Роль опухолевого супрессора ARF в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии

Пимкина, Юлия Сергеевна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль опухолевого супрессора ARF в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Пимкина, Юлия Сергеевна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.16

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль опухолевого супрессора ARF в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии

На правах рукописи

* е

Пимкина Юлия Сергеевна

Роль опухолевого супрессора АЮ7 в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии

14.00.16 - патологическая физиология „ Л|1Т

- 1 ОКТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2009

003478180

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Доросевич Александр Евдокимович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Петрищев Николай Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Владимир Николаевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится « о^т^» октября 2009г. в У/ часов на заседании диссертационного совета Д 001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан « » сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность изучаемой проблемы

Количество онкологических заболеваний в последнее время неуклонно растёт. Изучение механизмов лежащих в основе развития опухоли - залог успеха в разработке новых методов диагностики и лечения. Важную роль в патогенезе новообразований играет активация протоонкогенов и нарушение функций опухолевых супрессоров (Копнин Б.П., 2002). Поэтому детальное изучение механизмов действия как протоонкогенов, так и опухолевых супрессоров, является актуальной задачей.

Локус INK4a/ARF, кодирующий опухолевый супрессор ARF - второй по частоте мутаций после р53 при развитии новообразований, что говорит о его важной роли в механизмах канцерогенеза (Sherr C.J. et al., 2005; Sherr С.J., 2005). К настоящему моменту хорошо изучены р53-зависимые функции ARF, которые включают участие в процессах стабилизации р53, приводящих к остановке клеточного цикла и запрограммированной гибели клетки (Yarbrough W.G. et al., 2002). Однако р53-независимые функции белка ARF остаются малоизученными. В последнее время было показано, что опухолевый супрессор ARF независимо от р53 участвует в образовании комплексов с белками регулирующими клеточную пролиферацию: нуклеофосмином, c-myc, E2F-1, DPI, FoxMl, HIFla (Sherr С.J., 2005). Таким образом, все ранее описанные функции белка ARF так или иначе связаны с подавлением клеточного роста. Если это так, то почему экспрессия ARF повышается при развитии многих новообразований, как то: в 40% случаев лимфом Беркита (Eischen С.М. et al., 1999; Basso К. et al., 2005), в 30% случаев аденокарциномы яичников (Hendrix N.D. et al., 2006) и молочной железы (van de Vijver, M.J. et al., 2002). Это парадоксальное явление может объясняться тем, что, помимо супрессирующих функций, ARF играет и промотирующую роль в развитии некоторых опухолей, однако данная гипотеза требует экспериментального подтверждения.

В литературе имеются данные об укороченной форме ARF, которая располагается в митохондриях и активирует аутофагию. Однако механизмы активации аутофагии и роль в этом процессе полноценного опухолевого супрессора ARF, изучены не были (Reef S. et al., 2006). Необходимость изучения роли полноценного белка ARF в молекулярных механизмах активации аутофагии объясняется важной ролью аутофагии в механизмах канцерогенеза.

Аутофагия - это эволюционно консервативный механизм самопереваривания повреждённых белков и органел и высвобождения энергии и аминокислот, при помощи которого поддерживается гомеостаз (Levine et al., 2008). Нельзя не отметить противоречивость литературных данных о роли аутофагии в канцерогенезе. С одной стороны, гетерозиготные мыши, у которых инактивирован один аллель Beclinl - один из главных регуляторов

молекулярных механизмов аутофагии - склонны к развитию опухолей (Liang, Х.Н. et al.,1999; Yue, Z. et al., 2003). С другой стороны, в генах отвечающих за регуляцию аутофагии всегда удалён только один аллель. Данный факт может свидетельствовать о том, что на первоначальных этапах развития опухоли аутофагия является сдерживающим механизмом, а при уже развившейся опухоли базовый уровень аутофагии необходим для её выживания в условиях метаболического стресса, однако такая гипотеза требует дальнейшего изучения и подтверждения.

С практической точки зрения, понимание молекулярных механизмов активации аутофагии и механизмов её регуляции может послужить основой для разработки целенаправленных и эффективных методов лечения новообразований.

Целью настоящего исследования являлось изучение роли опухолевого супрессора ARF в молекулярных механизмах аутофагии и влияние ARF-опосредованной аутофагии на развитие и прогрессию новообразований.

В задачи настоящего исследования входило:

• Изучить влияние, оказываемое опухолевым супрессором ARF на транспорт р53 в митохондрии.

• Определить клеточную локализацию опухолевого супрессора ARF.

• Оценить роль митохондриальной формы ARF в регуляции молекулярных механизмов запрограмированной гибели клетки первого и второго типа.

• Изучить роль ARF в молекулярных механизмах аутофагии в условиях метаболического стресса.

• Изучить молекулярный механизм ARF-опосредованной аутофагии.

• Оценить чувствительность опухолевых клеток к метаболическому стрессу при отсутствии экспрессии ARF.

• Изучить влияние подавления экспрессии ARF и ARF-опосредованной аутофагии на рост и развитие различных опухолей.

Научная новизна и практическая значимость работы

Нами описан новый молекулярный механизм активации аутофагии, опосредованный увеличением экспрессии ARF. Впервые показана неоднозначная роль белка ARF в канцерогенезе. До сих пор считалось, что ARF является опухолевым супрессором, и что его активация способствует подавлению опухолевого роста. Нами впервые показано, что эта точка зрения справедлива не для всех опухолей. Впервые установлена промотирующая роль ARF в развитии Т и В-клеточных лимфом.

С практической точки зрения понимание молекулярных механизмов ARF-опосредованной аутофагии и исследование чувствительности опухолей к

подавлению изученных механизмов может быть использовано для лечения новообразований. Иигибирование аутофагии в чувствительных новообразованиях уже существующими и хорошо изученными препаратами (хлорохин, 3-МА) может быть одним из потенциальных и очень эффективных способов терапии.

Положения выносимые на защиту

1. Митохондриальная клеточная локализация опухолевого супрессора ARF играет важную роль в активации и регуляции молекулярных механизмов аутофагии.

2. Механизм активации ARF-опосредованной аутофагии основан на взаимодействии с Bcl-xl - антиапоптотическим белком семейства BCL2.

3. Подавление экспрессии ARF и ARF-опосредованной аутофагии ингибирует прогрессию Т- и B-клеточных лимфом, что говорит о повышенной чувствительности этих опухолей к блокированию аутофагии.

Внедрение результатов исследования

Основные положения диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе, а также в лекционном курсе и на практических занятиях на кафедрах патологической анатомии и медицинской биологии Смоленской государственной медицинской академии.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии «Иммунология, иммунопатофизиология, иммунопатоморфология» Смоленской государственной медицинской академии (2006-2009); доложены на международных конференциях: «Высокие технологии в морфологии, их значение в клинике и перспективы внедрения в практическое здравоохранение» (Минск, Беларусь, 2006), «11 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2006), «98 Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (JIoc Анжелес, США, 2007), «12 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2007), «99 Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (Сан Диего, США, 2008), «13 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 в ВАК-рецензируемых журналах.

Структура и объём работы

Диссертация изложена на 115 страницах и включает 34 рисунка. Диссертация состоит из Введения, четырёх глав: "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов исследования", а также Выводов. Указатель

литературы содержит 13 отечественных и 193 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование клеток

В работе использовали клеточные линии U20S, MCF7, U20S ARF, В2998, Т313, MEF, MEFp53-/-, которые культивировали в средах DMEM (U20S, U20S ARF, MEF) и RPMI (MCF7, В2998, Т 313), содержащих 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 10000 ед/мл пенициллина и 10000 ед/мл стрептомицина, при 37°С. Для клеточной линии U20S ARF в среду добавляли 50 мкг/мл зеоцина и В 50 мкг/мл гидромицина.

Выделение митохондрий

Для выделения митохондрий мы использовали Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells (PIERCE, США). Данный кит предназначен для выделения митохондрий из культуры эукариотических клеток. Выделение производилось в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Иммуноблотинг

Для детекции белков применяли метод иммупоблотинга - переноса разделённых белков с полиакриломидного геля на поливинилиден-фторидную (PVDF) мембрану (Millipore, США) с последующим применением поли- и моноклональных антител к изучаемым белкам.

Иммуноцитофлюоресцентный анализ

Клетки трансфецировали плазмидой, кодирующей маркер аутофагии -белок LC3, меченный зелёной флюоресцентной меткой. Формирование аутофагосом детектировали при помощи флюоресцентного микроскопа через 24, 48 и 72 часа.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Наиболее достоверным методом изучения аутофагии является трансмиссионная электронная микроскопия (Bampton Е.Т. et al., 2005). Клетки высевали на покровные стекла для электронной микроскопии в 12-луночные планшеты при конфлюентности 25% и инкубировали соответствующее время при 37°С, 5% СОг Затем клетки фиксировали, подвергали микродиссекции и анализировали под микроскопом при увеличении в 3000 - 12000 раз.

РНК-интерферен11ия

В качестве трансфекционного реагента для трансфекции миРНК в

клеточную линию HeLa использовался реагент DharmaFECT 1 (Dharmacon, США). Через 48 часов трансфекционная смесь заменялась на стандартную ростовую среду. Спустя 96 часов после начала трансфекции количество GFP-положительных клеток измерялось методами проточной цитофлюорометрии. Измерение эффективности нокдауна методом РНК-интерференции на уровне мРНК и белка проводилось по прошествии 48 и 72 часов с момента начала трансфекции, соответственно.

Инфещия клеток ретровирусами

Ретровирусные векторы, кодирующие shARF, были любезно предоставлены др. Хеманом. В качестве клеток-упаковщиков использовали линию клеток эмбриональной почки Феникс (Phoenix, Stanford University). Для инфекции эмбриональные мышиные фибробласты (MEF) обрабатывали вирусными частицами, стабилизированными добавлением полибрена до концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов. Инфекцию повторяли три раза. Селекцию инфицированных клеток проводили в среде, содержащей пуромицин (1,5 мкг/мл) в течение 48 часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Роль p!4/p!9ARF опухолевого супрессора в митохондриалыюм р53-опосредованном пути апоптоза

Опухолевый супрессор р53 играет важную роль в регуляции экспрессии ряда генов и деления клеток (Kruse JP et al., 2009). В ответ на стресс или повреждение ДНК р53 активируется путём фосфорилирования, и активированный белок вызывает либо остановку клеточного цикла и репарацию ДНК, либо апоптоз, в зависимости от величины повреждения (Green DR et al., 2009). Показано, что в ответ на стресс небольшая фракция (около 5%) фосфорилированного р53 транслоцируется в митохондрии, вызывая олигомеризацию белка ВАК (проапоптотический белок семейства BCL2), который в свою очередь индуцирует транспорт цитохрома С из митохондрий в цитоплазму, запуская апоптотическую гибель клетки (Murphy М.Е. et al., 2004). Также известно, что активация таких онкогенов как туе, ras, E2F1, El a, v-abl приводит к активации транскрипционно-независимого р53-опосредованного пути апоптоза (Nemajerova A. et al., 2005). Помимо этого, активация вышеперечисленных онкогенов активирует опухолевый супрессор pl4/pl9ARF (Hemmati P.G. et al., 2002).

Опираясь на эти данные, мы предположили, что активация онкогенов активирует опухолевый супрессор pl4/pl9ARF, который, в свою очередь, может участвовать в активации р53-опосредованного митохондриалыюго пути апоптоза. В ходе эксперимента на примере клеточной линии U20S ARF была проверена стабилизация и транслокация в митохондрии белка р53 в общем клеточном лизате в сравнении с митохондриальной фракцией до и

после активации ARF методом Вестерн блоттинга (Рис.1). В качестве контроля стабилизации и транслокации белка р53 в митохондрии использовался адриамицин (ДНК-повреждающее вещество), который, как было показано ранее, стабилизирует белок р53 и активирует его транслокацию в митохондрии (Mahyar-Roemer М. et al., 2004; Shieh S.Y. et al., 1997). Из клеток выделили митохондриальную фракцию; для сравнения использовали клеточный лизат. В качестве контролей чистоты выделенной митохондриальной фракции использовались митохондриальные белки GRP 75, ВАК и цитохром С (положительные контроли), а также ядерный белок PCNA (отрицательный контроль). По результатам эксперимента было доказано участие pl4/pl9ARF в стабилизации и транслокации р53 в митохондрии. Также было обнаружено потенциирующее действие опухолевого супрессора ARF на адриамицин-опосредованную стабилизацию и транслокацию в митохондрии белка р53. Помимо этого в митохондриальной фракции был обнаружен и сам опухолевый супрессор ARF, что расходится с ранее имеющейся точкой зрения об pl4/pl9ARF как об исключительно ядерном белке (Weber J.D. et al., 1999) (Рис.1).

U2QS ARF Клеточный лизат Митохондриальная

фракция

Доксициклин .+-+ + - +

Дцриамицин ..++ + +

PCNA Bäk р53

ARF

Рис. 1. Определение АИР в митохондриальной фракции клеток остеосаркомы. Количественный анализ содержания белков АРР, р53, РСЫА и Вак в митохондриальной фракции и клеточном лизате клеток 11208 АРР методом Вестерн блоттинга.

Митохондриальная локализация ARF также была подтверждена методом конфокальной микроскопии. На Рис. 2 белок АИР, помеченный зелёным флюорофором, колокализуется с красным митохондриальным маркером. Это является дополнительным доказательством нахождения А11Р

в митохондриях. Ц203 АГ^

Рис. 2. Колокализация опухолевого супрессора АЯР с митохондриальным маркером в клетках остеосаркомы (1/203АР?Р). Конфокальная микроскопия клеток 11203 АРР после индукции АЯР (доксициклин 100 нг/мл) с последующей обработкой клеток анти-АР^ антителами (1), митохондриальным маркером (2) и ядерным маркером (3). 4 - наложение спектров (1,2,3) друг на друга.

Помимо этого, митохондриальная локализация опухолевого супрессора АИР была подтверждена методом иммуно-электронной микроскопии. На представленной электроннограмме (Рис.3) каждая митохондрия содержит 3-4 золотые АЯР-метки, хотя нельзя не отметить, что, как и было показано в предыдущих исследованиях, опухолевый супрессор АИР располагается в основном в ядрышках, и только 5-10% - в митохондриях.

Рис. 3. Иммуноэлетроннограмма митохондриального расположения АИР. Клетки и20Э ARF после индукции АЯР в течение 24 часов (доксициклин 100 нг/мл) обработаны антителами к А13Р с золотыми метками. Контуром выделены участки цитоплазмы, содержащие митохондрии с золотыми метками (1-3) и участок ядра с ядрышком (4).

Следующим этапом нашего исследования было определение конкретного местонахождения АИР в митохондриях. Митохондриальная фракция клеток остеосаркомы (ШОБ АИР) была проинкубирована с возрастающими концентрациями трипсиЕга. В том случае, если белок

располагается на внешней митохондриальной мембране, при инкубации в трипсине по мере увеличения его концентрации уменьшается количество АЯР в митохондриальной фракции, так как трипсин нарушает взаимодействие белка с наружной митохондриальной мембраной, что и было получено в ходе эксперимента (Рис.4).

игОЭ А1ЧР + Доксициклин *

Митохондриальная фракция

Трипсин ; (jg/ml

HSP60

Цитохром С

ARF

Рис. 4. Опухолевый супрессор ARF располагается на внешней митохондриальной мембране. Количественный анализ митохондриальных белков ARF, HSP60 и цитохрома С после инкубации с увеличивающимися концентрациями трипсина (0, 75, 100, 125 и 150 мкг/мл) методом Вестерн блоттинга.

Опухолевый супрессор ARF активирует аутофагию

Полученные нами данные являются убедительным доказательством того, что опухолевый супрессор ARF располагается на внешней митохондриальной мембране. Следующим шагом было выяснение функции опухолевого супрессора ARF в митохондриях. Логично было бы предположить, что ARF может принимать участие в регуляции механизмов запрограммированной клеточной смерти первого типа - апоптоза, поскольку этот белок участвует в регуляции стабильности и активности р53 - важного регулятора апоптоза. Для проверки этой гипотезы было проведено флоуцитометрическое исследование с определением количества апоптотических клеток до и после индукции экспрессии ARF в клетках остеосаркомы (U20S ARF). В результате было получено, что индукция экспрессии белка ARF не принимает участия в активации апоптоза, но способствует деполяризации митохондриальной мембраны (Рис.5). Полученный результат свидетельствует о важной роли опухолевого супрессора ARF в регуляции поддержания гомеостаза в клетках и участии данного белка в апоптоз-независимых молекулярных механизмах гибели клеток.

Измерение апоптоза (Annexin assay) Измерение деполяризации

митохондриальной мембраны

□ Контроль ■ Доксицикгын С9 Дг^иагимцин □ Контроль ■ Доксициклин

*,**-р <0.001 *,**-р< 0.001

Рис. 5. ARF индуцирует деполяризацию митохондриальной мембраны, но не вызывает апоптоз (флоуцитометрический анализ клеток U20S ARF).

Полученные нами данные и недавно опубликованное исследование (Reef S. et al., 2006), в котором была показана роль короткой формы опухолевого супрессора ARF в индукции аутофагии (в короткой форме отсутствуют первые 45 аминокислот, отвечающие за большинство описанных функций ARF), натолкнуло нас на мысль о возможности участия ARF в активации и регуляции аутофагии. Аутофагия - самопереваривание клеточных структур с целью их обновления и получения энергии -используется клетками довольно часто для поддержания гомеостаза в условиях метаболического стресса (Cecconi F et al., 2008). Для проверки нашей гипотезы мы использовали хорошо охарактеризованный в литературе маркер аутофагии — белок LC3, входящий в состав аутофагосомальной мембраны. Во время активации аутофагии происходит протеолитическое расщепление белка LC3, и он ковалентно связывается с фосфатидилэтаноламином, в результате чего повышается скорость его миграции в полиакриламидном геле (Bampton Е.Т. et al., 2005). Аккумуляция расщепленной формы белка LC3 на Вестерн блоттинге говорит об активации процесса аутофагии, что и было получено в клетках остеосаркомы после активации ARF (Рис.бА). Следующим шагом было подтверждение формирования аутофагосом. Для этого клетки остеосаркомы U20S ARF трансфецировали вектором содержащим химерный белок LC3 с GFP (green fluorescent protein). Данный белок при активации аутофагии накапливается в аутофагосомах. Образование аутофагосом можно регистрировать с помощью конфокальной микроскопии. Как видно на Рис. 6Б индукция белка ARF в клетках остеосаркомы способствует накоплению GFP в цитоплазматических вакуолях - аутофагосомах.

^ Эндогенный ЮЗ

Дохсицикпин: Т: 48ч

игоэ игоэ

1_С31 1СЗН

игОБ-АКР

Доксициклин:

Рис. 6. АИР активирует аутофагию. А. Количественный анализ накопления расщепленной формы ЬСЗ в клеточном лизате (11208 АЯР) после индукции экспрессии АГЗР при помощи доксициклина (100 нг/мл, 48ч.). Б. Накопление вРР-1-СЗ в цитоплазматических вакуолях - аутофагосомах - вследствие активации экспрессии АИР при помощи доксициклина (100 нг/мл) через 24 часа (2) и 48 часов (3) по сравнению с контролем (1).

Аутофагосома представляет собой цитоплазматическую двумембранную вакуоль, содержащую часть цитоплазмы и органеллы. Для подтверждения того, что образующиеся цитоплазматические вакуоли являются аутофагосомами, был использован метод электронной микроскопии. На электроннограмме видно, что индукция А11Р активирует формирование вакуолей с двойной мембраной и частью цитоплазмы внутри, что соответствует определению аутофагосомы (Рис.7).

Рис. 7. Индукция АИР активирует формирование аутофагосом. Электронная микроскопия клеток и20Э АРР до (1) и после (2) индукции экспрессии АРР доксициклином (100 нг/мг). Стрелками указаны аутофагосомы.

Далее следовало выяснить, когда и при каких условиях опухолевый супрессор ARF вызывает аутофагию. Из данных литературы известно, что онкогенные транскрипционные факторы Ras и El А повышают экспрессию ARF в эмбриональных мышиных фибробластах (Palmero I. Et al., 2002). Таким образом, можно предположить, что активация данных онкогенов вызывает не только активацию экспрессии ARF, но и способствует активации процесса аутофагии. Для проверки этой гипотезы мышиные эмбриональные фибробласты (MEF) инфицировали ретровирусными векторами, содержащими El А и Ras. Степень активации аутофагии оценивали методом Вестерн блоттинга (детекция накопления ращеплённой формы LC3) и методом электронной микроскопии (детекция аутофагосом). В результате было получено, что инфекция ретровирусами, экспрессирующими онкогены El А и Ras, приводит к повышению экспресии ARF, но не способствует расщеплению LC3 и формированию аутофагосом (Рис.8). В то же время, совместная инфекция El A/Ras при отсутствии в клетках экспрессии р53 вызывала значительное увеличение расщепленной формы LC3 и формирование аутофагосом. По результатам данного эксперимента можно сделать вывод, что ARF вызывает аутофагию при отсутствии экспрессии р53, что свидетельствует о независимости ARF-опосредованной аутофагии от опухолевого супрессора р53 (Рис.8).

12 3 4

Рис. 8. Эндогенный ARF активирует р53-независимую аутофагию. (А) Количественный анализ белков р53, ARF, LC3 и актина в клетках MEF до (1) и после ретровирусной инфекции (2,3,4). (Б) Электронная микроскопия клеток MEF после ретровирусной инфекции с онкогенами Е1 A/Ras (1) или онкогенами E1A/Ras и shp53 (2).

Отсутствие активации аутофагии при индукции онкогенов El А и Ras, с одной стороны, можно объяснить тем, что р53 подавляет ARF-опосредованную аутофагию, а с другой стороны, нельзя исключать

возможности, что уровень экспрессии ARF играет решающую роль при активации аутофагии. По данным эксперимента, в результате инактивации р53 экспрессия ARF увеличивается во много раз больше, чем при инфекции ретровирусами, экспрессирующими онкогены El A/Ras, и именно достижение высокой экспрессии ARF способно активировать аутофагию (Рис.8).

Роль опухолевого супрессора ARF в условиях метаболического стресса

Как известно, процесс аутофагии активируется в условиях метаболического стресса как защитный механизм, в результате которого клетки подвергают деградации внутриклеточные органеллы и (частично) цитоплазму с последующим высвобождением энергии и аминокислот, необходимых для выживания (Cecconi F et al., 2008). Для проверки участия опухолевого супрессора ARF в этих механизмах мы использовали мышиные эмбриональные фибробласты от р53-иокаутных мышей (MEFp53-/-), подвергая их голоданию путем инкубации в солевом буфере Хэнкса (HBSS). Инкубация с HBSS привела к быстрому повышению экспрессии опухолевого супрессора ARF (Рис.9А). Данное повышение экспрессии происходит на посттранскрипционном уровне. Такой же результат наблюдался и при инкубации с HBSS мышиных эмбриональных фибробластов с диким типом р53 (Рис.9Б), хотя и в меньшей степени, поскольку, как уже отмечалось ранее, р53 подавляет экспрессию белка ARF. Несмотря на это, даже при наличии блокирующего действия р53 метаболический стресс способен вызывать активацию экспрессии ARF (рис.9).

A MEFp53-/- Б дтМЕР

HBSS, 0 2 3 4 HBSS 0 2 4

Рис. 9. Повышение экспрессии опухолевого супрессора АРР при метаболическом стрессе. Количественный анализ белка АКР в клетках МЕР р53-/- (А) или дтМЕР (Б) до и после индукции метаболического стресса буфером НВЭЗ (0, 2, 3, и 4 ч.) методом Вестерн блоттинга. В качестве контроля нанесения использовался актин.

Одним из способов изучения роли белков в молекулярных механизмах жизнедеятельности клеток является иигибирование экспрессии интересующего нас белка с использованием механизмов РНК

интерференции. Для подтверждения важной роли экспрессии белка АИР в механизмах аутофагии, его экспрессия была заблокирована при помощи инфекции клеточной линии МЕРр53-/- ретровирусным вектором зИАИР. На рисунке 10А показано, что зЬАИР позволяет специфически заблокировать 90% экспрессии АИР. В результате подавления экспрессии АИР было получено снижение аккумуляции расщепленной формы белка ЬСЗ в ответ на метаболический стресс (инкубация с НВБ8) (Рис. 10А). Помимо аккумуляции маркера аутофагии ЬСЗ, в данных образцах было проверено формирование аутофагосом в ответ на метаболический стресс методом электронной микроскопии (рис.1 ОБ). В результате было получено накопление аутофагосом в контрольных клетках, в то время как в клетках с подавленной экспрессией АИР наблюдалось понижение количества образующихся аутофагосом.

А Б

МЕР р53-/~

МЕР р53-,<-, НЗЗг 2ч

¡8 I тш

с о

е- ь ц. Ж о се

а /шж,

-с х:

НВвБ 2ч

«НОВ ■■и»

—г

шиш 1Ш1ЖИ1111

- актин МЕР рКи-аЬАЯР, Н8БЕ 2ч

♦ЬСЗI * .

- ЮЗ 1!

"Ч

ШЕ

................... ............ *

♦ АКР ' -- ,

Рис. 1 0. Присутствие АКР необходимо для НВЗЭ-опосредованной аутофагии. (А) Количественный анализ белков АКР и ЮЗ в клетках МЕР р53-/- методом Вестерн блоттинга до и после ретровирусной инфекции вектором эЬАКР в условиях голодания. В качестве контроля нанесения использовался актин. (Б) Электронная микроскопия клеток МЕР р53-/- до и после ретровирусной инфекции эИАКР в условиях голодания (инкубация с буфером НВБЭ в течение 2 часов). Стрелками указаны аутофагосомы.

Следует отметить, что метаболический стресс, вызываемый инкубацией клеток в буфере НВЗБ в течение 24 часов, не вызывает гибель контрольных клеток, в то время как чувствительность к действию буфера НВ88 клеток, в которых заблокирован АИР, повышена. Как видно из

графика (рис.11), после 24 часов инкубации с буфером НВЗБ выживают лишь 30% клеток, в которых экспрессия АР11 заблокирована. Полученные результаты свидетельствуют о том, что АИР-опосредованиая аутофагия необходима клеткам для выживания в условиях метаболического стресса.

НВ88, 24ч

I * — -П ^0 4 ® ^

а ^Н Я 24 ч

Л ; \ J ! | _щ

т . | ^НВ ! з ............................

1£> < 1 —1 }.....................X................

о ■__

# МЕР р53 -/-

Рис. 11. Жизнеспособность клеток в условиях метаболического стресса. Одинаковое количество клеток (1*106) МЕРрбЗ-/- и МЕРр53-/-БЬАР?Р инкубировали с буфером ИВБв в течение 24 часов с последующей оценкой их жизнеспособности методом Оиауа \ZiaCount. На графике представлены данные трёх независимых экспериментов ( «*» - р < 0.001).

Опухолевый супрессор АЯР взаимодействует с Вс1-х1 и ингибирует формирование комплекса ВесИп1/Вс1-х1

В ходе предшествующих экспериментов, нами была впервые показана важная роль опухолевого супрессора АЯР в процессе аутофагии, однако молекулярные механизмы, лежащие в основе данного процесса пока остаются загадкой. Следующей задачей нашего исследования стало выяснение этих механизмов. Для этой цели были выявлены белки, которые взаимодействуют с митохондриальной формой АРР. Для этого из клеток остеосаркомы до и после активации экспрессии АИР доксициклином была выделена митохондриальная фракция, из которой при помощи А11Р-специфических антител были иммунопреципитированы белки-интеракторы (т.е. белки предположительно взаимодействующие с опухолевым супрессором АРР). Полученный преципитат вместе с контролем (клетки в которых АИР не индуцировали) был проанализирован двухмерным разностным гель-электрофорезом (2В-ОЮЕ). На рис. 12 представлен гель, на котором красными точками обозначены белки, взаимодействующие с митохондриальной формой АИР. Данные белки впоследствии были идентифицированы при помощи масс-спектрометричсского анализа, который позволил заключить, что митохондриальная форма опухолевого супрессора АЯР взаимодействует с такими белками как Вс1-х1, ОЯР-75, р32.

Взаимодействия между этими белками и опухолевым супрессором АШ^ были независимо подтверждены методом иммунопреципитации с последующей детекцией методом иммунноблоттинга.

U20S-ARF

Рис. 12. Выявление белков, взаимодействующих с митохондриальной формой опухолевого супрессора ARF (красный флюорофор) по сравнению с клетками, не экспрессирующими ARF (зелёный флюорофор), с помощью дифференциального гель-дисплея, общий вид. Белки, взаимодействующие с ARF, обведены белым контуром.

Из списка полученных белков, которые взаимодействуют с митохондриальной формой ARF, только Bcl-xl описан в литературе как важный регулятор молекулярных механизмов аутофагии. Этот антиапоптотический белок семейства BCL2 играет важную роль в процессах ингибирования аутофагии путём взаимодействия с белком Beclinl, который в комплексе с Vps34 непосредственно принимает участие в формировании аутофагосомальной мембраны. Bcl-xl, взаимодействуя с Beclinl, блокирует его функцию (Feng W. et al., 2007). Одним из потенциальных механизмов активации ARF-опосредованной аутофагии может быть взаимодействие с белком Bcl-xl и последующее предотвращение блокирующего действия Bcl-xl на комплекс Beclinl /Vps34, ведущее к реактивации аутофагии. Взаимоотношения между тремя белками и способность их формировать комплексы друг с другом были проверены in vitro, и результат оценен методом Вестерн блоттинга. В результате было найдено, что повышение концентрации 358-меченного Beclin-1 оттитрованного с GST-ARF/Bcl-xl

реакцией связывания, снижает способность АИР взаимодействовать с меченным Вс1-х1, тем самым подтверждая нашу гипотезу о предотвращении ингибирующего действия Вс1-х1 на формирование комплекса ВесНп1/Ур834 (рис.13).

GST-ARF ...........S..

Beclinl: Bel-XL:

вектор

-V-S

Beclinl

Bel-XL

Рис. 13. При увеличении концентрации Beclinl понижается способность GST-ARF взаимодействовать с Bcl-xl in vitro. GST-ARF инкубировали с Замеченным Bcl-xl с увеличивающимися концентрациями 835-меченного Beclinl. После инкубации комплекс Bclxl-ARF был преципитирован, и результат регистрировали при помощи электрофореза (SDS-PAGE). Линия 1 отображает увеличивающиеся концентрации Beclinl. Линия 2 отображает Bcl-xl, взаимодействующий с ARF.

Подавление экспресии ARF ингибирует прогрессию В- и Т-клеточной лимфом

Как отмечалось ранее, у некоторых опухолей повышен уровень экспрессии опухолевого супрессора ARF: например, в 40% случаев В-клеточной лимфомы, при меланоме и др. (Eischen С.M. et al., 1999; Basso К. et al., 2005). Почему некоторые опухоли экспрессируют в большом количестве опухолевый супрессор, который должен предотвращать развитие опухоли? Мы предположили, что ARF может выступать в роли опухолевого супрессора для одних опухолей и способствовать выживанию других. Нельзя исключать возможности, что в основе данного различия лежат ARF-опосредованные молекулярные механизмы аутофагии. Для подтверждения физиологической значимости ARF-опосредованного механизма активации аутофагии в процессах онкогенеза, мы подавили экспрессию ARF в клетках В-клеточной лимфомы от E|i-myc трансгенных мышей с мутацией в гене р53 (В2998), так как именно лимфомы гиперэкспрессируют ARF в 40% случаев. Изначально данная клеточная линия экспрессировала высокий уровень ARF, скорее всего благодаря мутации в гене р53. Клетки В2998 инфицировали двумя разными ретровирусным векторами (shARF157 и shARF56). И в том и другом случае, как видно на Рис. 14Б, в ходе инфекции экспрессия ARF была

подавлена на 99%. Затем те же клетки были инфицированы ретровирусным люцефиразным вектором. Полученные клеточные линии при помощи внутривенной инъекции были имплантированы в венозный кровоток иммунокомпрометированных мышей (8СШ). Результат оценивали через 7 дней после имплантации опухолевых клеток в организм мыши и подтверждали через 14 дней. Как видно на Рис. 14А, подавление экспрессии АИР в клетках лимфомы способствовало ограничению опухолевого роста, что доказывает необходимость экспрессии данного белка для развития лимфомы. Идентичные результаты были получены на примерах В-клеточной лимфомы ЕЗЗО и Т-клеточной лифомы.

г-

ю (О

V ю

и. и.

а: 0!

< <

■С х:

(Л 1/5

р16

АЯЯ

актин

В2998 лимфома

Рис. 14. Подавление экспрессии АРР приводит к супрессии опухолевого роста В-клеточной лимфомы. (А) Биолюминисцентное изображение ксенографных В-клеточных лимфом после инфекции клеток лимфомы (В2998) с ретровирусом, экспрессирующим 5ЬАР?Р157, эИАКРбб или контрольным ретровирусным вектором. Изображение ксенографных опухолей на 7 день после в/в имплантации полученных в ходе инфекции клеток. (Б) Количественный анализ содержания белков АКР, р16 и актина в клетках В-клеточной лимфомы через 48 часов после ретровирусной инфекции методом Вестерн блоттинга.

В качестве ещё одного примера роли АКТ-опосредованной аутофагии в канцерогенезе была выбрана клеточная линия саркомы, полученная из опухоли мышей р53-/-. Так же, как и в предыдущих экспериментах, была подавлена экспрессия АИР, и полученная клеточная линия вместе с контрольной клеточной линией была имплантирована подкожно иммунокомпрометированным мышам (БСЮ). Результат эксперимента

оценивали биолюминисцентным методом. В ходе эксперимента наблюдали, что саркома с подавленной экспрессией АИР развивается быстрее, чем саркома с ненарушенной экспрессией АЯР (рис.15). Полученные данные подтверждают нашу гипотезу, что не все опухоли для развития и прогрессии нуждаются в АКР-опосредованной аутофагии.

Контроль shAHF

Рис. 15. Подавление экспрессии ARF способствует быстрому росту и прогрессии сарком. (А) Биолюминисцентное изображение ксенографных сарком после инфекции клеток остеосаркомы (р53-/-) с ретровирусом, экспрессирующим shARF, или контрольным ретровирусным вектором. Изображение ксенографных опухолей на 21 день после подкожной имплантации. (Б) Количественный анализ содержания белков ARF, LC3 и актина в клетках остеосаркомы через 48 часов после ретровирусной инфекции методом Вестерн блоттинга. (С) Масса ксенографных опухолей. На графике представлены данные трёх независимых экспериментов по 5 мышей на образец («*» - р < 0.008).

Таким образом, полученный результат свидетельствует о том, что ARF -белок с противоположно направленными функциями. При развитии одних опухолей - таких, как саркомы - он выступает в роли опухолевого супрессора, и повышение его экспрессии сдерживает опухолевую прогрессию. Для других опухолей - таких, как Т- и B-клеточные лимфомы - повышение экспрессии ARF и ARF-опосредованной аутофагии способствует развитию опухоли. В будущем выявление опухолей чувствительных к ARF-опосредованной аутофагии и возможность её блокирования хорошо изученными препаратами (хлорохин) может быть одним из потенциальных и очень эффективных

способов терапии новообразований.

ВЫВОДЫ

1. ARF способствует стабилизации и транслокации р53 в митохондрии. Опухолевый супрессор ARF располагается в митохондриях.

2. Митохондриальная форма ARF не принимает участия в регуляции молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток первого типа (апоптоза), но способствует деполяризации митохондриалыюй мембраны и активации молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток второго типа (аутофагии).

3. Метаболический стресс повышает экспрессию ARF и активирует аутофагию. Ингибирование ARF-опосредованной аутофагии путём блокирования экспрессии ARF снижает жизнеспособность клеток в условиях метаболического стресса.

4. Митохондриальная форма ARF взаимодействует с Bcl-xl, тем самым предотвращая его ингибирующую активность на образование комплекса Beclinl/VPS34. Полученное взаимодействие является одним из звеньев молекулярного механизма ARF-опосредованной аутофагии.

5. Подавление экспрессии ARF повышает чувствительность опухолевых клеток к метаболическому стрессу.

6. Подавление экспрессии ARF и ARF-опосредованной аутофагии приостанавливает прогрессию Т и В-клеточных лимфом, но не сарком. Полученный результат говорит о неоднозначной роли белка ARF в механизмах канцерогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пимкина Ю.С., Доросевич А.Е. Роль опухолевого супрессора ARF в онкогенезе//Архив патологии.- 2009.- Т. 71.—№.1- С. 60-63.

2. Пимкина Ю.С., Доросевич А.Е., Мёрфи М.Е. Влияние Bcl-xl на стабилизацию р53 и его роль в митохондриалыюм механизме апоптоза II Высокие технологии в морфологии, их значение в клинике и перспективы внедрения в практическое здравоохранение- Минск, 2006,- С. 55-57.

3. Pimkina J., Murphy М.Е. ARF, autophagy and tumor suppression // Autophagy.- 2009.- V. 5 - N. 3,- P. 397-399.

4. Pimkina J., Humbey O., Zilfou J.T., Jarnik M., Murphy M.E. (2008) ARF induces autophagy by virtue of Interaction with Bcl-xl // Journal of Biological Chemistry.- 2009,- N. 284V.5.- P. 2803-2810.

5. Humbey O., Pimkina J., Zilfou J.T., Jarnik M., Dominguez-Brauer C., Burgess D., Murphy M.E. The ART tumor suppressor can promote the progression of some tumors // Cancer Research- 2008 - N. 68. V.23 - P. 9608-9613.

6. Pimkina J., Humbey O., Newman K., Murphy M. The tumor suppressor pl4/pl9-ARF localizes to mitochondria and induces autophagy // Abstracts of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research-Los Angeles, 2007.

7. Humbey O., Pimkina J., Zilfou J., Jarnik M., Murphy M. Tumor suppression by pl4ARF and autophagy // Abstracts of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research- San Diego, 2008.

8. Pimkina J., Humbey O., Zilfou J., Jarnik M., Murphy M. The ARF tumor suppressor induces autophagy // Abstracts of the 13 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference - Philadelphia, 2008.

9. Humbey O., Pimkina J., Newman K., Murphy M. The tumor suppressor pl4/pl9-ARF localizes to mitochondria and induces autophagy // Abstracts of the 12 Annual Postdoctoral & Graduate Student ConferencePhiladelphia, 2007.

10. Humbey O., Pimkina J., Newman K., Murphy M. ARF tumor suppressor relocalizes and induces p53 translocation to the mitochondria // Abstracts of the 11 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference - Philadelphia, 2006.

Пимкина Юлия Сергеевна Роль опухолевого супрессора АИР в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии. Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата мед. наук.

Подписано в печать 18.09.2009 г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная № 1. Печать офсетная Объем 1 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 9103.

Отпечатано ОАО «Смоленская городская типография», 214000, г. Смоленск, ул. Маршала Жукова, 16, тел.: 59-99-07, 38-28-65, 38-14-53.

Оглавление диссертации Пимкина, Юлия Сергеевна :: 2009 :: Санкт-Петербург

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Молекулярные механизмы действия опухолевого супрессора ARF.

1.1.1 Роль онкогенов и опухолевых супрессоров в патогенезе новообразований.

1.1.2 Опухолевый супрессор р 14/р 19ARF и его функции.

1.1.3 Регуляция стабильности опухолевого супрессора р53.

1.1.4 Влияние ARF на процессинг рРНК.

1.1.5 Взаимодействие ARF и белков семьи BCL2.

1.1.6 Роль короткой митохондриальной формы р 19ARF в аутофагии.

1.1.7 Спектр опухолей, вызываемых инактивацией опухолевого супрессора ARF.

1.2 Аутофагия и её роль в канцерогенезе.

1.2.1 Аутофагия и её функции.

1.2.2 Вакуолярные изменения при аутофагии.

1.2.3 Регуляция аутофагии.

1.2.4 Семейство белков BCL-2 и регуляция аутофагии.

1.2.5 Аутофагия и программируемая клеточная смерть.

1.2.6 Аутофагия и канцерогенез.

1.2.7 Методы измерения аутофагии в клетках животных

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Культивирование клеток.

2.2 Трансформация химически компетентных клеток Е. coli XLBlue.".;.

2.3 Выделение плазмид в препаративном формате.

2.4 Трансфекция клеток плазмидами.:.

2.5 Выделение митохондрий.

2.6 Иммуноблотинг.

2.7 Йммунопреципитация

2.8 Иммуноцитофлюоресцентный анализ .'.'.49'

2.9 Флоуцитометрический анализ (TUNEL-assay + Annexin).

2.10 Трансмиссионная электронная микроскопия.

2.11 ПЦР в реальном времени.:.

2.12 РНК-интерференция.

2.13 Инфекция клеток ретровирусами.

2.14 Двухмерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE).

2.15 Измерение деградации долгоживущих белков.

2.16 Методы статистического анализа.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Роль pl4/pl9ARF опухолевого супрессора в митохондриальном р53 опосредованном пути апоитоза.

3.2 Опухолевый супрёссор ARF активирует аутофагию.

3.3 Роль опухолевого супрессора ARF в условиях метаболического стресса.

3.4 Опухолевый супрессор ARF взаимодействует с BCL-XL и ингибирует формирование комплекса Beclin/Bclxl.

3.5 Влияние статуса ARF на чувствительность опухолей к ингибированию аутофагии.

3.6 Подавление экспресии ARF ингибирует прогрессию В- и Т-клеточной лимфом.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Пимкина, Юлия Сергеевна, автореферат

Актуальность темы:

Количество онкологических заболеваний в последнее время неуклонно растёт. Изучение механизмов лежащих в основе развития опухоли — залог успеха в разработке новых методов диагностики и лечения. Важную роль в патогенезе новообразований играет активация протоонкогенов и нарушение функций опухолевых супрессоров [7]. Поэтому детальное изучение механизмов действия как протоонкогенов, так и опухолевых супрессоров является актуальной задачей.

Локус INK4a/ARF, кодирующий опухолевый супрессор. ARF — второй по* частоте мутаций локус опухолевого супрессора после р53 при развитии новообразований, что, говорит о • его важнрй роли в механизмах канцерогенеза [173,175]. К настоящему моменту хорошо изучены р53-зависимые функции ARF, которые включают участие в процессах стабилизации р53, приводящих к остановке клеточного цикла и запрограммированной гибели клетки. Однако р53-независимые функции белка ARF остаются, малоизученными. В последнее время было показано, что опухолевый супрессор ARF независимо от р53 участвует в образовании комплексов с белками регулирующими клеточную пролиферацию: нуклеофосмином, c-myc, E2F-1, DPI, FoxMl, HIFla [175]. Таким образом,

I i . , . I все ранее описанные функции белка ARF так или иначе связаны с i I j подавлением клеточного роста. Если это так, то почему экспрессия ARF повышается при развитии многих новообразований,' как то: в 50% случаев лимфом Беркита [22,50], в 30% случаев аденокарциномы яичников [73] и молочной железы [192]. Это парадоксальное явление может объяснятся тем,

• it I * I. I • • что помимо супрессирующих функций, ARF играет и промотирующую роль в развитии некоторых опухолей, однако данная гипотеза требует экспериментального подтверждения.

В' литературе имеются данные об укороченной форме ARF, которая располагается в митохондриях и активирует аутофагию, хотя механизмов, при помощи которых происходит активация аутофагии и роль полноценного опухолевого супрессора ARF в процессе аутофагии, изучено не было [157]1 Необходимость изучения роли- полноценного белка ARF в молекулярных механизмах активации аутофагии^ объясняется важной ролью данного процесса в механизмах канцерогенеза.

Аутофагия - это эволюционно консервативный механизм самопереваривания повреждённых белков и органел и1 высвобождения^ энергии и аминокислот, при помощи, которого поддерживается гомеостаз.

I * *

Однако нельзя не отметить.противоречивость литературных данных о роли аутофагии в канцерогенезе. ,G одной стороны, гетерозиготные мыши, у которых инактивирован один аллель Beclinl - один из главных регуляторов, молекулярных^ механизмов аутофагии - склонны к развитию опухолей. С другой стороны, в генах отвечающих за регуляцию аутофагии всегда удалён только один аллель. Данный факт. может свидетельствовать о том,' что на первоначальных этапах развития опухоли аутофагия является сдерживающим механизмом, а при уже развившейся опухоли базовый уровень аутофагии необходим для её выживания в условиях метаболического стресса. Очевидно, данная гипотеза требует дальнейшего изучения и подтверждения.

С практической точки зрения понимание молекулярных механизмов активации аутофагии и механизмов регуляции данного процесса может послужить основой для разработки целенаправленных и эффективных j методов лечения новообразований. ч I • . г i t * 1 J ' ' • '

В задачи настоящего исследования входило:

• Изучить влияние оказываемое опухолевым супрессором ARF на транспорт р53 в митохондрии.

• Определить клеточную локализацию опухолевого супрессора ARF.

• Оценить роль митохондриальной формы ARF в регуляции молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток первого и второго типа. . ,

• Изучить роль ARF в молекулярных механизмах аутофагии в условиях метаболического стресса.

• Изучить молекулярный механизм ARF-опосредованной аутофагии .

• Оценить чувствительность опухолевых клеток к метаболическому стрессу при отсутствии экспрессии ARF.

Научная новизна,и практическая значимость работы

В данной работе описан новый молекулярный механизм активации аутофагии, опосредованный, увеличением экспрессии ARF. Впервые показана неоднозначная роль белка ARF в канцерогенезе. До сих пор считалось, что ARF является опухолевым супрессором, и что его активация способствует подавлению опухолевого роста. Нами впервые показано, что эта точка зрения справедлива не для всех опухолей. Впервые установлена промотирующая роль ARF в развитии Т и В-клеточных лимфом.

С практической; точки зрения понимание молекулярных механизмов ARF-опосредованной аутофагии и: исследование чувствительности опухолей к подавлению (изученных механизмов может быть использовано для лечения новообразований. Ингибирование аутофагии в чувствительных новообразованияхуже существующими и хорошо изученными препаратами, такими, как хлорохин и 3-МА, может быть одним из потенциальных и очень эффективных способов терапии.

Внедрение результатов исследования;

Основные положения; диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе, а* также в лекционном курсе и на практических занятиях' на кафедрах патологической! анатомии, и медицинской биологии Смоленской тосударствённоЙ5меда

Апробация работы ,

Основные положения диссертации доложены и обсуждены наг заседаниях проблемной комиссии «Иммунология, иммунопатофизиология, иммунопатоморфология» Смоленской государственной^ медицинской: академии (2006-2009); доложены на международных конференциях: «Международная конференция патологоанатомов» (Минск, Беларусия, 2006), «11 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2006); «98vAnnual! Meeting; of the American Association for Cancer Research» (JIoc Анжелес, США, 2007), «12. Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2007), «99 Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» ( Сан Диего, США, 2008), «13 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2008).

Положения, выносимые на защиту:

2. Механизм активации ARF-опосредованной аутофагии основан на взаимодействии с антиапоптотическим белком семейства BCL2 - Bcl-xl.

3. Подавление экспрессии ARF и ARF-опосредованной аутофагии ингибирует прогрессию Т- и В-клеточных лимфом, что говорит о повышенной чувствительности данных опухолей к блокированию аутофагии.

Заключение диссертационного исследования на тему "Роль опухолевого супрессора ARF в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии"

выводы

2. Митохондриальная форма ARF не принимает участия в регуляции молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток первого типа (апоптоза), но способствует деполяризации митохондриальной мембраны и активации молекулярных механизмов запрограммированной/ибели клеток второго типа (аутофагии).

4. Митохондриальная форма ARF взаимодействует с белком Bcl-xl, тем самым предотвращая его ингибирующую активность на образование комплекса Beclinl/VPS34. Полученное взаимодействие является одним из звеньев молекулярного механизма ARF-опосредованной аутофагии.

5. Подавление экспрессии ARF повышает чувствительность опухолевых клеток к метаболическому стрессу.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Пимкина, Юлия Сергеевна

1. Балушкина Н.Н. Хасан Хамад Али, Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза //Вопр. биол. мед. фарм. химии. — 1998. - №4. - С.15-23.

2. Балушкина Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза //Арх. Пат.- 2001.- №1.- С. 51-60.

3. Глазунова В.А., Штиль А.А. Митохондриальные механизмы апоптоза в ответ на повреждение ДНК // Молекулярная биомедицина.- 2008.- №5.- С. 765-71.

4. Глухова Е.И., Лукашина М.И., Богатырёв Б.Н. и др. Экспрессия белков,контролирующих апоптоз, и индекс ДНК опухолевых клеток рака молочной, > > j ■ ' < железы // Российский Биотерапевтический Журнал.- 2002.- Т.1, №3.- С. 1521.

5. Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., Бондаренко О.Ю. и др. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени // Российский журнал гастроэнтерологии,гепатологии,колопроктологии.-2002.- №6.- С. 38-43.

6. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Фундаментальная онкология: наиболее примечательные события 2004 года // Практическая онкология.- 2005.- Т.6, №1.-С. 1-5.

7. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. — Т. 65, вып. 1.-С. 5-33. 1 1 !

8. Копнин Б.П. Неопластическая клетка: основные свойства и механизмы их возникновения // Практическая онкология. 2002. - Т. 3, №4. - С. 229-235.

9. Пупышев А.Б. Лизосомы человека: библиометрическая оценкаактуальных направлений исследований // Бюллетень СО РАМН.- 2006.1..; 1 ' ) 1 !1.-С. 106-116.

10. Ю.Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н. Апоптоз основные механизмы развития, и роль в онкологической практике // Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина.-Казань, 2000.- С. 250-266.

11. П.Семеняк, О.Ю., Чумаков П.М., Копнин Б.П. Влияние различных мутантных р53 на чувствительность клеток к цитостатикам //Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины.- 1999.- №3.- С.

12. Туровец' Н.А., Чумаков П.М., Копнин Б.П.Влияние инактивации различных компонентов сигнальных путей опухолевого супрессора р53 на стабильность генома//Генетика.- 1999.- Т. 35, №12.- С. 1651-8.I

13. Межклеточные взаимодействия // Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин

14. С.Е. Москва. - Медицина.- 2003.1 1

15. Abedin, M.J., Wang, D., McDonnell, M.A., et al. Autophagy Delays Apoptotic

16. Death in Breast Cancer. Cells Following-DNA Damage // CelLDeath Differ.-Vol.14.- 2007.- P.500-510;

17. Abida, W.M.,Gu, W. P53-Dependent and P53-Independent Activation of

18. Autophagy by Arf// Cancer Res.- Vol.68.- 2008.- P.352-357.

19. Aita, VJVP., .Liang,/Х.Н., Murty, .V.V., ,et al. Cloning and Genomic

20. Organization of Beclin 1, a Candidate Tumor Suppressor Gene on Chromosome 17q21 // Genomics.- Vol.59:- 1999.- P.59-65.

21. Akar, U., Ghaves-Reyez, A., Barria, Mi, et al. Silencing of Bcl-2 Expressionby Small Interfering Rna Induces Autophagic Cell Death in Mcf-7 Breast Cancer Cells //'Autophagy.- Vol.4.- 2008.- P.669-679.

22. Alevizopoulos, K., Vlach, J!, Hennecke, S., et al. Cyclin E and C-Myc

23. Promote Cell Proliferation in the Presence of P16ink4a and of Hypophosphorylated Retinoblastoma Family Proteins // Embo J.- Vol.16.1997.-P.5322-5333. ■ ' • •i

24. Amaravadi, R.K., Yu, Di, Lum, J.J., et al. Autophagy Inhibition Enhances

25. Therapy-Induced Apoptosis1 in a Myc-Induced Model of Lymphoma // J Clin Invest.- Vol.117.- 2007.- P.326-336.

26. Arico, S., Petiot,' A., Bauvy; C., et al. The Tumor Suppressor Pten Positively

27. Regulates Macroautophagy by' Inhibiting the Phosphatidylinositol 3

28. Kinase/Protein Kinase В Pathway // J Biol Chem.- Vol.276.-" 2001.-P.35243-35246.

29. Ayrault, O., Andrique, L., Fauvin, D:, et al. Human Tumor Suppressor PI4arf

30. Negatively Regulates Rrna. Transcription and; Inhibits UbfT Transcription Factor Phosphorylation // Oncogene.- Vol.25:- 2006:- P:7577-7586;

31. Basso; K., Margolin, A.A., Stolovitzky, G., et al. Reverse Engineering of

32. Regulatory Networks in Human В Cells // Nat Genet.- Vol.37:-.2005.-P3 82-390.

33. Bertwistle, D., Sugimoto, M.,Sherr, C.J. Physical and Functional Interactionsof the Arf Tumor Suppressor Protein with.Nucleophosmin/B23 // Mol Cell Biol.- Vol.24.- 2004.- P.985-996.

34. Biederbick, A., Kern, I-I.F.,Elsasser, H.P. Monodansylcadaverine (Mdc) Is a

35. Specific in. Vivo .Marker for Autophagic Vacuoles- // Eur J Cell Biol-Vol.66.- 1995.- P;3-14: ; ' '

36. Blais, A.,Dynlacht, B:D. E2f-Associated Chromatin Modifiers and Cell Cycle

37. ControlT/ Curr Opin ёеШЙю1.- Vol;l9i- 2007.- РГ658-662:26; Blankson; H., Holen,, I.,Seglen,. P:0. Disruption of the Cytokeratin Cytoskeleton and Inhibition of Hepatocytic Autophagy by Okadaic Acid.// Exp Cell Res.- Vol.218.- 1995:- Р^г^^ЗО. :

38. Blommaart, E.F., Krause, U., Schellens, J.P., et al. The Phosphatidylinositol 3

39. Kinase Inhibitors Wortmannin and Ly294002 Inhibit Autophagy in Isolated Rat Hepatocytes;//;Eur J Biochem:-^Уо1Ц43-- 1997:-P:240^246i,

40. Blume-Jensen, P;,Hunter, . T. Oncogenic Kinase Signalling // Nature:1. Vol.411,- 2001 P.355-365.29: Botti, J., Djavaheri-Mergny, M., Pilatte, Y., et al. Autophagy Signaling and the Cogwheels of Cancer//Autophagy.-Vol.2.-2006.-P:67-73;

41. Bracken, A.P., Ciro, M., Cocito, A-, et al. E2f Target Genes: Unraveling the

42. Biology II Trends Biochem Sci;- Vol.29.- 2004.-P.409-417.

43. Bursch, W., Ellinger, A., Kienzl, H., et al. Active Cell Death Induced by the

44. Anti-Estrogens Tamoxifen and Ici 164 384 in Human Mammary Carcinoma Cells (Mcf-7) in Culture; The Role of Autophagy // Carcinogenesis.-Vobl 7.- 1996.->: 1595-1607. .

45. Campbell- S.L., Khosravi-Far, R., Rossman; K.b., et all Increasing Complexityof Ras Signaling // Oncogene.- Vol. 17.- 1998.-РЛ395-1413.

46. Carew, J.S., Nawrocki, S.T., Kahue, C.N., et al; Targeting Autophagy

47. Augments the Anticancer Activity of the Histone Deacetylase Inhibitor Saha to Overcome Bcr-Abl-Mediated Drug Resistance // Blood.- Vol.110.- 2007:-P.313-322.

48. Oarnero, A., Hudson; J.D., Price, C.M., et al. P16ink4a and P19arf Act in

49. Daido, S., Kanzawa, Т.; jVamamoto; A., et al; Pivotal Role of the Cell Death

50. Factor Bnip3 in Ceramide-Induced Autophagic Cell Death in- Malignant Glioma Cells /AGancer Res.- VoH64.- 2004 P.4286-4293;

51. Degenhardt, K., Mathevv, R., Beaudoin, В., et al. Autophagy Promotes Tumor

52. Cell Survival and: Restricts Necrosis, Inflammation, andt Tumorigenesis // Cancer Cell.- Vol.10.- 2006.- P.51-64.

53. Dickins, R.A., Hemann, M.T., Zilfou, J.T., et al. Probing Tumor Phenotypes

54. Dunn, W.A., Jr., Cregg, ,J.M., Kiel, J.A., et al. Pexophagy: The Selective

55. Autophagy of Peroxisomes // Autophagy.- Vol.1.- 2005.- P.75-83.50: Eischen, С.М*, Weber, J.D:, Roussel; M.F., et al. Disruption of the Arf-Mdm2-P53 Tumor Suppressor Pathway in Myc-Induced Lymphomagenesis // Genes Dev.- Vol.13.- 1999.- P:2658-2669.

56. Elmore, S.P., Qian, Т., Grissom, S.F., et al. The Mitochondrial Permeability

57. Transition Initiates Autophagy in Rat Hepatocytes // Faseb J.- Vol; 15:2001.- P.2286-2287.

58. Erlich, S., Mizrachy, L., Segev, O., et al. Differential Interactions between

59. Beclin 1 and Bcl-2 Family Members // Autophagy.- Vol.3.- 2007.- P.561-568;

60. Eymin, В., Claverie, P:, Salon- C., et al: PI4arf Triggers G2 Arrest through

61. Fimia,. G.M., Stbykoyaj, A., Romagnoli:, A., et: al: Ambral Regulates

62. Autophagy and Development of the Nervous System // Nature.- Vol.447.-2007.-P. 1121-1125. : •

63. Gil, J.,Peters, G; Regulation of the Ink4b-Arf-Ink4a Tumour Suppressor1.cus: All for One or'One for All // Nait Rev Mol Cell Biol.- Vol.7.- 2006.-P.667-677. ' 1 ; ; ' "

64. Giorgi, C., Romagnoli, A., Pinton, P., et al. Ca2-f Signaling, Mitochondria-and

65. Cell Death // Cuit M61 Medi- Vol.8b 2008:- P:119-130:

66. Gjerset, R.A.,Bandyopadhyay, K. Regulation of PI4arf through Subnuclear

67. Compartmentalization // Cell Cycle.- Vol.5.- 2006 P.686-690:i '■'. I : • • . .

68. Goldberg, A.L. Protein Degradation and Protection against Misfolded or

69. Damaged Proteins//Nature.-Vol.426.-2003.-P.895-899.

70. Gonzalez-Polo, R.A., Boya, P., Pauleau, A.L., et ah The Apoptosis/Autophagy

71. Paradox: Autophagic Vacuolization before Apoptotic. Death // J Gell Sci.-Vol. 118.- 2005.- P.3091 -3102.

72. Gozuacik, D.,Kimchi, A. Autophagy as a Gell Death and Tumor Suppressor

73. Mechanism // Oncogene.- Vol.23.- 2004,- P.2891-2906.

74. Green, D;R. Apoptotic Pathways: The Roads to Ruin // Cell.- Vol.94.- 1998;1. P.695-698.

75. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B;, et ah Nucleophosmin and; Cancer//Nat

76. Rev Cancer.-Voh6:-2006.-P:493-505:

77. Gross, A., McDonnell, J.M.,Korsmeyer, S.J. Bcl-2 Family Members and the

78. Hariri, M;, Millane, G., Guimorid;. M.P., et ah Biogenesis of Multilamellar

79. Bodies Via Autophagy // Mpl Bipl Cell:- УрГ.11.- 2000.- Р;255-268:

80. Ilemmati, P.G., Gillissen; B;, von? Haefen; C., et ah Adenovirus-Mediated

81. Hollstein, M., Rice, K., Greenblatt, M.S., et ah.Database of P53 Gene Somatic Mutationsin Human Tumors andiGell Eines // Nucleic Acids Res.- Vol.22.-1994.-P3551-3555. 7 . : : : '

82. Holm, T.M., Braun, A., Trigatti, B.L., et al. Failure of Red Blood Cell

83. Maturation in Mice with Defects in the High-Density Lipoprotein Receptor Sr-Bi //Blood.- Vol.99.- 2002.- P. 1817-1824.

84. Honda, R.,Yasuda, H. Association of P19(Arf) with Mdm2 Inhibits Ubiquitin1.gase Activity of Mdm2 for Tumor Suppressor P53 // Embo J.- Vol.18.-1999.- P.22-27.

85. Houri, J.J., Ogier-Denis, E., De Stefanis, D., et al. Differentiation-Dependent

86. Autophagy Controls the Fate of Newly Synthesized N-Linked Glycoproteins in the Colon Adenocarcinoma Ht-29 Cell Line // Biochem J.-Vol.309 (Pt 2).- 1995.- P.521-527.

87. Hoyer-Hansen, M., Bastholm, L., Szyniarowski, P., et al. Control of

88. Macroautophagy by Calcium, Calmodulin-Dependent Kinase Kinase-Beta, and Bcl-2 // Mol Cell.- Vol.25.- 2007.- P.193-205.• i , \ I ( , 'i

89. Humbey, O.,' Pimkina,'J., Zilfou, J.T., et al. The Arf Tumor Suppressor Can

90. Promote" tlie Progression of Some Tumors // Cancer Res.- Vol.68.- 2008.-P.9608-9613: 4 '

91. Iiboshi, Y., Papst, P.J., Kawasome,' H., et al. Amino Acid-Dependent Controlof P70(S6k). Involvement of Trna Aminoacylation in the Regulation' // J Biol Chem.- Vol.274.- 1999.- P.1092-1099.

92. Ishihara, N., Hamasaki,' M:, Yokota, S., et al. Autophagosome Requires

93. Specific Early Sec Proteins for'Its Formation and Nsf/Snare for Vacuolar Fusion //Mol Biol Cell.- Vol.12.- 2001.- P.3690-3702.

94. Itahana, K., Bhat, K.P., Jin, A., et al. Tumor Suppressor Arf Degrades B23, a

95. Nucleolar Protein Involved in Ribosome Biogenesis and Cell Proliferation // Mol Cell.- Vol.l2'.-'2003.- P.ll'51-1164.

96. Jacks, Т., Remington, L., Williams, B.O., et al. Tumor Spectrum Analysis in

97. P53-Mutant Mice // Curr Biol'.- Vol.4.- 1994.- P.l-7. .

98. Jin, S.,White, E. Tumor Suppression by Autophagy through the Managementof Metabolic Stress // Autophagy.- Vol.4.- 2008.- P.563-566.

99. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno,, Т., et al. Lc3, a Mammalian Homologue of

100. Yeast Apg8p, Is Localized in Autophagosome Membranes after Processing

101. Embo J.- Vol. 19.- 2000.- P.5720-5728.i k ,

102. Kamijo, Т., Bodner, S., van de Kamp, E., et al. Tumor Spectrum in Arf

103. Deficient Mice // Cancer Res.'- Vol.59.- 1999.- P.2217-2222.

104. Kamijo, Т., Weber, J.D., Zambetti, G., et al. Functional and Physical1.teractions of the. Arf Tumor Suppressor with P53 and Mdm2 // Proc Natl Acad Sci US A.- Vql.95!r 1998,- P.8292-8297.

105. Kamijo, Т., Zindy, F., Roussel, M.F., et al. Tumor Suppression at the Mouse Ink4a Locus Mediated by the Alternative Reading Frame Product P19arf //i i

106. Cell.-Vol.91.- 1997.-Р.649-659:

107. Karantza-Wadsworth, V., Patel, S., Kravchuk, O., et al. Autophagy Mitigates.

108. Metabolic Stress and Genome Damage in Mammary Tumorigenesis // Genes Dev.- Vol.21.- 2007.- P.1621-1635.

109. Kerr, J.F., Wyllie, A.H.,Gurrie, A.R. Apoptosis: A Basic Biological

110. Phenomenon with Wide-Ranging Implications in Tissue Kinetics // Br J Cancer.- Vol.26.- 1972.- P.239-257.

111. Khan, S.H., Moritsugu, J.,Wahl, G.M. Differential. Requirement for P19arf inthe P53-Dependent Arrest Induced by DNA Damage,. Microtubule Disruption, and Ribonucleotide Depletion: // Proc Natl Acad Sci U S A.-Vol.97.- 2000.- P.3266-3271.

112. Kim, J., Huang, W.P., Stromhaug, P.E.,. et: al; Convergence of Multiple

113. Klionsky, DJ. Tlie Correct Way to Monitor Autophagy in Higher Eukaryotes

114. Autophagy.-.VoU:-2005:-P.65:'

115. Klionsky, D.J., Cueva, R.,Yaver, D.S. Aminopeptidase I of Saccharomyces

116. Korgaonkar; C., Zhao, L., Modestou, M:, et al; Arf Function Does Not Require P53 Stabilization or Mdm2 Relocalization // Mol Cell Biol.-Vol:22:-2002.-Pri96-206:;" ■" Г

117. Kroemer, G.,. Galluzzi, L., ■ Vandenabeele, P., et al. Classification of Cell

118. Death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell; Death 2009 // Cell Death Differ.- Vol. 16:- 2009.- P.3-11.

119. Kroemer, G.,Jaattela, M. Lysosomes and Autophagy in Cell Death Control //

120. Nat Rev Cancer.-'VoL5.^'2005.-P.886-897.

121. Kruse, J.P.,Gu, W. Modes of P53 Regulation // Cell.- Vol.137.- 2009.- P.609622.

122. Kuo, M.L., den Besten, W., Bertwistle, D., et al. N-Terminal Polyubiquitination and Degradation of the Arf Tumor Suppressor // Genes Dev.- Vol.18.- 2004.- P. 1862-1874.

123. Lawrence, В .P., Brown, W.J. Autophagic Vacuoles Rapidly Fuse' with Pre

124. Existing Lysosomes in Cultured Hepatocytes // J Cell Sci.- Vol.102 ( Pt 3).-1992.- P.515-526.

125. Lee, C., Smith,- B.A., Bandyopadhyay, K., et al. DNA Damage Disrupts the

126. P14arf-B23(NucIeophosmin) Interaction and Triggers a Transient Subnuclear Redistribution of P14arf// Cancer Res.- Vol.65.- 2005.- P.9834-9842.

127. Levine, B.,Klionsky,; DJ. Development by Self-Digestion: Molecular Mechanisms and Biological Functions of Autophagy // Dev Cell.- Vol.6.2004.- P.463-477.

128. Levine, B.,Kroemer, G. Autophagy in 'the Pathogenesis of Disease // Cell.1. Vol.1321- 2008,- P.27-42.f \ * , i » ♦ « i « < . 4 ^ .

129. Liang, C., Feng, P., Ku, В., et al. Autophagic and-Tumour Suppressor Activity of a Novel Beclinl-Binding Protein Uvrag // Nat Cell Biol.- Vol.8.-2006.-P.688-699.' : ' ''

130. Liang, X.H., Jackson, S., ,Seaman, M., et al. Induction of Autophagy and1.hibition of Tumorigenesis by Beclin 1 // Nature.- Vol.402.- 1999.- P:672-676. ' . '

131. Lin, W.C., Lin, F.T.,Nevins, J.R. Selective Induction(of E2fl in Response to

132. DNA Damage, Mediated by Atm-Dependent Phosphorylation // Genes Dev.-Vol.15.-2001.-P'l'833-1844. ' ' '•

133. Liou, W., Geuze, H.J., Geelen, M.J., et al. The Autophagic and Endocytic

134. Pathways Converge at the Nascent Autophagic Vacuoles // J Cell Biol.-Vol.136.- 1997.-'Р.61-70.

135. Llanos, S., Clark, P.A., Rowe? J., et al. Stabilization ofP53 by P14arf without

136. Relocation of Mdm2:to the Nucleolus // Nat Cell Biol.- Vol.3.- 2001.1. P.445-452. '' 1 1 ' ' 'i

137. Lohrum, M.A., Ashcroft, M.,. Kubbutat, M.H., et al. Identification of a Cryptic Nucleolar-L'ocalization Signal in Mdm2 // Nat Cell Biol.- Vol.2.-2000.-P:i 79-181. " ' '

138. Lum; J.J., Bauer, DfE., Kong, M., et al. Growth Factor Regulation of Autophagy and Cell' Survival in the Absence of Apoptosis // Cell.- Vol.120.2005.-P.237-248.

139. Maclean, K.H., Dorsey, F.C., Cleveland, J.L., et al. Targeting Lysosomal

140. Degradation Induces P53-Dependent Cell Death and Prevents Cancer in Mouse Models of Lymphomagenesis // J Clin Invest.- Vol.118.- 2008. P.79-88.

141. Mahyar-Roemer, M., Fritzsche, C., Wagner, S., et al. Mitochondrial P531.vels Parallel Total P53 Levels Independent of Stress Response in Human Colorectal Carcinoma and Glioblastoma Cells // Oncogene.- Vol.23.- 2004.-P.6226-6236.

142. Maiuri, M.C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. Bh3-Only Proteins and Bh3

143. Mimetics Induce Autophagy by Competitively Disrupting the Interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L) // Autophagy.- Vol.3;- 2007.- P.374-376;

144. Maiuri; M.C., Zalckvar, E,j Kimchij A., et al. Self-Eating and; Self-Killing:

145. Crosstalk' between-''Autojjhagy''and<: Apoptosis // Nat; Rev' Mob Cell- Biol';-Vol.8,- 2007.-P.741-752.

146. Mathew,' R.; Karant'za-Wa'dsworth; V.,White, E. Role of Autophagy in. Cancer// Nat Rev Cancer.- Voi.7.;- 2007.- P:961-967.

147. Mathew, R., Kongara, S., Beaudoin, 13;, et al. Autophagy Suppresses Tumor

148. Progression by Limiting;.Chromosomal? Instability -II Genes Dev.- Vol.21.-2007.-P;1367-13811 ' 1 ' ' ^' ' ' : ' . .; ■ -v.••.;,' ).■.<', i . .

149. McKeller, R.N.,, Fowler, J.L.,. Cunningham, J:J., et al: The Arf Tumor

150. Suppressor Gene Promotes Hyaloid Vascular Regression During Mouse Eye Development //Proc Natl Acad Sci U S A.- Vol.99.- 2002.- P:3848-3853.

151. Meijer, A.J.,Codogno, P: Regulation and Role of Autophagy in Mammalian

152. Mizushima; N., Levine, В:, Cuervo, A.M;, et al. Autophagy Fights Diseasethrough Cellular Self-Digestion // Nature.- Vol.451.- 2008.- P.1069-1075.

153. N. i • л\ i . .!.! . i . I'. . . • .

154. Mizusbima,, .N.^/Y^^otp^/A-.i.'- Hataiio,. M:, et al. Dissection of

155. Autophagosome Formation Using Apg5-Deficient Mouse Embryonic Stem Cells //J Cell Biol.- Vol.152.- 2001.- P.657-668.

156. Mortimore, G.E., Khurana, K.K.,Miotto, G. Amino Acid Control of Proteolysis in Perfused Livers of Synchronously Fed Rats. Mechanism and Specificity of Alanine Co-Regulation // J Biol Chem.- Vol.266.- 1991.-P.1021-1028.

157. Murphy, M.E., Leu, J.I.,George, D.L. P53 Moves to Mitochondria: A Turn onthe Path to Apoptosis // Cell Cycle.- Vol.3.- 2004.- P.836-839.

158. Nakazawa, Y., Kamijo, Т., Koike, K., et al. Arf Tumor Suppressor Induces

159. Mitochondria-Dependent Apoptosis by Modulation of Mitochondrial Bcl-2 Family Proteins // J Biol Chem.- Vol.278.- 2003.- P.27888-27895.

160. Natarajan, K., Meyer, M.R., Jackson, B:M., et al. Transcriptional Profiling

161. Shows That Gcn4p Is a Master Regulator of Gene Expression During Amino Acid Starvation'in'Yeast // Mol CellBiol.- Vol.21.- 2001.- P.4347и . < i i4368. ' 1

162. Nemajerova, A!, ; Wolff, ,S.',''P'etrenko, 'O.; et al. Viral and Cellular Oncogenes1.duce Rapid1 Mitochondrial Translocation of P53 insPrimary Epithelial and Endothelial1 Cells' Early in' Apoptosis // FEBS Lett.- Vol.579.- 2005.-P.6079-6083:

163. Oberstein; A., Jeffrey; P.D.',Shi, Y. Crystal Structure of the Bcl-Xl-Beclin 1

164. Peptide Complex: Beclin Г Is a Novel ВЬЗ:Оп1у Protein // J- Biol Chem.-Vol.282.-2007.-P.13123-13132. .s

165. Oda, M.N., Scott, S.V., Hefner-Gravink, A., et al. Identification of a Cytoplasm to Vacuole Targeting Determinant in Aminopeptidase I // J Cell Biol.- Vol.132'.- 1996.- P.999-1010.

166. Ogier-Denis, E.,Codogno,'P. Autophagy: A Barrier or an Adaptive Responseto Cancer//Biochim Biophys Acta.- Vol. 1603.- 2003.- P. 113-128.

167. Ogier-Denis, E., Houri, J.J., Bauvy, C., et al. Guanine Nucleotide Exchangeon Heterotrimeric Gi3 Protein Controls Autophagic Sequestration in Ht-29 Cells // J Biol Chem!- Vol:27L- 1996.'- P.28593-28600.

168. Ogier-Denis, E., Pattingre, S., El Benna, J., et al. Erkl/2-Dependent Phosphorylation of Galpha-Interacting Protein Stimulates Its Gtpase Accelerating Activity and Autophagy in'Human Colon Cancer Cells // J

169. Biol Chem.- Vol.275.- 2000.- P.39090-39095.> i

170. Oltersdorf, Т., Elmore, S.W., Shoemaker, A.R., et al. An Inhibitor of Bcl-2

171. Family Proteins Induces Regression of Solid Tumours // Nature.- Vol.435.2005.- P.677-681. ' 't t

172. Oren, M. Regulation of the P53 Tumor Suppressor Protein // J Biol Chem.

173. Vol.274.- 19991- P.36031-36034. ''1

174. Paddison, P.J., Cleary, M., Silva, J.M., et al. Cloning of Short Hairpin Rhasfor Gene Knockdown in Mammalian Cells // Nat Methods.- Vol.1.- 2004.-P.l 63-167.

175. Palmero, I., Murga, M., Zubiaga, A., et al. Activation of Arf by Oncogenic

176. Stress in Mouse Fibroblasts Is Independent of E2fl and E2f2 // Oncogene.-Vol.21.- 2002.- P.2939-2947.

177. Palmero, I., Pantoja, C.,Serrano, M. PI 9arf Links the Tumour Suppressor P53to Ras//Nature.-Vol.395> 1998.-P.125-126.

178. Pattingre, S., De Vries, L., Bauvy, C., et al. The G-Protein Regulator Ags3

179. Petiot, A.,, Ogier-Denis, E., Blommaart, .E.F., et al. Distinct Classes- of Phosphatidyiinositol 3-Kinases Are Involved, in Signaling: Pathways That Control Macroautophagy in Ht-29 Cells-// J Biol Chem.- Vol.275.- 2000:' ' ' P:992-998. ' л : '

180. Plomp, P:J , Gordon,; P:B:, Meijer, A.J., et al. Energy Dependence of Different Steps in the Autophagic-Lysosomal Pathway // J Biol? Chem.-Vol.264.'- 1989.- P.6699-6704 / ' ' "

181. Pomerantz,. J., Schrciber-Agus, N.,. Liegeois, N.J., et al. The Ink4a. Tumor

182. Suppressor Gene Product, ' P19arf, Interacts with: Mdm2 and. Neutralizes Mdm2's InhibitiomofP53;^ Cell:- Vol.921- 1998:- P.713-723:

183. Porter, A.C.,Vaillancourt, R.R. Tyrosine Kinase Receptor-Activated: Signal

184. Transduction Pathways Which Leadito: Oncogenesis ■// Oncogene.- Vol. 17.-1998i-P.1343-1352.

185. Qi; Y., Gregoty;, MAi, Li, Z., et al. PI9arf Directly and Differentially Controls the Functions of C-Myc Independently of P53 // Nature.- Vol.431 .-2004.-P.712-717!'

186. Quelle, D:E., Zindy, F., Ashmun, R:A., et.aL Alternative Reading Frames ofthe Ink4a Tumor Suppressor Gene Encode Two Unrelated Proteins Capable of Inducing CellCycieArrestT/Cell:-Vol:831- 1995:-P1993-1000:

187. R.eef, S., Zalckyar, E., Shifman, O:, et al. A Short Mitochondrial Form of P19arf Induces Autophagy and Caspase-Independent Cell Death // Mol

188. Cell.- Vol.22.- 2006.- P.463-475.

189. Reggiori, F., Wang, C.W., Nair, U., et al. Early Stages of the Secretory

190. Pathway, but Not Endosomes, Are Required for Cvt Vesicle and Autophagosome Assembly in Saccharomyces Cerevisiae // Mol Biol Cell.-Vol.15.- 2004.- P.2189-2204.

191. Reunanen, H., Punnonen, E.L.,Hirsimaki, P. Studies on Vinblastine-Induced

192. Autophagocytosis in Mouse Liver. V. A Cytochemical Study on the Origin of Membranes // Histochemistry.- Vol.83.- 1985,- P.513-517.

193. Robertson, K.D.,Jones, P.A. The Human Arf Cell Cycle Regulatory Gene

194. Promoter Is a Cpg Island Which Can Be Silenced by DNA Methylation and Down-Regulated by Wild-Type P53 // Mol Cell Biol.- Vol.18.- 1998.-P.6457-6473.

195. Rodriguez-Enriquez, S., He, L.,Lemasters, J.J. Role of Mitochondrial Permeability Transition Pores in Mitochondrial Autophagy // Int J Biochem Cell Biol.- Vol.36;- 2004:- P.2463-2472.i i 1

196. Rodriguez-Enriquez,' S., Kim, I.; Currin, R.T., et al. Tracker Dyes to Probe

197. Mitochondrial Autophagy (Mitophagy) in Rat Hepatocytes // Autophagy.-Vol.2.- 2006.- P39-46.

198. Rodway, H., Llanos, S., R!owe,' J., et al. Stability of Nucleolar Versus Non

199. Nucleolar Forms of Human P14(Arf) // Oncogene.- Vol.23.- 2004.- P.6186-6192.

200. Rowland, B.D., Denissov, S.G., Douma, S., et al. E2f Transcriptional Repressor Complexes'Are Critical Downstream Targets of P19(Arf)/P531.duced Proliferative Arrest // Cancer Cell.- Vol.2.- 2002.- P.55-65.

201. Rubbi, C.P.,Milner, J. Disruption of the Nucleolus Mediates Stabilization of

202. P53 in Response to DNA Damage and Other Stresses // Embo J.- Vol.22.-2003,- P.6068-6077.

203. Saeki, K., Yuo, A., Okuma, E., et al. Bcl-2 Down-Regulation Causes Autophagy in a Caspase-Independent Manner in Human Leukemic H160

204. Cells // Cell Death Differ.- Vol.7.- 2000.- P.1263-1269.i

205. Samari, H.R., Moller, M.T., Holden, L., et al. Stimulation of Hepatocytic

206. Amp-Activated Protein Kinase by Okadaic Acid and Other Autophagy-Suppressive Toxins // Biochem J.- Vol.386.- 2005.- P.237-244.

207. Sasnauskiene, A., Kadziauskas, J., Vezelyte, N., et al. Apoptosis, Autophagyand Cell Cycle" Arrest Following Photodamage to Mitochondrial Interior // Apoptosis.- Voh2009.- P.! '

208. Scarlatti, F., Granata, R., Meijer, A.J., et al. Does Autophagy Have a Licenseto Kill Mammalian Cells? '// Cell Death Differ.- Vol.16.- 2009.- P.12-20.t

209. Scarlatti, F., Maffei, R., Beau, I., et al. Non-Canonical Autophagy: An

210. Exception or an Underestimated Form of Autophagy? // Autophagy.-Vol.4.- 2008.- P.l 083-1085.

211. Scott,.S.V., Hefner-Gravink, A., Morano, K.A., et al. Gytoplasm-to-Vacuole

212. Targeting, and Autophagy Employ the Same Machinery to Deliver Proteins to the Yeast Vacuole // Proc Natl Acad Sci U S A.- Vol.93.- 1996.-P. 12304-12308;

213. Serrano, M., Lee, FI., Chin, L., et al. Role of the Tnk4a Locus in Tumor

214. Suppression and Cell Mortality//Cell.-Vol.85;-1996.-P:27-37.

215. Sherr, C.J. Divorcing Arf and P53: An Unsettled Case // Nat Rev Cancer.1. Vol.6.- 2006.- P.663-673.

216. Sherr, C.J. The Ink4a/Arf Network in Tumour Suppression // Nat Rev Mol

217. Shimizu,; S., Kanasekii ;T., Mizu^ima., N.,, et: al. Role of Bcl-21 Family Proteins in a Non-Apoptotic Programmed! Cell? Death; Dependent on Autophagy QenesV/ NatCell BioKr VbL6;- 2004.- Pil221-1228:

218. Shintani; T.,Klionsky, D:J: Autophagy in Health and Disease: A Double-EdgedtSword // Science Vol;306.- 2004:- P:990-995;

219. Siliciano, J.D., Canman, C.E., .Taya, Y., et al. DNA Damage Induces Phosphorylation of the Amino Terminus of P53 // Genes Dev.- Vol. 11.-1997.- P.3471-3481." ' "

220. Silva, R.L., Thornton, J;D.% Martin, A.C., et al. Arf-Dependent Regulation of

221. Pdgf Signaling in Perivascular Cells in the Developing Mouse Eye // Embo J.-Vol:24.T 2005;-P:2803-2814.'

222. Stott, F.J., Bates, S;, James, MiC., et al. The Alternative Product from the

223. Human Cdkn2a Locus, P14(Arf), Participates in a Regulatory Feedback Loop with P53 and Mdm2 // Embo J.- 'Vol.17.- 1998.- P:5001-5014. ;

224. Suzuki, K., Kirisako, Т., ,Kamada, Y., et al. The Pre-Autophagosomal

225. Structure Organized by Concerted Functions of Apg Genes Is Essential for Autophagosome Formation // Embo J.- Vol.20.- 2001.- P.5971-5981.

226. Takahashi, Y., Coppola, D., Matsushita, N., et al. Bif-1 Interacts with Beclin1 through Uvrag and Regulates Autophagy and Tumorigenesis // Nat Cell Biol.- Vol.9.- 2007.- P.l 142-1151.

227. Takeuchi, H., Kondo, Y., Fujiwara, K., et al. Synergistic Augmentation of

228. Rapamycin-Induced Autophagy in Malignant Glioma Cells by Phosphatidylinositol 3-Kinase/Protein Kinase В Inhibitors // Cancer Res.-Vol.65.- 2005.- P.3336-3346.

229. Tao, W.,Levine, A J. P19(Arf) Stabilizes P53 by Blocking Nucleo-Cytoplasmic Shuttling of Mdm2 // Proc Natl Acad Sci U S A.- Vol.96.-1999.- P.6937-6941.

230. Tasdemir, E., Chiara Maiuri, M., Morselli, E., et al. A Dual Role of P53 inthe Control of Autophagy // Autophagy.- Vol.4.- 2008.- P.810-814.1.i ,

231. Tasdemir, E., Maiuri, M.C., Galluzzi, L., et al. Regulation of Autophagy by

232. Cytoplasmic P53 //Nat Cell Biol.- Vol.10.- 2008.- P.676-687.

233. Tasdemir, E., Maiuri, M.C., Orhon, I:, et al. P53 Represses Autophagy in a

234. Cell Cycle-Dependent Fashion // Cell Cycle.- Vol.7.- 2008.- P.3006-3011.

235. Tsujimoto, Y.,Shimizu, S. Bcl-2 Family: Life-or-Death Switch // FEBS Lett.1. Vol.466.- 2000.- P.6-10.i < t192. van de Vijver, M.J.; He, Y.D., van't Veer, L.J., et al. A Gene-Expression

236. Signature as a Predictor, of Survival in Breast Cancer // N- Engl J Med.-Vol.347.- 2002.- P. 1999-2009.

237. Vivanco, I.,Sawyers, C.L. The Phosphatidylinositol 3-Kinase Akt Pathway in

238. Human Cancer // Nat Rev Cancer.- Vol.2.- 2002.- P.489-501.

239. Wang, C.W.,Klionsky', D.J. The Molecular Mechanism of Autophagy // Mol

240. Med.-Vol.9.-2003.-P.65-76.

241. Weber, J.D., Jeffers, J.R., Rehg, J.E., et al. P53-Independent Functions of the

242. P19(Arf) Tumor Suppressor// Genes Dev.- Vol.14.- 2000.- P.2358-2365.

243. Weber, J.D., Taylor, L.J., Roussel, M.F., et al. Nucleolar Arf Sequesters

244. Mdm2 and Activates P53 //Nat Cell Biol.- Vol.1.- 1999.- P.20-26.

245. Wu, X., Bayle, J.H., Olson, D., et al. The P53-Mdm-2 Autoregulatoiy Feedback Loop // Genes Dev.- V.ol.7.- 1993.- P.l 126-1132.

246. Xi, X., Han, J.,Zhang; J.Z. Stimulation of-Glucose Transport by Amp-Activated Protein Kinase Via Activation of P38 Mitogen-Activated Protein Kinase // J Biol Chem.- Vol.276.- 2001.- P.41029-41034.

247. Xie, Z.,Klionsky, D.J. Autophagosome Formation: Core Machinery and Adaptations // Nat Cell Biol.- Vol.9.- 2007.- P.l 102-1109.

248. Xie, Z., Nair, U.,Klionsky, D.J. Atg8 Controls Phagophore Expansion During

249. Autophagosome Formation // Mol Biol Cell.- Vol.19.- 2008.- P.3290-3298.

250. Xue, L., Fletcher, G.C.,Tolkovsky, A.M. Mitochondria Are Selectively Eliminated from Eukaryotic Cells after Blockade of Caspases During Apoptosis//CurrBiol.-Vol.ll.-2001.-P.361-365.

251. Yarbrough, W.G., Bessho, M., Zanation, A., et al. Human Tumor Suppressor

252. Arf Impedes S-Phase Progression Independent of P53 // Cancer Res.-Vol.62.-2002,-P.l 171-1177.

253. Yorimitsu, T.,Klionsky, D.J. Autophagy: Molecular Machinery for Self-Eating // Cell Death Differ.- Vol.12 Suppl 2.- 2005.- P.1542-1552.

254. Yousefi, S.,Simon, H.U. Autophagy in Cancer and Chemotherapy // Results

255. Probl Cell Differ.-Vol.2009.-P.

256. Yue, Z., Jin, S;, Yang, C., et al. Beclin 1, an Autophagy Gene Essential for

257. Early Embryonic Development, Is a Haplo insufficient Tumor Suppressor // Proc Natl Acad Sci U S A.- Vol. 100.- 2003.- P. 15077-15082.

258. Zhang, Y., Xipng, Y., Yarbrough, W.G. Arf Promotes Mdm2 Degradation and

259. Stabilizes, P53: Arf-Ink4a Locus Deletion Impairs Both the Rb and P53 Tumor Suppression Pathways// Cell.-Vol.92.- 1998.-P.725-734.