Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии

005555369

На правах рукописи

РАХМАТУЛЛИН РАМИЛЬ РАФАИЛЕВИЧ

Биопластнческнй ¡материал на основе гидроколлоида

гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии

14.01.24 - Трансплантология и искусственные органы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 Пг.ОЯ 2014

Москва-2014

005555369

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет» и в отделе биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России.

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

Шевлкж Николай Николаевич

Усов Виктор Васильевич

Егоров Виктор Иванович

Доктор биологических наук, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России

Доктор медицинских наук, профессор,

ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет, заведующий кафедрой клинической и экспериментальной хирургии Школы биомедицины ДВФУ

Доктор медицинских наук, профессор,

ФГБУ «3 Центральный военный клинический госпиталь им. A.A. Вишневского Министерства обороны России, заведующий отделением микрохирургии уха

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова".

Защита состоится « 014 года в /i "часов на заседании диссертационного совета

Д.208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и на сайте http://transpl.ru/about center/science activity/dissertation council/ Автореферат разослан « »_2014 года

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной реконструктивной и восстановительной хирургии получили развитие и широко применяются методы органоспецифического замещения поврежденных структур с помощью биосовместимых материалов.

Одной из ключевых и актуальных проблем является создание материалов с оптимальными биоинженерными свойствами (Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И., 2006; Василец В.Н. и др. 2010). Достижения в области молекулярной и клеточной биологии демонстрируют принципиальную возможность восстановления поврежденных тканей и органов с помощью материалов, способных имитировать свойства замещаемых биологических структур (Шумаков В .И., Севастьянов В.И., 2003; Campoccia D. Et al„ 1998; Adams E., 2003; Hewood E„ 2004).

Для производства биопластических материалов используются биодеградируемые полимеры: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, фиброины шелка, полиэфиры бактериального происхождения - полиоксибутираты и их сополимеры (Севастьянов В.И., Кирпичников М.П., 2011). Отличительная особенность биоматериалов - их способность к биодеградации и включение в метаболизм клеток продуктов распада, которыми являются моносахара, молочная и гликолевые кислоты и др.

При создании современных конструкций для реконструктивной и восстановительной хирургии разработчики используют гиалуроновую кислоту (ГК) - гликозаминогликан, естественный компонент внеклеточного матрикса тканей позвоночных животных (Хабаров, В.Н., 2012; Brown Т., Alcom D., Frazer J., 1999; Brun P., Cortivo R., Radice M., Abatangelo G., 1999; Aziz Z., Abu S., Chong N., 2012). Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, таким как высокая гидрофильность и мультиполярность, молекула ГК способствует формированию оптимального внеклеточного матрикса для восстановления поражённых органов, предотвращая явления фиброза и формирование Рубцовых тканей (Зиновьев Е.В. и др., 2014; Burg, К., 2000; Heitland, А., 2004; Kelechi Т. J., 2012).

В большинстве своем наноструктурированные материалы на основе ГК получают с помощью технологии химической модификации и биосинтеза дополнительных протеиновых компонентов (Сяобин Жао и др., 2010; Kuzuya М„ Satake S., Miura Н„ 2006; Sanginario V. et al„ 2006). Высокая эффективность микро- и наноструктурированных биоматериалов на основе ГК подтверждена клиническими показателями, например, при лечении дефектов покровных тканей, вызванных повреждениями (механические травмы, ожоги) и заболеваниями сосудов (трофические язвы нижних конечностей) (Савельев B.C., 2001; Зиновьев Е.В., 2013; 2014).

К одному из перспективных направлений использования биопластических материалов многими исследователями относится разработка 2D и 3D матриксов для тканеинженерных

конструкций и биоискусственных органов (Севастьянов В.И., 2009; Edmonds М., 2009; DiDomenico L., Emch K.J., Landsman A.R., et al., 2011; Cheng A, Saint-Cyr M„ 2012; Dumville J.C., Deshpande S., 2013).

Одним из перспективных направлений применения биопластических материалов в последнее время является их использование в качестве структурной основы для тканеинженерных конструкций (ТИК). ТИК по сравнению с суспензионными клеточными трансплантатами повышают выживаемость клеток, обеспечивают их более активную пролиферацию за счёт адгезии на матриксе. Материал ТИК, выступает в роли объемообразующего агента, способствует активной индукции ангиогенеза и репаративной регенерации (Сухих Г.Т. и др., 2002; 2013). Благодаря ряду специфических физико-химических свойств (гидрофильность, мультиполярность, иммунологическая толерантность) молекула ГК, используемая как основа для ТИК, способна формировать оптимальный внеклеточный матрикс (Shih H.N., et al., 2004; Snyder S„ 2012; Хабаров B.H., 2012).

В ряде работ показано, что применение гиалуроновой кислоты (естественного протеогликана аморфного межклеточного вещества тканей) в хирургической практике открывает большие перспективы для разработки новых методов органоспецифической регенерации (Адельшин А.И. и др., 2013; Зиновьев Е.В. и др., 2013; 2014; Snyder D., 2012). Однако для реализации данного направления требуется проведение исследований в плане нехимического структурирования макромолекул гиалуроновой кислоты с целью получения пластических материалов с оптимальной матрицей и функциональными свойствами. Кроме того, важно учитывать совместимость будущих материалов с клеточными технологиями, позволяющих значительно расширить их клинические показания и заложить основы для создания новых тканеинженерных конструкций и биоискусственных органов.

Степень разработанности темы исследования. Известны гидрогели и пластические материалы, изготовленные с применением гиалуроновой кислоты и химически модифицированных материалов по типу «нетканого волокна» (технология этерификации "HYAFF'). Гидрогели ГК и «нетканые волокна» HYAFF, в силу специфики технологии изготовления, неизбежно содержат химические примеси, токсичные для клеток, что является сдерживающим фактором для их широкого клинического применения и биоинжиниринга (Snyder S., 2012; Хабаров В.Н., 2012; Рева Г.И., Усов В.В., 2013). Вопрос о разработке новых материалов на основе ГК с использованием технологий фотохимического микро- и наноструктурирования до сих пор остаётся открытым, что и послужило основанием для выполнения настоящей работы.

Цель работы: разработка и экспериментально-клиническое исследование микро- и наноструктурированного биопластического материала на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии .

Основные задачи работы.

1. Разработать технологию получения биопластического материала из гидрогеля гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса методом фотохимического микро- и наноструктурирования.

2. Исследовать физико-химические и биологические свойства полученного биопластического материала. Оценить степень биологической совместимости материала в условиях in vitro и in vivo.

3. Изготовить биоинжеиерные конструкции на основе полученного биопластического материала и изучить их биологические свойства на экспериментальных моделях в условиях in vitro и in vivo.

4. Разработать медико-технические требования к созданию биопластического материала для восстановления дефектов тканей.

5. Оценить клиническую эффективность биопластического материала при миринго- и дерматопластике.

Научная новизна работы. Разработана оригинальная рецептура смеси гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для эффективной фотохимической сшивки макромолекул, сопровождающейся микро- и наноструктурированием получаемого биопластического материала.

Создан биопластический материал, имеющий ячеисто-сетчатую структуру, которая обеспечивает эффективную адгезию, миграцию и пролиферацию прививаемых клеточных элементов.

Предложена новая методика биопластики для восстановления дефектов покровных тканей с применением созданного пластического материала.

Экспериментально-клиническими исследованиями продемонстрирована высокая эффективность использования созданного биоматериала в хирургической практике для восстановления дефектов покровных тканей, в том числе у пациентов с рефрактерностью к традиционной терапии. Доказана стабилизация достигнутого эффекта в течение ближайшего и отдаленного срока наблюдения.

Разработаны показания и противопоказания к применению нового изделия медицинского назначения — биопластического материала Гиаматрикс.

Теоретическая и практическая значимость работы. С использованием оригинальной технологии фотохимического микро- и наноструктурирования гидроколлоида гиалуроновой кислоты разработаны новые изделия медицинского назначения - биопластический материал Гиаматрикс и 3 D матрикс G-DERM.

Разработан клинический алгоритм применения биопластического материала у больных с дефектами тканей различной этиологии в ото- и общехирургической практике. Получено регистрационное удостоверение Росздравнадзора на биопластический материал Гиаматрикс (№ФСР 2011/10313 от 18.03.2011 г.). Данный материал широко применяется в ведущих медицинских учреждениях и центрах по показаниям пластики дефектов покровных тканей у больных с трофическими язвами на фоне сосудистой недостаточности. Организовано промышленное производство данного биопластического материала.

Клиническое использование Гиаматрикс по специальным показаниям, например, при мирингопластике позволяет в короткие сроки восстановить целостность барабанной перепонки у больных с постгравматическими перфорациями, хроническими мезотимпанитами, эпитимпанитами и болезнью оперированного уха.

Предлагаемый метод с использованием нового биопластического материала делает возможным улучшение качества лечения, и сокращение периода медико-социальной и профессиональной реабилитации пациентов.

Методология и методы исследования. Методологическая часть исследования основана на аргументированном применении алгоритмов научного поиска. В ходе проведения экспериментальных исследований изучены биофизические свойства гидроколлоида гиалуроновой кислоты, разработана технология его структурирования с получением пластических материалов с заданными биоинженерными параметрами, оценена их биосовместимостъ.

Доклинические исследования выполнены в соответствии с международными требованиями оценки биологического действия медицинских изделий и включали в себя методы in vitro и in vivo.

Клинический раздел выполнен в дизайне сравнительного рандомизированного открытого исследования (клинические, инструментальные, морфологические, микробиологические, иммунологические, статистические методы).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Технологическая платформа создания биопластического материала с заданными биоинженерными свойствами основанная на фотоиндуцировании химических связей между макромолекулами в гидроколлоиде гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса.

2. Экспериментальные подходы к фотохимическому структурированию макромолекул гиалуроновой кислоты для получения имплантируемых материалов с высокими биосовместимыми и функциональными свойствами.

3. Экспериментальные модели пролиферативных процессов в выделенных культурах фибробластов и кератиноцитов человека in vitro.

4. Способ применения биопластического материала для клинической технологии биопластики дефектов покровных тканей.

5. Метод хирургического лечения хронических средних отитов, посттравматических перфораций барабанной перепонки, венозно-трофических язв, восстановления дефектов покровных тканей, в т.ч. у пациентов с рефрактерностью традиционной терапии, разработанный на основе результатов доклинических и клинических исследований биоматериала).

Степень достоверности и апробация материалов исследования

Достоверность исследований определяется репрезентативным объёмом групп экспериментальных и клинических наблюдений, использованием современных методов объективной оценки и верификации полученных научных результатов, а также применением современных методов статистической обработки данных. Выводы, положения и рекомендации аргументированы системным анализом достаточного объёма выборок разноплановых исследований.

Апробация и публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 1 монография, 46 статей в периодических изданиях, в том числе 39 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных результатов диссертаций на соискание доктора наук, получено 8 патентов РФ на изобретение, поданы 2 международные заявки на изобретение.

Результаты исследований доложены и обсуждены на II Всероссийском инновационном конвенте (г. Санкт-Петербург, 2009 г.), I конвенте ПФО (г. Нижний Новгород, 2009 г.), Межрегиональном форуме-выставке «Чувашия-био» (г. Саранск, 2009 г.), Всероссийской научно-практической конференции оториноларингологов с международным участием «Достижения и перспективы развития микрохирургии уха и верхних дыхательных путей» (г. Оренбург, 2011г.), V всероссийской научно-практической конференции (г. Оренбург, 2011 г.), XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (г. Казань, 2011 г.), I Всероссийском инновационном форуме «РусИнноМед-2011» (г.Пермь, 2011 г.), I Международной научно-практической конференции (г. Екатеринбург, 2011 г.) международном конгрессе «Image Nano» (Бильбао, Испания, 2011 г.), Международном семинаре «Передовые российские технологии» (Мадрид, Испания, 2011 г.), Ш и IV Международных форумах Роснанотех (г. Москва, 2010 г., 2011 г.), Международном форуме «Инновационные технологии лечения ожогов и других травм в медицине катастроф» (Нагория, Израиль, 2013 г.), Международном форуме «Открытые инновации» (Москва, 2013 г.), I Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013г), Форуме «U-NOVUS» (Томск, 2014 г.).

Реализация результатов исследования. Разработанный биопластический материал внедрён в клиническую практику крупных лечебно-профилактических учреждений РФ, среди которых Институт хирургии РАН им. А.В. Вишневского, клиника военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Дальневосточный ожоговый центр. Теоретические и практические результаты исследований используются в учебном процессе на кафедрах Оренбургского государственного университета и Оренбургской государственной медицинской академии.

Личный вклад автора заключается в проведении аналитического обзора литературы (100 %), составлении программы исследования (95 %), разработке карты обработки медицинских документов (95 %), сборе и анализе данных (95 %), статистической обработке результатов (95 %). Соискатель разработал план и провел серии биофизических работ и экспериментов с участием лабораторных животных (60 %), участвовал в отборе пациентов для проведения клинических исследований (85 %).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 322 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, содержащих обзор литературных данных по излагаемой проблеме, описания экспериментальных и клинических исследований, методов обследования, результатов собственных исследований, обсуждений полученных результатов, выводов, а также практических рекомендаций и библиографического указателя, состоящего из 160 отечественных и 272 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 139 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В основу диссертации легли теоритически обоснованные, исследованные экспериментальными методами in vitro и in vivo и подтверждённые практически на анализе 120 клинических наблюдений материалы.

Компоненты и разработка биопластического материала

В качестве исходных компонентов при разработке нового биопластического материала, были использованы:

1. Гиалуроновая кислота (натрия гиалуронат кристаллический химический чистый для научных исследований) производства НПО «Вектор» (Россия), НПО «СОЛЯРИС-СЕРВИС» (Россия), SHAANXI SCIPHAR BIOTECHNOLOGY, LTD (Германия-Китай), HANGRHOU ONION CHEMICAL (Китай).

2. Пептидный комплекс (набор олигопептидов химический чистый для научных исследований) производства Biotrend GmbH (Германия), Sederma (Франция) и JPT Peptide GmbH (Германия).

Изучение компонентов с целью разработки их рецептурного соотношения проводили следующими методами.

УФ-спектроскопию гидрогеля ГК проводили на спектрофотометре «Solar СМ-2203», с диапазоном измерений 190 - 1100 нм, шириной выделяемого спектрального интервала 5 нм по стандартной методике.

ИК-спектры поглощения полимерной пленки измеряли на ИК-спектрометре с Фурье-преобразованием «Инфралюм ФТ-02» с техническими характеристиками: спектральный диапазон измерений 350-6000 см"1, предел погрешности 0.005 см"1.

Для оценки содержания пептидной фракции в исходном гидроколлоиде гиалуроновой кислоты использовали методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Экспериментальные исследования

В экспериментальную часть работы были включены биофизические исследования анализом фотохимических свойств как самого гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса, так и полученного на его основе биополимера, а также доклинические исследования биопластического материала методами in vitro и in vivo с созданием экспериментальных моделей.

Материалы экспериментального исследования

Для проведения экспериментальных и клинических исследований образцы биопластического материала, получаемого методом фотохимического микро- и наноструктурирования исходных компонентов, изготавливали в виде вид пластин белесовато-золотистого цвета размером 10 х 15 см, толщиной 500 мкм (рис. 1). Биопластический материал в виде пластин был обозначен как Гиаматрикс.

Рис. 1. Биопластический материал

Регулируя соотношение исходных компонентов: гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса и конструкцию заливочных форм при фотохимическом микро- и наноструктурировании композиции, были получены биопластический материал в виде губчатых или трубчатых форм (рис.2,3). Данные образцы были обозначены как ЗЭ матриксы в-ОБЯМ.

Рис.3. Трубка из биопластического материала

Методы исследования физико-химических и биофизических свойств образцов пластин биопластического материала

Исследования физико-химических и биофизических свойств биоматериала проводили в Центре коллективного пользования «Институт микро- и нанотехнологий Оренбургского государственного университета».

Электронные спектры поглощения измеряли на спектрофотометре SolarCM-2203. Инфракрасные спектры поглощения и нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) измеряли на Фурье-спектрофотометре Vanan 3100FT-IR.

Микроструктуру биоматериала исследовали с помощью сканирующего атомно-силового микроскопа (ACM) СММ-2000 (ЗАО «КПД», Зеленоград). Для получения АСМ-изображений в воздушной среде использовали треугольные кантилеверы жесткостью 0,01 н/м с пирамидальной иглой радиусом кривизны г- 15 - 25 нм.

Проницаемость по кислороду регистрировалась методом лазерного флеш-фотолиза и оценена по тушению кислородом (Ог) замедленной флуоресценции (ЗФ) молекулярных зондов, внедренных в биоматериал.

Оценка биологического действия

Исследования и испытания в соответствии с требованиями международных и межгосударственных стандартов серии ГОСТ ISO 10993-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» проведены в испытательной лаборатории доклинических исследований «БИОМИР» Института медико-биологических исследований и технологий (AHO «ИМБИИТ»).

Исследование взаимодействия биопластического материала с культурами клеток в условиях in vitro.

Тестирование образцов пластин биопластического материала в культуре мультипотентных мезенхимально стромальных клеток (ММСК) in vitro.

Работа была выполнена на базе научно-производственной лаборатории клеточных технологий Оренбургского государственного университета.

Мезенхимные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч) были выделены из биоптата жировой ткани взрослого человека с помощью механической дезагрегации и ферментативной обработки 0,1% коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующей отмывкой и центрифугированием. Клетки культивировали в среде Alpha-MEM (Панэко, Россия), содержащей 10% ЭТС (Hyclone, США), добавку ITS (Gibco, США), в присутствии антибиотиков пенициллин/стрептомицин. Культивирование производили в пластиковой посуде фирмы Coming (США) в стандартных культуральных условиях (5% СОг; температура +37°С). Пересев клеточных культур проводили по стандартной методике с использованием растворов

Версена (Панэко, Россия) и Трипсин-ЭДТА (Панэко, Россия). С целью прижизненной визуализации клеток на непрозрачном объекте (губка), на 1 пассаже после выделения, культуру клеток трансфицировали геном красного флуоресцирующего белка TagRFP под CMV-промотором при помощи лентивирусной конструкции (ООО Евроген, Россия). Тестирование проводили в двух группах: первая группа - контрольная (клетки без биопластического материала); вторая группа - опытная (с присутствием биопластического материала определённых размеров в среде для культивирования).

Во всех группах проводилось определение скорости пролиферации, морфологии и ее изменение в динамике, определение экспрессии щелочной фосфатазы как маркера остеогенной дифференцировки, определение жизнеспособности клеток методом окраски на трипановый синий, определение скорости миграции клеток и сканирующая электронная микроскопия.

Срок культивирования ММСК в присутствие биоматериала составляло 26 суток. Ежедневно проводили видеодокументирование в каждой группе и серии экспериментов. Оценку площади клеток проводили на аппаратно-программном комплексе Axio Observer Al фирмы Carl Zeiss, с программным обеспечением Axio Vision. Кластерный анализ культуры осуществляли на программном комплексе Image J и Image Pro Plus, деление клеток на группы проводили исходя из плотности пикселей на объект.

Подсчет клеток осуществляли на аппаратном комплексе Vi-Cell XR, фирмы Becman Coulter перед посевом и по окончании культивирования. Рассчитано число удвоений культуры за период культивирования и определена скорость удвоения культуры (удвоений/час).

Иммунофенотипирование ММСК проводили на проточном цитофлюориметре FACS Canto фирмы Becton Dickinson непосредственно перед посевом и после снятия клеток на 19 и 26 день культивирования. Исследовали следующие антигены: CD90, 44, 45, HLA-ABC, HLA-DR, 73, 34, 105, 14. Оценка миграционной способности данных клеток проводили по видеозаписи их роста 3-суточными циклами всего периода культивирования.

Взаимодействия образцов 3D «матрикса G-DERM» с культурами клеток Исследования проводили на биопластическом материале в виде губки с размерами 10 х 15см, и толщиной 10 мм на культурах постнатальных фибробластов кожи человека, мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека и эпидермальных кератиноцитов.

Изучение клеточных реакций в условиях in vitro на 3D «матриксах G-DERM» изучалось в культуре клеток фибробластов кожи, мезенхимных стромальных клеток жировой ткани и эпидермальных кератиноцитов человека.

Постнатальные фибробласты кожи человека (ФЧ) были выделены из биоптата кожи взрослого человека с помощью механической дезагрегации и ферментативной обработки 0,1% коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующей отмывкой и центрифугированием.

Клетки культивировали в среде DMEM (Панэко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hyclone, США), в присутствии антибиотиков пенициллин/стрептомицин. Культивирование производили в пластиковой посуде фирмы Corning (США), в стандартных культуральных условиях (5% С02; температура +37°С). Пересев клеточных культур проводили по стандартной методике с использованием растворов Версена (Панэко, Россия) и Трипсин-ЭДТА (Панэко, Россия). С целью прижизненной визуализации клеток на непрозрачном объекте (губка), на 3 пассаже после выделения культуру фибробластов трансфицировали геном зеленого флуоресцирующего белка EGFP под CMV-промотором при помощи лентовирусной конструкции (ООО Евроген, Россия). В дальнейшем клетки на губке можно было наблюдать с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus 1X51 (Olympus, Япония).

Мезенхимные стромальные клетки жировой ткани человека (МСКЖТ) выделялись по методике, описанной выше. В дальнейшем клетки на губке можно было наблюдать с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus 1X51.

Эпидермальные кератиноциты человека (ЭКЦ) были выделены из биоптата кожи взрослого человека с помощью механической дезагрегации и ферментативной обработки диспазой (протеаза тип 9) (Sigma, США) и Трипсин-ЭДТА (Панэко, Россия) с последующей отмывкой и центрифугированием. Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, Россия), содержащей 10% ЭТС (Hyclone, США), добавку ITS (Gibco, США), эпидермальный фактор роста 10 нг/мл (Peprotech, США) в присутствии антибиотиков пенициллин/стрептомицин. Культивирование производили в пластиковой посуде фирмы Corning (США) в стандартных культуральных условиях (5% СОг; температура +37°С). Пересев клеточных культур проводили по стандартной методике с использованием растворов Версена (Панэко, Россия) и Трипсин-ЭДТА (Панэко, Россия). С целью прижизненной визуализации клеток на 1 пассаже после выделения, культуру фибробластов трансфицировали геном красного флуоресцирующего белка TagRFP под CMV-промотором. В дальнейшем клетки на губке наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Была выявлена способность образцов 3D матрикса G-DERM поддерживать миграцию клеток внутрь губки по поверхности, на которую изначально помещены клетки при посеве. Для этого проведён гистологический анализ материала после клеточного культивирования в полной ростовой среде в течение 21 суток для ФЧ, МСКЖТ и ЭКЦ. Матрицы фиксировали в 4 % формальдегиде, отмывали в PBS, заливали в парафиновые блоки и затем на микротоме получали препараты гистологических срезов губок (толщина 5 мкм), используя стандартные методики. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином и фотографировали в проходящем свете, а также окрашивали DAPI и фотографировали, используя флуоресцентный микроскоп.

Исследование тканевой совместимости биопластического материала in vivo

Исследование проводилось в условиях эксперимента на лабораторных животных, материалом для исследований послужила кожа крыс линии Wistar с подшитым под неё биопластическим материалом. Животных содержали в стационарных условиях вивария при температуре 18-20'С, на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде. Перед проведением эксперимента крыс выдерживали в карантине 20 дней. Все болезненные манипуляции проводили под эфирным наркозом, животных выводили из опыта методом цервикальной дислокации на 7, 14 и 21 сутки. Было сформировано 2 группы животных: в контрольной группе исследовали кожу интактных крыс, в опытных - кусочки кожи на границе с имплантированным биоматериалом. Для гистологических исследований фиксацию материала проводили в 10% растворе нейтрального формалина, с последующим уплотнением тканей в парафиновой проводке. Готовили серийные гистологические срезы. Окраска: гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон на волокнистые структуры, альциановым синим для выявления кислых мукополисахаридов (КМПС).

Клинические исследования

Исследования клинической эффективности биопластического материала при лечении трофических язв были выполнены на клинической базе госпитальной хирургии и урологии Оренбургской государственной медицинской академии, хирургического отделения железнодорожной больницы ст. Оренбург и поликлиники № 1 городской клинической больницы № 3 г. Оренбурга. Общее количество пациентов с трофическими язвами составило 30 человек основной группы с неэффективной традиционной терапией. В представленной группе были 21 (70 %) пациент с варикозной болезнью нижних конечностей (ВБНК) и 9 (30 %) пациентов с постгромбофлебитической болезнью (ПТФБ).

Для всех больных при поступлении применен стандартный набор инструментально-клинических исследований и дана оценка статуса венозной системы нижних конечностей. Состояние трофических язв оценивалось по морфологическим критериям, результатам бактериологических исследований (качественный и количественный состав микрофлоры, антибиотикочувствительность) и данных цитологического изучения тканевых отпечатков. Площадь язвенных дефектов измеряли в динамике методом фотопланиметрии с учетом краевой и очаговой эпителизации.

Исследования клинической эффективности биопластического материала у пациентов с хроническим туботимпанальным средним отитом, хроническим гнойным эпитимпано-антральным средним отитом, болезнью оперированного уха, острым посттравматическим разрывом барабанной перепонки были проведены на клинической базе кафедры оториноларингологии факультета последипломного образования Оренбургской

государственной медицинской академии. В основной группе пациентов (90 человек) для мирингопластики был использован биопластический материал, данная группа была сформирована среди пациентов с неэффективной традиционной терапией, в связи с чем, контрольная группа в исследовании не выделялась. При поступлении у пациентов оценивали остроту слуха (исследования живой речью, камертональными пробами и аудиометрией). Наличие дефектов барабанной перепонки выявляли методами отоскопии, отомикроскопии.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Технология изготовления биопластического материала

В отличие от большинства других полисахаридов, гиалуроновая кислота (ГК) содержит в боковых цепях аминокетогруппы >Ш-(С=0)-СНз. Эти группы термически устойчивы, однако могут быть активны фотохимически. В ультрафиолетовых спектрах ГК наблюдается полоса поглощения в области 230 нм. Карбонильные группы поглощают в ультрафиолетовой области спектра, и, переходя в возбужденные состояния, претерпевают химические превращения с достаточно высокой эффективностью. В алифатических кетонах, содержащих карбонильные группы, известны четыре типа первичных реакций: а-расщепление, отщепление атома водорода, образование комплексов с переносом заряда и элиминирование а-заместителей. При фотохимическом а-расщеплении (реакция Норриша I) образуются активные свободные радикалы, способные образовать новые химические связи в местах пространственного сближения цепей гиалуроновой кислоты. Именно эти сшивки образуют устойчивый трехмерный микро- и наноструктурированный каркас гидрогеля ГК. Радикалы, не участвующие в образовании сшивок, быстро исчезают в результате обратной рекомбинации и не влияют на химические, биологические и другие свойства материала.

Фотохимические превращения в гидроколлоиде были положены в основу технологии создания матрикса пластического материала за счет формирования фотоиндуцированных межмолекулярных связей. Технология включала оптимизацию состава исходного гидрогеля ГК и условий его фотохимической модификации. Наиболее эффективно сшивка фотохимически активных групп происходит при облучении гидрогеля светом с длиной волны, соответствующей максимуму полосы поглощения исходной смеси.

На рисунке 4 приведен электронный спектр поглощения биополимерной пленки, полученной поливом гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты на кварцевую подложку. Для создания биопленки производилось облучение раствора УФ излучением в течение 6 часов, при этом видимых изменений в электронном спектре поглощения, по сравнению с необлученной пленкой, не наблюдается. Это свидетельствует о том, что процесс облучения не вызывает

деградации ГК в составе биопластического материала, количество сшивок невелико и основная масса макромолекул не разрушается.

Рис. 4. Спектры поглощения биопластического материала

В спектрах поглощения проявляются два широких бесструктурных максимума. За коротковолновое поглощение (X < 230 нм) ответственны молекулы ГК. длинноволновый максимум поглощения (А. = 280 нм) - результат суммарного поглощения входящих в состав питательной среды пептидов.

На рис. 5 приведены ИК-спектры поглощения двух образцов: пленки, полученной без УФ облучения раствора (2) и биоматериала, полученного из этого же гидрогеля при УФ облучении (1). После УФ облучения незначительно меняется соотношение интенсивности полос поглощения и появляется новый максимум на 870 см"'.

Рис. 5. Нормированные ИК спектры поглощения биополимеров: 1 - разработанный биоматериал; 2 - биополимер, полученный из исходного гидрогеля без УФ-обработки

Для выяснения природы вновь образовавшихся связей проанализируем характеристические частоты поглощения различных групп атомов, представленных в таблице 1. На 870 см"1 могут проявлять себя валентные С-С колебания, симметричные и асимметричные С-О-С, ковалентно-связанные N=0, деформационные С-Н колебания.

Таблица 1 - Виды колебаний и функциональные группы

Волновое число, см"' Вид колебаний Функциональная группа

800-900 Валентные колебания С-С

830-940 Симметричные и асимметричные валентные колебания в алифатических простых эфирах С-О-С

840-870 Ковалентно-связанные колебания N = О

780-975 Деформационные колебания С-Н

Таким образом, в результате УФ-облучения за счет химических сшивок между макромолекулами в биоматериале формируется микро- и наноструктурированный трехмерный каркас с характерными размерами ячеек порядка 20-100 им (см. АСМ изображения, представленные ниже). Система ковалентных связей дополняется переплетениями макромолекул и лабильными водородными связями между ними. В отличие от большинства других полисахаридов ГК содержит в боковых цепях фотоактивные амидокетогруппы. Ранее такая технология для модификации ГК не применялась из-за низкой фотохимической активности простых полисахаридов.

При исследовании пептидного компонента биопластического материала обнаружены пептидные комплексы различного аминокислотного состава с варьирующей молекулярной массой 244-459 Да. (табл. 2). В обнаруженных пептидах превалируют алифатические (лейцин, изолейцин, аланин, глицин) и полярные незаряженные аминокислотные остатки: треонин, пролин, гистидин, серии, а также полярные заряженные аминокислотные остатки: аргинин, глутамин, аспарагин, лизин, аргинин. Присутствуют димеры изолейцинов, и полимерные трипептиды, в том числе пептиды, содержащие ароматические аминокислотные остатки (триптофан) и полярные незаряженные аминокислотные остатки. Время удержания на колонке обнаруженных пептидов варьируется в интервале от 6,162 до 13,806 минут, погрешность измерения прекурсорных ионов от - 7,24 до 11,24 ррт, все пептиды зарегистрированы как псевдомолекулярные ионы в зарядном состоянии 1+. При поиске в базе данных Uniprot/TrEMBL зарегистрированные пептиды были выровнены по алгоритму BLAST и обнаружены как возможный неспецифичный потенциальный продукт ферментативного гидролиза хемотрипсином или термолизином 12125 белковых молекул. В тандемном спектре распада обнаружены пики гистидина и бета-аланина, подтверждающие присутствие карнозина как уникального дипептида. Обнаружен пик карнозина с m/z 227.3273 в зарядном состоянии 1+,

соответствующий молекулярной массе 226.31. Время удержания карнозина составляет 8,38 минут, ошибка измерения прекурсорного иона 3,65 ррш.

Таблица 2,

Результаты анализа проб пептидных компонентов

Состав Хим.формула Масса, Да Дельта массы в нанопотоковом режиме Масса в отн.ед.

Иу-Тгр-Пе с19н2ел4о4 374.19541 -2.33 10.692

А^-01у-А$р с17н,5 м7о4 432.24512 11.25 7.453

Пе-Авр-Пе С16Н29Ы306 359.20564 12.97 8.674

РЬе-А^-Рго C2oHзoN604 418.23285 -0.29 9.024

ап-Шв-Шв С|7Н24Ы805 420.18697 -5.74 17.732

А1а-Тгр-Ьув С20Н29Ы5О4 403.22195 -5.76 8.934

Рго-Шв-Туг С20Н25Ы5О5 415.18557 -11.10 14.407

ТЬг-Тгр-Тф с26н29ы5о5 491.21687 -12.84 9.460

Ьув-РЬе-ТЬг с19нзоы4о; 394.22162 -7.25 8.854

Ьу8-А^-Ме1 С17Нз5Ы70452 433.24712 10.73 9.102

РЬе-Сув-Ме! С17Н25Ы30452 399.12865 4.19 11.108

11е-11е С,2Н^2Оз 244.17869 8.67 11.038

Авр-Ьув-Ьув С16Нз,К5Об 389.22743 16.59 8.863

Тгр-Рго с16н19к3зоз 301.14264 -18.38 10.672

аи-ТЬг с9н,бы2о6 248.10084 3.47 5.500

Эеято.чте ОмВД^Оц 526.28769 -15.37 9.523

Особый интерес представляет обнаружение в пробах десмозина (аминокислоты, производной лизина). Десмозин содержится в белке эластине. Благодаря своей разветвлённой структуре, которая имеет четыре аминокислотных группы, одна молекула десмозина может входить одновременно в четыре пептидные цепи. Этим самым она скрепляет различные нити эластина и придаёт этому белку упругость.

На этапе фотохимического структурирования ГГК идрогель наносится слоем примерно 3 мм на плоские гидрофобные поверхности. Эмпирически показано, что изменяя исходную концентрацию ГК и пептидов в растворе, можно управлять характерными размерами микро- и наноструктурированного каркаса биопластического материала.

Методом сканирующей зондовой микроскопии была исследована поверхность биоматериала, что позволило с нанометровым латеральным пространственным разрешением охарактеризовать его структурные особенности.

Ультраструктура поверхности материала, визуализированная методом атомно-силовой микроскопи (АСМ), представлена глобулярными образованиями однотипной морфологии (рис.б). .

Рис. 6. АСМ-профиль глобулярной структуры поверхности биоматериала

Морфометрический анализ размеров визуализированных глобулярных структур позволил рассчитать средние значения их длины, ширины и высоты с учетом формы и радиуса кривизны используемого зонда. Длина объектов составила 101,5 ± 11,2 нм, ширина — II 0,3 ± 10,7 нм. высота - 23,4 ± 3,4 нм. При этом нужно отметить, что высота глобулярных объектов - величина относительная, поскольку получение точных значений высоты возможно только при расположении глобулярных образований на поверхности подложки в виде одиночных объектов. Расстояние между глобулярными образованиями равно 127,2 ± 21,3 нм.

Степень развитости рельефа проанализирована по параметру среднеквадратичной шероховатости (1Ц - отклонение точек профиля от его средней линии). Показано, что поверхность исследуемого препарата представляет собой однородную текстуру с значениями - 8,7 ± 0,5 нм (рис. 6).

Z: 10.1 (im

24 54 nffi | 44 83 nm |

19 13 nm •2 830 nfn I 22 02 nm |

-20 29nm 1001

oeclicnl 0 0'course 0 072'mean tii 4parlt[

Beafng

00

Rms rough [RqJ 8680nm Mean rough |Ral 6 530 rtn 1 Opt mean |Rj| 32.39nm

\ А • Ал t V 1

\А \/Л jVfV АЛ Л V

-vy V—-V v4i У v iу* ^ \1 V i

8 025rnkm I 8025mkm] 015Г баге 8025mkm Seel smooth 1 * »

Meanmdlh |Sm| 544 Onm Local width IS) 125 Orm Rms slope iDql 4 883' СоиеИюл 1.2

■OX

34 (K 67 05:

-1005

Hrst smooth 1

OX 337X CK

0.3» 11 ж

1S6>. 76 08X

I 157*| I6416X)

100Й

Рис. 7. Среднеквадратичная шероховатость поверхности разработанного биопластического материала

Биоматериал отличается стабильностью морфологических и относительной стабильностью механических параметров при увлажнении, что благоприятно сказывается на хранении и культивировании клеток при различных условиях окружающей среды.

Адгезия биопластических материалов на ране и эффективность миграции клеточных элементов в репаративном гистогенезе определяются с одной стороны их гидрофильными/гидрофобными свойствами, а, с другой, - микрорельефом. Известно, что закрепление соматических клеток с большей вероятностью происходит на поверхности материалов, обладающих высокой поверхностной энергией (на гидрофильной поверхности), а на основные клеточные процессы (рост, дифференциация, миграция) в большей степени оказывают влияние геометрические и размерные особенности рельефа биоматериала (Тата<3а У., 1ка(1а У, 2003).

Гидрофильные/гидрофобные свойства биоматериала оценивали по начальному значению краевого угла смачивания по воде, значение которого составило 83". На этой основе рассчитали работу адгезии (\¥а), которая с учетом коэффициента шероховатости, оказалась равной 99,88 мДж/м2, что характеризует поверхность материала как умерено смачиваемую [Татас1а У., 1кас1а У, 2003].

Такую относительно низкую гидрофильность поверхности пластины биополимера можно объяснить присутствием воздуха в полостях и порах биоматериала, который препятствует проникновению воды.

На рис.8 представлено распределение гидрофильных и гидрофобных областей на поверхности биопластического, полученное в режиме адгезионно-контактной атомно-силовой микроскопии.

Тёмные Гидрофобная участки область_

Светлые Гидрофильная участки область_

Рис. 8. АСМ-изображение распределение сил адгезии (гидрофильных / гидрофобных

областей) на поверхности биопластического материала. Шкала - 500 нм.

Взаимодействие биопластических материалов Гиаматрикс и 3 D матриксов G-DERM с культурами клеток.

Результаты тестирования пластин биопластического материала Гиаматрикс in vitro показали отсутствие какого-либо его негативного влияния на культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Морфометрические данные по эксперименту указывают на некоторое уменьшение площади клеток в исследуемой группе 3284,51 мкм2 (min 292,63 мкм2: max 32359,53 мкм2) против 3826,65 мкм2 в контроле (min 350,93 мкм2; max 36733,7 мкм2), при сопоставимой скорости пролиферации, что свидетельствует о хорошем состоянии клеток при продолжительном культивировании. Оценка способности клеток к таксису показала схожие результаты, дистанция движения клеток составила 281,50 мкм (min 33,0 мкм; max 722,0± 154,78 мкм) в исследуемой группе против 234,00 мкм (min 23,0 мкм; max 684,0±155,01 мкм) в контроле, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния материала на клетки. Результаты иммунофенотипирования не позволили выявить какого-либо различия в группах. Все клетки после культивирования экспрессировали стандартный набор стромальных антигенов CD 44, 73, 90, 105 и были негативны к гемопоэтическим маркерам CD 14, 34, 45, HLA-DR. Способность клеток адгезироваться и расти на исследуемом материале, была доказана наличием окрашенных клеток при окраске красителем «Гимза» и их ядер, при окрашивании специфическим красителем DAPI, активным только в присутствии ДНК.

В результате 26-дневного культивирования клеток получены доказательства митотической активности клеток, а также наличие в толще материала лакун, в которых располагались клетки (рис. 9).

Рис. 9. Сканирующая электронная микроскопия расположения клетки в «лакуне» материала (указано стрелкой)

В дальнейших исследованиях по клеточному культивированию in vitro был использован вариант объёмной (3D) матрицы G-DERM, которая имеет следующие морфометрические параметры:

• толщина от 3 мм до 100 мм;

• степень пористости от 70% до 90%;

• гетерогенное распределение пор со средним размером 252,6+98,73 мкм;

• длина глобулярных образований на поверхности материала при исследовании методами туннельной микроскопии 101,5 ± 11,2 нм, ширина 110,3 ± 10,7 нм, высота 23,4 ± 3,4 нм. В условиях in vitro была доказана способность 3D матрикса G-DERM (губки)

поддерживать миграцию клеток с поверхности внутрь материала. Гистологический анализ материала после культивирования в течение 21 суток (постнатальных фибробластов кожи человека (ФЧ), мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСКЖТ). эпидермальных кератиноцитов кожи человека (ЭКЦ)) показал трёхмерное распределение клеток по всей её структуре, в том числе миграция в глубину матрикса (рис.10-15). Плотность клеток максимальна на поверхности и в ближайших слоях и постепенно падает к центру толщины губки. Важно отметить, что в варианте с культурой ЭКЦ наблюдается образование эпителиального слоя на поверхности матрикса.

Рис. 10 Гистологический срез 31) матрикса С-БЕИМ с культурой клеток ФЧ, клетки отмечены стрелками. Окраска гематоксилин-эозином

Рис. 11. Гистологический срез губки ЗГ) матрикса Сж-ИЕНМ с культурой клеток МСКЖТ, ядра клеток отмечены стрелками. Окраска ядер клеток 1)АР1.

Рис. 12. Гистологический срез 31) матрикса О-ОЕИМ с культурой клеток, клетки отмечены стрелками. Окраска гематоксилин-эозином

Рис. 13. Гистологический срез губки 31) матрикса С-ОЕКМ с культурой клеток МСКЖТ, ядра клеток отмечены стрелками. Окраска ядер клеток ОЛР1

Рис. 14. Гистологический срез 30 матрикса С-ИЕКМ с культурой клеток ЭКЦ, клетки отмечены стрелками. Окраска гематоксилин-эозином

Рис. 15. Гистологический срез губки ЗБ матрикса О-ОЕШИ с культурой клеток ЭКЦ, ядра клеток отмечены стрелками. Окраска ядер клеток БАР!.

Результаты исследование тканевой совместимости биопластического материала in vivo продемонстрировали формирование грануляционной ткани в области имплантации, с последующим ограничением и постепенной биодеградации пластического материала в течение 14 суток. Отмечалось замещение материала созревающей соединительной тканью без его инкапсулирования и снижением клеточных реакций. Реакция на биоматериал проходила по

асептическому типу с формированием четких границ и сохранением нормальной гистологической структуры в окружающих тканях без Рубцовых изменений (рис.16).

Рис.16. 14 сутки после первичной хирургической обработки экспериментальной раны и применения биоматериала. Окраска: пикрофуксином по Ван Гизон. Ув. ок. 10: об.Ю

На месте резорбирующихся участков материала формируется тонковолокнистая соединительная ткань, предупреждается развитие грубых Рубцовых изменений. В контрольной группе отмечалось формирование грубой волокнистой ткани и рубцов (рис.17).

Рис.17. Контрольная группа, 21 сутки после первичной хирургической обработки раны и применения биоматериала. Окраска: пикрофуксином по Ван Гизон. Ув. об. 10.; ок. 10

Клиническое применение пластин биопластического материала Гиаматрикса при лечении трофических язв.

Применение биоматериала в клинических условиях на больных, имеющих трофические язвы на фоне варикозной болезни нижних конечностей (ВБНК) и посттромбофлебитической болезни (ПТФБ) стало следующим этапом работы. Изучение и анализ клинических наблюдений с 2007 по 2012 гг. проводились на клинической базах кафедры госпитальной хирургии и урологии Оренбургской государственной медицинской академии, расположенных в городской клинической больнице № 1 г. Оренбурга.

В исследование были включены пациенты, длительно страдающие трофическими язвами, в том числе с неэффективной традиционной терапией и с неудачными исходами хирургических методов лечения, неблагоприятным прогнозом по язвенному дефекту различной локализации, не имеющего тенденции к самостоятельному заживлению. У всех пациентов отмечались обширные язвенные дефекты, средняя площадь которых составляла 95,5+ 3 см2.

Местная терапия трофических язв была этапной и соответствовала определённой фазе раневого процесса (по классификации раневого процесса, предложенной М.И. Кузиным (1977)). В I фазу раневого процесса осуществляли очищение (туалет) и санацию трофической язвы и защиту окружающих тканей с использованием антисептиков (3% раствор борной кислоты, раствор Эплана, мирамистин и диоксидин). При наличии гнойного отделяемого из трофических язв применяли мази на гидрофильной основе (Левомеколь, Левосин, Диоксидин). Для очистки области язвенного дефекта от значительных наложений фибрина применяли протеолитические ферменты в виде мазей (Ируксол) или в составе специальных перевязочных средств, импрегнированных протеазами (Дальцикс-трипсин, ПАКС-трипсин). На этапе перехода раневого процесса во II фазу, когда отмечалось формирование грануляционной ткани, применяли разработанный способ биопластики с использованием разработанного биоматериала.

Выполняли туалет раны. Края раны иссекали с получением округлых кусочков жизнеспособной ткани кожи размером 0,5 на 1 мм, которые затем помещали в стерильный физиологический раствор температурой 36-37 °С. На подготовленную рану гладкой поверхностью накладывали пластический материал, пинцетом и ватным влажным тампоном его тщательно расправляли таким образом, чтобы материал полностью принял все рельефы подлежащих тканей и выступал за края раны на 0,5-1 см. Критерием правильного наложения считали отсутствие воздушных «карманов» и затёков. Материал при этом становился эластичным за счёт внешнего увлажнения тампоном, смоченным антисептиком, и впитывания раневого экссудата. Благодаря микроперфорациям под материалом не отмечалось скопления жидкости, наблюдался эффект дренирования ран. После того как материал прилипал к ране и

превращался в эластичную мембрану, в заранее выполненные скальпелем или ножницами лунки числом 3-5 на пластину средним диаметром до 10мм укладывали извлечённые из физиологического раствора кусочки жизнеспособных тканей самого пациента. Этот этап был обозначен как «частичная (парциальная) аутопластика». После заполнения всех лунок материала аутотканевыми элементами на его поверхность накладывали вторую пластинку так, чтобы лунки подлежащего слоя были закрыты пластинкой второго листа биоматериала. Сверху на материал помещали атравматическое раневое покрытие так, чтобы захватывалось не менее 1-2 см от краев раны. Затем сверху без нажима накладывали стерильную марлевую салфетку и производили бинтование. Выполнялась лёгкая компрессия.

Дальнейшее ведение раны осуществляли посредством этапных смен наружной повязки, в ходе которых проводится контроль процесса заживления (эпителизации) язвы. При обильном промокании повязки раневым (негнойным!) отделяемым смену наружной повязки производили ежедневно.

При смене наружной повязки визуально определяли состояние раны: отсутствие воспалительного инфильтрата, гиперемии и отёчности. В случае аллергических реакций на компоненты материала биопластику отменяли и пациента исключали из основной группы (1 случай наблюдения). При частичной биодеградации материала этот участок дополнялся новым лоскутом материала (рис. 18). Хорошим прогностическим признаком считали наличие тонкого нестратифицированного эпителия по краю раны и/или островчатой эпителизации, наблюдаемых при частичной метаболизации материала или при аккуратном его удалении.

Рис. 18. Наложение и адгезия биоматериала в области язвенного дефекта

Объективным подтверждением улучшения состояния трофических язв служило динамичное уменьшение площади язвенной поверхности, которое оценивалось методом фотопланиметрии с учетом краевой и очаговой эпителизации. Степень уменьшения площади язвенной поверхности за сутки у больных основной группы составила в среднем 2,7 ± 0,7 % (5,2 ± 0,6 % у больных ВБНК и 2,2 ± 0,7 % у больных с ПТФБ).

У 9 больных (30 % от общего числа волонтеров) на 8-10 сутки после выполнения биопластики отмечалось значительное снижение репаративной активности и практически нулевая скорость уменьшения площади язвенного дефекта. При выполнении повторной биопластики не удалось достичь сокращения площади язвы, и пациентам была рекомендована кожная аутодермопластика, которая была более успешной, поскольку рана стала выровненной по глубине и заполнена грануляционной тканью.

На 28 сутки от начала лечения у 21 больного (70 %) (с ВБНК у 17 чел. (54,8 %) и с ПТФБ у 4 чел. (12,9 %)) трофические язвы полностью эпителизировались. Среди неэпителизировавшихся язв площадь последних уменьшилась более чем на 50 % у 8 больных (25,8 %) (с ВБНК у 3 чел. (9,7 %) и с ПТФБ у 5 чел. (16,1 %)). У 1 больного (6,6 %) с ПТФБ площадь трофических язв уменьшилась менее чем на 50 %.

Результаты микробиологических исследований в динамике показали санирующий эффект в виде увеличения доли стерильных посевов, что, несомненно, отражает эффективность выбранной антибиотикотерапии и, вероятно, связано с эффектом защиты раны пластическим материалом от внешней бактериальной агрессии и стимуляцией регенеративных процессов в области язвенного дефекта.

Цитологический метод исследования мазков-отпечатков с поверхности трофических язв показал, что использование метода биопластики приводит к увеличению клеток, характеризующих регенераторную активность (макрофагов, фибробластов), и уменьшению клеток острого воспаления (нейтрофилов). Кроме того, выявлено значительное увеличение эпителиальных клеток. Результаты цитологического метода исследования подтверждены клиническими данными и свидетельствуют о том, что использование метода биопластики стимулирует регенераторные процессы трофических язв.

Полученные результаты свидетельствуют о значительном улучшении течения процессов регенерации в области язвенных дефектов и демонстрируют положительный эффект в группе пациентов с длительным «язвенным анамнезом» и неэффективным традиционным лечением.

Средняя продолжительность стационарного лечения больных основной группы составила от 21 до 25 дней. За период наблюдения в течение 5 лет у 6 больных (20 %) основной группы были выявлены рецидивы трофических язв, которые в основном были связаны с нарушением режима в виде отказа от эластичной компрессии нижних конечностей.

При проведении в оториноларингологии малоинвазивных эндоскопических и микрохирургических операций требуются тканеинженерные конструкции с фиброархитектоникой и функциональными свойствами, обеспечивающими эффективную репарацию замещаемых структур (Ашмарин М.П., 2006). В отоларингологии для восстановления целостности барабанной перепонки используют биотрансплантаты, которые

благодаря пластинчатому строению восполняют лишь дефекты барабанной перепонки. К таким биоматериалам относятся: OrCel - matrix, Apligraf, HYAFF, аутофасция височной мышцы (Agrawal С.М, 1997; Brown T.J., et al„ 1999; Brun P. et al., 1999; Burg KJL, 2000; Temenoff J.S., Mikos A.G., 2000; Pathiraja A. et al., 2003). В результате применения биоматериала Гиаматрикс образуется неотимпанальная мембрана с недостаточным восстановлением слуховой функции.

Разработанный Гиаматрикс. благодаря хорошей эластичности и адгезии, способен закрепляться по периферии в барабанное кольцо и находиться на границе раздела двух воздушных сред, что позволяет применять его в отохирургии. Для пластики дефекта барабанной перепонки из биоматериала выкраивается лоскут, превосходящий на 2 мм диаметр перфорации барабанной перепонки.

При изучении виброакустических свойств восстановленной барабанной перепонки с помощью лазерного автодинного измерителя по методике Мареева О.В. установлено, что подвижность барабанной перепонки в центральной части составила 160 нм, в задненижнем квадранте 270 нм, в задневерхнем квадранте 210 нм, в передненижнем квадранте 200 нм. При сравнительном анализе колебаний нативной и неотимпанальной мембран установлено, что их профиль амплитуд является сопоставимым.

Разработанная искусственная барабанная перепонка на основе биопластического материала Гиаматрикс успешно применялась для закрытия дефекта барабанной перепонки у больных ЛОР-отделения городской клинической больницы №1 г.Оренбурга. Готовый к применению пластический материал хранится в лиофилизированном состоянии в упаковке в тёмном сухом месте при температуре (+4 °С) в течение 36 месяцев.

Пластический материал обладает адгезионными свойствами, благодаря чему при мирингопластике прилипает к остаткам барабанной перепонки, в связи с чем, тампонада наружного слухового прохода не производилась (рис. 19).

Рис. 19. Укладка биопластического материала на область дефекта барабанной перепонки

После закрытия дефекта барабанной перепонки у больных улучшался или восстанавливался слух, купировался шум в ушах.

В группе больных с хроническим туботимпанальным средним отитом, имеющим дефект барабанной перепонки диаметром до 5 мм, после пластических операций с использованием искусственной барабанной перепонки положительный анатомический результат имел место в ближайшем периоде наблюдения у 18 (90%) больных, в отдаленном периоде наблюдения - у 20 (100%). Положительный функциональный результат с улучшением слуховой функции наблюдался в ближайшем периоде наблюдения - у 18 (90%) пациентов, в отдаленном периоде наблюдения- у 20 (100%) человек.

У пациентов с хроническим эпитимпано-антральным средним отитом использование разработанного материала для пластики дефектов барабанной перепонки эффективно. Положительный анатомический результат в ближайшие сроки наблюдения был у 17 (85%) пациентов, в отдаленном периоде наблюдения - у 18 (90%). Положительные функциональные результаты с улучшением слуха установлены в ближайшем периоде наблюдения - у 17 (85%) человек, в отдаленном периоде наблюдения - у 16 (80%) человек.

Методика использования искусственной барабанной перепонки для формирования неотимпанальной мембраны у больных с болезнью оперированного уха показала положительный анатомический результат в ближайшие сроки наблюдения у 7 (70%) оперированных больных, в отдаленном периоде наблюдения - у 9 (90%) пациентов. Положительный функциональный результат в ближайшие сроки наблюдения установлен у 7 (70%) больных, в отдаленном периоде наблюдения он не изменился и установлен у 7 (70%) пациентов.

Искусственная барабанная перепонка - высокоэффективный пластический материал, который можно использовать для пластики рецидивов дефекта неотимпанальной мембраны, возникших в ближайшем послеоперационном периоде после хирургических вмешательств на среднем ухе у больных хроническим средним отитом. Положительный анатомический результат наблюдался у 19 (95%) оперированных больных.

Также положительный анатомический результат наблюдался у 17 (85%) больных. У 3 (15%) пациентов с рецидивами дефекта барабанной перепонки для восстановления целостности тимпанальной мембраны пришлось повторно укладывать на дефект искусственную барабанную перепонку, и в итоге удалось добиться положительного анатомического результата у всех 20 (100%) больных. Положительные функциональные результаты с улучшением слуха имели место у 17 (85%) пациентов. У 3 (15%) человек слух улучшился после закрытия дефекта барабанной перепонки повторными укладками искусственной барабанной перепонки.

Заключение

Разработаны два типа 2D и 3D биосовместимых биополимерных материалов в виде пластин (Гиаматрикс) и 3D матрикса G-DERM. В условиях in vitro и in vivo доказали возможность использования Гиаматрикса для пластики дефектов покровных тканей. Полученные результаты в условиях in vivo показали перспективность применения матрикса 3D G-DERM в тканевой инженерии.

Обобщение полученных в результате клинических наблюдений данных позволяет предложить его использование при лечении трофических язв и дефектов барабанной перепонки, в частности при оказании неотложной хирургической помощи больным с острым посттравматическим разрывом тимпанальной мембраны, при плановых хирургических вмешательствах у больных хроническим средним отитом.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология фотохимического микро- и наноструктурирования гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса, позволяющая получать пластический эластичный материал толщиной 350 - 500 мкм, с однородной глобулярной поверхностью и наношероховатым рельефом поверхности (Rq - 8,7 ± 0,5 нм), обладающий адгезионными свойствами, умеренной гидрофильностью и морфологическим сходством с эпидермальным слоем кожи.

2. По разработанной программе биологических испытаний изделий, длительно контактирующих с тканями пациента, в условиях in vitro и in vivo доказана биологическая безопасность биоматериала.

3. В экспериментах в условиях in vitro выявлена способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток адгезироваться и пролиферировать на поверхности биоматериала Гиаматрикс и в порах 3D матрикса G-DERM.

4. Исследования in vitro на культурах кератиноцитов и фибробластов на 3D-биопластических материалах показали трёхмерное распределение данных клеток по всей структуре (отмечена миграция фибробластов в глубину материала) и формирование эпителиального слоя на поверхности данного матрикса, что предполагает перспективное использование 3D матрикса G-DERM для разработки новых тканеинженерных конструкций.

5. Результаты исследование функциональных свойств биопластического материала Гиаматрикс в течение 14 суток на экспериментальной модели эксцизионной раны продемонстрировали замещение биоматериала созревающей соединительной тканью и снижением клеточных реакций. Реакция на биоматериал проходила по асептическому типу с формированием четких границ и сохранением нормальной гистологической структуры в окружающих тканях без Рубцовых изменений.

6. На основе полученных экспериментальных данных разработаны медико-технические и технические требования к биопластическим материалам (Гиаматрикс, 3D матрикса G-DERM) и их производству. Получено регистрационное удостоверение на клиническое применение Гиаматрикса.

7. Получены положительные результаты клинического применения биопластического материала Гиаматрикс в группе пациентов с длительными незаживающими трофическими язвами на фоне сосудистой патологии и малоэффективной традиционной терапии. Разработаны показания и инструкция его применения.

8. Экспериментально апробирован и внедрен в клинику биопластический материал Гиаматрикс как имплантат для пластики дефектов барабанной перепонки у больных

хроническим средним отитом, болезнью оперированного уха и острым постгравматическим разрывом тимпанальной мембраны.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для применения в широкой клинической практике общей и пластической хирургии, отохирургии в целях эффективного восстановления дефектов покровных тканей различной этиологии рекомендован новый биопластический материал «Гиаматрикс» (Регистрационное удостоверение №ФСР 2011/10313 от 18.03.2011г.).

2. Показанием к применению биопластического материала является дефект покровных тканей.

3. Противопоказанием служит наличие системных, а также острых и хронических инфекционно-аллергических заболеваний.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в научных изданиях, рекомендованных ВАК при соискании учёной степени доктора биологических наук:

1. Гарифзянова, С.М. Формирование неотимпанальной мембраны при хирургическом лечении больных хроническим гнойным и острым посттравматическим средним отитом / С.М. Гарифзянова, P.P. Рахматуллин, В.Н. Щетинин // Российская оториноларингология. - 2007. - № 2(27). - С. 25-28.

2. Рахматуллина, Л.Р. Биохимические подходы к разработке биосовместимых материалов / Л.Р.Рахматуллина, Е.С. Барышева, P.P. Рахматуллин, О.И. Бурлуцкая // Вестник ОГУ. -2009. - октябрь. - С.685-686.

3. Стадников, A.A. Новый биопластический материал для регенерации покровных тканей (данные электронно-микроскопических исследований) / A.A. Стадников, P.A. Забиров, В.Н. Щетинин, P.P. Рахматуллин, Л.В. Коваленко // Российская оториноларингология. -

2009. -№3(40). -С. 100-102.

4. Забиров, P.A. Восстановление целостности барабанной перепонки при травматических её повреждениях / P.A. Забиров, P.P. Рахматуллин, С.М. Гарифзянова, Л.Р. Рахматуллина // Вестник оториноларингологии. - 2009. - № 5. - С. 87-88.

5. Rakhmatullina, L.R. Development of cell biomatrits based on hyaluronic acid / L.R. Rakhmatullina, E.S. Barysheva, R.R. Rakhmatullin //European journal of natural history

2010.- №4.-P. 11-12.

6. Рахматуллин, P.P. Наноструктурированный материал «Гиаматрикс» / P.P. Рахматуллин, О.И. Бурлуцкая, Л.Р. Адельшина, Т.И. Бурцева // Врач. - 2011. -№ 5. - С. 22-24.

7. Рахматуллин, P.P. Исследование биологической совместимости нового биоматериала «Гиаматрикс» / Р.Р.Рахматуллин, О.И. Бурлуцкая, P.P. Гильмутдинова // Врач. - 2011. - № 6. - С.32-34.

8. Адельшина, Л.Р. Алгоритм применения биоматериала «Гиаматрикс» в условиях эксперимента /Л.Р. Адельшина, И.Р. Гильмутдинова, О.И. Бурлуцкая, P.P. Рахматуллин // Врач. - 2011. - № 7. - С. 25-26.

9. Рахматуллин, P.P. Эффективность нового метода восстановления дефекта кожи у больного с врожденным буллёзным эпидермолизом: клиническое наблюдение / P.P. Рахматуллин, О.И. Бурлуцкая, Л.Р. Адельшина, Т.И. Бурцева // Вопросы современной педиатрии. - 2011. - Том. 10. - № 2. - С. 190-192.

10. Рахматуллин, P.P. Биопластический материал на основе гиалуроновой кислоты: биофизические аспекты фармакологических свойств / P.P. Рахматуллин // Фармация. - 2011. - № 4. - С. 37-39.

11. Летута, С.Н. Оптическая диагностика клеток биологических тканей в процессе их культивирования на полимерных средах / С.Н. Летута, B.C. Маряхина, P.P. Рахматуллин // Квантовая электроника. -2011. - Том. 41. - №4. - С. 314-317.

12. Бурлуцкая, О.И. Токсико-фармакологические исследования биоматериала «Гиаматрикс» // Фармация. - 2011. - №5. - С.45-47.

13. Гильмутдинова, И.Р. Органоспецифический регенерат GI-биопластический материал нового поколения / И.Р. Гильмутдинова, P.P. Рахматуллин, Р.Г. Гильмутдинов // Фармация. - 2011. - № б. - С. 50-52.

14. Бурлуцкая, О.И. Современное состояние и перспективные тенденции рынка биопластических материалов /О.И. Бурлуцкая, P.P. Рахматуллин, Р.Г. Гильмутдинов, Т.И. Бурцева, И.Р. Гильмутдинова // Фармация. - 2011. - № 7. -С. 49-51.

15. Гильмутдинова, И.Р. Восстановление костной ткани с помощью органоспецифического регенерата GI / И.Р. Гильмутдинова, Р.Г. Гильмутдинов, P.P. Рахматуллин // Фармация. -

' 2011. - №8. - С.40-41.

16. Летута, С.Н. Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей / С.Н. Летута, B.C. Маряхина, С.Н. Пашкевич, P.P. Рахматуллин // Оптика и спектроскопия. - 201!. - Том 110. - № 1. - С. 72-75.

17. Рахматуллин, Р. Лечение трофических язв биоматериалом «Гиаматрикс» /Р. Рахматуллин, В. Смолевский, О. Бурлуцкая // Врач. - 2011. 8. - С. 21-23.

18. Рахматуллин, P.P. Фармакоэкономические исследования биопластического материала «Гиаматрикс» /P.P. Рахматуллин, О.И. Бурлуцкая, И.Р. Гильмутдинова // Врач. - 2011. -№9. -С. 59-61.

19. Смолевский, В. Использование биокожи «Гиаматрикс» для лечения вялогранулирующих ран / В. Смолевский, JI. Адельшина, Р. Рахматуллин // Врач. - 2011. - № 10. - С. 63-64.

20. Бурлуцкая, О. Применение биоматериала «Гиаматрикс» после инвазивных процедур в пластической хирургии и косметологии / О. Бурлуцкая, Р. Рахматуллин, Н. Колесова, Т. Бурцева // Врач. - 2011. - № 11. - С. 22-24.

21. Рахматуллин, P.P. Применение биоматериала «Гиаматрикс» (Hyamatrix) в арсенале современных методов лечения ожогов и ожоговой болезни /P.P. Рахматуллин, О.И. Бурлуцкая, Р.Г. Гильмутдинов // Врач. - 2011. - № 12. - С. 44-46.

22. Рахматуллин, Р. Применение нового биопластического материала «Гиаматрикс» в оториноларингологии / Р. Рахматуллин, Р. Забиров, О. Бурлуцкая // Врач. - 2011. - №13. - С.32-33.

23. Макеев, О. Перспективная биосовместимая матрица для создания тканеинженерной конструкции эпителия роговицы человека /О. Макеев, С. Коротких, Р. Рахматуллин, М. Герасимов // Врач. - 2011. - № 14. - С.25-27.

24. Бурлуцкая, О.И. Восстановление дефектов кожи у больных ладонно-подошвенным псориазом с помощью нового биопластического материала «Гиаматрикс» / О.И. Бурлуцкая, P.P. Рахматуллин, JI.P. Адельшина, С.Н. Летута // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2011. - № 4. - С. 52-54.

25. Бурлуцкая, О. Комплексная косметическая композиция «Гиалуроновая кислота + матричные пептиды» /О. Бурлуцкая, Р. Рахматуллин // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2011. - № 4. - С.41-44.

26. Бурлуцкая, О.И. Восстановление ногтевой пластины с помощью гиалуроновой кислоты, обогащенной микроэлементным комплексом /О.И. Бурлуцкая, P.P. Рахматуллин, Н.П. Колесова, Т.И. Бурцева // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. -2011,- №5.-С. 33-35.

27. Бурлуцкая, О.И. Применение косметического средства «Гиаматрикс» в сочетании лазеротерапией для стимулирования роста волос / О.И. Бурлуцкая, P.P. Рахматуллин // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2011. -№6. - С.32-33.

28. Забиров, P.A. Новые биопластические материалы и их применение в отохирургии /P.A. Забиров, В.Н. Щетинин, М.И. Аникин, P.P. Рахматуллин, С.М. Гарифзянова, С.А. Грязнов, Ю.А. Кашина//Бас, Мойын Хирургиясы. - 2011. - №1-2 - С. 105-106.

29. Акимов, A.B. Перспективы применения биопластических материалов в ринохирургиии /A.B. Акимов, P.A. Забиров, P.P. Рахматуллин, М.В. Григорьева // Российская оториноларингология. - 2011. - Том 53. - № 4. - С. 10-13.

30. Рахматуллин, P.P. Разработка наноструктурированного биопластического материала «Гиаматрикс» для ото- и ринохирургии / P.P. Рахматуллин, P.A. Забиров, A.B. Акимов, С.М. Гарифзянова //Российская оториноларингология. — 2011. - Том 53. — № 4. — С. 128 -131.

31. Забиров, P.A. Использование новых биопластических материалов в клинической практике /P.A. Забиров, P.P. Рахматуллин, В.Н. Щетинин, С.М. Гарифзянова, С.А.Грязнов//Российская оториноларингология. - 2011. - Том 53 - №4.- С. 77-85.

32. Перова, Н.В. Изучение таксиса клеток на поверхности искусственной барабанной перепонки / Н.В. Перова, P.P. Рахматуллин //Технология живых систем. - 2012. - Том.9. - №7.-С. 11-13.

33. Рахматуллин, P.P. К вопросу о биологической совместимости современного наноструктурированного биопластического материала «Гиаматрикс» на примере мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток /P.P. Рахматуллин, Н.В. Перова, О.И. Бурлуцкая //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии»-2012. - №12- С.55-58.

34. Адельшин, А.И. Нативные матриксы для создания живого эквивалента кожи /А.И. Адельшин, P.P. Рахматуллин, Т.И. Бурцева, О.И. Бурлуцкая //Морфологические ведомости - 2013. - №3. - С.4-8.

35. Гильмутдинова, И.Р. Исследование эффективности применения биопластического материала «Гиаматрикс» при ожогах ЗБ степени в эксперименте И.Р. Гильмутдинова, Л.Т. Волова, В.В. Болтовская, И.Ф. Нефёдова, P.P. Рахматуллин // Морфологические ведомости. - 2013. - №3,- С.28-31.

36. Зиновьев, Е.В. Механотопография и биологические свойства гистоэквивалент-биопластического материала на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты /Е.В. Зиновьев, P.P. Рахматуллин, К.Ф. Османов, К.К. Жилин, Ю.В. Нестеров, Д.К. Якимов //Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2013. - №4(44). -С.200-204.

37. Зиновьев, Е.В. Биопластические дерматотерапевтические системы на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса / Е.В. Зиновьев,

P.P. Рахматуллин, К.Ф. Османов, И.А. Алмазов, A.A. Сулнца //Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2014. - №1(45). - С.147-151

38. Зиновьев, Е.В. Возможности биопластики трофических язв гистоэквивалент-биопластическим материалом на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты /Е.В. Зиновьев, A.M. Кисленко, К.Г. Сивожелезов, И.М. Сулейманов, С.А. Швецов, P.P. Рахматуллин, К.Ф. Османов //Научно-практический журнал «Хирург». - 2014. - №4. - С.14-21.

39. Бурлуцкая, О.И. Деструктурированная гиалуроновая кислота и пептидный комплекс: возможности anti-age терапии / О.И. Бурлуцкая, P.P. Рахматуллин, Т.И. Бурцева // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2014. - №2. - С. 47-51. Монография:

Забиров, P.A. Пластика дефектов барабанной перепонки биопластическим материалом «Гиаматрикс» / P.A. Забиров, P.P. Рахматуллин, С.М.Каркаева. - Оренбург: ДИМУР, 2013,- 144 с. Патенты:

1. Патент РФ № 2367476 от 21.03.2008 г. «Биопластический материал».

2. Патент РФ № 2425694 от 19.08.2011 г. «Нанострукгурированный биопластический материал».

3. Патент РФ N° 2418067 от 10.05.2011 г. «Способ культивирования клеток».

4. Патент РФ №2462255 от 23.06.2011 г. «Органоспецифический регенерат Gl».

5. Патент РФ №2458709 от 28.12.2012 г. «Биопластический материал».

6. Патент РФ №2481127 от 21.02.2012 г. «Микро-наноструктурованный биопластический материал».

7. Патент РФ №2513838 от 09.01.2014г. «Гистоэквивапент-биопластический материал».

8. Патент РФ №2528899 от 25.07.2014г. «Кожа косметическая».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСМ - атомно-силовой микроскоп

ВБНК - варикозная болезнь нижних конечностей

ГК - гиалуроновая кислота

ИК - инфракрасные спектры

МСКЖТ - мезенхимные стромальные клетки жировой ткани

НПВО - нарушенное полное внутреннее отражение

ГГГФБ - постгромбофлебитическая болезнь

УФ - ультрафиолетовое излучение

ФЧ - фибробласты человека

ЭКЦ - эпидермальные кератиноциты

РАХМАТУЛЛИН РАМИЛЬ РАФАИЛЕВИЧ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 06.11,2014г.

Печать ризограф. Гарнитура Times New Roman

Бумага офсетная Тираж 150 экз Заказ № 987

ООО «ОнЛайн» 460018, г. Оренбург, пр.Победы, 18