снижение sFas/Apo-1 в слёзной жидкости при наблюдении больных в динамике.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ

Результаты практических разработок внедрены в клиническую практику офтальмологического отделения ГКБ №12. Материалы исследований включены в программу лекций и практических занятий кафедры офтальмологии РУДН.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: III-V Российских общенациональных офтальмологических форумах (Москва, 20102012); VIII-IX Международных конференциях «Глаукома: теории, тенденции, технологии. HRT Клуб Россия» (Москва, 2010, 2011); Научно-практической конференции офтальмологов Северо-Запада «Глаукома: теория и практика» (Спб, 2011); X-XI Всероссийских школах офтальмолога (Снегири, 2011, 2012); П1 Международной научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2011); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); Международных научно-практических конференциях «Восток-Запад» (Уфа, 2011, 2012); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фёдоровские чтения-2011»; на заседании кафедры глазных болезней медицинского факультета РУДН (Москва, 2013).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 26 работ, из них 8 - в изданиях, рекомендуемых ВАК, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации; подана заявка на патент.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 37 рисунками. Список литературы содержит 315 источников, из них 96 отечественных и 219 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использованы клинико-офтальмологические и лабораторные (иммунологические) методы исследования.

Клинико-офтальмологнчсские исследования проведены на кафедре глазных болезней РУДН (зав. каф. - д.м.н., проф. М.А.Фролов) у 129 больных (228 глаз) с I-III/IV стадиями ПОУГ и нормализованным (до среднестатистического нормального диапазона значений) внутриглазным давлением в возрасте от 59 до 75 лег (средний возраст 67±8,4 года). Клиническое обследование проводили непосредственно до лечения и на следующий день после завершения курса терапии. Дальнейшее наблюдение осуществляли через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Медиана времени наблюдения за больными составила 32,5 месяца (от 6 до 36 месяцев).

Офтальмологические методы исследования включали: визо- и рефрактометрию, тонометрию по Маклакову, биомикроскопию, офтальмоскопию, статическую компьютерную периметрию на «Octopus» 101 (Interzeag AG, Швейцария), с помощью которой оценивали динамику изменений поля зрения по показателям: средней светочувствительности сетчатки (индекс MS, mean sensitivity), среднему дефекту (индекс MD, mean

defect). RF (reliability factor) - степень достоверности исследования, во всех случаях был менее 15%. На приборе «Периком» оценивали количество относительных (I и II порядка) и абсолютных скотом. Ретин ал ь ну ю томографию (прибор Heidelberg Retina Tomograph III фирмы Heidelberg Engenering - HRT-III) с оценкой слоя нервных волокон сетчатки (параметр RNFL, мм).

Критериями включения больных в исследование являлись: диагностированная ПОУГ I-III стадий, устойчивая компенсация офтальмотонуса, достигнутая медикаментозно и/или хирургически, и отсутствие стабилизации зрительных функций в течение последних 6 месяцев. Исключались больные с патологией макулярной области, зрелой катарактой, терминальной глаукомой.

На основании офтальмологического обследования больные были рандомизированы случайным образом на три сопоставимые группы: основные (IA, 1Б) и сравнения (II) по 43 человека в каждой, с учётом возраста, гендерного фактора и стадии ПОУГ {табл.1).

Таблица 1

Характеристика терапевтических групп

Характеристики Основные группы Группа сравнения

I А(п-43> 1Б(п=43) 11 (п=43>

а 6с. % абс. % абс. %

Количество пациентов (глаз) 43(78) (00 43 (74) 100 43(76) 100

Средний возраст (Шт) 67,4 ± 0,99 69,9 ±0,99 68,8 ±0.66

Мужчины 19 44.2 21 48.8 22 51,2

Женщины 24 55,8 22 51,2 21 48,8

Стали» глаукомы Начальная Eg 41,9 12 33,3 17 37

Развитая 20 46,5 22 60 22 54,3

Далеко зашедшая 5 11,6 9 6,7 4 8,7

Схемы лечения: больные основных групп в течение 10 дней получали внутривенные инъекции цитаколина в дозах 1000 мг/сутки (группа 1А) и 500 мг/сутки (группа Ш); в группе сравнения (группа II) применялась традиционная терапия (Эмокеипин 1,0% - 1,0 мл, Ксантинола никотинат 15% - 2,0 мл, вит В« 5% - 2,0 мл, вит Вп 5% - 2,0 мл внутримышечно, «Аевит» по 1 капсуле 2 раза в дет). Курс лечения составил 10 дней.

Иммунологические исследования проводились в лаборатории иммунологии и вирусологии (рук.- д.б.н., проф. О.С.Слепова) ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца МЗ России» (директор - засл. деятель науки РФ, д.м.н., проф. В.В.Нероев). С помощью ИФА в слёзной жидкости и сыворотке крови определяли растворимые формы факторов Fas-апоптоза (sApo-1/Fas и sFasL) и Вс1-2. Использовали тест-системы «Bender MedSystems», Австрия. Забор тесг-проб производился до и после лечения цитиколииом (по схеме 500 мг/сутки в течение 10 дней).

Всего исследовано 54 пробы сыворотки крови (28 до и 26 после курса цитиколина) и 100 проб слёзной жидкости (56 и 44, соответственно) от 28 пациентов (56 глаз) с разными стадиями ПОУГ. Групповое распределение проб сыворотки крови проводилось с ориентацией на худший глаз. В качестве контроля были исследованы пробы сыворотки крови (10) и слёзной жидкости (20), полученные у 10 добровольцев сопоставимого возраста (от 50 до 64 лет) и пола, не имевших признаков офтальмопагологии и/или сопутствующих заболеваний.

Статистическая обработка материала выполнена с помощью программы «BIOSTATD» (t-кригерий Стыодента, критерий Фишера и -¿).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты клинико-функциональных исследований. В группе больных, получавших традиционную терапию количество относительных скотом I и II порядка, а также абсолютных скотом, достоверно (р<0,05) сократилось на всех стадиях ПОУГ сразу после завершения курса терапии и сохранялось в течение 3 месяцев. Тенденция к ухудшению полученного результата и возвращение к исходным параметрам отмечалась к году после проведённого лечения у больных на начальной и развитой стадиях ПОУГ. Разница по параметрам относительных скотом I порядка составила: 2,9%-3,0%: II порядка - 0,9%-0,4%; абсолютных скотом - 0,1%-0,4%, соответственно. На далекозашедшей стадии к 12 месяцам все параметры

возвращались к исходным данным и в ряде случаев были хуже исходных показателей.

В основной 1Б группе (цитаколин 500 мг/сутки) количество относительных скотом I и И порядка, а также абсолютных скотом, имело выраженное и стойкое улучшение через 3 месяца после курса терапии у больных на I и II стадиях ПОУГ, оставаясь стабильной в сроки до 12 месяцев Уменьшение относительных скотом (I и II порядка) и абсолютных скотом, по стадиям в сравнении с данными до лечения составило 10,7%-4,9%; 5,4%-2,7% и 0,7%-1,5%. На III стадии ПОУГ эффект от проведенной терапии был менее значимым, сохранялся только 3 месяца и быстро возвращался к исходным данным.

В основной группе IA (цитиколин 1000 мг/сутки) количество относительных скотом I и II порядка, а также абсолютных скотом значительно уменьшилось в течение 3-х месяцев после лечения, независимо от стадии ПОУГ. В отдалённые сроки (12 месяцев) улучшение сохранялось у больных на I и П стадиях. Разница с исходными данными по снижению количества относительных (I и II порядка) и абсолютных скотом составила 11Д%-2,1%; 4,8%-2,7%; 0,6%-0,4% соответственно. Сокращение абсолютных скотом было незначительным. На далекозашедшей стадии ПОУГ эффект от проведённой терапии был менее значимым в срок 3 месяцев после лечения и, как и при минимальной дозе цигиколина (500 мг/сутки), быстро возвращался к исходным значениям к 6-му месяцу. Динамика иццекса MD (mean defect), MS (mean sensitivity) у больных с разными стадиями ПОУГ в зависимости от вида лечения представлена на рис. ¡-2.

Таким образом, на фоне предложенной нейропротекторной терапии -парентерального введения цитиколина в дозах 1000 и 500 мг/сутки отмечено статистически достоверное (р<0,05) улучшение исследуемых показателей по сравнению с группой сравнения, получавшей традиционную терапию.

При применении максимальной дозы цитиколина (1000 мг/сутки) динамика клинико-функциональных параметров оказалась наилучшей. Уменьшение

123 ИI стадия

12 3 123 123 II стадии

¡23

I стадия

MD (дБ)

р - достоверность различий относительно показателей до лечения

Рис.1. Динамика показателя периметрии Ml) (mean defect) у бальных с разными стадиями ПОУГ в зависимости o r вида лечения.

1 - до лечения 2 - через 3 месяца 3 - через 6 месяцев

Ш традншонкад терапия S цнтиколин 500 мг/супси В цитиколин 1 ООО мг/супси

MS (дБ) 30

123 123 I стадия

123 123 II стадия

123 12 3 П1 стадия

р- достоверность различий относительно показателей до лечения

Рнс.2. Динамика показателя периметрии MS (mean sensitivity) у больных с разными стадиями ПОУГ в зависимости от вида лечения.

количества абсолютных и относительных скотом I и II порядка с качественным переходом на другой (лучший) уровень, было наиболее явным максимально к 3 месяцу и сохранялось в течение 12 месяцев у больных на I и II стадиях ПОУГ.

У пациентов на III стадии отмечалась достоверная, но менее выраженная динамика этих параметров, которая возвращалась к исходным значениям к концу 6 месяца после проведённого лечения. Динамика индексов MS (mean sensitivity), MD (mean defect) подтверждает полученные изменения. Подобная тенденция отмечена и при использовании минимальной дозы цитиколина (500 мг/сутки), когда улучшение исследуемых показателей у больных на I и II стадиях ПОУГ также было выражено максимально к 3 месяцу и стабильно сохранялось в течение 12 месяцев. На Ш стадии уменьшение количества абсолютных и относительных скотом (I и II порядка) наблюдалось в течение 3 месяцев, было выражено слабее, возвращение к исходным значениям - в основном также к 6-му месяцу. Полученные данные свидетельствуют об актуальности нейропротекторной терапии на всех стадиях ПОУГ. Критический период для оценки динамики процесса и результатов лечения (6 месяцев) вызывает необходимость переосмысления периодичности консервативного лечения. Результат лечения определяется индивидуальной ситуацией, поскольку ответ на подобную терапию неодинаков, зависит от стадии ПОУГ и, в меньшей степени, от дозы препарата, сроков оценки результатов, а также от ряда других патогенетических факторов. Среди последних особое внимание привлекают факторы апоптоза, исследование которых и явилось предметом иммунологического раздела нашей работы.

Результаты иммунологических исследований. Иммунологические исследования показали, что содержание факторов апоптоза в слёзной жидкости и, в значительно меньшей степени, в сыворотке крови может служить индикатором как апоптотического, так и связанного с ним глаукоматозного процесса (табл.2).

Установлено, что начальные стадии ПОУГ характеризовались активизацией системы Рай/РаБЬ, играющей ключевую роль в запуске апоптоза. При этом проявлялось «противоборство» индукторного (вРавЬ) и рецепторного (эАрсМ/Раз) факторов, что было наиболее заметно на местном уровне (рис.3).

Таблица 2

Маркёры апоптоза у больных с разными стадиями ПОУГ

Стадия ПОУГ Число проб СЖ/СК* зАро-1/Раз (пг/мл) эРжЬ (пг/мл) Вс1-2 (Ед/мл)

СЖ СК СЖ СК СЖ СК

контроль 20/10 497* 157 212±45 7545 <10 0,1 ±0,02 7,042,11

Подозрение на глаукому 6/2 1062*576' 74±5 60410 <10' 4,942,1' 6,9413*

I 8/4 1081*287' 17849 40±4 32±22 2,0±1,1 4,944,6'

П 18/6 7024350' 211478 74*17 75415м 7341.8" 5,940,9м

III 18/10 4864156 154±33 61415 35±16 3,541,5' отр.

IV 6/6 161±92и 201±39 4046 1444* отр отр.

Примечания: достоверные отличия: для яАро-1/Кя5: '(подозрение на глаукому+1 ст.) - IV ст. (р=0,046); 2 II ст. - IV ст. (р=0,000); для ¡¡КахЬ:3 подозрение на глаукому - II ст. (р=0,03б); 4 И ст.ЧУ СТ. (р=0,047); для Вс1-2: по отношению к IV ст.: 5(р=0,004);6(р=0,003);7(р=<),002); 8(р=0,000); '(р=0,026); ю(р=0,000)

Прогрессирование заболевания и переход в терминальную стадию ассоциировались с явным уменьшением содержания обоих факторов в слёзной жидкости и тенденцией к возвратному восстановлению - в сыворотке крови. Надо полагать, что это отражало «истощение» Равюпосредованного звена апоптоза и переход в следующую фазу апоптотического процесса, связанную с другими его маркёрами.

Исследование антиапоптозного белка Вс1-2 показало, что уже на 1-ой стадии ПОУГ проявлялась тенденция к уменьшению его содержания в сыворотке крови и в слёзной жидкости (по сравнению с контролем и/или подозрением на глаукому). После локального, по-видимому - защитного,

14

всплеска уровня Вс1-2 на И-ой стадии, отмечалось падение его в обеих тест-пробах.

вАро-Ь'Рая 1200 1000 800 600 400 200 0

я Рая!.

"■■■»—'' ---- -

--1-1-1-1-1-

контроль подозрение на глаукому

80 70 60 50 40 30 20 10 0

I стадия II стадия Ш стадия IV стадия

—•—вАрсИ/Рав — « — вРав!.

РнеЗ. Соотношение *Лро-1/Рач н (пг/мл) в слёзной жидкости у больных ПОУГ

в динамике глаукоматозного процесса.

Переход в терминальную стадию ассоциировался с явным сочетанным (местным и системным) дефицитом этого фактора.

Существенные различия, выявленные при исследовании факторов Раа-апоптоза и Вс1-2 у больных с разными стадиями ПОУГ, были расценены нами как свидетельство их участия в патогенезе глаукоматозного процесса.

Это подтвердили и данные, полученные при сопоставлении маркёров апоптоза (особенно - локальных) с клинико-функциональными параметрами ГОН. Установлено, что показатели увеличения среднего дефекта, ослабления светочувствительности сетчатки (высокий индекс N0, низкий индекс МБ) и уменьшения толщины слоя нервных волокон сетчатки (низкий ИОТЬ) ассоциировались с минимальными уровнями вАро-^ав (<100 пг/мл) и максимальными вРазЕ, (>100 пг/мл) в слёзной жидкости. Особенно неблагоприятным оказалось отсутствие в слезе, а также в сыворотке крови, антиапоптозного белка Вс1-2 (табл.3).

Обобщение результатов клинико-иммунологических исследований позволило нам разработать критерии прогнозирования течения

глаукоматозного процесса с учётом стадии заболевания на момент обследования (табл.4).

Таблица 3

Показатели периметрии (индексы МБ и МО) и ретинотомографии (КЫРЦ при различных уровнях Вс1-2 в слёзной жидкости у больных ПОУГ

Вс1-2 (Ед/мл) Число проб Светочувствительность, MS. (дБ), М±т Средний дефект, MD, (дБ). М±ш Слой нервных волокон сетчатки, RNFL, (мм), М±ш

Интервалы уровней Средний уровень М±т

отриц. <0.50 8 17,28±0,97 7,47±0Т22 0,14940,010

0,50-1,50 0,97±0,12 10 23,3040,74 П=0,000 4,4840,38 р=0,000 0,19940,006 р=0,(100

2,0-6,50 4,37±0,37 12 21,65±0,52 р=0,000 5,87±0,57 р-0.042 0,17040,007 р=0,045

7,0- 10,0 8,05±0,39 8 20,2541,19 7,4540,4 0,16640,008

12,0-18,0 14,2341,23 6 20;7040,38 р=0,013 6,8640,97 0,17440,010 р=0,014

Примечание: р - достоверность различий по сравнению с клинико-функционаяьными показателями у бальных с отсутствием Вс1-2

Наиболее информативными показателями, связанными с прогрессированием ГОН, по нашим данным, является отсутствие Вс1-2 в обеих тест-пробах и падение уровня БАро-^ав в слёзной жидкости в динамике.

Изучение возможностей медикаментозного воздействия на изучавшиеся факторы апоптоза показало, что применение цитиколина (500 мг/сутки) у большинства больных приводило к значительному (в 1,5 раза и более) подъёму уровней антиапоптозного белка Вс1-2 в сыворотке крови (76,9%) и, что особенно важно, в слёзной жидкости (81,8%). Кроме того, почти в половине случаев (45,6%) наблюдалось прогностически благоприятное увеличение содержания в слёзной жидкости зАро-^ав и параллельное падение бРзбЬ (очевидно, вследствие взаимодействия между этими факторами).

Таблица 4

Критерии прогнозирования течения ПОУГ на основе определения

маркёров апоптоза в слёзной жидкости и сыворотке крови

Маркёры апоптоза

Стадия развития $Аро-1/Ра$ зРазЬ* Вс1-2

ПОУГ

СЖ ск СЖ СК СЖ ск

Риск возникновения 1 * * * ** I *

Показатель прогрессировал ия (на I - 11-ой стадиях) Д * ** ! ** ** д ** д

Риск перехода в терминальную стадию 1 * ** Д ** Д 1 1

Примечание: "дополнительная информация при условии исследования Вс1-2 и яДро-Ш-аз; * не информативно; ** информативно только в динамике;

Обнаружено, что воздействие цитиколина зависело от фоновых значений маркёров апоптоза. При максимальных исходных уровнях Вс1-2 и БАро-ШаБ отмечались случаи снижения их содержания после применения препарата (рис. 4).

пг/мл 2000 1600 1200 800 400 0

менее 100 100-300 303-559 560-1000 1001-2000 Исходный

уровень

до лечения V после лечения ьЛро! Л'а<;

р - достоверность различий при сравнении уровней 5Аро-1/Каз перед начшюм и после окончания курса лечения циггиколином

Рис.4. Изменение на фоне лечения нитиколнном уровня $Аро- N (пг/мл) в слёзной жидкости при разных исходных уровнях.

В целом это указывало на определенный иммунокорригирующий эффект цитиколина и важность учёта фоновых иммунологических показателей при назначении лечения.

Влияние лечения цитиколином на клинико-функциональные параметры ПОУГ в зависимости от фоновых показателей апоптоза.

Установлено, что прогностически благоприятные сдвиги маркёров апоптоза на фоне терапии цитиколином коррелируют с положительной динамикой периметрических индексов, подтверждая вклад иммунокоррекции и нейропротекции в механизм терапевтического действия препатата.

Наиболее явно это проявилось при сопоставлении количественного содержания локальных маркёров апоптоза с показателями периметрии (снижение дефекта и повышение светочувствительности). Так, наиболее достоверное снижение дефекта в поле зрения (индекс 1УГО) на фоне лечения цитиколином коррелировало с отмеченным выше увеличением в слёзной жидкости содержанием Вс1-2 и БАро-^аэ (рис. 5 и 6).

р - достоверность различий при сравнении показателей МО перед началом и после окончания курса лечения цитиколином

Рис.5. Изменение на фоне лечения цитиколином периметрического индекса М1) при различных исходных уровнях Вс|-2 (Ед/мд) в слезной жидкости у больных с ПОУГ.

МЭ (дБ)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 О

менее 100

101-302 303-559

а до лечения

2001-3100 Исходный уровень чЛпо-ЬТая

560-1000 1001-2000 >* после лечения

р - достоверность различий при сравнении показателей МО перед началом и после окончания курса лечения цигтиколииом

Рис.6. Изменение на фоне лечения шпнколнном периметрического индекса МО при различных исходных уровнях ро-1 /Каз (пг/мл) в слёзной жидкости у больных с ПОУГ.

Характерно, что терапевтический и иммунокорригирующий эффект препарата проявлялся как на начальной и развитой, так и на далекозашедшей стадиях ПОУГ, хотя и в меньшей степени (рис 1-2.), что подтверждает мнение о перспективности его применения у больных с ГОН.

Вместе с тем, анализ и обобщение представленных данных позволяют заключить, что для усиления и закрепления полученных результатов целесообразно проводить повторные курсы лечения цитиколином с индивидуальным подбором доз препарата и учётом иммунологического фона, в частности маркёров апоптотического процесса.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в клинических условиях на 129 больных с ГОН с нормализованным (до среднестатистического нормального диапазона значений) внутриглазным давлением и нестабильными зрительными функциями проведены комплексные (клинико-иммунологические) исследования, направленные на изучение роли апоптотического процесса и

влияния нейропротектора цитиколин на факторы апоптоза и клинико-функциональные показатели.

2. У больных с ГОН цитиколин проявил свойства эффективного нейропротектора. Применение препарата в дозах 500 и 1000 от/сутки в течение 10 дней способствует оптимизации лечения больных, по сравнению с традиционной терапией, что подтверждается улучшением клинико-функциональных показателей: уменьшением площади абсолютных и относительных скотом, повышением светочувствительности сетчатки (индекс МБ), снижением среднего дефекта (индекс МБ). Более выраженный и стойкий терапевтический эффект отмечен на начальной и развитой стадиях ПОУГ. Результаты лечения на далекозашедшей стадии оказались менее выражены и имели тенденцию к возвращению к исходным показателям.

3. Лучшие результаты по длительности стабилизации глаукоматозного процесса (12 мес. - срок наблюдения) отмечены при применении дозы цитиколина 1000 мг/сутки. При анализе данных периметрии у больных, получавших цитиколин в дозе 1000 мг/сутки в течение 10 дней, спустя 3 месяца отмечено повышение светочувствительности сетчатки (индекс МБ) с 20,33±1,04 до 28,76±1,19 дБ (р<0,001), снижение дефекта (индекс МБ) с 7,09±1,07 до 3,38±0,76 (р<0,001), что свидетельствует об эффекте последействия, который сохранялся до 6 месяцев после проведённой терапии. Меньшая доза препарата (500 мг/сутки) давала менее выраженный и стойкий (3-6 мес.) терапевтический эффект.

4. Свидетельством участия изученных факторов апоптоза в патогенезе ПОУГ являются статистически подтверждённая связь между уровнями растворимых форм вАрЫ/Рав, БраэЬ и Вс1-2 в слёзной жидкости и, в меньшей степени, в сыворотке крови (по отдельным показателям: Вс1-2, БравЬ) и стадиями развития заболевания, а также выраженностью клинико-функциональных признаков ГОН и их количественными изменениями на фоне лечения цитиколином.

5. Исследованные маркёры апоптоза являются индикаторами развития апоптотического и связанного с ним процесса прогрессирования ГОН. Высокие уровни 5Аро-1/Ра5 (1062±576 пг/мл; р=0,046) и Вс1-2 (14,2±1,2 Ед/мл; р=0,004) в слёзной жидкости могут служить предвестниками заболевания. Наиболее информативными показателями прогрессирования ГОН и перехода в терминальную стадию ПОУГ является снижение содержания 5Аро-1/Раз в слёзной жидкости (до 161±92 пг/мл; р=0,000) и полное исчезновение Вс1-2 как в слёзной жидкости (р=0,004), так и в сыворотке крови (р=0,000).

6. Парентеральное введение цитиколина больньм ПОУГ (500 мг/сутки, в течение 10 дней) в большинстве случаев приводит к значительному изменению содержания в слёзной жидкости и сыворотке крови растворимых фор« 5Аро-1/Ра5 (45,6% и 53,2% соответственно), зРазЬ (45,6% и 16,1%) и Вс1-2 (81,8% и 76,9%). Направленность сдвигов зависит от фоновых значений: подъём уровней Вс1-2 и БАро-1/Раз имеет место при исходно низких или умеренных уровнях, снижение - при исходно высоких; динамика сдвигов БГазЬ отличается противоположной направленностью. В целом это свидетельствует об иммунокорригирующих свойствах препарата.

7. Прогностически благоприятные сдвиги маркёров апоптоза (повышение уровней Вс1-2 и вАро-^ав в сыворотке крови и, особенно, в слёзной жидкости) на фоне терапии цитиколином находятся в корреляционной зависимости с улучшением клинико-функциональных показателей (по данным периметрии), подтверждая иммунокорригирующий и нейропротекторный эффект лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Цитиколин может быть использован у больных с ГОН в терапевтических дозах: 500 мг/сутки на начальной, развитой и 1000 мг/сутки на далекозашедшей стадиях глаукомы в течение 10 дней парентерально.

Оптимальной дозой для достижения более стойких результатов на всех стадиях ПОУГ является 1 ООО мг/сутки.

2. Рекомендуемая кратность курсов нейропротекции при применении цитиколина: на начальной и развитой стадиях каждые 6 месяцев, на далекозашедшей стадии -каждые 3 месяца.

3. С целью контроля терапии целесообразно исследование слёзной жидкости (и сыворотки крови - в качестве дополнительного теста) на определение факторов алоптоза (sApo-1/Fas, и особенно Вс1-2) до начала и в динамике лечения. Повышение исходно низких/умеренных уровней этих факторов в слёзной жидкости, а также Вс1-2 в сыворотке крови, подтверждает благоприятное воздействие лечения: уменьшение значений указывает на отсутствие иммунокорригирующего эффекта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Опыт применения цитиколина в лечении глаукоматозной оптической нейропатии / Фролов МЛ., Морозова Н.С.. Фролов A.M. // III Рос. общенац. офт. форум: Сборник трудов научно-практ. Конф. с междунар. уч., 7-8 окт. 2010г.-М.: МНИИГБ им. Гельмгольца. 2010. Т.1.-С. 415-419.

2. Влияние цитиколина (CDP - choline) на зрительные функции и некоторые лабораторные показатели липцдного спектра сыворотки крови у больных ПОУГ / Фролов М.А., Морозова Н.С.. Фролов A.M., Божок Е.В. // «Клиническая офтальмология» -Т. 11 .-№3.-2010.-0.82-83.

3. Клинические аспекты применения цитиколина в условиях консультативно-диагностического центра / Фролов МЛ., Морозова Н.С., Фролов A.M., Колесникова JI.H., Владимирова Н.Ю. И Сб. научн. трудов регион, конф. «Глаукома: теория и практика» - СПб„ 2011. С .113-116.

4. Нейропротекшя при ПОУГ: Возможности применения цитиколина / Фролов МЛ., Морозова Я С. Ловпаче Дж.Н. И Матер. X Всерос. шк. офтальм.- М. 2011.-С.121-124.

5. Роль ноотропного препарата с антиоксидантными свойствам! в терапии первичной открытоугольной глаукомы / МЛ. Фролов, Морозова Н.С.. Фролов A.M. //Там же.-С. 124-127.

6. Лазерная сканирующая ретинотомография как метод мониторинга пациентов с глаукоматозной оптической нейропатией / Фролов A.M., Морозова Н. С. // Сборник тезисов П1 Международной научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». М. 2011.- С. 58.

7. Сравнительный анализ применения различных доз цитиколина в лечении больных с первичной открытоугольной глаукомой / Фролов A.M., Морозова Н.С. Н Там же. М. 2011.-С.59.

8. Коррекция зрительных нарушений у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой препаратом цитиколнн / Фролов М.А., Морозова Н.С.. Фролов A.M., Казакова К.А. И Вестник РУДН-№2.-2011. С. 103-106.

9. Клиническая эффективность щггиколина (CDP - choline) в лечении больных первичной открытоугольной глаукомой / Фролов hi.А., Морозова Н.С.. Фролов A.M. Н XVIII Рос. нац. конгресс «Человек и лекарство»: М.,-20П.-241 с.

10. Эффективность и безопасность пероралыюй формы цитиколина (CDP -choline) в лечении га аукоматозной оптической нейропатии / Фролов М.А., Морозова Н.С., Фролов A.M. // Междунар. науч. - практич. конф. «Восток - Запад» // Сб. научи, трудов, посвящ. 85-лет. Уф. НИИ гл. бол. - Уфа. 2011.-С. 207-209.

11. Влияние терапии цитиколином на качество жизни больных с глаукоматозной оптиконейропатией / Колесникова Л.И., Фролов М.А.. Морозова Н.С.. Фролов A.M. Н IX Всерос. научн. - практич. конф. с междунар. уч. «Фёдоровские чтения -2011». 22-24 июня 2011г., М. ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова Росмедтехнологии»: Сб. тез.-2011. -С.312-313.

12. Информативность лазерной ретинотомографии в оценке эффективности нейропротекции при первичной открытоугольной глаукоме / Морозова Н. С. Фролов М.А., Фролов A.M., Колесникова JI.H. // Там же. - С.332-333.

13. Эффективность консервативного лечения первичной открытоугольной глаукомы у больных с нормализованным офтальмотонусом / Морозова Н.С.. Фролов М.А., Фролов А.М, Колесникова Л.Н. И Там же. С. 334-335.

14. Влияние парентерального применения цитиколина на зрительные функции и качество жизни больных с первичной открытоугольной глаукомой / Фролов МЛ., Гончар П.А., Морозова И.С., Барашков В.И., Кумир В., Фролов A.M., Казакова К.А. // Вести. Офтальмол.-20П.-Т.127.-№ 5.-С. 17-21.

15. Цитиколнн: перспективы применения при первичной открытоуголыюй глаукоме / Фролов М.А., Морозова Н.С.. Фролов A.M., Казакова КЛ. // Рос. Офтальмол. Журнал // Том 4.-№4. -2011 .-С. 108-112.

16. Анализ клинической эффективности н безопасности препарата CERAXON* при первичной открытоугольной глаукоме / Фролов М.А., Морозова Н.С., Гопчар ПЛ., Кумир В., Фролов A.M., Казакова КЛ. U Вестник РУДН-№ 2.—2012.С.100-103.

17. Эффективность, безопасность и взаимодействие лекарственных препаратов при лечении больных с первичной открытоугольной глаукомой / Фролов М.А., Морозова И.С.. Гончар П.А., Барашков В.И., Кумар В.. Фролов A.M., Казакова К.А. ИIV Рос. общенац. офт. форум: Сб. трудов научн.-практ. конф. с междунар. уч., 5-7 окт. 2011г., М: МНИИГБ им. Гельмгольца. 2011. Т. 1.-С. 342-343.

18. Клиническая эффективность комплексной нейрометаболической и антиоксидантной терапии при первичной открытоугольной глаукоме / Фролов М.А., Морозова Н.С.. Гончар П.А., Кумар В., Фролов A.M., Казакова К.А. и др. // Там же. -С. 343-350.

19. Клиническое использоваюге препарата CERAXON® при первичной открытоугольной глаукоме / Фролов М.А., Морозова Н.С.. Фролов A.M. /^Глаукома: теории, тенденции, технологии. HRT Клуб России 2011: сб. тез. IX Междунар. конф. -М., 2011.-С. 337-341.

20. Анализ клинической эффективности комплексной терапии у пациентов с глаукоматозной опти коней ропати ей / Фролов МЛ., Морозова Н.С., Гончар

П.А., Кумир В., Фролов A.M., Казакова КА. // «Земский врач»-2012. №1(11). С. 24-27. "

21. Маркёры Fas-опосредованного апоптоза при первичной открытоугольной глаукоме и возможности их фармакологической коррекции / Ctenoea О.С., Фраюв МЛ., Морозова Н.С.. Лоепаче Дж.Н. // Вести. Офтальм ол.-2012.-Т. 128.-№ 4.-С. 27-31.

22. Мигтохондриальная патология и первичная открытоугольная глаукома / Фраюв МЛ., Перфильева Е.А.. Морозова Н.С. И Матер. XI Всерос. школы офт.-М.2012.-С.114-117.

23. Факторы Fas-опосредованного апоптоза при первичной открытоугольной глаукоме / Фролов М.А., Слепова О.С., Морозова Н.С.. Лоепаче Дж.Н. // Междунар. научн.-практич.конф. «Восток-Запад» //Сб. научн. Тр.-Уфа.2012.-С.246-247.

24. Роль про- и антиапоптотических факторов в патогенезе глаукоматозной оптической нейропатии и изменение их секреции в условиях лечения цитиколином / О.С. Слепова, Н.С. Морозова. Дж.Н. Лоепаче, МА.Фролов, A.M. Фролов И V Рос. общенац.офт. форум: Сборник трудов научн.-практичю конф. с межяунар. уч., 3-5 октября 2012г.-М: МНИИГБ им. Гельмгольца. 2012.Т. 1.-С.123-126.

25. Исследование антиапоптозного белка Вс1-2 в слёзной жидкости и сыворотке крови и его значение для понимания патогенеза н обоснования нейропротекции при первичной открытоугольной глаукоме / Слепова О.С., Фролов МЛ., Мопотва Н.С.. Лоепаче Дж.Н. //Рос. Офтальмол. журнал // Том 6.-№1.-2013.-С. 48-52.

26. Маркёры апоптоза у больных с глаукоматозной оптической нейропатией / Слепова О.С, Морозова Н.С., Лоепаче Дж.Н., Фролов МЛ. // Рос. Иммуиологич. журнал // Том 7 (16). -№2-3. - 20I3.-C. 254.

ПАТЕНТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕ

«Способ прогнозирования прегрессирования первичной открытоугольной глаукомы путём определения белка Вс1-2 в слёзной жидкости и/или сыворотке крови» / Счепова О.С., Фролов МЛ., Мопоюва Н.С.. Фролов A.M., Лоепаче Дж.Н. Заявка на патент РФ № 2012149809 от 22.11.12.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГОН-глаукоматозная оптическая

нейропатия

ИФА-иммуноферментный анализ СЖ-слЬная жидкость СК-сыворотка крови ПОУГ-первичная открытоугольная глаукома

Bcl-2 (B-ceü lymphoma 2>-В-клеточной лимфомы подобный протеин HRT HI (iHeidelberg Retina Tomograph ///)-ретинальная томография

MD (mean defect)-средний дефект, отражающий диффузное снижение светочувствительности сстчапси MS (mean scnsitivityy-cpemsix светочувствительность сетчатки

RNFL (retinal nerve fiber ¡ayer)-слой нервных волокон сетчатки

SAP-статическая автоматическая периметрия sApo-l/Fas (soluble)-растворимая форма Fas-рецептора (FasR)

sKASL (ло/«/>/е)-растворимая форма Fas-лиганда (FasL)

Подписано в печать: 19.09.2013 Объем: 1,4 усл.пл. Тираж: 100 экз. Заказ №913 Отпечатано в типографии «Реглет» 101000, г. Москва, Пл. Мясиицкис Ворота д. 1, стр.3 (495) 971-22-77 wwv.reglet.ru