Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Влияние наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на течение репаративного процесса роговицы

На правах рукописи

005538837

ЯХИНА ОЛЬГА МИХАИЛОВНА

ВЛИЯНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОГО БИОПОЛИМЕРА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ТЕЧЕНИЕ РЕПАРАТИВНОГО ПРОЦЕССА РОГОВИЦЫ

14.01.07 — глазные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 ноя 2013

Москва-2013

005538837

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

Научные руководители:

Канюков Владимир Николаевич

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Стадников Александр Абрамович

доктор биологических наук, профессор

Мороз Зинаида Ивановна

доктор медицинских наук, профессор, зав. отделом трансплантационной и оптико-реконструктивной хирургии переднего отрезка глазного яблока ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

Обрубов Сергей Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней» РАМН

Защита состоится 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного

совета Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

Автореферат разослан «/£> // 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

В.В. Агафонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

По данным Всемирной организации здравоохранения заболевания роговицы являются причиной слепоты у 5% населения мира, при этом из 314 миллионов 45 миллионов пациентов абсолютно слепые, на 8 миллионов слепых приходится 1,5 миллиона детей. В силу своих топографических особенностей роговица постоянно подвержена воздействию физических, механических, химических факторов внешней среды (В.П. Филатов, 1934; P.A. Гундорова с соавт., 2000; В.В. Вит, 2010; М.В. Сухинин, 2011). Количество пациентов, нуждающихся в реабилитационных хирургических вмешательствах на глазном яблоке и его придаточном аппарате, ежегодно возрастает (В.Н. Канюков, Р.Н. Подопригора, 2009).

Следствием воспалений, травм и других повреждений роговицы является ее помутнение, которое в зависимости от выраженности в той или иной степени снижает зрительные функции (Э.Ф. Левкоева, 1951; З.Р. Дадашева, 2002; Г.В. Джавришвили, 2004; З.И. Мороз, 2007, 2010; Л.П. Догадова, 2009; A.A. Каспаров, 2010).

Ведущее место в структуре глазного травматизма принадлежит ожогам глаз, которые характеризуются большим количеством неблагоприятных исходов (P.A. Гундорова с соавт., 1983; С.С. Сапоровский, 1990; П.В. Макаров, 2003,2004,2007; А.Н. Ульянов, 2008; А.Е. Севостьянов, 2010; Р. Fagerholm, 2009). Патологический механизм ожоговой болезни и ее последствий является многофакторным. По данным ряда исследований в поврежденных тканях глаза происходит снижение активности тканевого дыхания, уменьшение количества гликогена, мукополисахаридов, витаминов, АТФ, истощаются ресурсы антиоксидантов (H.A. Пучковская и др., 2001; Г.В. Джавришвили, 2004; В.Ф. Черныш, 2008). Совокупность взаимодействия физиологических и биохимических изменений при ожогах глаз приводит к нарушению регенераторных процессов в роговице (З.Р. Дадашева, 2002; Л.Р. Николаева, 2007).

Целью лечения в остром периоде ожога глаз являются: коррекция процесса асептического воспаления, ускорение восстановления поверхности глаза (эпителизации), профилактика вторичной инфекции, контроль гипертензии и купирование болевого синдрома (А.Ф. Неделька и др., 1999; Л.К. Мошетова и др., 2006; А.Е. Севостьянов, 2010). Для этого назначаются: стероидные и нестероидные противовоспалительные средства, антибиотики широкого спектра действия, лучше всего в виде комбинированных с гормонами форм, кератопластические и слезозамещающие препараты, по

з

показаниям гипотензивные и циклоплегические препараты, а так же пероральные обезболивающие средства (Б.А. Парамонов, 2000; Н.К. Полянская, 2008; В.Ф. Черныш, 2008).

Консервативное лечение занимает длительное время и не гарантирует полного восстановления прозрачности роговой оболочки и зрительных функций из-за развития таких осложнений, как эрозия роговицы, помутнение и отек роговицы, острое повышение ВГД, расплавление роговицы, истончение роговицы и, как следствие, ее перфорация (P.A. Гундорова, 2000; R.K. Pfister, 1984). Помимо которых могут возникать вторичная глаукома, рубцевание конъюнктивальной полости, язва роговицы (асептическая или инфекционной природы), ее помутнение и васкуляризация, субатрофия глазного яблока (В.П. Филатов, 1945; H.A. Пучковская, 2001; М.Б. Эгембердиев, 2005; Е.В. Калинина, 2010).

Вследствие чего возникает необходимость применения хирургических методов лечения, таких как частичное удаление участков некротизированной конъюнктивы, покрытие амниотической мембраной, трансплантация лимбальных стволовых клеток; трансплантация культивированных стволовых клеток роговичного эпителия в остром периоде ожога глаз (P.A. Гундорова и др., 2000; Ю.Е. Батманов и др., 2004; П.В. Макаров, 2004, 2007; Е. С. Милюдин, 2007; A.B. Золотарев и др., 2008; О.В. Иванова, 2008; С.А. Борзенок и др., 2012).

В отдаленном периоде ожоговой болезни глаз с целью реабилитации зрительных функций могут быть выполнены; сквозная или послойная кератопластика, с одновременной реконструкцией переднего отрезка глаза в случае необходимости, кератопротезирование, успех которых зависит от структуры сформировавшегося бельма (Т.У. Горгиладзе, 1983; З.Р. Дадашева, 2004; З.И. Мороз и др., 2004; А.Н. Казенное, 2010; A.B. Шипунова, 2012).

Репаративные процессы роговицы изучены и описаны в исследованиях A.A. Khodadhoust (1968), A.A. Клишова (1984); F. Malecaze (1994), I. Schwab (2000), A.B. Шипуновой (2012), однако вопрос возможности воздействия на них при той или иной патологии продолжает оставаться не решенным.

В последнее время внимание исследователей привлечено к поиску методов лечения с использованием нанотехнологий и биопластических материалов. В научно-производственной лаборатории клеточных технологий Оренбургского государственного университета был разработан наноструктурированный биопластический материал «Гиаматрикс» (С.Н. Летута с соавт., 2011). Он был получен из исходного гидрогеля ГК,

который подвергался воздействию ультрафиолетового облучения (^ши=230 нм), в результате чего происходила фотохимическая сшивка макромолекул. В результате применения биоматериала в комплексе с лечением ожогов кожи сокращались сроки пребывания больных в стационаре ввиду более быстрой эпителизации раневой поверхности (Л.Р. Аделынина с соавт., 2011; О.И. Бурлуцкая с соавт., 2011).

Работами М.Т. Азнабаева (2000), А.Р. Шамратовой (2002), М.Б. Эгембердиева (2005) было доказано, что гиалуроновая кислота, являясь основным межклеточным веществом организма, способствует активации макрофагов, стимулирует физиологические репарационные процессы и в определенной степени подавляет фиброгенез.

Цель

Экспериментально обосновать использование наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты в лечении раневого процесса роговицы.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на роговицу и определить его влияние на структуры переднего отрезка глаза и его придаточный аппарат.

2. Изучить течение раневого процесса эрозии роговицы на фоне применения наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты и при применении мягкой контактной линзы.

3. Провести сравнительный анализ клинического течения щелочного и кислотного ожога роговицы на фоне аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты и при применении глазного геля Солкосерил.

4. Провести сравнительный анализ морфологических изменений в структуре глаза при щелочном и кислотном ожоге роговицы на фоне аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты и при применении глазного геля Солкосерил.

Научная новизна результатов исследования

1. Впервые в условиях эксперимента установлено, что применение наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты в виде аппликации на роговицу не вызывает воспалительную, токсико-аллергическую, пролиферативную реакции неизмененной передней глазной поверхности.

2. Время биодеградации биополимера гиалуроновой кислоты

увеличивается до 84-96ч., по сравнению с обычным его применением на коже, которое составляет 72ч.

3. Впервые экспериментально-гистологическим методом установлено позитивное влияние наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты для оптимизации течения раневого процесса роговицы, заключающееся в уменьшении признаков асептического воспаления: отека и гиперемии и компенсаторному сокращению экссудативной фазы.

Практическая значимость результатов работы

1. Разработан оптимальный способ аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на роговицу заключающуюся в размещении увлажненного физиологическим раствором диска биоматериала с полным покрытием дефекта, фиксацией мягкой контактной линзой и перекидными швами для предотвращения его смещения.

2. Впервые показано, что аппликация данного биополимера при формировании эрозии роговицы на глазах экспериментальных животных способствует сокращению сроков эпителизации в 1,5 раза.

3. Впервые в эксперименте in vivo показано, что применение биополимера гиалуроновой кислоты приводит к формированию менее интенсивного поверхностного помутнения при щелочном ожоге роговицы, в отличии от результата лечения с применением глазного геля Солкосерил.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наноструктурированный биополимер гиалуроновой кислоты не оказывает токсико-аллергического действия на структуры переднего отрезка глаза и его применение на начальных этапах лечения повреждений роговицы (эрозия, щелочной и кислотный ожоги) создает оптимальные условия для репаративных процессов, способствующих нормализации эпителио-соединительнотканных взаимоотношений.

2. Разработан оригинальный способ аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на роговицу с учетом физиологических особенностей конъюнктивальной полости позволяющей отказаться от использования полимерной перевязочной пленки применяемой с ним в дерматологии.

Апробация работы

Работа прошла апробацию на научно-практической межотделенческой конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва, 2013).

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Оренбургского регионального отделения общества офтальмологов России, на VI Международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2012), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения-2012» (Москва, 2012), V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 2012), Всероссийской научно-практическая конференции «Брошевские чтения - 2012» (Самара, 2012), Дистанционной конференции «Актуальные вопросы теоретической и практической медицины» (Кабардино-Балкария, 2012), Научно-практической конференции офтальмологов с международным участием «Филатовские чтения-2013» (Одесса, 2013), XXIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» (Оренбург, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 - в журналах, рецензированных ВАК РФ и 2 - в иностранной печати. По теме диссертационной работы получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 132 страницах компьютерного текста; иллюстрирована 5 таблицами, 65 рисунками. Работа состоит из введения и 4-х глав, включающих литературный обзор, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Список литературы включает 229 источников, из них 150 отечественных и 79 зарубежных.

Гистологические исследования выполнены на базе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии (зав. кафедрой - проф., д.б.н. A.A. Стадников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы Работа носила экспериментальный характер и выполнена на 63 кроликах (126 глаз), посвящена изучению влияния наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на неизмененную роговицу и при различных патологических процессах. Объектом изучения был «Гиаматрикс», который представляет собой биопластический материал в виде эластично-упругой плёнки белого или желтоватого цвета, толщиной 0,3 - 0,5мм, длиной 150мм и шириной 100мм. Он разрешен к применению в общей и пластической хирургии (регистрационное удостоверение ФСР 2011/10313 от 18.03.2011).

Все животные были разделены на 4 серии: в 1-ой серии эксперимента исследовали влияние наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на интактную роговицу по сравнению с парными глазами, на которые надевалась МКЛ. Во 2-ой серии изучали его влияние на течение механической эрозии роговицы по сравнению с лечебным действием МКЛ. В 3-й серии формировали щелочной ожог роговицы, оценивали влияние «Гиаматрикса» на репаративные процессы в опытной группе, а в контроле применяли глазной гель Солкосерил. В 4-й серии по аналогии с 3-ей серией оценивали влияние «Гиаматрикса» на течение кислотного ожога роговицы, а в контроле закладывали глазной гель Солкосерил.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинические методы

Состояние животных оценивали динамически ежедневно в течение семи дней, последующие наблюдения проводили 2 раза в неделю до конца эксперимента с фото регистрацией. Клинически оценивали признаки: наличие или отсутствие отделяемого; характер инъекции конъюнктивы и ее выраженность; отек конъюнктивы; диаметр дефекта роговицы определялся после окрашивания 0,1 % раствором флюоресцеина натрия; наличие неоваскуляризации; интенсивность помутнения роговицы; чувствительность роговицы; пальпаторно определяли ВГД.

На сроках 3, 7,14, 30 и 90 суток животных выводили из эксперимента для проведения морфологического исследования.

Гистологические методы

Все животные выведены из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. При выполнении исследования соблюдались правила биоэтики, утвержденные приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977.

Светооптическое, электронно-микроскопическое и

иммуноцитохимическое исследования проводили по стандартной технологии.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на неизмененную роговицу

Экспериментальных животных 1-ой серии эксперимента (15 кроликов, 30 глаз) разделили на 2 группы: опытную, в которой наноструктурированный биополимер гиалуроновой кислоты накладывали на интактную роговицу (15 глаз), контрольную, где на роговицу для сравнения надевали МКЛ (15 глаз).

С учетом того, что биопластический материал «Гиаматрикс» впервые применяли в конъюнктивальной полости, нами разработана технология его аппликации на роговицу. После стандартной обработки операционного поля, проведения эпибульбарной анестезии, веки фиксировали векорасширителем. Предварительно из биоматериала «Гиаматрикс» трепаном выкраивали диск диаметром 10мм, который укладывали на поверхность роговицы и смачивали физиологическим раствором. Биоматериал накрывали МКЛ. На МКЛ накладывали металлическое кольцо с ручкой, внешний диаметр которого совпадал с диаметром линзы. Линзу с помощью кольца выравнивали относительно краев трансплантата и прижимали вместе с биоматериалом к роговице, после чего кольцо удаляли. Фиксировали МКЛ двумя перекидными швами по взаимно перпендикулярным меридианам (патент №2485919 от 12.04.2012, авторы: В.Н. Канюков, Е.Ф. Чеснокова, О.М. Яхина).

В этой и последующих сериях эксперимента использовали МКЛ Pure Vision 2 High Definition (Bausch & Lomb) sph (-) 0,5; рекомендованые для гибкого режима ношения длительностью до 30 дней.

Технология применения «Гиаматрикса» на коже заключается в покрытии патологического дефекта кожи и фиксацией биоматериала полимерной перевязочной воздухо- и влагонепроницаемой пленкой (Urcell) с целью сохранения его увлажнения, при этом полный лизис биоматериала

происходил в течение 72ч. Однако в конъюнктивальной полости условия иные: температура на роговице в среднем 33,7 °С, слеза обладает слабощелочной реакцией (рН 6,8-7,5), в то время как естественный показатель рН кожи человека находится в диапазоне от 4,0 до 6,5. Таким образом, при аппликации «Гиаматрикса» на роговицу его помещали в условия отличные от условий среды под полимерной перевязочной пленкой на коже, а значит, они могли повлиять на время его биодеградации.

В опытной группе на 1-е сутки оценить состояние роговицы и глубже лежащих сред не представлялось возможным из-за наличия «Гиаматрикса» под МКЛ, только на 2-е сутки под МКЛ по периферии просматривалась неизмененная роговица. На 3-е сутки у кроликов опытной группы в центральной части подлинзового пространства сохранялись фрагменты биоматериала в виде студенистых комочков желтого цвета, которые легко после снятия МКЛ отделялись от роговицы. Обнаружение фрагментов биоматериала потребовало продлить аппликацию «Гиаматрикса» у животных опытной группы для установки времени полного лизиса биоматериала и перенести сроки снятия МКЛ на 7 сутки. У 3-х кроликов полный лизис отмечали на сроке 84ч, а у 12-ти кроликов биодеградация длилась до 96ч.

Морфологическое исследование глаз экспериментальных животных показало, что гистогенетических и структурных изменений роговицы не было выявлено: передний эпителий, строма, десцеметова мембрана и эндотелий имели обычное строение без патологических включений и соответствовали результатам гистологического исследования контрольной группы.

Так как количество биопластического материала по истечении 72ч было уже настолько мало, и это обстоятельство не приводило к изменению гистологической структуры тканей переднего отрезка глазного яблока, было принято решение в последующих сериях эксперимента не продлевать сроки аппликации свыше 72 часов (3-х суток).

Учитывая, что аппликация наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на роговицу не вызывала воспалительной и токсико-аллергической реакций тканей передней глазной поверхности и не приводила к нарушению ее морфологической структуры, позволило нам приступить к следующему этапу исследования - изучению влияния «Гиаматрикса» на течение патологических процессов роговицы.

Влияние наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на течение процессов регенерации роговицы при формировании механической травмы

Во второй серии эксперимента формировали эрозию роговицы по методу С. Hanna, J.E. O'Brien (1960). Под местной анестезией 0,4% Инокаином легким прижатием трепана с поршнем диаметром 8мм к роговице наносили метку, которую окрашивали 0,1% раствором флюоресцеина натрия. В пределах метки лезвием соскабливался эпителий роговицы. Дефект эпителия снова окрашивали для того, чтобы отчетливее были видны его форма и размер.

После формирования эрозии животные были разделены на две группы: опытную (12 правых глаз) и контрольную (12 левых глаз). В опытной группе проводили аппликацию биопластического материала по описанной выше методике. В контрольной группе надевали MKJI. В обеих группах в течение всего времени, пока сохранялся дефект роговицы, проводили инсталляции Ципромеда * 4 раза в день.

В первые сутки эксперимента на всех глазах отмечали инъекцию, которая проходила полностью в опытной группе к 3 суткам, в контрольной группе медленнее - к 5 суткам.

Биомикроскопия глаз экспериментальных животных опытной группы показала полное закрытие дефекта на 3-й сутки аппликации, что подтвердили результатом флюоресцеиновой пробы - прокрашивания роговицы не было, при этом отмечали восстановление прозрачности, сферичности, гладкости, блеска и высокой чувствительности роговицы. В то время как в контрольной группе сохранялся роговичный синдром и полное закрытие дефекта отмечали только на 4-е сутки.

При морфологическом и морфометрическом изучении препаратов глаз опытной группы в сроки 3-х суток было обнаружено, что в зоне механического дефекта роговицы активно происходила эпителизация дефекта эпителия. При этом клетки эпителия были дифференцированные, располагались в 3-4 ряда по периферии, ближе к центральной зоне в 2-3 ряда. Оценивая гистологические структуры глаз кроликов в контрольной группе, определяли большую активность фибропластических процессов, вызванных эрозией, включающих дистрофические изменения и остатки деструктивных. По истечении 7-и суток и далее роговица имела обычное строение, инфильтрацию в слоях роговицы не определяли как в опытной, так и в контрольной группах.

Таким образом, аппликация наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты не приводила к нарушению соединительнотканной структуры роговой оболочки и изменению стадийности физиологического ответа на травму роговицы. Асептическое воспаление при механическом воздействии на эпителий роговой оболочки завершалось в сроки 3-х суток в опытной группе и по данным морфологического исследования до 7-и суток в контрольной группе. Клиническое исследование явных отличий течения реактивного воспаления не выявило, но показало что закрытие эрозии в контрольной группе проходило быстрее, чем в опытной. Учитывая положительные результаты аппликации при механической травме, было принято решение применить биопластический материал при более агрессивном воздействии на роговицу.

Восстановление роговицы после химического (щелочного и кислотного) повреждения в условиях применения биополимера гиалуроновой

кислоты

В третьей серии проводили изучение течения щелочного ожога роговицы (18 кроликов, 36 глаз) при применении биопластического материала «Гиаматрикс» (опытная группа - 18 глаз) и на фоне применения глазного геля Солкосерил (контрольная группа - 18 глаз). Щелочной ожог вызывали аппликацией фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смоченной 2,5% раствором гидрооксида натрия с экспозицией 5 секунд на роговицу под местной анестезией 0,4 % Инокаином (Е.В. Ченцова, 1996; Е.С. Милюдин, 2007). В четвертой серии изучали течение кислотного ожога, при этом в опытной группе (18 глаз) также проводили аппликацию «Гиаматрикса», а в контрольной (18 глаз) инсталляции глазного геля Солкосерил. В доступной литературе описание методики формирования кислотного ожога в эксперименте не было обнаружено, поэтому был разработан собственный метод формирования кислотного ожога роговицы в эксперименте по аналогии со щелочным ожогом. Кислотный ожог роговицы вызывали под местной анестезией 0,4 % Инокаином аппликацией фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8мм), смоченной 3 % раствором уксусной кислоты с экспозицией 5 секунд на роговицу. В обеих сериях эксперимента всем животным проводили профилактику вторичной инфекции инсталляциями Ципромеда * 4 раза в день.

Результаты клинического исследования

Щелочной ожог. Перед началом лечения в обеих группах: наблюдали усиление инъекции конъюнктивы век и бульбарной конъюнктивы, сопровождающуюся ее отеком, что свидетельствовало о дальнейшем развитии ожогового процесса после его формирования. Данная клиническая картина служила исходным состоянием для оценки лечебных мероприятий, которые начинали проводить на следующие сутки после ожога. Далее проводили сравнение течения раневого процесса в опытной и контрольной группах.

На 1-е сутки в опытной группе роговица была не доступна осмотру, отмечали усиление отека и инъекции бульварной конъюнктивы, что может быть связано с дополнительной травмой при фиксации МКЛ. После снятия МКЛ на 3-й сутки при биомикроскопии определяли: отек и гиперемию конъюнктивы, помутнение верхних слоев роговицы, дефект эпителия, прокрашивающийся флуоресцеином в виде круга, который уменьшился в 2 раза и составил 3,5мм в диаметре. В контрольной группе на 1-2-е сутки лечения при биомикроскопии определили: инъекцию конъюнктивы, помутнение верхних слоев роговицы и уменьшение дефекта эпителия в виде круга до диаметра 5мм к концу 2-х суток, в нижнем отделе передней камеры хлопья белого цвета (фибриноидная реакция), участки радужной оболочки, которые просматривались по периферии были с четким рисунком, глубже лежащие среды офтальмоскопировались плохо.

Динамическое наблюдение с проведением биомикроскопии в течение 2-х недель после лечения показало, что эпителизация протекала следующим образом: в опытной группе на 7-е сутки отмечали закрытие дефекта, а в контрольной уменьшение диаметра раневого дефекта до Змм с завершением эпителизации к 10-11 суткам (12 глаз) и в единичных случаях к 14-15 суткам (3 глаза).

В опытной группе при оценке стромального помутнения у всех экспериментальных животных оно занимало оптическую зону роговицы и сохранялось до 7 суток, а к 14 суткам уменьшалось до размеров круга диаметром 4мм, на месте которого формировалось стойкое помутнение. Тем временем, как в контрольной группе оно сохранялось до 30 суток, на месте которого отмечали формирование стойкого помутнения.

Пальпаторное определение ВГД в обеих группах показало, что офтальмотонус был нормальным на всем периоде наблюдения.

На сроке 30 суток у 4 кроликов опытной группы и 5 кроликов контрольной группы отмечали неоваскуляризацию, на сроке 90 суток у

экспериментальных животных опытной группы формировалось нежное поверхностное помутнение, занимающее 1/3 часть роговицы, в то время как в контрольной группе помутнение было грубым и занимало 2/3 роговицы.

Кислотный ожог. Клиническое исследование показало, что сразу после действия 3 % раствора уксусной кислоты, несмотря на отсутствие прокрашивания роговицы флюоресцеином, отмечались признаки роговичного синдрома: блефароспазм, светобоязнь, слезотечение. При биомикроскопии определяли инъекцию конъюнктивы, помутнение роговицы в области контакта с детергентом за счет отека эпителия. Влага передней камеры была прозрачной, радужная оболочка с четким рисунком, зрачок диаметром 7мм, реакция на свет вялая, рефлекс с глазного дна розовый.

Клиническое наблюдение показало, что отек роговицы на всех глазах опытной группы сохранялся до 7-ми суток, в то время как в контрольной группе до 14 суток.

Инъекция конъюнктивы в опытной группе усиливалась в первые 3-е суток после аппликации, что могло быть связано с фиксацией МКЛ, а затем наблюдали положительную динамику и полное исчезновение инъекции к 8-9 суткам. В контрольной группе инъекция конъюнктивы уменьшалась медленнее и проходила полностью к 14 суткам.

Морфологическое исследование

Щелочной ожог. Повреждение переднего эпителия закономерно приводило к изменению местного обмена веществ; кроме того развивалась интоксикация продуктами распада поврежденных клеток, которая особенно была выражена в глазу в виду анатомических особенностей его строения и кровоснабжения. Клинически это проявлялось резким увеличением отека и инъекции конъюнктивы, отеком роговицы, блефароспазмом, светобоязнью, слезотечением, помутнением роговицы в первые 7-10 суток, что характерно для острой фазы ожога. Повреждались не только те ткани, которые были подвергнуты прямому воздействию, но щелочь вызывала повреждение глубжележащих структур.

На препаратах фрагмента роговицы кролика в условиях щелочного ожога на сроке 3-х суток в обеих группах наблюдали десквамацию клеток переднего эпителия, отек и дискомплексацию волокон собственного вещества роговицы, но при применении биополимера гиалуроновой кислоты кроме этого отмечали лимитирование эпителизации раневой поверхности роговицы.

На сроке 7-ми суток, на глазах опытной группы обнаруживали эпителиальные пролифераты погружного и покровного характера и отмечали

и

наличие новообразованного эпителиального пласта в центральной зоне повреждения тканей роговицы, а в контрольной группе лишь формирование малодифференцированной соединительной ткани.

Существенным являлось то обстоятельство, что по мере продолжения развития деструктивного процесса (сроки 7 и 14 суток) в прилежащих к некротизированным тканям участках, возникало выраженное вторичное реактивное воспаление. Оно характеризовалось вазодилятацией кровеносных сосудов, экстравазацией плазмы и форменных элементов крови с формированием демаркационной зоны. Демаркационная линия в исследованных участках глаза была выражена слабо, а в лимбальной зоне она отсутствовала. Это приводило к утяжелению и прогрессированию некротических процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.

Альтерация тканей роговицы не сопровождалась адекватными экссудативной (сосудистой) и продуктивной (пролиферативной) реакциями, что свидетельствовало о сохранении дистрофических процессов в моделируемых условиях. Таким образом, фокус воспаления в связи с процессами экссудации не в полной мере выполнял дренажную и элиминативную функции при ожоговой травме роговицы.

Преобладающее большинство эмигрирующих лейкоцитов составили сегментоядерные нейтрофилы. Помимо них, значительно реже экстравазации подвергались лимфоциты, моноциты, базофильные гранулоциты и эозинофилы. Данные клетки продвигались в зону повреждения роговицы между волокнистыми структурами по направлению к центру воспаления, где и наблюдалось их наибольшее скопление.

В области повреждения роговицы и прилежащих участков конъюнктивы по мере угасания воспалительного процесса происходила активизация камбиальных клеток и клеток фибробластического дифферона. При этом образовывались волокнистые структуры без разрастаний эпителиальной ткани. Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что щелочное повреждение роговицы экспериментальных животных (кроликов) приводило к развитию некротического воспаления.

Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов роста, источниками которых могут быть макрофаги, эндотелиальные, тучные и другие клетки. Элементы крови, пропотевая через сосудистую стенку, проникали между набухшими пластинками стромы, образуя экстравазаты полосчатого вида, в которые врастали эндотелиальные клетки из капилляров, так происходило формирование новых сосудистых каналов. Поверхностному врастанию

сосудов предшествовал отек эпителия. Глубокому врастанию сосудов предшествовала избыточная гидратация стромы.

На фоне восстановления гемомикроциркуляции (до 3-х месяцев с момента ожога) развивались пролиферативные и регенераторные процессы, которые обеспечивали впоследствии образование коллагеновых волокон и межуточного вещества стромы поверхностных тканей глаза. В процессе регенерации участки некроза ткани заполнялись не специфической стромальной тканью, а соединительной с формированием рубца.

На протяжении стадии ранних исходов ожогового процесса, до 90 суток с момента ожога, субэпителиально осуществлялись фибропластические процессы, формировалась грануляционная ткань. В стадии отдаленных исходов ожогового процесса, свыше 90 суток с момента ожога, происходило ремоделирование рубца с его истончением, уменьшением количества клеточных элементов, дифференцировкой фибробластов в фиброциты, запустеванием новообразованных сосудов.

В сроки свыше 2-х недель процессы как в опытной, так и в контрольной группах были сходными, ведущими к стабилизации раневого процесса. Однако их завершение в опытной группе было быстрее. Для подтверждения этого было проведено иммуноцитохимическое исследование, которое показало, что при применении биополимера гиалуроновой кислоты снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фибробластов роговицы, взятой для исследования на 3-й и 15-ые сутки эксперимента. С другой стороны возрастала экспрессия синтеза протеина Ьс12, что свидетельствует о выраженности пролиферативной фазы воспаления. Таким образом, иммуноцитохимическое исследование показало, что аппликация биополимера гиалуроновой кислоты оптимизировала репаративные гистогенезы с включением механизмов лимитирования экспрессии проапоптатического гена р 53, снижая число иммунопозитивных эпителиоцитов в 2,5-3 раза по сравнению с контрольной группой.

Кислотный ожог. Морфологические изменения роговицы при кислотном ожоге имели особенности, обуславливающие соответствующую клиническую картину. Они представляли собой коагуляционный некроз поверхностных слоев с формированием плотного струпа на роговице, что обусловило роговичный синдром, но не дало возможности прокрашивания стромы флуоресцеином. На сроке 3-х суток как в опытной, так и в контрольной группах обнаруживали, что клетки переднего эпителия роговицы были повреждены, в мелких сосудах формировались тромбы, при этом плазма выходила в окружающие ткани, что клинически проявлялось

отеком конъюнктивы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечали нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. Морфологически определяли признаки токсического действия продуктов распада поврежденных клеток. Таким образом, при кислотном ожоге в отличие от щелочного ожога, возникал коагуляционный (сухой) некроз - кислотная денатурация белков, благодаря которой кислота не проникала в подлежащие слои ткани.

При иммуноцитохимическом исследовании так же как и при щелочном ожоге снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фиброблатов, но возрастала экспрессия синтеза протеина bel 2, свидетельствующая о выраженности пролиферативной фазы воспаления.

На сроке от 30-ти суток и выше наблюдали завершение фибробластических процессов как в опытной, так и в контрольной группе.

Полученные данные свидетельствуют об оптимизации процессов эпителизации раневой зоны, стимуляции митотической активности базальных и шиповатых клеток переднего эпителия, лимитировании апоптотической доминанты эпителиоцитов и фибробластов собственного вещества роговицы в условиях применения наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты, что также было подтверждено иммуноцитохимическим исследованием.

По результатам исследования химического ожога глаз, имея выраженную картину клинического течения с особенностями связанными с действием повреждающего агента: щелочи или кислоты. Применение аппликации биопластического материала на начальном этапе лечения способствовало стабилизации эпителио-соединительнотканных

взаимоотношений в более ранние сроки эксперимента, что ускоряло эпителизацию. Применение биоматериала способствовало сокращению течения экссудативной фазы воспаления, более быстрому переходу в завершающую пролиферативную фазу и сокращению сроков реабилитации.

ВЫВОДЫ

1. Применение наноструктурированного биополимера

гиалуроновой кислоты в виде аппликации на роговицу не вызывает воспалительной, токсико-аллергической, пролиферативной реакций.

2. Время биодеградации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты увеличивается до 84-96ч в условиях конъюиктивальной полости по сравнению с временем полного лизиса на коже (72ч), ввиду более низкой температуры на поверхности роговицы, щелочной реакции слезы, более высокому уровню влажности.

3. При применении аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты в эксперименте с формированием эрозии роговицы эпителизация дефекта наступает быстрее в 1,5 раза по сравнению с применением МКЛ.

4. Аппликация наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на роговицу на начальных этапах лечения повреждений роговицы (эрозия, щелочной и кислотный ожог) уменьшает выраженность отека и гиперемии и, как следствие, сокращает экссудативную фазу воспаления.

5. В опытной группе с применением наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты в отдаленные сроки эксперимента в исходе щелочного ожога роговицы отмечается формирование более нежного помутнения с меньшей неоваскуляризацией по сравнению с контролем.

6. В опытной группе с применением наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты в исходе кислотного ожога за счет сокращения экссудативной фазы воспаления происходит ускорение рассасывания помутнения роговицы к 14 суткам по сравнению с контролем (к 30 суткам), где применяли глазной гель Солкосерил.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Наноструктурированный биополимер гиалуроновой кислоты может быть рекомендован к дальнейшим клиническим исследованиям с определением возможности применения в лечении механических и химических (щелочной и кислотный ожог) повреждений роговицы для ускорения эпителизации дефектов и уменьшения выраженности экссудативной фазы воспаления.

2. Оптимальным способом аппликации наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на роговицу является технология с выкраиванием диска биоматериала, размером превышающим дефект, увлажнением его физиологическим раствором, с размещением на

поверхности роговицы, закрытием мягкой контактной линзой и фиксацией перекидными швами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. В.Н. Канюков, Е.Ф. Чеснокова, О.М. Яхина Альтернативные способы хирургического лечения трофических язв роговицы // Вестник ОГУ.-2010.-С. 98-100.

2. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Состояние проблемы реабилитации пациентов с патологией роговицы (обзор литературы) // Вестник ОГУ. - 2012. - С. 192-194.

3. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Эволюция в лечении и реабилитации пациентов с ожогами глаз // Филатовские чтения. Сб. тезисов. - Одесса, 2012. - С. 176-177.

4. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Нанотехнологии в лечении заболеваний роговицы // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: V Всероссийский симпозиум с международным участием. Сб. тезисов. - Уфа, 2012.-С.156-157.

5. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Оптимизирующее репаративное воздействие нового биопластического материала «Гиаматрикс» при экспериментальных ожогах роговицы // Брошевские чтения. Сб. тезисов. - Самара, 2012. — С. 431-433.

6. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Стимуляция репаративной регенерации роговицы аппликацией «Гиаматрикса» // Восток-Запад. Сб. научных трудов. - Уфа, 2012.- С. 104105.

7. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Новые технологии в лечении заболеваний роговицы. // Современные достижения бионаноскопии: VI Международная научная конференция. Сб. тезисов. — Москва, 2012. - С. 50.

8. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Исследование влияния биопластического материала «Гиаматрикс» на процессы регенерации роговицы в эксперименте // Федоровские чтения Сб. тезисов. - Москва, 2012. - С. 137-138.

9. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Репаративная регенерация глазной поверхности при моделировании щелочного ожога в эксперименте // Практическая медицина. Том 2. - С. 192-193.

10. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Особенности регенерации роговицы при применении биопластического материала на основе гиалуроновой кислоты // Вестник ОГУ. - 2012. - С. 76-79.

11. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Влияние биопластического материала «Гиаматрикс» на течение щелочного

ожога роговицы // Филатовские чтения. Сб. тезисов. - Одесса, 2012. - С. 176177.

12. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Современные подходы к лечению ожогов глаз // Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике: Юбилейная Всероссийская конференция с международным участием. Сб. тезисов. -Санкт-Петербург, 2012. - С. 223.

13. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Изучение репаративной регенерации роговицы под действием гиалуроновой кислоты // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины: дистанционная конференция. Сб. тезисов. - Кабардино-Балкария, 2012. - С. 63-64.

14. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Экспериментально-гистологическое обоснование применения «Гиаматрикса» для лечения ожогов глаз // Морфологические ведомости. - 2013. №3-С. 46-52.

15. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Аппликация биопластического материала «Гиаматрикс» при заболеваниях роговицы // Вестник ОГУ. - 2013. №4 - С. 243-245.

16. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Определение эффективности нового метода лечения щелочного ожога роговицы // Федоровские чтения Сб. тезисов. - Москва, 2013. - С.234-235.

17. В.Н. Канюков, A.A. Стадников, О.М. Трубина, О.М. Яхина Применение биоматериала «Гиаматрикс» для лечения травматических повреждений глаз // Современные технологии диагностики и лечения при поражениях органа зрения: Юбилейная конференция. - Санкт-Петербург, 2013.-С. 63.

Патенты РФ на изобретения по теме диссертации В.Н. Канюков, Е.Ф. Чеснокова, О.М. Яхина Способ лечебной аппликации роговицы биопластическим материалом «Гиаматрикс». Патент РФ на изобретение № 2485919 от 12.04.2012

Биографические данные Яхина Ольга Михайловна, 1985 года рождения, в 2008 году окончила Оренбургскую государственную медицинскую академию по специальности «Педиатрия». С 2008 по 2010 год проходила обучение в клинической ординатуре по специальности «офтальмология» на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. С 2010 по 2013 год обучалась в очной аспирантуре на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Является автором 17 печатных работ, 1 патента на изобретение.

Подписано в печать: 13.11.13 Тираж: 150 экз. Заказ № 1037 Объем: 1,5 усл.п.л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru